Tổng hợp polymer đóng dấu phân tử cafein định hướng ứng dụng làm pha tĩnh trong kỹ thuật chiết pha rắn chọn lọc

Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018

TỔNG HỢP POLYMER ĐÓNG DẤU PHÂN TỬ CAFEIN ĐỊNH HƢỚNG ỨNG DỤNG LÀM PHA TĨNH
TRONG KỸ THUẬT CHIẾT PHA RẮN CHỌN LỌC
Nguyễn Như Quỳnh*, Phan Văn Hồ Nam*

TÓM TẮT
Mở đầu: Polymer đóng dấu phân tử như một thụ thể nhân tạo, có tính chọn lọc cao, rất hiệu quả trong
việc tách và phân tích các mẫu phức tạp, như dịch sinh học hoặc môi trường. Nhằm góp phần nhân rộng kỹ
thuật đóng dấu phân tử tại Việt Nam, đề t|i “Tổng hợp polymer đóng dấu phân tử cafein để định hướng
ứng dụng l|m pha tĩnh trong kỹ thuật chiết pha rắn chọn lọc” được thực hiện, với đối tượng cafein, một
alkaloid với nhiều tác dụng sinh học, được chọn là phân tử mẫu.
Mục tiêu: Khảo sát phản ứng tổng hợp polymer đóng dấu phân tử cafein (cafein-MIP) có cỡ hạt nano
có khả năng lưu giữ thuận nghịch cafein.
Đối tượng Cafein-MIP có khả năng hấp phụ thuận nghịch cafein.
Phương pháp nghiên cứu: Tổng hợp cafein-MIP bằng phương ph{p kết tủa trong dung môi. Khảo sát
khả năng rửa giải và tái hấp phụ cafein của polymer bằng phương ph{p quang phổ UV-Vis và HPLC.
Kết quả: Cafein-MIP dạng hạt được tổng hợp có kích thước khoảng 500 nm, hình cầu, tương đối đồng
đều. Khảo sát các tỷ lệ khác nhau giữa acid methacrylic và 4-vinyl pyridine cho thấy khả năng đóng dấu
cafein tăng khi tăng h|m lượng 4-vinyl pyridine trong công thức, tuy nhiên nồng độ acid cao lại làm giảm
hiệu quả đóng dấu. Với tỷ lệ 1:1, hiệu quả đóng dấu của cafein-MIP gấp 6,8 lần so với polymer không đóng
dấu (NIP).
Kết luận: Đề tài lần đầu tiên tổng hợp được cafein-MIP với cỡ hạt bằng nano có khả năng lưu giữ
thuận nghịch cafein với hiệu quả đóng dấu phân tử cao.
Từ khóa: Polymer đóng dấu phân tử cafein, chiết pha rắn chọn lọc

ABSTRACT
SYNTHESIS OF CAFFEINE-IMPRINTED POLYMER, DIRECTED
AS THE SORBENT FOR SELECTIVE SOLID-PHASE EXTRACTION

Nguyen Nhu Quynh, Phan Van Ho Nam
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018: 204 - 209
Introduction: Molecularly imprinted polymer is considered as artificial receptors with high selectivity
and affinity, that could be used for analyse of sophisticated samples such as biological fluid and
environmental ones. To expand the application of this novel method in Vietnam, the study "Synthesis of
caffeine-imprinted polymer, directed as the sorbent for selective solid phase extraction" was conducted in
which caffeine, an alkaloid having many biological activities, was selected as a template for polymerization
reaction.
Objectives: Investigating the synthesis of caffeine-imprinted polymer (cafeine-MIP) particles in nano
size that is able to retain caffeine reversibly.

*Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: TS. Phan Văn Hồ Nam
ĐT: 0909615007

204

Email:

Chuyên Đề Dƣợc


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018

Nghiên cứu Y học

Subjects: cafeine-MIP with ability of reversible caffeine absorption.
Study methods: Synthesis of polymer particles based on precipitation method. Study on convertible
holding capacity of caffeine-MIP by using UV-Vis and HPLC methods.
Results: The spherical caffeine-MIP particles with approximately 500 nm size and relatively uniform

was successfully synthesized. Surveying the various ratios between methacrylic acid and 4-vinyl pyridine
showed that the imprinted efficiency was increased by rising the concentration of 4-vinyl pyridine in the
formula, and was reduced by high acid content. In case of 1:1 rate, caffeine-MIP can hold caffeine than 6.8
times the NIP (non-imprinted polymer).
Conclusions: The caffeine-MIP particles in nano size with reversibly and high imprinted efficiency
was first time synthesized.
Keywords: Caffeine-imprinted polymer, selective solid-phase extraction
trong tƣơng lai. Chính vì vậy, đề t|i “Tổng
ĐẶT VẤN ĐỀ
hợp polymer đóng dấu phân tử cafein định
Năm 1930, những nghiên cứu đầu tiên về
hƣớng ứng dụng l|m pha tĩnh trong kỹ thuật
kĩ thuật đóng dấu phân tử đƣợc công bố(3). Từ
chiết pha rắn tách cafein có tính chọn lọc cao”
đó đến nay, kĩ thuật này ngày càng phát triển
đƣợc thực hiện nhằm góp phần nhân rộng kỹ
mạnh mẽ và chứng minh tính ứng dụng cao
thuật này, giúp tiết kiệm thời gian, chi phí,
của mình trong những ngành khoa học khác
công sức, không chỉ trong công tác kiểm
nhau. Polymer đóng dấu phân tử (MIP –
nghiệm cafein m| còn trong c{c lĩnh vực khác.
Molecular Imprinting Polymer) đƣợc hình
ĐỐI TƢỢNG– PHƢƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU
thành dựa trên kĩ thuật đóng dấu phân tử MIT
(Molecular Imprinting Technology), trong đó
Đối tƣợng nghiên cứu
một phức hợp đƣợc hình thành giữa mẫu
Cafein-MIP.
(chất khảo sát – template) và monomer chức

Chất đối chiếu
năng trong dung môi của phản ứng polymer.
Cafein khan (số lô 394541AX20, xuất xứ
Cho mẫu, monomer, chất liên kết chéo (crossGermany, h|m lƣợng 99,92%).
linker), tác nhân mồi phản ứng vào ống
Hóa chất – dung môi
nghiệm, sau phản ứng một mạng lƣới polymer
không gian ba chiều đƣợc hình thành. Tiếp
Dung môi, hóa chất thuốc thử đạt độ tinh
theo, mẫu đƣợc rửa giải khỏi polymer để lại
khiết tùy mục đích sử dụng: Dung môi tổng
những “lỗ hổng” với hình dạng, kích thƣớc và
hợp, rửa giải polymer, pha chế dung dịch:
chức năng hóa học phù hợp với phân tử chất
ethanol, methanol, acid acetic, cloroform, nkhảo sát. Kết quả, polymer nhận diện và gắn
butanol, n-hexan, diethyl ether, xuất xứ Trung
một cách có chọn lọc với mẫu(2,4,5). Chúng rất
Quốc; Hóa chất tổng hợp polymer: acid
hữu ích cho việc phân tích các mẫu phức tạp
metacrylic (MAA), 4-vinylpyridin (4-VP),
nhƣ dịch sinh học và mẫu môi trƣờng. Ở Việt
ethylen glycol dimethylacrylate (EDMA),
Nam, kỹ thuật này vẫn còn khá mới lạ. Bên
azobisisobutyronitril (AIBN) (Aldrich-sigma);
cạnh đó, cafein l| một alkaloid phổ biến trong
Dung môi sắc ký lỏng: MeOH (J.T.Baker), acid
cuộc sống, ngƣời ta hầu nhƣ dễ dàng bắt gặp
acetic băng (Merck).
các chế phẩm có cafein trên thị trƣờng. Cafein
Trang thiết bị

có tác dụng g}y hƣng phấn thần kinh, lợi tiểu,
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
giãn nở phế quản(1). Cafein đƣợc chọn làm
Waters Alliance 2695, đầu dò dãy diod quang
phân tử mẫu trong nghiên cứu n|y để từ đó
2996 (Waters, Mỹ). Cân phân tích Sartorius CP
phát triển hơn kỹ thuật đóng dấu phân tử

Chuyên Đề Dƣợc

205


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018

Nghiên cứu Y học

224D (Sartorius, Đức), m{y đo quang phổ tử
ngoại khả kiến UV-Probe 2550 (Shimadzu –
Nhật)
Phƣơng pháp nghiên cứu

Tổng hợp polymer đóng dấu phân tử cafein
(cafein-imprinted polymer - cafein-MIP) và
polymer trắng (non-imprinted polymer NIP)
Pha các dung dịch Cafein mẹ nhƣ sau: DD
C1: 5 mg /ml cafein trong aceton, DD C2: 5
mg/ml cafein trong acetonitril, DD C3: 5
Bảng 1: Công thức thành phần tổng hợp polymer
Thành phần

DD C1 (µl)
DD C2 (µl)
DD C3 (µl)
EDMA (mg)
MAA (mg)
4-VP(mg)
AIBN (µl)
Aceton (ml)
ACN (ml)
Cloroform (ml)
Acid acetic (µl)
NaOH 0,1N (µl)

B1
200
160
14
35
1
-

B2
200
160
14
35
1
-

B3

200
160
14
35
1
-

B4
200
140
35
35
1
-

Tạo hạt
Sau khi tổng hợp polymer đến trạng thái
gel, lấy 500 µl polymer dạng gel này cho vào
ống nghiệm có nắp đậy. Thêm vào ống
nghiệm 5 ml ethanol. Khuấy trong 4 giờ trên
bếp từ. Sau đó đem ly t}m với tốc độ 5000
vòng/phút trong 5 phút, thu lấy cắn.
Kiểm tra sự lưu giữ cafein của cafein-MIP
dạng hạt sử dụng phương pháp quang phổ
UV-Vis và HPLC (Sơ đồ 1)
Hạt polymer (MIP hoặc NIP) sau khi tổng
hợp theo công thức B7, B8, B9, B11 (Bảng 1)
đƣợc rửa sạch cafein với dung môi thích hợp
bằng cách cho vào ống nghiệm 5 ml dung môi
rủa giải, đậy nắp ống nghiệm, lắc rung trong 2

phút, để lắng trong 1 phút v| đem ly t}m với
tốc độ 5000 vòng/phút trong 5 phút. Dịch thu
đƣợc pha loãng thành 25 ml. Tiến h|nh đo
quang để kiểm tra sự hiện diện của cafein.
Quy trình đƣợc thực hiện với dung môi rửa

206

mg/ml cafein trong cloroform. Thực hiện tổng
hợp MIP theo các công thức kh{c nhau nhƣ
Bảng 1. Cho các thành phần vào eppendorf,
lắc rung hỗn hợp trên trong 10 gi}y. Sau đó
cách thủy hỗn hợp ở 74 oC cho đến khi hỗn
hợp hình thành trạng thái gel, ngay lập tức lắc
rung hỗn hợp trong 30 giây. Với mỗi công
thức MIP, thực hiện tổng hợp NIP song song
để đối chiếu trong đó th|nh phần tổng hợp
tƣơng ứng không có dung dịch cafein.

B5
200
120
50
35
1
-

B6
200
140

35
40
1
-

B7
200
150
30
10
35
0,4
-

B8
200
150
20
20
35
0,4
-

B9
200
150
10
30
35
0,4

20
-

B10
200
160
40
35
0,4
20

B11
200
160
40
35
0,4
-

giải methanol, thu đƣợc dung dịch A, dung
môi rửa giải methanol – acid acetic (9:1) thu
đƣợc dung dịch B.

Sơ đồ 1: Quy trình kiểm tra sự lưu giữ cafein của
cafein-MIP dạng hạt sử dụng phương ph{p quang
phổ UV-Vis và HPLC

Chuyên Đề Dƣợc

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018
Tái hấp phụ cafein: cho 1ml dung dịch
cafein pha trong ACN có nồng độ 1 mg/ml vào
hạt polymer đã rửa sạch ở trên (MIP hoặc
NIP). Lắc rung trong 2 phút, để ổn định 1 phút
rồi đem ly t}m. Tiếp tục cho vào cắn trên 5 ml
dung dịch methanol, lắc rung trong 2 phút, để
ổn định 1 phút, ly tâm 5000 vòng/phút trong
10 phút. Thực hiện 3 lần, gộp các dịch thu
đƣợc pha loãng bằng methanol thành 25 ml
(dung dịch C). Cho 4 ml dung dịch methanolacid (9:1) cắn còn lại. Lắc rung trong 2 phút, để
lắng 1 phút rồi đem ly t}m 5000 vòng/phút
trong 10 phút. Lặp lại bƣớc trên 3 lần nữa. Sau
đó, gộp các dịch thu đƣợc pha loãng với
methanol-acid (9:1) thành 25 ml (dung dịch D).
Lọc các dung dịch A, B, C, D thu đƣợc qua
màng lọc 0,45 µm, tiến h|nh định lƣợng cafein
bằng phƣơng ph{p sắc kí lỏng hiệu năng cao
(HPLC).
Quy trình ph}n tích HPLC để x{c định nồng
độ cafein trong dịch rửa giải sử dụng c{c điều
kiện sắc ký là: Cột sắc kí CC 125/4 Nucleosil 1005C18 (125 × 4 mm, 5 µm); Pha động l| Nƣớc methanol - acid acetic (69:28:3); Nhiệt độ cột là
45oC; Tốc độ dòng 1ml/phút; Thể tích tiêm mẫu
10 µl; Bƣớc sóng phát hiện 273 nm. Quy trình đã
đƣợc kiểm tra tính tƣơng thích hệ thống và thẩm
định đạt yêu cầu ph}n tích định lƣợng theo
hƣớng dẫn của ICH.

Nghiên cứu Y học

KẾT QUẢ
Tổng hợp polymer đóng dấu phân tử cafein
(cafein-imprinted polymer - cafein-MIP) và
polymer trắng (non-imprinted polymer NIP)
Quan sát cảm quan hạt MIP/NIP thu đƣợc
từ các công thức B1, B2, B3, hạt polymer tạo
thành trong dung môi cloroform trong suốt
không màu, hầu nhƣ không thể quan s{t đƣợc
điểm gel của phản ứng. Bên cạnh đó cafein tan
trong acetonitril tốt hơn trong aceton, nên
dung môi acetonitril đƣợc chọn làm dung môi
phản ứng polymer (công thức B2). Nồng độ
AIBN trong MIP càng cao, thời gian tổng hợp
càng nhanh. Tuy nhiên, nếu tăng nồng độ
AIBN lên quá cao, polymer sẽ đông khối trƣớc
khi kịp cho vào dung môi tạo hạt. Do đó, công
thức B4 phù hợp hơn so với B6. So sánh công
thức B2, B4, B5 có tỷ lệ chất liên kết chéo monomer (EDMA - MAA) kh{c nhau. Lƣợng
chất liên kết chéo càng lớn, hạt càng to, không
đồng đều, tủa nhanh chóng và vón cục, tuy
nhiên nếu hạt nhỏ quá sẽ không phù hợp nhồi
cột SPE. Vậy nên tỷ lệ EDMA - monomer
trong công thức đƣợc chọn là 80:20 (công thức
B4). Sự hiện diện của NaOH làm phản ứng
polymer hóa kéo dài trên 24 giờ. Vậy cuối
cùng chỉ có các công thức B7, B8, B9, B11 đƣợc
sử dụng để khảo sát khả năng lƣu giữ của
cafein-MIP.

Tạo hạt

Hình 1: Hình dạng hạt dưới kính hiển vi có độ phóng đại 100x, mỗi vạch nhỏ nhất trên thước trắc vi tương
ứng 400 nm

Chuyên Đề Dƣợc

207


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018

Polymer ở dạng gel đƣợc kết tủa trong
ethanol, thu đƣợc các hạt nhỏ có kính thƣớc
h|ng micromet khi quan s{t dƣới kính hiển vi
có độ phóng đại 100x (Hình 1)
Kiểm tra sự lƣu giữ cafein của polymer sử
dụng quang phổ UV-Vis
Sau khi tổng hợp MIP và NIP rồi tạo hạt
với ethanol, tiến hành rửa giải với lần lƣợt
các dung môi theo thứ tự: n-butanol,
isopropanol, ethanol, methanol, methanolacid acetic (9:1) rồi đo quang phổ UV-Vis ta
thu đƣợc kết quả nhƣ Bảng 2. Kết quả cho
thấy sau khi dùng n-butanol rửa giải
cafein, các dung môi phân cực hơn không
thể rửa giải nốt lƣợng cafein còn lƣu giữ
trong cafein-MIP ngoại trừ hỗn hợp
methanol-acid acetic (9:1). Hiện tƣợng sảy
ra tƣơng tự khi tiến hành tái hấp thu

cafein. Tuy nhiên khi tái hấp thu, NIP cho
kết quả tƣơng tự MIP.
Bảng2: Kiểm tra sự lưu giữ cafein của polymer
dạng hạt sử dụng phương ph{p quang phổ UV-Vis
(kết quả được trình bày theo MIP/NIP của từng
công thức tương ứng)
B7
B8
Dung môi tạo hạt
+/+/n-butanol
+/+/Isopropanol
-/-/Ethanol
-/-/Methanol
-/-/Methanol-acid (9:1)
+/+/Tái hấp phụ cafein
n-butanol
+/+
+/+
Iso propanol
-/-/Ethanol
-/-/Methanol
-/-/Methanol-acid (9:1)
+/+
-/-

B9
+/+/-/-/-/+/-

B11
+/+/-/-/-/+/-

+/+
-/-/-/+/+

+/+
-/-/-/-/-

Chú thích: (+) l| dương tính, có hiện diện cafein, (-) là
âm tính, không có hiện diện cafein

Kiểm tra sự lƣu giữ cafein của polymer sử
dụng phƣơng pháp HPLC
Lƣợng cafein trong các dịch rửa giải
MIP/NIP ở c{c giai đoạn kh{c nhau đƣợc trình
bày trong Bảng 4.

208

Bảng 3: Lượng cafein (mg) thu hồi trong các dịch
rửa giải MIP/NIP ở c{c giai đoạn khác nhau với
lượng cafein thêm vào mỗi giai đoạn là 1 mg.
B 11
B7
B8
B9
Dung
dịch MIP NIP
MIP NIP
MIP NIP
MIP NIP

A 0,6144 0 0,3846 0 0,6351 0 0,5612 0
B 0,0031 0
0
0
0
0 0,0000 0
C 0,9127 0,9199 0,9234 0,9222 0,7141 0,7359 0,7317 0,6294
D 0,0015 0,0017 0
0 0,0040 0,0006 0
0

BÀN LUẬN
Từ kết quả Bảng 3 cho thấy, khi dùng
methanol để rửa giải, polymer B7 và B9 không
có khả năng lƣu giữ cafein, trong khi polymer
B8 và B11 chỉ bị rửa giải thêm bởi hỗn hợp
methanol-acid acetic (9:1). B11 với monomer
chỉ gồm acid methacrylic có thể đã tạo liên kết
hydro với cafein nên cả MIP v| NIP đều có thể
lƣu giữ cafein, lƣợng cafein còn lại chƣa đến
9%, tuy nhiên không có sự khác biệt, nhƣ vậy,
liên kết này yếu hoặc quá ít nên việc đóng dấu
không thành công.
B8 là công thức giúp polymer có khả năng
lƣu giữ thuận nghịch cafein. So sánh công
thức của B8 với 3 công thức còn lại, sự khác
biệt có thể đến từ h|m lƣợng tổng cộng của
acid là thấp nhất. Nhƣ vậy có thể nhóm chức –
COOH của acid methacrylic và acid acetic cản
trở hình thành ái lực giữa polymer và cafein.

B8 với monomer gồm acid methacrylic và
4-VP có 2 nhóm chức khác nhau là –COOH và
nhóm pyridin có khả năng tƣơng hỗ tốt hơn
để tạo ái lực tốt hơn với cafein, vốn là một
base hữu cơ rất yếu, do vậy B8 lƣu giữ đƣợc
nhiều cafein hơn, v| tạo là sự khác biệt giữa
MIP và NIP, MIP có thể giữ cafein gấp 6,8 lần
so với NIP (0,40% so với 0,06%). Hiệu quả
đóng dấu phân tử này là rất cao so với các tài
liệu tham khảo tìm thấy. Tuy nhiên ái lực này
quá cao khiến cho cafein không thể rửa giải
hoàn toàn với dung môi methanol-acid acetic
(9:1). Tổng lƣợng cafein thu hồi đƣợc chỉ vào
khoảng 70% so với 90% của B11.

Chuyên Đề Dƣợc


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018
KẾT LUẬN
Đề tài lần đầu tiên tổng hợp đƣợc cafeinMIP có khả năng lƣu giữ thuận nghịch cafein
mà hiệu quả đóng dấu l|m tăng 6,8 lần so với
không đóng dấu phân tử, bên cạnh đó cũng
tổng hợp thành công hạt polymer với kích
thƣớc nano tƣơng đối đều, đồng nhất. Từ kết
quả n|y, đề t|i cũng mở ra những hƣớng
nghiên cứu tiếp theo để cafein-MIP có đƣợc
hiệu quả đóng dấu tối ƣu, phù hợp với định
hƣớng l|m pha tĩnh cafein-MISPE.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

Institute of Medicine (2014). Caffeine in Food and Dietary
Supplements: Examining Safety: Workshop Summary.
Leslie P, Ann LY, Diana P Washington DC, The National
Academies Press. 2014.

Chuyên Đề Dƣợc

2.

3.

4.

5.

Nghiên cứu Y học

Lieberzeit PA, Findeisen A, Mähner J, Samardzic R,
Pitkänen J, Anttalainen O, Dickert FL (2010). Artificial
receptor layers for detecting chemical and biological threats.
Procedia Engineering. 5(Supplement C):381-384.
Öpik A, Menaker A, Reut J, Syritski V (2009). Molecularly
imprinted polymers: A new approach to the preparation of
Functional materials. Proceedings of the Estonian Academy of
Sciences. 58(1):3-11.
Phan N, Sussitz H, Lieberzeit P (2014). Polymerization
Parameters Influencing the QCM Response Characteristics

of BSA MIP. Biosensors. 4(2):161-171.
Vasapollo G, Sole RD, Mergola L, Lazzoi MR, Scardino A,
Scorrano S, Mele G (2011). Molecularly imprinted polymers:
present and future prospective. International journal of
molecular sciences. 12(9):5908-5945.

Ngày nhận bài báo:

18/10/2017

Ngày phản biện nhận xét bài báo:

01/11/2017

Ng|y b|i b{o được đăng:

15/03/2018

209