Nghiên cứu kỹ thuật nhuộm BAND G để lập karyotype trong chẩn đoán các bệnh rối loạn nhiễm sắc thể

TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 15, 2003

NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT NHUỘM BAND G ĐỂ LẬP KARYOTYPE 
TRONG CHẨN ĐOÁN CÁC BỆNH RỐI LOẠN NHIỄM SẮC THỂ
 Hà Thị Minh Thi
Đoàn Thị Duyên Anh, Nguyễn Viết Nhân
Trường Đại học Y khoa, Đại học Huế

1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Bất thường nhiễm sắc thể  (NST) là một trong những nguyên nhân quan trọng 
gây ra các bệnh lý di truyền, được gặp với tỷ  lệ 1/150 trẻ sinh sống và trongû 50% 
trường hợp sẩy thai ngẫu nhiên ở ba tháng đầu thai kỳ [6].
Lập karyotype là một xét nghiệm cần thiết cho tất cả các trường hợp trên lâm  
sàng nghi ngờ có bất thường số lượng hoặc cấu trúc NST [2]. Kết quả không những  
phục vụ  việc chẩn đoán xác định mà còn có ý nghĩa quyết định trongû công tác tư 
vấn di truyền.
Từ  năm 1970, người ta đã không công nhận những Karyotype được lập với kỹ 
thuật nhuộm Giemsa thường (không có band) vì với kỹ  thuật nhuộm này khó nhận  
dạng chính xác từng NST cũng như không thể phát hiện được những bất thường cấu  
trúc kiểu đảo đoạn, nhân đôi đoạn,...[6]. Từ  đó đến nay, tất cả  các karyotype thông 
thường được lập tại các phòng xét nghiệm di truyền trên thế giới chỉ sử dụng các kỹ 
thuật nhuộm band, trong đó thông dụng nhất là kỹ thuật nhuộm band G.
Để   việc  nhuộm  band  G   đạt   được  kết   quả  tối   ưu  làm  cơ   sở   cho  việc   lập 
karyotype, cần phải hoàn thiện hai bước quan trọng đó là (1) làm được tiêu bản với  
các cụm NST phân tán tốt, không bị  biến dạng (sau khi đã nuôi cấy mẫu); (2) xử lý 
tiêu bản và nhuộm đúng kỹ thuật với kết quả các band trên NST đạt tiêu chuẩn.
Việc lập karyotype có thể  tiến hành đối với các mẫu nghiệm như  tế  bào máu  
ngoại vi (tế bào lympho), tế bào nước ối, tủy xương, tế bào da... nhưng tế  bào máu  
ngoại vi được sử  dụng nhiều nhất. Vì vậy, chúng tôi chọn nuôi cấy tế  bào máu  
ngoại vi để nghiên cứu hoàn thiện kỹ thuật nhuộm band G các cụm NST.
Tuy nhiên, việc nhuộm NST bằng kỹ  thuật nhuộm band đòi hỏi phải có hoá  

chất đặc biệt, thao tác kỹ thuật tinh tế cũng như điều kiện môi trường (nhiệt độ, độ 
ẩm) thích hợp cho việc làm tiêu bản [1]. Vì vậy, hiện nay một số phòng xét nghiệm 
di   truyền   trong   toàn   quốc   vẫn   phải   lập   karyotype   với   kỹ   thuật   nhuộm   Giemsa  
thường.
129


Để  phục vụ  nhu cầu chẩn  đoán và tư  vấn di truyền tại  địa phương, nhóm 
nghiên cứu tiến hành đề tài này nhằm hai mục tiêu sau:
 Cải tiến và hoàn thiện việc làm tiêu bản NST tế bào máu ngoại vi.
 Cải tiến và hoàn thiện quy trình nhuộm nhiễm sắc thể  bằng kỹ thuật nhuộm  
band G.
2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu:
 Chúng tôi nghiên cứu lập Karyotype tế bào máu ngoại vi người. 
Các mẫu máu được nghiên cứu lấy từ  những người bình thường tình nguyện 
cũng như  những bệnh nhân với lâm sàng có chỉ  định lập Karyotype được giới thiệu  
từ khoa Nhi và Khoa Sản Bệnh viện Trung ương Huế.
 Nghiên cứu thiết kế tủ làm tiêu bản, giá gác tiêu bản khi nhuộm.
 Nghiên cứu hoàn thiện kỹ thuật nhỏ tiêu bản nhằm tăng chất lượng tiêu bản
 Nghiên cứu hoàn thiện các bước làm già, xử lý và nhuộm tiêu bản
2.2. Phương pháp nghiên cứu:
Tất cả  các nghiên cứu cải tiến cũng như  hoàn thiện quy trình làm tiêu bản và 
nhuộm band G của chúng tôi đều dựa trên những tiêu chuẩn kỹ  thuật của Hội kỹ 
thuật Di truyền thế giới (AGT). Đối với mỗi bước kỹ thuật đều có nhiều cách làm  
khác nhau tuỳ  theo từng phòng xét nghiệm. Vì vậy, đối với mỗi mẫu nuôi cấy thu  
hoạch từ mỗi người được nghiên cứu, chúng tôi chia nhiều lô để thử nghiệm.
Tế   bào   máu   ngoại   vi   sau   khi   được   nuôi   cấy   bằng   môi   trường   F10   và 
phytohemagglutinin trong 3 ngày sẽ được thu hoạch với colcemide, sốc nhược trương 
bằng  dung  dịch  KCl  và   sodium   citrate,   cố   định   trong  Carnoy  (3  methanol:  1  acid 

acetic). Sau đó tiến hành các bước làm tiêu bản và nhuộm như sau:
2.2.1. Làm tiêu bản:
Chúng tôi nghiên cứu để tiêu bản đạt chất lượng chuẩn là: các NST phân tán 
tốt, tối đa chỉ  3 NST có biểu hiện chồng chéo và không có NST bị  biến dạng hoặc 
đứt gãy.
Để đạt được kết quả này, quá trình làm tiêu bản phải được thực hiện với các 
điều kiện sau:
Điều kiện nhiệt độ, độ   ẩm khu vực nhỏ  tiêu bản thích hợp nhằm giúp tiêu  
bản khô trong khoảng thời gian 30­45 giây : Hầu hết các phòng xét nghiệm di truyền 
tế bào trên thế giới đều sử dụng Thermotron để ổn định nhiệt độ, độ ẩm. Trong điều  
kiện độ ẩm Thừa Thiên Huế cao (80­90%), lại không có Thermotron, chúng tôi thiết  
kế một tủ làm tiêu bản bằng cách nối máy hút ẩm thông thường với một tủ kính có 
cửa sổ. 
Lam kính được chuẩn bị tốt : chúng tôi sử dụng các loại lam ướt như sau: 
o
 Lam ngâm trong nước 10­20 C
o
 Lam ngâm trong nước 50­60 C
o
 Lam ngâm nước 30­40 C 
Sau khi nhỏ, lượng nước trên tiêu bản được làm ráo bằng giấy Kimwipes.
130


Tư  thế  lam kính khi nhỏ  dịch treo tế  bào phù hợp : chúng tôi lần lượt thử 
nghiệm với các tư thế như sau:
 Lam kính được đặt nằm ngang
o
 Lam kính được đặt nằm nghiêng 20­30 .
2.2.2. Làm già tiêu bản:

Có các cách như sau:
 Để ở nhiệt độ phòng trong 3­4 ngày
o
 Để  trong tủ sấy 90­95 C, trong 20 phút
o
 Để trong tủ sấy 60 C, trong 12­24 giờ
2.2.3. Xử lý tiêu bản bằng trypsin 0,025%:
Tác dụng của trypsin lên NST nhằm tạo band khi nhuộm phụ  thuộc vào thời  
gian tiếp xúc với tiêu bản, độ pH của trypsin. Chúng tôi chỉnh pH = 8 bằng Na 2HPO4. 
Thời gian ngâm tiêu bản trong trypsin được thử nghiệm ở 10, 15, 20 giây.
Sau khi ngâm trypsin, tiêu bản được rửa 2 lần trong dịch muối đẳng trương.
2.2.4. Nhuộm bằng thuốc nhuộm Wright:
 Sử dụng thuốc nhuộm Wright mẹ pha với dung dịch đệm Gurr tỷ lệ 1: 4
 Thời gian nhuộm là 3 phút
 Vì thuốc nhuộm Wright rất dễ kết tủa nên thay vì ngâm nhiều tiêu bản trong  
cốc nhuộm, chúng tôi cải tiến bằng cách tạo 1 giá nhuộm  ở  la­va­bô. Trên giá này 
chúng tôi gác các tiêu bản đã xử lý trypsin và đổ thuốc nhuộm sử dụng lên mỗi tiêu  
bản. Tiêu bản được rửa và làm khô bằng không khí ép.
3. KẾT QUẢ
3.1. Thiết bị tự thiết kế:
3.1.1. Tủ làm tiêu bản:
Chúng tôi đã thiết kế  thành công tủ  làm tiêu bản bằng cách nối máy hút  ẩm  
với một tủ kính có 2 cửa sổ.
Sau khi bật máy hút  ẩm 30­60 phút, độ   ẩm trong tủ  còn khoảng 50­60%. 
Người kỹ thuật viên dễ dàng luồn tay qua cửa sổ để thao tác việc làm tiêu bản.
3.1.2. Giá gác tiêu bản để nhuộm:
Chúng tôi đã thiết kế một giá để gác các tiêu bản khi nhuộm ngay tại la­va­bô. 
Để nhuộm 1 tiêu bản, chỉ cần trộn 1 ml dung dịch Wright mẹ với 4 ml đệm Gurr rồi 
phủ lên tiêu bản đã gác trên giá. Sau 3 phút, rửa ngay tiêu bản tại la­va­bô.  

131


3.2. Chất lượng tiêu bản:
Bảng 1: Chất lượng tiêu bản theo tư thế và điều kiện nhiệt độ
của lam kính khi nhỏ tiêu bản
Nhiệt độ  
nước ngâm  
lam kính
o

Thời gian  
khô

10­20 C

> 60 giây

30­40oC

30­50 giây

50­60oC

< 20 giây

Lam kính nằm ngang

Lam kính nghiêng  20­30oC

Có hiện tượng 2 cụm NST  Hiện tượng 2 hoặc nhiều 
trộn   lẫn   nhau;   hoặc   các  cụm NST trộn lẫn nhau rất 
cụm không phân tán
nhiều.
Cụm   NST   có   phân   tán 
nhưng   số   NST   có   sự 
Cụm NST phân tán tốt
chồng chéo nhiều (> 3)
Cụm NST không phân tán
Cụm NST không phân tán

3.3. Hình ảnh NST sau khi nhuộm band G :

Bảng 2: Sự thay đổi chất lượng hình ảnh NST được nhuộm band G
theo các chế độ làm già tiêu bản và thời gian xử lý bằng trypsin

Kiểu làm già 
tiêu bản
Nhiệt độ  
phòng 3­4  
ngày
60oC 12­24 giờ
90­95oC 20  
phút

Trypsin 10 giây
NST sắc nét, bắt 
màu đậm, không 
hiện band
NST sắc nét, bắt 

màu đậm, không 
hiện band
NST không sắc nét, 
bắt màu đậm không 
hiện band

Chất lượng hình ảnh NST
Trypsin 15 giây
Trypsin 20 giây
NST sắc nét, bắt 
màu tốt, band hiện rõ

NST phồng lên, trong 
lòng có những chỗ trống

NST sắc nét, bắt 
màu tốt, band hiện rõ

NST phồng lên, trong 
lòng có những chỗ trống

NST không sắc nét, 
nhưng bắt màu tốt 
và hiện band

NST nhoè, phồng lên, 
trong lòng có những chỗ 
trống

4. BÀN LUẬN 

4.1. Về những trang thiết bị tự thiết kế:
Tủ  làm tiêu bản tự  thiết kế:  trong điều kiện độ   ẩm của Thừa Thiên­Huế 
cao, thường đến 80­90%, tủ làm tiêu bản tự thiết kế tỏ ra rất hữu hiệu vì đã đưa độ 
ẩm xuống còn 50­60% trong vòng 30­60 phút. Đồng thời, việc thao tác trong tủ  kín 
giúp tránh được sự  thay đổi của luồng không khí lưu thông, điều này giúp  ổn định  
thời gian khô của tiêu bản. Ngoài ra, nhờ  tủ  làm tiêu bản này, người kỹ  thuật viên  
tránh được tác hại do hơi methanol và acid acetic bay lên trong quá trình phun tiêu  
bản.
Giá gác tiêu bản để nhuộm: trước đây, với phương pháp ngâm tiêu bản trong  
cốc nhuộm, mỗi cốc chứa 50 ml thuốc nhuộm đã pha (tương đương 10 ml Wright 
mẹ) chỉ ngâm được 4 tiêu bản. Sau đó, nếu muốn nhuộm thêm phải hòa thuốc nhuộm 
mới vì thuốc vừa ngâm đã bị kết tủa. Như vậy, kiểu nhuộm cũ rất tốn thuốc nhuộm  
132


và khó rửa sạch thuốc nhuộm trên các tiêu bản trong cốc cùng một lần. Nhờ giá gác 
tiêu bản này, chúng tôi có thể  nhuộm lần lượt từng tiêu bản mà không xảy ra hiện  
tượngû kết tủa thuốc nhuộm. Việc nhuộm sẽ dừng khi nào đủ số cụm NST đạt chất 
lượng để  đánh giá. Thông thường, mỗi bệnh nhân chỉ  cần nhuộm tối đa 5 tiêu bản  
nên lượng thuốc nhuộm Wright mẹ cần dùng không quá 5 ml.
4.2. Chất lượng tiêu bản:
Theo Hội kỹ thuật di truyền thế giới, có thể  nhỏ  dịch treo tế  bào lên lam kính 
khô hoặc ướt. Tuy nhiên, lam kính khô thường chỉ áp dụng cho các vùng có điều kiện  
nhiệt độ, độ ẩm lý tưởng. Các lam ướt làm cụm NST dễ phân tán vì các “thấu kính”  
nước trên lam kính sẽ rút lại ngay lập tức khi Carnoy trong dịch treo tế bào chạm vào 
nó [1]. Theo Holmquist và Motara, năng lượng khử nước từ dung dịch Carnoy đã đóng  
vai trò quan trọng trong việc giúp phân tán cụm NST [4]. Vì vậy, chúng tôi chọn 
phương pháp lam kính ướt. Chúng tôi kiểm soát thời gian khô tiêu bản nhờ vào việc 
thay đổi nhiệt độ của nước ngâm. Thời gian khô tiêu bản rất quan trọng vì nó quyết 
định chất lượng phân tán của cụm NST. Theo phần lớn các nhà kỹ  thuật di truyền, 

thời gian khô lý tưởng là 30­45 giây [1]. Nhiệt độ  nước ngâm lam kính cũng có sự 
thay đổi tương đối tuỳ  theo từng tác giả, tuy nhiên Hansen cho rằng nên sử  dụng  
nước ngâm  ở  nhiệt độ  từ  20­48oC [3]. Nghiên cứu của chúng tôi  ở  bảng 1 cho thấy  
chỉ  khi làm tiêu bản với những lam kính ngâm trong nước 30­40oC thì thời gian khô 
mới đạt 30­50 giây. Ở các nhiệt độ  nước ngâm khác trong nghiên cứu của chúng tôi 
chất lượng tiêu bản đều không tốt dù tư thế lam kính khi nhỏ là nằm ngang hay nằm  
nghiêng. Với nhiệt độ  nước ngâm lam kính 30­40oC, chúng tôi nhận thấy với lam 
kính đặt nghiêng 20­30oC theo trục ngắn thì chất lượng tiêu bản tốt hơn. Một số nhà  
kỹ  thuật di truyền vẫn làm tiêu bản với lam kính nằm ngang, nhưng theo Hội kỹ 
thuật di truyền thế  giới, hiện nay đa số  các phòng xét nghiệm áp dụng tư  thế  lam  
kính nằm nghiêng 20­30o theo trục ngắn [1]. Ngoài ra, theo kinh nghiệm của chúng  
tôi, nếu dùng những lam kính có sự  phân bố  nước đồng đều khi lấy ra khỏi nước  
ngâm sẽ tạo được tiêu bản có NST phân tán tốt hơn.
4.3. Chất lượng hình ảnh NST sau khi nhuộm band G:
Kết quả   ở  bảng 2 cho thấy chế  độ  làm già tiêu bản  ở  90­95oC trong 20 phút 
không đảm bảo chất lượng hình  ảnh sau khi nhuộm band G.  Ở chế độ  làm già tiêu 
bản này, hình  ảnh NST có thể  đem phân tích được nếu xử  lý bằng trypsin đúng 15 
giây, nhưng chúng tôi không chọn vì NST tuy có bắt màu và hiện band tốt nhưng 
không được sắc nét. Tuy nhiên, một số  tác giả  vẫn sử  dụng khi cần có kết quả 
karyotype nhanh [1]. Có lẽ phòng xét nghiệm của các tác giả này nằm trong khu vực  
có độ ẩm thích hợp hơn chúng tôi nên kết quả nhuộm đạt chất lượng hơn.
Cả 2 chế độ làm già tiêu bản là để ở nhiệt độ phòng 3­4 ngày và 60 oC trong 12­
24 giờ đều cho kết quả giống nhau. Qua kết quả này, chúng tôi đã chọn chế  độ  làm  
già tiêu bản là 60oC trong 12­24 giờ để tiết kiệm thời gian trả kết quả. Thông thường  
chúng tôi làm tiêu bản vào buổi chiều và để tiêu bản trong tủ sấy 60 oC qua đêm. Quá 
trình làm già tiêu bản rất quan trọng trong việc tạo nên hình ảnh NST đạt chất lượng  
sau nhuộm. Tuy nhiên, người ta vẫn chưa thực sự hiểu rõ tác dụng của nó, có lẽ là do 
133

quá trình này đã làm khô hết lượng nước trên tiêu bản mà có thể ảnh hưởng đến việc 
nhuộm band [1].
Bảng 2 còn cho thấy chỉ  bằng cách xử  lý 15 giây với trypsin thì mới cho hình  
ảnh NST đạt chất lượng. Theo Wang và Federoff, trypsin đã thủy phân protein của  
nhiễm sắc chất làm cho thuốc nhuộm có thể phản ứng với DNA được bộc lộ [7]. Về 
sau, Hsu cho rằng trypsin tác động bằng sự  chelat hóa (tạo phức hợp “càng cua” có  
tính hoà tan) hơn là tiêu hủy protein [5].
Tóm lại, qua việc thử nghiệm các kiểu tiến hành làm tiêu bản và nhuộm, chúng  
tôi đưa ra quy trình làm tiêu bản và nhuộm band G như sau:
 Quá trình làm tiêu bản thực hiện trong tủ làm tiêu bản sau khi bật máy hút ẩm  
30­60 phút để đạt độ ẩm 50­60% (có kiểm tra bằng ẩm kế).
o
 Nhỏ  dịch treo tế  bào lên lam kính đã được ngâm trong nước 30­40 C với lam 
o
kính nằm nghiêng 20­30  theo trục ngắn.
o
 Sau khi tiêu bản khô, làm già tiêu bản trong tủ sấy 60 C để qua đêm.
 Sáng hôm sau, xử  lý tiêu bản bằng trypsin 0,025% pH = 8 trong 15 giây. Rửa  
sạch trypsin 2 lần trong dung dịch muối đẳng trương.
 Nhuộm bằng thuốc nhuộm Wright: gác tiêu bản lên giá, trộn 1 ml dung dịch  
Wright mẹ với 4 ml đệm Gurr rồi phủ lên tiêu bản trong 3 phút. Sau đó rửa sạch tiêu 
bản và làm khô bằng không khí ép.
5. KẾT LUẬN 
Qua quá trình nghiên cứu và cải tiến quy trình làm tiêu bản và nhuộm band G,  
chúng tôi rút ra một số kết luận như sau:
Việc thiết kế  tủ  làm tiêu bản đã giúp ổn định độ  ẩm và sự  lưu thông không 
khí  ở  khu vực làm tiêu bản, tạo điều kiện đảm bảo chất lượng tiêu bản (có nhiều  
cụm nhiễm sắc thể đạt tiêu chuẩn).
Việc thiết kế giá gác tiêu bản giúp đảm bảo chất lượng thuốc nhuộm khi cần  
nhuộm nhiều tiêu bản, đồng thời tiết kiệm được lượng thuốc nhuộm Wright mẹ.

Chúng tôi đã thiết lập được quy trình làm tiêu bản và nhuộm band G đạt chất  
lượng cao với các cụm NST phân tán tốt, hình  ảnh NST sắc nét, bắt màu thuốc  
nhuộm tốt và hiện band rõ.
TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Barch M.J., Knutsen T., Spurbeck J.L The AGT Cytogentics Laboratory Manual.. 3rd  
edition. Lippincott ­ Raven (1997)
2. Geleherter   T.D.,   Collins   F.S.,   Ginsburg   D.   Principles   of   Medical   Genetics.   2nd 
edition. William & Wilkins (1998)
3. Hansen S. Slide preparation. Karyogram, 1980. In: Barch M.J., Knutsen T., Spurbeck 
J.L  The   AGT   Cytogentics   Laboratory   Manual...   3rd   edition.   Lippincott   ­   Raven 
(1997)
4. Holmquist   G.P.,   Motara   M.A.,  The   magic   of   cytogenetic   technology.   In:   Obe   G, 
Basler A., Cytogenetics. Springer­Verlag (1987)
134


5. Hsu T.C., Longitudinal differentiation of chromosomes.  Annu Rev Genet, 1973. In: 
Barch M.J., Knutsen T., Spurbeck J.L The AGT Cytogentics Laboratory Manual.. 3rd 
edition. Lippincott ­ Raven (1997)
6. Jorde  L.B.,   Carey   J.C.,   Bamshad   M.J.,   White   R.L.Medical   Genetics.   2nd   edition, 
Mosby (2000)
7. Wang H.C., Federoff S. Banding in human chromosomes treated with trypsin. Nature  
New  Biol,  1972.   In:   Barch  M.J.,  Knutsen T.,  Spurbeck J.L  The  AGT   Cytogentics  
Laboratory Manual. 3rd edition. Lippincott ­ Raven (1997)

TÓM TẮT
Lập karyotype là một xét nghiệm cần thiết cho tất cả  các trường hợp trên lâm sàng  
nghi ngờ  có bất thường số lượng hoặc cấu trúc NST. Để  lập Karyotype đạt tiêu chuẩn cần  
phải nhuộm NST với kỹ  thuật nhuộm band, trong  đó thông dụng nhất là nhuộm band G.  

Nhóm nghiên cứu đã thiết kế được tủ làm tiêu bản và giá gác tiêu bản để nhuộm. Đồng thời,  
thiết lập được quy trình làm tiêu bản và nhuộm band G với một số đặc điểm kỹ  thuật như  
sau:
o
 lam kính được ngâm trong nước 30­40 C 
o
 tư thế lam kính khi nhỏ tiêu bản: nghiêng 20­30  theo trục ngắn.
o
 làm già tiêu bản trong tủ sấy 60 C để qua đêm.
 xử lý tiêu bản bằng trypsin 0,025% pH = 8 trong 15 giây. 
 nhuộm bằng thuốc nhuộm Wright trong 3 phút
Kết quả: các cụm NST phân tán tốt, hình  ảnh sắc nét, bắt màu thuốc nhuộm tốt và  
hiện band rõ.

G­BANDING TECHNIQUE FOR MAKING KARYOTYPE USED 
IN THE DIAGNOSIS OF CHROMOSOMAL DISORDERS
 Ha Thi Minh Thi
Đoan Thi Duyen Anh, Nguyen Viet Nhan
Collge of Medicine, Hue University
SUMMARY
Making karyotype is very necessary for all the clinical cases doubted to have abnormal  
number or structure. To make karyotype get the standard required, chromosomes ought to be  
dyed using banding techniques, of which G­banding id the most common. The authors of the  
study   designed   successfully   a   cabinet   for   slide   preparation   and   a   rack   for   staining.   The  
procedure   for   slide   making   and   G­banding   was   established   with   the   following   technical  
properties:
The slides are rinsed  in the water of 30­400C.
  
The slides are held at an angle of 20­300C during the time of    dropping cells.
Slide aging at 600C

Slide treating with tripsin of 0.025pH=8 for 15 seconds
Staining with Wright for 3 minutes
                         Result:  The chromosomes in each metaphase is well separated, the pictures of  
chromosomes are clear, the color good, and the bands visible.
135


136