Thẩm định phương pháp định lượng amphotericin B trong thuốc tiêm đông khô liposome amphotericin B bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016

THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG AMPHOTERICIN B
TRONG THUỐC TIÊM ĐÔNG HÔ LIPOSOME AMPHOTERICIN B
BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Nguyễn Tuấn Quang*; Nguyễn Thái Sơn**; Phạm Thị Minh Huệ***
TÓM TẮT
Mục tiêu: thẩm định phương pháp định lượng amphotericin B (AmB) trong thuốc tiêm đông
khô liposome amphotericin B bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) nhằm góp phần tiêu
chuẩn hóa chất lượng sản phẩm. Đối tượng và phương pháp: thuốc tiêm đông khô liposome AmB
được bào chế tại Bộ môn Bào chế, Trường Đại học Dược Hà Nội. Tiến hành phân tích AmB
bằng phương pháp HPLC với cột: Phenomenex C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm), detector PDA,
bước sóng 407 nm, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích tiêm 10 µl, pha động: acetonitrile - natri
acetat 10 mM pH 4,0 (theo gradient thể tích). Kết quả: phương pháp đảm bảo tính đặc hiệu,
tính tương thích, tính tuyến tính, độ đúng, độ chính xác và có khoảng xác định từ 15 - 25
µg/ml. Áp dụng phương pháp để xác định hàm lượng AmB trong thuốc tiêm đông khô liposome
AmB là 50,07 ± 0,51 mg/lọ (100,15 ± 1,02% so với hàm lượng ghi trên nhãn). Kết luận: phương
pháp định lượng đảm bảo các yêu cầu và có thể sử dụng để định lượng AmB trong thuốc tiêm
đông khô liposome AmB.
* Từ khóa: Amphotericin B; Liposome; Thuốc tiêm đông khô; Sắc ký lỏng hiệu năng cao.

Validation of an Analytical Assay Method for Amphotericin B in
Amphotericin B Liposomal Lyophilized Powder for Injection by High
Performance Liquid Chromatography
Summary
Objectives: To validate the analytical assay method for amphotericin B in amphotericin B liposomal
lyophilized powder for injection by high performance liquid chromatography (HPLC) aiming to
standardize the quality of the products. Participants and methodology: Amphotericin B liposomal
lyophilized powder for injection produced by Department of Pharmaceutics, Hanoi University of
Pharmacy is analyzed using the HPLC system with the column Phenomenex C18 (250 x 4.6 mm,
5 µm), detector PDA, the wave length of 407 nm, the water flow speed of 1.0 ml/min, injection

volume of 10 µl, a mixture of acetonitrile - natri actetate 10 mM pH 4.0 (gradient volume) as mobile
phase. Results: The method ensures the specificity, compatibility, linearity, propriety, accuracy
and is approximately determined from 15 µg/ml to 25 µg/ml. As a result, the amount of amphotericin
B measured in amphotericin B liposomal lyophilized powder for injection is 50.07 ± 0.51 (mg/vial)
* Học viện Quân y
** Bệnh viện Quân y 103
*** Đại học Dược Hà Nội
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Tuấn Quang ()
Ngày nhận bài: 24/01/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 25/02/2016
Ngày bài báo được đăng: 01/03/2016

13


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016
(100.15 ± 1.02% of the amount written on the label). Conclusion: The method meets all the
requirements and can be used to measure the amount of amphotericin B in amphotericin B
liposomal lyophilized powder for injection.
* Key words: Amphotericin B; Liposome; Lyophilized powder for injection; High performance
liquid chromatography.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Amphotericin B là một kháng sinh chống
nấm, phổ rộng, đã được sử dụng từ rất
lâu chủ yếu dưới dạng tiêm tĩnh mạch
trong trường hợp nhi m nấm hệ thống.
Tuy nhiên, hạn chế của dược chất này là
không tan trong nước, nên sinh khả dụng
không cao và gây nhiều tác dụng phụ,
đặc biệt gây độc cho thận [1, 3]. Việc

nghiên cứu đưa hoạt chất AmB vào hệ
mang thuốc liposome để cải thiện sinh
khả dụng và làm giảm độc tính trên thận
của AmB là vấn đề có ý nghĩa khoa học
và thực ti n cao. Thuốc tiêm đông khô
liposome AmB đã được bào chế thành
công ở quy mô 30 lọ/mẻ với các chỉ tiêu
vật lý đạt yêu cầu của hệ mang thuốc nano.
Việc nghiên cứu định lượng AmB trong
thuốc tiêm đông khô liposome AmB là rất
quan trọng, góp phần xây dựng công thức
bào chế, cũng như tiêu chuẩn hóa chất
lượng sản phẩm. Để định lượng AmB, có
thể sử dụng phương pháp quang phổ hấp
phụ tử ngoại khả kiến (UV-Vis) hay xác
định hoạt lực thuốc kháng sinh bằng phương
pháp thử vi sinh vật [2]. Tuy nhiên, các
phương pháp này hoặc có độ chính xác
không cao hoặc yêu cầu điều kiện thí
nghiệm rất nghiêm ngặt. Vì vậy, trong bài
báo này chúng tôi: Thông báo kết quả
thẩm định phương pháp định lượng AmB
trong thuốc tiêm đông khô liposome AmB
bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao.

14

NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Nguyên liệu và thiết bị.

- Thuốc tiêm đông khô liposome AmB
được bào chế tại Bộ môn Bào chế, Trường
Đại học Dược Hà Nội, số lô NC 0315, hạn
sử dụng 03 - 2017.
- Hóa chất: acetonitril, methanol, axít
acetic, natri acetat trihydrat, nước cất pha
tiêm đạt tiêu chuẩn cho HPLC; chất chuẩn
AmB (Dr. Ehrenstorfer, Đức, 95%); các hóa
chất dung môi khác đạt tiêu chuẩn tinh khiết
phân tích.
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
Water e2695 (Mỹ) gồm hệ bơm 4 kênh
dung môi, autosampler, detector PDA, cột
phenomenex C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm).
- Dụng cụ: cân phân tích Mettler toledo
(độ chính xác 0,1 mg) và các dụng cụ
phân tích khác đạt tiêu chuẩn thí nghiệm.
2. Phƣơ g pháp ghi

cứu.

- Điều kiện sắc ký:
+ Cột: Phenomenex C18 (250 x 4,6 mm;
5 µm).
+ Detector UV tại bước sóng: 407 nm.
+ Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.
+ Thể tích tiêm: 10 µl.
+ Pha động: acetonitrile - natri acetat
10 mM pH 4,0 (theo gradient thể tích)
[4, 5].

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016
Thời gian
(phút)

Tốc độ
dòng
(ml/phút)

% đệm
natri
acetat

%
acetonitril

0,01

1,00

70,0

30,0

Tính hàm lượng (%) AmB trong chế phẩm
theo công thức:
St * ft * mc * HLc

4,00

1,00

40,0

60,0

8,00

1,00

20,0

80,0

9,00

1,00

60,0

40,0

* Dung dịch natri acetat 10 mM pH 4,0:
cân chính xác 0,2014 g natri acetat trihydrat
và 0,5111 g axít acetic bằng hòa tan trong
1.000 ml nước cất. Điều chỉnh dung dịch về
pH 4 (nếu cần), lọc qua màng lọc 0,45 µm.
- Phương pháp xử lý mẫu:
+ Mẫu chuẩn: cân chính xác 10,0 mg

AmB chuẩn hòa tan trong bình định mức
100 ml bằng methanol. Hút chính xác 2 ml
dung dịch trên cho vào bình định mức
10 ml, thêm methanol vừa đủ đến vạch,
lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.
+ Mẫu thử: lấy 1 lọ chế phẩm thêm
10 ml nước cất vô khuẩn để pha tiêm, lắc
đều để thu được hỗn dịch liposome. Chuyển
sang bình định mức 250 ml, thêm 50 ml
hỗn hợp dung môi methanol-cloroform
(3/1, tt/tt), tiếp tục pha loãng đến vạch, lắc
đều. Hút chính xác 1 ml dung dịch trên cho
vào bình định mức 10 ml, thêm methanol
vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng
lọc 0,45 µm.
+ Mẫu trắng (placebo): lấy 1 lọ placebo
thêm 10 ml nước cất vô khuẩn để pha tiêm,
lắc đều. Chuyển sang bình định mức 250 ml,
thêm 50 ml hỗn hợp dung môi methanolcloroform (3/1, tt/tt), tiếp tục pha loãng
đến vạch, lắc đều. Hút chính xác 1 ml dung
dịch trên cho vào bình định mức 10 ml,
thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều.
Lọc qua màng lọc 0,45 µm.

H (%) =

x 100%
Sc * fc * Mn

Trong đó:

H (%): hàm lượng % AmB trong chế
phẩm.
St, Sc: diện tích píc của mẫu thử và
mẫu chuẩn.
ft, fc: hệ số pha loãng của mẫu thử,
mẫu chuẩn.
mc: khối lượng chất chuẩn (mg).
HLc: hàm lượng tinh khiết của chất
chuẩn (%).
Mn: hàm lượng hoạt chất ghi trên nhãn
(mg).
- Thẩm định phương pháp: với các tiêu
chí về tính đặc hiệu, tính thích hợp hệ
thống, tuyến tính, độ đúng, độ chính xác
và khoảng xác định [4].
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
. Tí h đặc hiệu.
Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn, mẫu thử
và mẫu trắng. Sắc ký đồ của các mẫu
trên được thể hiện ở hình 1, hình 2 và
hình 3. Kết quả trên sắc ký đồ (SKĐ) cho
thấy: mẫu thử cho píc của AmB có thời
gian lưu tương ứng với thời gian lưu của
píc AmB trong mẫu chuẩn. Píc của AmB
trong mẫu thử cân đối, tách hoàn toàn
khỏi píc tạp. Hệ số chồng phổ UV của píc
AmB thu được trong SKĐ của dung dịch
thử và phổ UV của píc tương ứng trong
SKĐ của dung dịch chuẩn xấp xỉ bằng 1
(hệ số chồng phổ = 0,9999). Đồng thời,

mẫu trắng không thấy xuất hiện píc có
thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu
của AmB trong mẫu chuẩn và mẫu thử.

15


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016
Diện tích píc
(mAU.s)

Thời gian
(phút)

Hình 1: SKĐ của mẫu trắng.
Diện tích píc
(mAU.s)

Thời gian
(phút)

Hình 2: SKĐ của mẫu chuẩn AmB.
Diện tích píc
(mAU.s)

Thời gian
(phút)

Hình 3: SKĐ của AmB trong mẫu thử.
16

Thời gian
(phút)


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016

2. Tính thích hợp.
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch AmB chuẩn có nồng độ khoảng 25 µg/ml vào
hệ thống sắc ký.
Bảng 1: Kết quả đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký.
Stt

Thời gia

ƣu của píc (s)

Diện tích píc (mAU.s) Hệ số đối xứng

Số đĩa ý thu ết

1.

5,606

1309969

1,18

45987

2.

5,588

1309678

1,21

44845

3.

5,594

1309601

1,18

42653

4.

5,582

1296938

1,19

44628

5.

5,589

1299925

1,21

43620

6.

5,591

1301446

1,20

43413

Trung bình

5,592

1304593

1,20

44191

RSD %

0,14

0,45

Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích píc của các mẫu chuẩn AmB
lần lượt là 0,14% và 0,45%. Hệ số đối xứng của píc AmB là 1,20 (đạt yêu cầu < 2),
số đĩa lý thuyết là 44141 (đạt yêu cầu không dưới 1000). Như vậy, phương pháp phân
tích hoàn toàn phù hợp với hệ thống sắc ký.
3. Tính tuyến tính.
Pha 1 dãy các dung dịch AmB chuẩn trong pha động có nồng độ từ 10 - 40 µg/ml.
Tiến hành sắc ký các dung dịch theo điều kiện sắc ký đã nêu.
Bảng 2: Kết quả khảo sát tính tuyến tính của phương pháp định lượng AmB.
Stt

Nồ g độ AmB (µg/ml)

Diện tích píc (mAU.s)

1

10

535148

2

15

793702

3

20

1055328

4

25

1309969

5

30

1583122

6

35

1863179

7

40

2104649

Phương trình hồi quy: y = 52680x + 3719. Hệ số tương quan (r): 0,999
Hệ số góc:

52680

Hệ số chắn:

3719

%Y:

0,352

17


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016
Diện tích píc
(mAU.s)

Nồng độ AmB (µg/ml)

Hình 4: Đồ thị biểu di n tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích píc AmB.
Trong khoảng nồng độ khảo sát, có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng
độ AmB và diện tích píc với hệ số tương quan r ≈ 1. Tỷ lệ (%) hệ số chắn Y tại nồng độ
20 µg/ml là 0,352% (đạt yêu cầu < 2%).
4. Độ đú g.

Tiến hành bằng phương pháp thêm chuẩn vào mẫu trắng để thu được các dung
dịch mẫu tự tạo có lượng AmB chuẩn tương ứng 75%, 100% và 125% hàm lượng ghi
trên nhãn (37,5 mg; 50 mg và 62,5 mg). Tiến hành sắc ký các dung dịch mẫu tự tạo (tại
mỗi mức nồng độ, thực hiện 3 mẫu độc lập) và mẫu chuẩn có nồng độ tương ứng, mỗi
mẫu tiêm 01 lần. Ghi lại sắc ký đồ, đáp ứng của píc và xác định tỷ lệ (%) AmB thu hồi.
Bảng 3: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng AmB.
Tỷ lệ

Stt

Tỷ lệ so với
đị h ƣợng
(%)

Mẫu trắng
(lọ)

Lƣợng chuẩn AmB
thêm vào (mg)

Diện tích píc
(mAU.s)

Lƣợng AmB
tìm lại (mg)

1

75

1

36,20

676541

36,53

100,94

2

75

1

36,20

679798

36,71

101,42

3

75

1

36,20

678665

36,65

101,26

thu hồi
(%)

Diện tích píc chuẩn (mAU.s): 676848

18

TB:

101,21

RSD (%):

0,24

4

100

1

48,26

911535

48,25

99,97

5

100

1

48,26

924120

48,91

101,35

6

100

1

48,26

922721

48,84

101,20


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016
Diện tích píc chuẩn (mAU.s): 920755
TB:

100,84

RSD (%):

0,75

7

125

1

60,33

1184609

60,15

99,72

8

125

1

60,33

1201927

61,03

101,17

9.

125

1

60,33

1195221

60,69

100,61

Diện tích píc chuẩn (mAU.s): 1199666
TB:

100,50

RSD (%):

0,73

X (%) (n = 9): 100,85
RSD (%) (n = 9): 0,62

Phương pháp có độ thu hồi AmB ở mỗi mức nồng độ đều nằm trong giới hạn cho
phép là 98 - 102%, với RSD của 9 kết quả là 0,62% (nằm trong giới hạn < 2%). Do đó,
phương pháp đạt yêu cầu về độ đúng.
5. Độ chính xác.
* Độ lặp lại:
Độ lặp lại của phương pháp định lượng được xác định khi định lượng 6 lần của một
mẫu thử ở điều kiện sắc ký đã nêu với diện tích píc của mẫu chuẩn là 1055328.
Bảng 4: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp định lượng AmB (n = 6).
Lọ

Diện tích píc (mAU.s)

Kết quả đị h ƣợng (%)

1

1063779

100,55

2

1078622

101,95

3

1060442

100,23

4

1050567

99,30

5

1051289

99,37

6

1052519

99,48

X

100,15

RSD %

1,02

Phương pháp có độ lặp lại cao với giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD = 1,02%
(đạt yêu cầu < 2%).
* Độ chính xác trung gian:
Độ chính xác trung gian của phương pháp định lượng được xác định như độ lặp lại,
nhưng được tiến hành khác ngày và không cùng kiểm nghiệm viên.

19


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016

Bảng 5: Kết quả đánh giá độ chính xác trung gian của phương pháp định lượng AmB.

Stt

Kiểm nghiệm viên 1

Kiểm nghiệm viên 2

Diện tích píc chuẩn: 1055328

Diện tích píc chuẩn: 1005747

Diện tích píc
(mAU.s)

Kết quả định lượng
(%)

Diện tích píc
(mAU.s)

Kết quả định lượng
(%)

1

1063779

100,55

1049223

100,10

2

1078622

101,95

1050606

100,23

3

1060442

100,23

1051256

100,29

4

1050567

99,30

1040455

99,26

5

1051289

99,37

1060356

101,16

6

1052519

99,48

1054064

100,56

Trung bình

100,15

100,27

RSD %

1,02

0,62

Kết quả (%) định lượng trung bình (n = 12): 100,21 RSD (%) (n = 12): 0,80

6. Khoả g xác định.
Trong phần xác định độ đúng, độ tuyến
tính ở các mức nồng độ 75%, 100% và 125%

so với hàm lượng AmB ghi trên nhãn đảm
bảo độ đúng, độ lặp lại và độ tuyến tính.
Vì vậy, khoảng xác định của phương pháp
định lượng từ 15 - 25 µg/ml.
7. Kết quả đị h ƣợng AmB trong
thuốc ti m đô g hô liposome-AmB.
Từ phương pháp đã thẩm định, tiến
hành xác định hàm lượng AmB trong
thuốc tiêm đông khô liposome AmB. Kết
quả cho thấy: hàm lượng AmB trong
thuốc tiêm đông khô liposome AmB là
50,07 ± 0,51 (mg/lọ) (n = 6).
KẾT LUẬN
Đã thẩm định được phương pháp định
lượng AmB trong thuốc tiêm đông khô
liposome AmB bằng HPLC. Phương pháp
có tính đặc hiệu và tính thích hợp cao với
hệ thống sắc ký, đảm bảo tính tuyến tính,
độ đúng và độ chính xác theo yêu cầu

20

phân tích, khoảng xác định từ 15 - 25 µg/ml.
Hàm lượng AmB trong thuốc tiêm đông
khô liposome AmB là 50,07 ± 0,51 (mg/lọ)
(đạt 100,15 ± 1,02% so với hàm lượng
ghi trên nhãn).
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bộ môn Hóa dược, Trường Đại học Dược
Hà Nội. Hóa dược - tập 2. NXB Y học. 2007,

tr.195-196.
2. Bộ Y tế. Dược điển Việt Nam IV. NXB
Y học. 2009, tr.91-92.
3. Bộ Y tế. Dược thư Quốc gia Việt Nam.
NXB Y học. 2002, tr.146-148.
4. Nguyễn Minh Đức. Sắc ký lỏng hiệu
năng cao và một số ứng dụng vào nghiên
cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu và
hợp chất tự nhiên. NXB Y học Thành phố
Hồ Chí Minh. 2006, tr.138,148-149.
5. Italia JL et al. High-performance liquid
chromatographic analysis of amphotericin B in
rat plasma using α-naphthol as an internal
standard. Analytica Chimica Acta. 2009, 634 (1),
pp.110-114.