luận văn thạc sĩ nghiên cứu đánh giá và xây dựng quy trình nhân giống cho loài sâm núi dành (callerya speciosa (champ ex benth) schot) phân bố trên địa bàn tỉnh bắc giang
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.38 MB, 86 trang )
BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Nguyễn Thanh Loan
ĐỀ TÀI: “ NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH
NHÂN GIỐNG CHO LOÀI SÂM NÚI DÀNH (CALLERYA
SPECIOSA (CHAMP.EX BENTH) SCHOT) PHÂN BỐ TRÊN ĐỊA
BÀN TỈNH BẮC GIANG”
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội - 2019
BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Nguyễn Thanh Loan
ĐỀ TÀI: “ NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH
NHÂN GIỐNG CHO LOÀI SÂM NÚI DÀNH (CALLERYA SPECIOSA
(CHAMP.EX BENTH) SCHOT) PHÂN BỐ TRÊN ĐỊA BÀN
TỈNH BẮC GIANG”
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :
Hướng dẫn 1: TS. Đồng Thị Kim Cúc
Hướng dẫn 2: TS. Nguyễn Thị Thanh Hương
Hà Nội - 2019
Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan đã trực tiếp thực hiện các nghiên cứu trong luận văn
này. Mọi kết quả thu được nguyên bản, không chỉnh sửa hoặc sao chép từ các
nghiên cứu khác. Các số liệu chưa từng được công bố trong luận án, luận văn
nào trước đây.
Mọi dữ liệu trích dẫn tham khảo trong luận văn đều được thu thập và sử
dụng từ nguồn dữ liệu mở hoặc với sự đồng ý của tác giả.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên!
Tác giả
Nguyễn Thanh Loan
i
Lời cảm ơn
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể các thầy cô và các cán bộ công tác tại
Học viện Khoa học và Công nghệ đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho
tôi trong suốt quá trình học tập tại Học viện.
Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Đồng Thị
Kim Cúc và TS. Nguyễn Thị Thanh Hương đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ cho
tôi trong quá trình công tác cũng như trong thời gian học tập, nghiên cứu và
thực hiện luận văn này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể các cán bộ, anh chị
em, bạn bè, đồng nghiệp trong Trung Tâm thực nghiệm Sinh học Nông nghiệp
Công nghệ cao thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp đã giúp đỡ và đóng góp
những ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận văn này.
Luận văn này được thực hiện bởi sự cho phép của Viện Di truyền Nông
nghiệp, Trung tâm Thực nghiệm sinh học Nông nghiệp Công nghệ cao và được
thực hiện từ nguồn kinh phí đề tài “Nghiên cứu đánh giá, bảo tồn nguồn gen cây
Sâm Núi Dành phân bố trên địa bàn Tỉnh Bắc Giang”
Luận văn có sự động viên và giúp đỡ của gia đình tôi.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 9 tháng 10 năm 2019
Tác giả
Nguyễn Thanh Loan
ii
Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt
Viết đầy đủ
Viết tắt
DNA
Deoxyribonucleic acid
PCR
Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi
polymerase)
Cs
Cộng sự
BA
Benzyladenine (6-Benzyladenine)
CT
Công thức
ĐC
Đối chứng
Ki
Kinetin
IBA
Indole-3-butyric acid
MS
Murashige và Skoog (1962)
NAA
Naphthaleneacetic acid
TB
Trung bình
TN
Thí nghiệm
CV%
Hệ số biến động (Correlation ò Variance)
LSD0,05
Sai khác tối thiểu có ý nghĩa ở P = 0,05
(Leant Significant Difference)
MTN
L
Mg
Môi trường nền
lít
miligram
iii
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
1.TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI ................................................................... 1
2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI .............................................................................. 2
3. Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI ................................................................................ 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 3
1.1.NGUỒN GỐC VÀ ĐẶC ĐIỂM CỦA SÂM NÚI DÀNH ............................. 3
1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI CALLERYA ... 5
1.3.TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI THỰC VẬT
DỰA TRÊN CHỈ THỊ PHÂN TỬ ...................................................................... 6
1.3.1. Tổng quan về trình tự bảo tồn trong các bộ gene thực vật .................... 6
1.3.2. Bộ gene lục lạp ...................................................................................... 7
1.3.3. Các trình tự bảo tồn ở bộ gene trong nhân ............................................ 7
1.3.4. Kết quả nghiên cứu ADN mã vạch trong kiểm định giống nhân sâm. .. 9
1.4. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH TRÊN CÂY SÂM
NGỌC LINH .................................................................................................... 10
1.5. TÌNH HÌNH NHÂN GIỐNG LOÀI CELLERYA SPECIOSA CHAMP ... 11
1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ......................................................11
1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ........................................................12
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 14
2.1.ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THƠI GIAN NGHIÊN CỨU . 14
2.1.1.Đối tượng ..............................................................................................14
2.1.2.Vật liệu nghiên cứu ...............................................................................14
2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ........................................................14
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ...................................................................... 14
2.2.1. Nội dung 1: Thu thập, lấy mẫu và phân loại chính xác loài Sâm Núi
Dành bằng marker phân tử trong số các mẫu Sâm thu thập được trên địa bàn
tỉnh Bắc Giang......................................................................................................14
2.2.2. Nội dung 2: Phân tích định tính một số nhóm chất trong củ Sâm Núi
Dành 15
2.2.3. Nội dung 3: Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống vô tính cho
loài Sâm Núi Dành bằng phương pháp giâm hom và phương pháp nuôi cấy invitro 15
2.3.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................... 15
2.3.1.Phương pháp thu mẫu và lấy mẫu ngoài thực địa.................................15
2.3.2. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền của các giống/loài bằng các
marker đặc trưng-Barcode....................................................................................16
iv
2.3.3. Phương pháp phân tích định tính một số nhóm hoạt chất có dược tính
trong loài Sâm Núi Dành......................................................................................19
2.3.4. Phương pháp nhân giống vô tính cho loài Sâm Núi Dành ..................20
2.3.5. Phương pháp bố trí thí nghiệm ............................................................25
2.3.6.Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................25
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ......................... 26
3.1. THU THẬP, LẤY MẪU VÀ PHÂN LOẠI CHÍNH XÁC LOÀI SÂM NÚI
DÀNH BẰNG MARKER PHÂN TỬ TRONG SỐ CÁC MẪU SÂM THU
THẬP ĐƯỢC TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH BẮC GIANG. ..................................... 26
3.1.1. Thu thập, lấy mẫu một số loài Sâm trên địa bàn tỉnh Bắc Giang ........26
3.1.2. Nghiên cứu xác định các marker đặc trưng-Barcode (trình tự ITS của
gen ribosom nhân) để nhận dạng chính xác loài Sâm Núi Dành. ........................28
3.2. PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH MỘT SỐ NHÓM CHẤT TRONG CỦ SÂM NÚI
DÀNH .............................................................................................................. 32
3.3. NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CHO LOÀI SÂM NÚI DÀNH BẰNG
PHƯƠNG PHÁP GIÂM HOM VÀ PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN-VITRO..36
3.3.1. Phương pháp nhân giống loài Sâm Núi Dành tại vùng bản địa bằng các
phương pháp giâm hom ........................................................................................36
3.3.2. Xây dựng quy trình nhân giống vô tính cho loài Sâm Núi Dành bằng
phương pháp nuôi cấy in-vitro .............................................................................40
3.3.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại giá thể đến tỷ lệ sống của cây
Sâm Núi Dành in-vitro ngoài vườn ươm .............................................................51
CHƯƠNG 4 . KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................... 54
4.1. KẾT LUẬN ............................................................................................... 54
4.2. KIẾN NGHỊ .............................................................................................. 55
v
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2. 1. Danh sách các mồi ITS .......................................................................14
Bảng 3.1. Danh sách kí hiệu 4 mẫu Sâm .............................................................28
Bảng 3.2. Thành phần bốn loại nucleotide của các mẫu Sâm nghiên cứu ...........30
Bảng 3. 3. Hệ số tương đồng giữa các mẫu Sâm nghiên cứu ..............................31
Bảng 3.4 . Kết quả phân tích định tính mẫu Sâm Núi Dành dưới 3 năm tuổi ....32
Bảng 3.5. Kết quả phân tích định tính mẫu Sâm Núi Dành từ 3-5 năm tuổi .......33
Bảng 3.6. Kết quả phân tích định tính mẫu Sâm Núi Dành trên 5 năm tuổi .......33
Bảng 3.7. Một số hình ảnh của phản ứng định tính một số nhóm chất................34
Bảng 3. 8. Ảnh hưởng của IBA tới khả năng hình thành rễ hom giâm ...............36
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của giá thể tới phát triển cây hom Sâm Núi Dành............37
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đến khả năng
tạo mẫu sạch bệnh ................................................................................................40
Bảng 3. 11. Ảnh hưởng của Ki đến khả năng tái sinh chồi..................................42
Bảng 3. 12. Ảnh hưởng của BA và IBA đến khả năng nhân nhanh chồi Sâm Núi
Dành .....................................................................................................................45
Bảng 3. 13. Ảnh hưởng của MS và nồng độ NAA đến sự hình thành rễ ............46
Bảng 3. 14. Ảnh hưởng của ½MS và nồng độ NAA đến sự hình thành rễ ........46
Bảng 3. 15. Ảnh hưởng của môi trường MS và IBA đến sự hình thành rễ .........47
Bảng 3. 16. Ảnh hưởng của môi trường ½MS và IBA đến sự hình thành rễ ......48
Bảng 3. 17. Ảnh hưởng của than hoạt tính tới chất lượng bộ rễ ..........................50
Bảng 3. 18. Ảnh hưởng của giá thể tới phát triển cây Sâm Núi Dành in-vitro....51
Bảng 3.19. Kết quả Blast trình tự các nucleotid vùng gen ITS của mẫu S1 trong
NCBI ....................................................................................................................64
Bảng 3.20. Kết quả Blast trình tự các nucleotid vùng gen ITS của mẫu S2 trong
NCBI ....................................................................................................................65
Bảng 3.21. Kết quả Blast trình tự các nucleotid vùng gen ITS của mẫu S3 trong
NCBI ....................................................................................................................66
Bảng 3.22. Kết quả Blast trình tự các nucleotid vùng gen ITS của mẫu S4 trong
NCBI ....................................................................................................................67
vi
DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1. a) Cây Sâm Núi Dành , b) Cây Sâm Đắng ..........................................26
Hình 3.2. Củ Sâm Núi Dành và củ Sâm Ngọt (Sâm Nam) ..................................27
Hình 3.3. Các dạng lá Sâm thu tại tỉnh Bắc Giang ..............................................27
Hình 3.4. a) Quả Sâm Núi Dành b) Quả Sâm Đắng ..........................................27
Hình 3. 5. Hom Sâm Núi Dành được xử lý qua các công thức thí nghiệm .........37
Hình 3.6. Động thái tăng trưởng số chồi/hom .....................................................38
Hình 3.7. Động thái tăng trưởng chiều dài của chồi hom giâm ...........................39
Hình 3.8. Động thái tăng trưởng số lá/chồi ..........................................................39
Hình 3. 9. Mẫu Sâm Núi Dành sau 2 tuần trên môi trường tái sinh ....................42
Hình 3. 10. Chồi Sâm Núi Dành trên các CT môi trường nhân nhanh ................44
Hình 3. 11. Ảnh hưởng của môi trường và nồng độ các hoocmon tăng trưởng đến
khả năng hình thành rễ .........................................................................................49
Hình 3. 12. Chồi Sâm ra rễ trên môi trường có bổ sung 1 mg/l IBA + 0,4 mg/l
THT ......................................................................................................................50
Hình 3. 13. Cây Sâm Núi Dành in-vitro hoàn chỉnh ............................................51
Hình 3.14. Cây Sâm Núi Dành in-vitro ra cây trên các công thức giá thể ..........52
vii
MỞ ĐẦU
1.TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Ở Việt Nam, trong tổng số 3.948 loài cây thuốc có khoảng 87,1% là các
loài mọc tự nhiên, tập trung chủ yếu ở các quần xã rừng, số còn lại là cây
trồng. Mỗi năm ngành Y dược tiêu thụ 30-50 tấn dược liệu các loại phục vụ
chữa bệnh hoặc làm nguyên liệu cho công nghiệp dược và xuất khẩu. Trong
số đó, trên 2/3 lượng dược liệu được khai thác từ nguồn cây thuốc mọc tự
nhiên hoặc trồng trong nước, vì thế nhu cầu cây thuốc trong nước là rất lớn.
Năm 2016, Viện Dược liệu đã công bố tổng số 5117 loài cây thuốc đã được
phát hiện [1].
Sâm Núi Dành là một loài cây thuốc phân bố ở chân Núi dành thuộc
huyện Tân Yên, tỉnh Bắc Giang. Hiện nay cho thấy do nhu cầu sử dụng dược
liệu tăng mạnh trong thời gian gần đây nên Sâm Núi Dành bị khai thác ồ ạt,
dẫn đến nguồn nguyên liệu đang trở nên cạn kiệt. Theo Sách đỏ Việt Nam
(2007), loài này được xếp ở mức độ sẽ bị nguy cấp bởi nơi cư trú của chúng
bị thu hẹp do rừng thường xuyên bị chặt phá; loài bị khai thác nhiều để làm
thuốc có thể dẫn đến cạn kiệt [2]. Một nguyên nhân khác dẫn đến sự cạn kiệt
nguồn gen quý này là do cây Sâm Núi Dành rất khó nhân giống. Hạt nảy
mầm rất khó nảy mầm trong điều kiện tự nhiên, vùng phân bố của Sâm không
đa dạng. Việc bảo tồn loài sâm quý này đang ở mức báo động, cần sự chung
tay góp sức của các cấp, ngành và người dân địa phương.
Một trong những mục tiêu quan trọng của đề tài là nhân giống vô tính được
loài Sâm Núi Dành nhằm lưu giữ, bảo tồn nguồn gen quý của loài Sâm này do
nguy cơ bị tuyệt chủng do khai thác ồ ạt. Việc đáp ứng nhanh và bền vững
nguồn giống Sâm Núi Dành có chất lượng tốt đang là yêu cầu cấp bách.
Nguồn cung cấp cây giống hiện nay chủ yếu bằng phương pháp nhân giống
truyền thống: giâm cành, gieo hạt nhưng hệ số nhân giống đạt rất thấp, hạt
gần như không nảy mầm ngoài tự nhiên. Để cải thiện hệ số nhân giống cây
Sâm này, chúng tôi đã nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cho loài
Sâm Núi Dành. Nghiên cứu này được thực hiện nhằm thiết lập quy trình nhân
giống vô tính loài Sâm Núi Dành có nguồn gốc từ tỉnh Bắc Giang. Nuôi cấy
1
mô tế bào thực vật là một trong những công cụ hữu hiệu cho việc nhân giống
và bảo tồn này. Nó cho phép trong thời gian ngắn nhất, nhân nhanh với quy
mô lớn và cây có độ đồng đều cao, sạch bệnh và giữ được đặc tính di truyền
của bố mẹ.
Xuất phát từ thực tiễn đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên
cứu, đánh giá và xây dựng quy trình nhân giống cho loài Sâm Núi Dành
(Callerya speciosa (Champ. ex Benth) Schot) phân bố trên địa bàn tỉnh
Bắc Giang”.
2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
- Nghiên cứu, điều tra, thu thập các mẫu Sâm trên địa bàn tỉnh Bắc
Giang. Xác định chính xác tên loài Sâm Núi Dành bằng phương pháp sinh
học phân tử và xác định thành phần một số hoạt chất trong củ Sâm Núi Dành
ở các độ tuổi khác nhau.
- Xây dựng được quy trình nhân giống cho loài Sâm Núi Dành bằng
phương pháp giâm hom và công nghệ in-vitro.
3. Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI
- Đề tài cung cấp các dẫn liệu khoa học bước đầu về nghiên cứu xây
dựng quy trình nhân giống vô tính cho loài Sâm Núi Dành.
- Các kết quả nghiên cứu của đề tài cũng là tài liệu tham khảo trong việc
nghiên cứu, giảng dạy có giá trị cho lĩnh vực công nghệ sinh học và nhân
giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.
2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.NGUỒN GỐC VÀ ĐẶC ĐIỂM CỦA SÂM NÚI DÀNH
Sâm Núi Dành là một đối tượng chưa được nghiên cứu nhiều ở Việt
Nam và trên thế giới. Vì vậy, việc tiếp cận các kết quả nghiên cứu còn hạn
chế, việc định hướng các tài liệu tham khảo trong và ngoài nước cũng khó
khăn.
Sâm Núi dành được biết đến qua một số bài báo của tác giả Trần Đình
Dũng, Trung tâm Khoa học Công nghệ và Môi trường huyện Tân Yên, tỉnh
Bắc Giang. Theo bài viết của tác giả, trong sách “Đại Nam nhất thống chí”,
có ghi: “Tên nỏ sản xuất tại Yên Thế. Sâm Nam sẵn ở đỉnh núi Chung Sơn.
Cỏ thi cũng có ở Chung Sơn”. Núi Chung Sơn được nhắc tới đó là Núi Dành,
nay phần lớn thuộc xã Liên Chung và phần còn lại thuộc địa phận xã Việt
Lập, huyện Tân Yên. Những câu chuyện quanh loài Sâm quý này được người
dân sinh sống dưới chân Núi dành kể lại. Theo ông Nguyễn Văn Được, 72
tuổi ở thôn Hậu, nhà ngay dưới chân Núi dành cho biết: “Núi dành xưa kia
toàn cây de với giàng giàng, mỗi lần Lý trưởng kiếm được củ sâm thì mừng
lắm, hiện ở góc vườn nhà tôi còn một khóm sâm, mỗi năm nó chỉ ra một đốt
từ đó mọc rễ và ra củ nên củ không lớn, tôi cũng đã từng nhân thử giống Sâm
Núi dành nhưng không thành công, và cũng đã nhiều lần thử du nhập những
giống sâm khác về trồng nhưng không sống được có lẽ do thời tiết và thổ
nhưỡng không hợp”. Ông Nguyên Khắc Lư, 62 tuổi, ở thôn Hậu, xã Liên
Chung tâm sự, gần hai chục năm trước ông nhận đất trồng rừng ở chân Núi
dành. Trong một lần cuốc đất thấy bật lên những củ nhỏ, mùi thơm, nếm thử
thấy ngọt mát, vốn gia đình có nghề làm thuốc Đông y nên ông Lư biết mình
gặp may khi tìm thấy gốc Sâm Núi dành và ông giữ gìn từ đó cho tới bây
giờ. Theo ông Lư, loại sâm này phải trên 10 năm tuổi dùng mới hữu dụng.
Những căn bệnh thông thường như ho cảm sốt, đau đầu, nhất là đối với trẻ
nhỏ dùng chút ít là khỏi [3].
Bằng phương pháp mô tả đặc điểm hình thái, các tác giả Đồng Thị Kim
Cúc và cộng sự, đã xác định được Sâm Núi Dành thuộc họ đậu (Fabaceae),
chi Callerya có tên khoa học Callerya speciosa (Champ.) Schot., [4].
3
Đặc điểm nông sinh học:
Thân: Sâm Núi Dành thuộc dạng cây dây leo hoặc trườn, thường dài 4 5 m hoặc hơn, cành non có lông màu bạc;
Rễ củ nạc, có lớp vỏ bên ngoài hơi cứng, bên trong lõi màu vàng nhạt,
mùi thơm dịu và vị ngọt mát.
Lá kép lông chim lẻ, trục chính của lá dài 6-15 cm, mang 3-7 lá chét; lá
chét hình bầu dục dài hay trái xoan, cỡ 3-8 x 1-3 cm, 2 mặt có lông tơ màu
trắng, gân bên có 5-6, mặt trên xanh thẫm, mặt dưới lá xanh nhạt.
Hoa: Cụm hoa chùm, mọc ở đầu cành hay nách lá, dài đến 30 cm,
cuống hoa và đài đều có lông nhung trắng. Hoa to, mọc đơn độc trên đốt trục
cụm hoa, dài 2,5-3 cm. Đài hình chuông, 5 mảnh dính với nhau, cỡ 9 x 12
cm, mặt ngoài có lông, mép có 4 răng; tràng 5 cánh không đều nhau, tiền khai
hoa cờ: cánh cờ (ở trên) lớn nhất, có màu sắc đẹp hơn và ở ngoài cùng, 2
cánh bên nhỏ hơn, trong cùng là 2 cánh thìa dính lại với nhau ở đáy tạo thành
cấu trúc tương tự như cái thuyền con mang kèm nhị và nhụy.
Cánh hoa màu trắng ngà, cánh cờ không có lông, 2 bên gốc có cục chai.
Nhị 10, 9 chiếc dính lại với nhau ở phần chỉ nhị thành 1 bó bao quanh nhụy, 1
chiếc rời. Bầu nhụy lớn, 1 ô, mang 2 dãy noãn, khi phát triển được sẽ tạo ra
quả. Bầu hình thuôn, dài bằng nhị.
Quả đậu, dẹp, cỡ 9-18 x 1,2-1,6 x 0,7-0,8 cm, có lông nâu phủ dầy. Hạt
2-3, hình trứng, cỡ 1 cm.
Củ sâm có lớp vỏ bên ngoài hơi cứng, bên trong lõi màu vàng nhạt,
mùi thơm dịu và có vị hơi ngọt.
Sinh học, sinh thái: Mùa ra hoa tháng 6-8, quả tháng 9-12 [4].
Giá trị sử dụng: Rễ củ được đào ở những cây trên 1 năm tuổi, phơi khô,
thái mỏng, tẩm nước gừng hoặc mật ong, sao vàng dùng làm thuốc; có tác
dụng trị đau vùng lưng, khớp, thông kinh hoạt lạc, bổ nhuận phế, chữa cơ thể
suy nhược, kém ăn, ho nhiều đờm, nhức đầu, bí tiểu tiện [5].
4
1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI CALLERYA
Ting Yin và cộng sự đã phân lập được flavonoid millettiaspecoside A,
millettiaspecoside B, millettiaspecoside C, millettiaspecoside
D,
khaephuoside B, seguinoside K, ablbrissinoside B từ phân đoạn n-butanol
của dịch chiết cồn củ Callerya speciosa (Champ.) [6], [7].
Zong XK và cộng sự đã phân lập được thêm 5 chất từ dịch chiết cồn
95o củ Callerya speciosa: Isoliquitigenin, maackiain, pterocarpin,
medicarpin, homopterocapain [8].
Ping Ding và cộng sự đã phân lập được thêm 13 chất từ phân đoạn
ether và ethyl acetat dịch chiết củ M. speciosa: docosanoic acid, tetracosane,
octadecane, hexacosanoic acid, β-sitosterol acetate, β-sitosterol, syringin,
maackiain, ormononetin, ψ-baptigenin, rotundic acid, pedunculoside và
daucosterol. Trong đó có β-sitosterol acetate, syringin, ψ-baptigenin,
rotundic acid và pedunculoside là những chất lần đầu tiên được công bố có
mặt trong cây [9].
Wang Cheng – wen đã định lượng được hàm lượng flavonoid tổng
trong dịch chiết chloroform rễ củ Millettia speciosa lên đến 5,52 mg/g dược
liệu [10].
Jun Cheno và cộng sự đã phân lập được 3 isoflavon glycosid từ thân
loài Callerya nitida (Millettia nitida var. hirsutissima) gồm: formononetin 7O-b-D-(6-ethylmalonyl)- glucopyranoside (hirsutissimiside A); 5Omethylgenistein 7-O-a-L- rhamnopyranosyl-(1→6)-b-D-glucopyranoside
(hirsutissimiside B); retusin 7,8-di- O-b-Dglucopyranoside (hirsutissimiside
C) [11].
Ito Chihiro và cộng sự đã phân lập được các isoflavonoid từ dịch
chiết aceton của thân và hạt loài Callerya atropurpurea (Millettia
atropurpurea) gồm: isoformonotein, sayanedine, prunetin, formonotein,
auriculasin, millepurone, vestitol và millepurpan [12].
Fang Song-Chwan và cộng sự đã phân lập được 6 flavonoid từ thân
loài Callerya reticulata var. reticulata (Millettia reticulata Benth.) gồm: (-)
epicatechin; narigenin; 5,7,3’,5’- tetrahydroxy flavone; formononetin;
5
isoliquirtigenin và genistein [13].
Theo Đỗ Tất Lợi, loài M. speciosa có chứa tinh bột và alkaloid [14]
1.3.TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI THỰC
VẬT DỰA TRÊN CHỈ THỊ PHÂN TỬ
1.3.1. Tổng quan về trình tự bảo tồn trong các bộ gene thực vật
Hệ thống hóa là quá trình thăm dò, mô tả và giải thích tính đa dạng của
thế giới sinh vật. Vào năm 1758, Linnaeus đã xây dựng hệ thống phân loại
mang tính thứ tự trước khi phát triển học thuyết tiến hóa. Sự xuất hiện và phát
triển của các kỹ thuật phân tử mà đặc biệt là phản ứng chuỗi polymer hóa –
PCR [15] đã hình thành nên một lượng lớn các dữ liệu sẵn sàng cho việc giải
trình tự DNA và các kỹ thuật làm nảy sinh đặc trưng nhận dạng DNA. Nhiều
dạng đặc điểm mang tính thông tin, đặc biệt là các trình tự DNA đã được ứng
dụng trong nghiên cứu mối quan hệ phát sinh và quá trình tiến hóa ở thực vật.
Các thực vật bậc cao mang trong nó ba bộ gene: bộ gene trong nhân, bộ gene
ty thể và bộ gene lạp thể. Tỷ lệ thay thế các nucleotide ở các bộ gene này xảy
ra không đồng đều. Tỷ lệ thay thế các nucleotide ở mỗi bộ gene đã được đánh
giá thông qua việc quan sát các thay thế nucleotide ở hàng loạt thực vật một
và hai lá mầm [16]. Bộ gene ty thể có mức độ thay thế nucleotide thấp nhất,
trung bình khoảng (0,2 - 1,1) × 10-9 thay thế cho một vị trí trong một năm. Bộ
gene lạp thể có mức độ thay thế nhanh hợn chút ít, khoảng (1,1 – 2,9) × 10-9
thay thế cho một vị trí trong một năm. Trái lại, bộ gene trong nhân có tỷ lệ
thay thế nucleotide nhanh hơn gấp 150 lần so với bộ gene ty thể (đến 31,5 ×
10-9 thay thế cho một vị trí trong một năm. Nghiên cứu đánh giá về tỷ lệ thay
thế nucleotide dựa trên các dữ liệu trình tự từ lúa và ngô cũng cho kết quả
tương tự như Wolfe và cộng sự. Tỷ lệ thay thế nucleotide ở những cây này
khác về căn bản so với sự tiến hóa nhanh chóng của các phân tử ty thể ở động
vật. Trong lịch sử tương đối ngắn của hệ thống học phân tử, lúc đầu các nhà
nghiên cứu tập trung tương đối nhiều vào bộ gene lục lạp, tuy nhiên điều đó
6
đã thay đổi khi các khảo sát về sau đã chuyển hướng sang các trình tự gene
trong nhân [17].
1.3.2. Bộ gene lục lạp
Bộ gene lục lạp của đa số các thực vật trên cạn thông thường được đặc
trưng bởi phân tử dạng vòng. Bộ gene này bé nhất trong số ba bộ gene,
khoảng 135-160kb [18] với hai phân đoạn lặp đảo [inverted repeat (IR)
segments] chia phần phân tử còn lại thành một vùng LSC (large single-copy
region) và một vùng SSC (small single-copy region). Thành phần, kích thước,
cấu trúc và trình tự của bộ gene lục lạp đã được xác định là có mức độ bảo tồn
cao trong các nghiên cứu về tiến hóa [19]. Tính bảo tồn cao này chỉ ra rằng
bất kỳ thay đổi nào về cấu trúc, cách sắp xếp hay thành phần đều liên quan
mạnh mẽ đến quan hệ phát sinh. Các phần khác nhau của bộ gene tiến hóa
theo các tỷ lệ khác nhau và tương đối chậm ở mức độ trình tự nucleotide.
Những vùng không mã hóa của bộ gene lục lạp tiến hóa nhanh hơn những
vùng mã hóa [16]. Các đột biến ở DNA lục lạp thường là các thay thế
nucleotide hay sự sắp xếp lại. Các đột biến tăng đoạn hay mất đoạn tích lũy
trong vùng không mang mã xảy ra với tỷ lệ ngang với sự thay thế nucleotide
và chính kiểu đột biến này làm tăng cường tính đa dạng của các vùng không
mang mã. Phần lớn các gene lục lạp là loại gene đơn bản trong khi các gene
trong nhân là thành viên của những họ đa gene. Tính bảo tồn cao của DNA
lục lạp thực sự là ưu thế khi sử dụng nó để xây dựng lại mối quan hệ phát sinh
và quá trình tiến hóa ở các mức độ từ loài đến chi và đến họ thực vật
[20],[17].
Có thể thấy những gene mã hóa và không mã hóa ở lục lạp thường
được sử dụng trong nghiên cứu quan hệ phát sinh như sau:
1.3.3. Các trình tự bảo tồn ở bộ gene trong nhân
Bộ gene trong nhân có kích thước lớn nhất trong số ba bộ gene ở thực
vật (1.1 × 106 đến 110 × 106 kbp) và bao gồm rất nhiều gene. Phần lớn các nổ
7
lực nghiên cứu về quan hệ phát sinh bằng chỉ thị phân tử sử dụng các trình tự
DNA ribosome trong nhân. Cấu trúc căn bản của DNA ribosome là một đơn
vị lặp đơn, mỗi đơn vị như thế có thể lặp lại đến hàng ngàn lần trong bộ gene.
Bộ gene trong nhân chứa một vùng sao mã có cấu trúc bao gồm khoảng trống
bên ngoài vùng sao mã (ETS), tiếp theo là gene 18S mã hóa cho tiểu đơn vị
nhỏ và gene 26S mã hóa cho tiểu đơn vị lớn vốn phân cách nhau bởi một gene
nhỏ hơn là 5,8S. Các khoảng trống trong vùng phiên mã (ITS1 và ITS2) tách
rời những gene vừa đề cập. Chiều dài của ba vùng mang mã là giống nhau ở
các thực vật: gene 18S là khoảng 1800bp, 26S là khoảng 3300bp và gene 5,8S
là khoảng 160bp. Ngược lại, chiều dài của các khoảng trống giữa các gene
biến động từ 1 đến 8kb. Họ gene rDNA chứa các vùng bảo tồn cao như 18S,
26S có thể sử dụng để suy luận các quan hệ phát sinh ở các mức độ phân loại
cao. Các đoạn tiến hóa nhanh như các vùng ITS có thể là thích hợp nhất trong
so sánh các loài và những chi gần nhau, thậm chí là so ở mức độ các quần thể.
Các trình tự 18S rDNA thường được sử dụng rộng rãi hơn các trình tự
26S. Cho dù cả hai vùng cùng được có dải ứng dụng rộng như nhau nhưng
kích thước trên 3000bp của 26S rDNA đã cản trở các nhà nghiên cứu, đặc biệt
là trong việc giải trình tự toàn bộ gene. Trái lại, kích thước của 18S rDNA
khoảng 1800bp giúp cho nó được ưu tiên lựa chọn hơn để khuếch đại bằng
PCR và giải trình tự. Thực tế cho thấy hình thể cây quan hệ phát sinh sử dụng
trình tự 18S rDNA khá đồng dạng với cây quan hệ phát sinh sử dụng trình tự
rbcL ở nhiều mức độ phân loại ở thực vật hạt kín. Cho dù rất có tiềm năng
trong việc xây dựng cây quan hệ phát sinh ở thực vật, vùng 18S rDNA vẫn
chưa được tận dụng trong hệ thống học thực vật hạt kín [17].
Gene 26S rDNA thường được lưu ý là ứng viên cho việc thay thế gene
18S rDNA. Khi so sánh có thể nhận thấy toàn bộ gene 26S rDNA tiến hóa
nhanh gấp từ 1,6 đến 2,2 lần và cung cấp các đặc điểm mang tính thông tin
nhiều hơn 3 lần so với 18S rDNA.
8
Gene 5,8S rDNA dễ dàng được khuếch đại và giải trình tự khi sử dụng
các mồi định vị trên các gene 18S và 26S rDNA. Gene 5,8S rDNA hiếm khi
được sử dụng để suy luận quan hệ phát sinh bởi tính bảo tồn cao và kích
thước bé (164-165bp). Tỷ lệ các vị trí mang thông tin tiềm năng cho phân tích
quan hệ phát sinh ở thực vật có hạt cũng tương đương với gene 18S rDNA.
Vùng ITS: ITS1 phân cách gene 18S rDNA với gene 5,8S rDNA còn
ITS 2 phân cách gene 5,8S rDNA với gene 26S rDNA. Vùng ITS hiện hữu
một cách rộng rãi dưới 700bp ở các thực vật có hoa [21]. Vùng ITS chứa các
trình tự bảo tồn cao nên rất nhiều mồi tổng thể được thiết kế cho việc khuếch
đại và giải trình tự đã được mô tả. Các trình tự ITS1 và ITS2 vốn giàu GC
làm cho việc giải trình tự trở nên khó khăn. Khó khăn trong việc giải trình tự
biến động theo các nhóm thực vật và việc cho thêm DMSO hay BSA vào
PCR hay phản ứng giải trình tự là việc bổ sung mang lại hiệu quả cao [22].
Việc căn trình tự ITS từ nhiều họ thực vật hạt kín chỉ ra rằng các trình tự ITS1
và ITS2 đa dạng hơn trình tự của các gene rDNA. Các trình tự ITS biến động
một cách hiệu quả cho phép giải quyết những câu hỏi về quan hệ phát sinh ở
những taxon có quan hệ họ hàng gần. Theo đó, rất nhiều các bài báo thể hiện
sự thành công trong việc xây dựng lại lịch sử tiến hóa sử dụng các trình tự
ITS [23],[24]. Hơn nữa, vùng ITS được di truyền theo kiểu từ cả cha và mẹ
khiến cho nó cũng có thể được sử dụng để thăm dò sự lai chéo [25].
1.3.4. Kết quả nghiên cứu ADN mã vạch trong kiểm định giống
nhân sâm.
Tại Hàn Quốc, việc sử dụng các chỉ thị phân tử trong phân loại chi
Panax đã được triển khai nhiều và đạt được nhiều kết quả mang tính ứng dụng
cao. Trường đại học tổng hợp Hàn Quốc. Thư viện BAC (bacterial artificial
chromosome) gồm 106.368 dòng với chiều dài trung bình khoảng
98,61kb[26]. Từ thư viện BAC các nhà khoa học đã thiết kế các chỉ thị phân
tử SSR và thành công trong việc xác định chỉ thị phân tử đặc hiệu trong phân
biệt các giống sâm của Hàn Quốc và trên thế giới. Trường đại học Chung Ang
Hàn Quốc đã nghiên cứu sự khác nhau giữa các loài nhân sâm bằng chỉ thị
phân tử RAPD. Kết quả mồi OP-5A cho băng đơn ADN với các mẫu nhân.
9
Mồi chỉ thị RAPD13B chỉ sự khác nhau giữa các loài sâm [27]. Trường đại
học William & Mary của Mỹ đã nghiên cứu đa dạng di truyền Sâm Mỹ và
nghiên cứu chọn giống Sâm bằng chỉ thị phân tử [28].
Năm 2011, Lee và cộng sự đã phát triển một chỉ thị SCAR dẫn xuất từ
ISSR để nhận dạng các chủng sâm P.ginseng có đặc tính tốt phục vụ cho chọn
giống. 34 trong số 85 mồi ISR hình thành locus đa hình. Các mồi UBC-821,
UBC-868 và UBC-878 làm nảy sinh các băng đa hình giữa các chủng
P.ginseng và cho phép phân biệt chúng với các mẫu P.quinquefolius và
P.notoginseng [29].
Tác giả Hongtao Wang – Trung tâm nghiên cứu và sản xuất Sâm của
Hàn Quốc đã nghiên cứu xác định chỉ thị phân tử đặc hiệu phân biệt giống
sâm Chunpoong với các giống Sâm khác. Giống sâm Chunpoong là một
giống nhập nội chất lượng cao và chất lượng cao trong số chín giống nhân
sâm Hàn Quốc. Trung tâm đã nghiên cứu quy trình kiểm định giống
Chunpoong bằng chỉ thị phân tử sử dụng các trình tự ADN của ty lạp thể
(COX2) trên vị trí intron I và intron II. Chỉ thị phân tử SNP đặc hiệu đã được
nghiên cứu dùng phân biệt giống nhân sâm Chunpoong với các giống nhân
sâm khác một cách đơn giản và chính xác [30].
Từ năm 2012 đến nay Trung tâm Ươm tạo và Hỗ trợ doanh nghiệp
Khoa học công nghệ đã hợp tác nghiên cứu giải trình tự hệ gen lục lạp của
Sâm Ngọc Linh với Trường đại học Quốc gia Seuol Hàn Quốc. Cuối năm
2015 tác giả Nguyễn Văn Binh, cán bộ của Trung tâm đã nghiên cứu giải
trình tự hoàn thiện genome lục lạp trên Sâm Ngọc Linh [31]. Kết quả này
đóng vai trò rất quan trọng trong việc nghiên cứu mối quan hệ di truyền của
Sâm Ngọc Linh với các loài khác trong họ Araliaceae và là cơ sở dữ liệu cho
việc thiết kế các chỉ thị phân tử đặc trưng cho loài.
1.4. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH TRÊN CÂY SÂM
NGỌC LINH
Nguyễn Ngọc Dung là một trong những tác giả đầu tiên nghiên cứu
nhân giống vô tính Sâm Ngọc Linh bằng con đường sinh học thông qua tái
sinh từ mô sẹo [32]. Năm 2010, Dương Tấn Nhật và cộng sự cũng tiến hành
10
nhân giống vô tính cây Sâm Ngọc Linh thông qua con đường phát sinh cơ
quan [33]. Mô sẹo được cảm ứng ở các mẫu củ Sâm Ngọc Linh cắt mỏng trên
môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l 2,4D và 0,2 mg/l TDZ trong điều kiện chiếu
sáng 16h/ngày. Môi trường tốt nhất cho tỷ lệ tăng sinh khối mô sẹo là môi
trường MS bổ sung 1,0 mg/l 2,4D và 0,2 mg/l TDZ. Số chồi tái sinh từ mô
sẹo đạt cao nhất trên môi trường Sh bổ sung1,0 mg/l BA, 1,0 mg/l NAA và
2,0 g/l thanh hoạt tính. Trong giai đoạn tăng trưởng chồi, môi trường ½MS
đực bổ sung 1,0 mg/l BA và 0,5 mg/l NAA, 50 g/l sucrose và 2 g/l thanh hoạt
tính. Nguyễn Bảo Triệu và công sự cũng đã tiến hành nghiên cứu nuôi cấy in
vitro Sâm Ngọc Linh trên môi trường MS bổ sung 1,0mg/l 2,4D, 0,2 mg/l
TDZ và trên môi trường SH bổ sung 1.0 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA. Mai
Trường và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về tạo và nhân giống phôi sôma
Sâm Ngọc Linh trong môi trường lỏng [34]. Hoàng Xuân Chiến và cộng sự đã
thử nghiệm khả năng tạo củ in vitro và xác định hàm lượng saponin ở các cây
trồng thử nghiệm 17 tháng tuổi [35]. Các hệ phức hợp của GA/ABA và
auxin/cytokinin trong quá trình hình thành củ cũng được tác giả khảo sát.
Nồng độ ABA thích hợp nhất cho quá trình tạo củ là 3,0 mg/l. GA3 ức chế
khả năng tạo củ in vitro cây Sâm Ngọc Linh. Các chồi cây Sâm Ngọc Linh
được cảm ứng để tạo củ thành công trên môt trường SH có bổ sung 1,0 mg/l
NAA và 2,0 mg/l BA trong điều kiện chiếu sáng 16h/ngày. Nồng độ đường
sucrose tốt nhất cho quá trình tạo củ là 50 g/l. Hàm lượng saponin trong củ
của những cây 17 tháng tuổi nuôi trồng ngoài tự nhiên cũng đã được xác định
là G-Rb1 (0,21%), G-Rg1 (0,17%) MR2 (0,77%) [35].
1.5. TÌNH HÌNH NHÂN GIỐNG LOÀI CELLERYA SPECIOSA CHAMP
1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Năm 2008, Huang và cs đã nghiên cứu về kỹ thuật nuôi cấy mô
Millettia speciosa Champ. (tên gọi khác của Cellerya speciosa Champ.): Họ
đã tìm được môi trường nền là MS + 1,0 mg/l 6-BA + 0,1 mg/l IBA kết quả
cho tỷ lệ cảm ứng tạo chồi có thể đạt 100%. Sau khi cấy 20 ngày, các chồi
nách bắt đầu nảy mầm và phát triển bình thường. Với môi trường nhân nhanh
là MS + 2,0 mg/l 6-BA + 0,1 mg/l IBA, sau nuôi cấy 30 ngày cho hệ số nhân
đạt 7,0, sự sinh trưởng và phát triển của chồi là bình thường. Môi trường tạo
11
cây hoàn chỉnh tốt nhất là 1/2MS + 0,5 mg/l IBA + 0,5 mg/l IAA cho tỷ lệ ra
rễ đạt 80%, chất lượng rễ tốt nhất [36].
Năm 2010, Pan và cs đã tiến hành nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào cây
thuốc Millettia speciosa Champ. Kết quả của nghiên cứu: sử dụng các đoạn
thân cây của Millettia speciosa Champ. để làm mẫu cấy để khử trùng và kết
luận là mẫu cấy khử trùng trong 5 phút với 0,1% HgCl2 là thích hợp nhất.
Môi trường cảm ứng tạo mô sẹo cao nhất là môi trường MS có bổ sung 1,0
mg/l αNAA [Error! Reference source not found.]. Các chồi nách ở thân có
thể tái sinh tạo chồi trong môi trường nuôi cấy có bổ sung thêm với 2,0 và 2,5
mg/l 6-BA, nhưng tỷ lệ tái sinh tạo chồi cao nhất chỉ đạt 78,6%. Môi trường
tốt nhất cho tái sinh chồi nách là MS + 2,0 mg/l 6-BA + 0,05 mg/l αNAA, hệ
số nhân là 4,0 - 5,0 sau khi nuôi cấy trong 30 ngày. Tỷ lệ ra rễ của chồi đạt
66,7% trên môi trường 1/2MS + 2,5 mg/l αNAA + 2,5 mg/l IBA và tỷ lệ sống
của cây đạt 85% sau 30 ngày ở giai đoạn vườn ươm khi cây giống cấy mô
được trồng trên giá thể là hỗn hợp chất đất và cát ở tỷ lệ (3:1) [37].
1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Năm 2015, Nguyễn Thị Minh Hiền đã nghiên cứu nhân giống invitro cây Sâm Nam Núi dành bằng phương pháp tạo callus. Nghiên cứu đã
thu được các kết quả: Các chất điều tiết sinh trưởng 2,4-D, αNAA, BA có
cảm ứng kích thích lớp mỏng mô lá Sâm Nam Núi dành tạo callus, tạo rễ
nhưng không tạo chồi. Bổ sung 3,0 mg/l αNAA là thích hợp nhất cho sự tái
sinh tạo callus cũng như tạo củ in vitro từ lớp mỏng mô lá Sâm Nam Núi
dành. Nguồn gốc callus tái sinh từ các môi trường khác nhau có ảnh hưởng
rõ rệt đến sự sinh trưởng của callus khi được cấy chuyển lên các môi
trường tái sinh mới. Trong đó, các khối callus trước đó được tái sinh từ lớp
mỏng tế bào mô lá Sâm Nam Núi dành trên môi trường (DCR + 3,0 mg/l
αNAA) có khả năng sinh trưởng tốt nhất. Nồng độ đường sucrose 30 g/l là
thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của callus.
Theo nghiên cứu của Hoàng Vũ Thơ đăng trên tạp chí Công nghệ
sinh học và Giống cây trồng với nội dung: “Nghiên cứu khả năng ra rễ của
Sâm Nam Núi dành (callerya spp.) bằng phương pháp giâm hom”. Thời
12
gian giâm hom vào vụ Xuân, với hom thu từ cây mẹ tuổi 4 cho thấy: 1) Sử
dụng IBA nồng độ 750ppm cho tỷ lệ ra rễ đạt 11,11%, số rễ trung bình trên
hom là 0,24 rễ, chiều dài rễ trung bình là 3,0cm và chỉ số ra rễ đạt trị số
0,72; 2) Khi sử dụng NAA nồng độ 500ppm cho tỷ lệ ra rễ hom đạt
11,11%, số rễ trung bình trên hom là 0,2 rễ, chiều dài trung bình của rễ là
1,33cm và chỉ số ra rễ là 0,27; 3) Sử dụng TTG giâm hom cho tỷ lệ ra rễ
đạt 2,22%, số rễ trung bình trên hom là 0,02, chiều dài trung bình của rễ là
1,5cm và chỉ số ra rễ là 0,03. Khả năng ra rễ của hom chịu ảnh hưởng rõ rệt
của nồng độ hoocmone.
13
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1.ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THƠI GIAN NGHIÊN CỨU
2.1.1.Đối tượng
Đối tượng nghiên cứu của đề tài là loài Sâm Núi Dành, một loại cây
dược liệu phân bố trên địa bàn Tỉnh Bắc Giang.
2.1.2.Vật liệu nghiên cứu
- Các mẫu Sâm thu thập trên địa bàn tỉnh Bắc Giang
- Danh sách các đoạn mồi ITS [38](Bảng 2.1)
Bảng 2. 1. Danh sách các mồi ITS
TT Mồi
Trình tự Nucelotid
ITS1
TCC GTA GGT GAA CCT TGC GG
ITS4
TCCTCCGCTTATTGATATGC
- Mẫu rễ cây Sâm Núi Dành ở các tuổi khác nhau: mẫu dưới 2 năm, 3 năm, 4
năm, > 5 tuổi và đoạn thân bánh tẻ chứa chồi ngủ cây Sâm Núi Dành có độ
tuổi từ 1-1,5 tuổi.
2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Thí nghiệm giâm hom được thực hiện tại Viện Di truyền Nông nghiệp
và xã Việt Lập – huyện Tân Yên – Bắc Giang.
- Nghiên cứu quy trình nhân giống in-vitro, nghiên cứu các marker đặc
trưng để nhận dạng chính xác loài Sâm Núi Dành được thực hiện tại Viện Di
truyền Nông nghiệp.
- Phân tích định tính các thành phần hóa học thực hiện tại Viện Hóa
học – Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam.
- Thời gian nghiên cứu : 2017 – 8/2019
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.1. Nội dung 1: Thu thập, lấy mẫu và phân loại chính xác loài
14
Sâm Núi Dành bằng marker phân tử trong số các mẫu Sâm thu thập
được trên địa bàn tỉnh Bắc Giang.
- Công việc 1 : Điều tra, thu thập thông tin và lấy mẫu một số loài Sâm phân
bố trên địa bàn tỉnh Bắc Giang.
- Công việc 2: Nghiên cứu xác định các marker đặc trưng-Barcode (trình tự
ITS của gen ribosom nhân) để nhận dạng chính xác loài Sâm Núi Dành.
2.2.2. Nội dung 2: Phân tích định tính một số nhóm chất trong củ
Sâm Núi Dành
- Công việc : Phân tích định tính một số nhóm chất trong loài Sâm Núi Dành
2.2.3. Nội dung 3: Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống vô
tính cho loài Sâm Núi Dành bằng phương pháp giâm hom và phương
pháp nuôi cấy in-vitro
- Công việc 1: Nghiên cứu phương pháp nhân giống loài Sâm Núi Dành tại
vùng bản địa bằng các phương pháp giâm hom.
- Công việc 2: Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cho loài Sâm Núi
Dành bằng phương pháp nuôi cấy in-vitro.
2.3.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1.Phương pháp thu mẫu và lấy mẫu ngoài thực địa
Sử dụng phương pháp thu mẫu thực địa theo Nguyễn Nghĩa Thìn
(1997, 2007).
- Phương pháp thu mẫu: Mẫu vật được thu hái theo danh lục đã phỏng vấn và
theo sự chỉ dẫn của các thầy thuốc bản địa. Các mẫu thu được có bộ phận dinh
dưỡng và bộ phận sinh sản; trường hợp mẫu thu được không đủ đặc điểm
phân loại (do không vào mùa hoa, quả) thì tiến hành thu và thay thế mẫu
trong các đợt thu mẫu tiếp theo. Mỗi mẫu đều được gắn nhãn (etyket) ghi số
hiệu mẫu, địa điểm và nơi lấy, các đặc điểm quan trọng: cây gỗ hay dây leo;
màu sắc lá, hoa, quả; mùi vị đặc trưng (nếu có); có nhựa mủ hay không; môi
trường sống...
15
- Cách xử lý mẫu: Mẫu vật được xử lý ngay sau mỗi đợt thu mẫu, ép tạm thời
bằng giấy báo, buộc chặt, cho vào túi nilon và tẩm cồn 70%.
- Chụp ảnh: sử dụng máy ảnh để ghi lại hình ảnh của các loài cây thuốc, cách
sơ chế, sử dụng và những hoạt động của tập thể trong quá trình nghiên cứu.
2.3.2. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền của các giống/loài
bằng các marker đặc trưng-Barcode
2.3.2.1. Tách chiết ADN tổng số
Phương pháp sử dụng CTAB có cải tiến.
Quy trình:
- Chuẩn bị sẵn dung dịch đệm chiết CTAB ở 60C.
- Nghiền 0,3 gam mẫu lá bằng chày cối sứ vô trùng trong nitơ lỏng đến khi
thành dạng bột mịn (mẫu sâm, chày, cối được giữ trước ở - 80C).
- Hoà tan mẫu đã nghiền nhỏ trong 800l CTAB buffer và 60l SDS 10%.
Thành phần dung dịch đệm chiết: Tris-bazơ 100 mM, EDTA 20 mM, NaCl
1,4 M, CTAB 2%.
- Ủ mẫu ở 65C trong bể ổn nhiệt, thời gian 60 phút.
- Bổ sung Chloroform, lắc nhẹ cho tới khi thành dạng nhũ sữa. Ly tâm
11000 vòng/phút trong 30 phút ở nhiệt độ 4C. Hút dung dịch phía trên
chuyển sang ống mới.
- Tiếp tục chiết lần 2 bằng Chloroform, thu được dịch chiết chứa ADN.
- Tủa ADN bằng isopropanol đã làm lạnh. Để ở -20C trong 1 giờ.
- Ly tâm thu tủa 10500 vòng/phút trong 15 phút ở 4C.
- Rửa tủa bằng ethanol 70%, ly tâm thu tủa, làm khô và hoà tan trong đệm TE.
- Loại ARN: bổ sung RNase vào mẫu ADN và ủ ở 37C trong 1 giờ.
Các bước tiếp theo tương tự các bước 5-9.
2.3.2.2. Thành phần của một phản ứng PCR
16
