Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5155-90

Nhóm M
Tiêu chuẩn Việt Nam

TCVN 5155 - 90

Thịt và sản phẩm của thịt
Phương pháp phát hiện và đếm số Escherichia Coli
Meat and meat products
Detection and enumeration of Escherichia Coli

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp phát hiện và đếm số E. coli trong 1 g và trên  100 cm2 
thịt và sản phẩm của thịt dùng làm thực phẩm cho người và thức ăn cho gia súc.
1. 

Đặc tính chung
Vi khuẩn hình gậy, mập, ngắn, gram dương, kích thước 0,4­0,7 x 13 micrômét, không có nha  
bào, không có giáp mô.
Vi khuẩn có những đặc tính sinh hoá được quy định kiểm nghiệm trong tiêu chuẩn này.

2. 

Nguyên tắc
Căn cứ vào đặc tính sinh hoá để  xác định vi khuẩn. Pha loãng mẫu thử   ở  các đậm độ  khác  
nhau ria cấy lên môi trường chọn lọc để đếm và tính số vi khuẩn.

3. 

Lấy mẫu: Theo TCVN 5153­90

4. 

Thiết bị và dụng cụ: Theo TCVN 5153­90

5. 

Môi trường, thuốc thử:

5.1. 

Phải dùng các loại hoá chất tinh khiết phân tích, nên sử dụng các thành phẩm cơ  bản hoặc  
đã chế  sẵn, khi dùng phải theo chỉ  dẫn của nơi sản xuất. Môi trường thuốc thử  phải bảo  
quản ở nơi tối, nhiệt độ 4oC không quá 1 tháng. Định kỳ kiểm tra lại môi trường, thuốc thử 
bằng giống vi khuẩn tiêu chuẩn.

5.2. 

Môi trường, thuốc thử (Phụ lục A)

5.2.1.  Môi trường nước thịt
5.2.2.  Môi trường thạch deoxycholat
5.2.3.  Môi trường thạch Macconkey
5.2.4.  Môi trường nước pepton (để thử phản ứng Indea)
5.2.5  Môi trường nước pepton glucose (để thử phản ứng đỏ methyl và Voges­ Proskauer). 
5.2.6.  Môi trường thạch Simon xitrat.
5.2.7.  Thuốc thử Indol (dung dịch Kowacs)
5.2.8.  Thuốc thử đỏ methil (M.R.)


Tiªu chuÈn ch¨n nu«i

TCVN 5155 - 90

5.2.9.  Thuốc thử Voges ­ Proskauer (dung dịch Barritt)
6. 

Cách tiến hành

6.1. 

Yêu cầu chung: Các dụng cụ, môi trường, thuốc thử v.v... và thao tác phải vô khuẩn.

6.2. 

Chuẩn bị mẫu thử: Thịt lạnh đông phải giải đông tự nhiên ở nhiệt độ trong phòng cho đến  
khi đạt 13­15oC, đồ hộp phải cọ rửa sạch vỏ ngoài, ủ 37 oC từ 5­7 ngày.

6.3. 

Chế huyễn phù ban đầu

6.3.1.  Để đếm số vi khuẩn trong 1 gam sản phẩm: Cân 100 ­225 gam (không lấy mỡ, lấy cả chất  
lỏng nếu có) nghiền trước trong cối sứ, nghiền nhuyễn tiếp trong máy xay thịt từ  2­3 phút 
với vận tốc 10.000 vòng/ phút, vừa nghiền vừa bổ  sung dần 9 phần môi trường nước thịt 
(10­1).
6.3.2.  Để  đếm số  vi khuẩn trên 100 cm 2 sản phẩm: Dùng những miếng giấy thấm vô khuẩn, có  
kích thước 5 x 5 cm đã được làm ẩm ướt bằng nước muối đẳng trương rồi dán lên bề mặt 
sản phẩm ở các vị trí khác nhau từ 4­8 miếng (100­200 cm 2). Sau 2 phút chuyển toàn bộ số 
giấy thấm vào bình đã đựng sẵn 10­20 ml môi trường nước thịt và 10­15 viên bi thuỷ  tinh. 
Lắc cho tan giấy tuỳ theo khối lượng mẫu thử  cần sử dụng mà pha loãng thành 1:1 (1 ml  
tương đương với 1m2)
6.4. 

Đếm số vi khuẩn: Từ huyễn phù ban đầu (6.3) tiếp tục pha loãng 10 lần (10 ­1, 10­2, 10­3) tuỳ 
mức nhiễm khuẩn mà quyết định.  Mỗi đậm độ cấy vào 2 đĩa môi trường thạch deoxycholat  
hoặc Macconkey một khối lượng bằng nhau trong khoảng từ  0,1­1 ml (tuỳ  mức nhiễm  
khuẩn mà quyết định), dàn đều trên mặt thạch hoặc trộn đều trong thạch nóng lỏng ở 45  oC, 
đặt sấp đĩa môi trường, ủ 37 oC. Đọc kết quả 2 lần vào 24 giờ và 48 giờ
Khuẩn lạc E. coli to, đục, mặt khô, màu đỏ.
Căn cứ vào hình dạng, màu sắc mà đếm; chọn 5 khuẩn lạc để giám định tiếp tính chất sinh 
hoá và xác định tỷ lệ (phụ lục B).

6.5. 

Thử các phản ứng IMViC.

6.5.1.  Phản ứng Indol: Phương pháp theo TCVN 5153­90
E. coli có phản ứng dương tính, lớp thuốc thử trên mặt môi trường có màu đỏ.
Chú thích: E. coli không điển hình (atypic) có phản ứng âm tính: màu vàng nhạt.

6.5.2.  Phản ứng đỏ methyl (methyl red): Cấy vi khuẩn (6.4) vào môi trường nước pepton glucos, ủ 
37  oC từ  2­4 ngày, nhỏ  5 giọt thuốc thử  đỏ  methyl vào, đọc kết quả: E. coli có phản  ứng  
dương tính: màu đỏ (âm tính: màu vàng)
6.5.3. Phản ứng Voges ­ proskauer: Phương pháp theo TCVN 5153­90
E. coli có phản ứng âm tính, không màu hoặc vàng nhạt (dương tính: màu đỏ)
6.5.4.  Trên môi trường thạch Simon xitrat: Ria cấy vi khuẩn (6.4) trên mặt thạch nghiêng, ủ 37 oC 
từ 1­3 ngày E. coli không sinh trưởng (­)
7. 

Tính toán kết quả

7.1.

Căn cứ vào kết quả giám định tính chất sinh hoá.

7.2. 

Căn cứ  vào công thức dưới đây để  tính số  E. coli trong 1 gam hoặc trên 100 cm 2  sản  
phẩm

2


Tiªu chuÈn ch¨n nu«i

TCVN 5155 - 90

X gam= sè khuÈnl¹c ®Õm®­îc x

1
1
x
khèi l­îng nu«i cÊy béi sè phalo·ng mÉuthö

X 100gam= 100 x sè khuÈnl¹c ®Õm®­îc x

1
1
x
khèi l­îng nu«i cÊy béi sè phalo·ng

Phụ lục A

Môi trường nuôi cấy, thuốc thử
A1. 

Môi trường nước thịt: Theo phụ lục B  TCVN 5153­90

A2. 

Môi trường  thạch deoxycholat:
­ Pepton
­ Thạch
­ Natri deoxycholat
­ Natri clorua
­ Kali hydro phot phát (K2HPO4)
­ Lactos
­ Sắt xitrat
­ Đỏ trung tính dung dịch 0,1% trong cồn (neutra­ red)
­ Nước cất

10 g
18­20 g
1 g
5 g
2 g
10 g
2 g
33,3 ml
1.000 ml

Môi trường  thạch macconkey:
­ Pepton

­ Thạch
­ Natri clorua
­ Lactos
­ Muối mật
­ Dung dịch cồn đỏ trung tính 0,1 %
­ Nước cất 

20 g
18­20 g
5 g
10 g
5 g
5 ml
1.000 ml

A3. 

Hoà tan pepton, thạch trong nước đun sôi, chỉnh pH 7,5. Lần lượt hoà tan các thành phần còn  
lại (trừ đỏ trung tính). Lọc qua bông, chỉnh lại pH 7,5. Cho dung dịch đỏ trung tính vào, lắc 
mạnh cho tan đều. Hấp 115oC trong 20 phút, chia vào các đĩa petri mỗi đĩa 15­20 ml
A4. 

Môi trường nước pepton: Theo phụ lục B  TCVN 5153­90

A5. 

Môi trường nước pepton ­ glucose: Theo phụ lục B  TCVN 5153­90

A6. 

Môi trường thạch Simon ­ xitrat:
­ Ammonium dihydrophotphat (NH4H2PO4)
­ Magiê ­ sulphat (Mg So4)
­ Kali hydro photphát (K2HPO4)
­Natri xitrat (Na3C6H5O7.2H2O)                                 
­ Natri clorua (NaCl)

1 g
0,2 g
1 g
2,3g
5 g

3


Tiªu chuÈn ch¨n nu«i

TCVN 5155 - 90

­ Thạch
18­20 g
­ Nước cất
1.000 ml
­ Xanh Brôm­thy­môn, dung dịch 0,5 ­ 1% trong cồn (Bromthymol Blue): 10­20 ml

A7. 
A8. 
A9. 

Theo thứ tự lần lượt hòa tan các muối trong nước, cho thạch vào và đun sôi, chỉnh pH 6,8 rồi  
cho tiếp dung dịch xanh brôm­thy­môn. Lắc đều và lọc qua bông. chia ra các ống nghiệm 10  
x 100 mm, mỗi  ống từ  3­5 ml. Hấp 121oC trong 20 phút. Để     ống nằm nghiêng cho môi 
trường đông lại (môi trường có màu xanh).
Thuốc thử Indol: Theo phụ lục B  TCVN 5153­90
Thuốc thử  đỏ  methil (methyl red):  Hoà tan 0,04 g đỏ  methyl trong 60 ml cồn 95 o  sau cho 
thêm 40 ml nước cất.
Thuốc thử Voges­ Proskauer: Theo phụ lục B  TCVN 5153­90
Phụ lục B
Kỹ thuật đếm và tính số vi khuẩn (khuẩn lạc)

B1. 

Đếm số bằng mắt thường hoặc kính lúp. Tốt nhất là đếm toàn bộ số vi khuẩn có trên đĩa 
môi trường; nếu số vi khuẩn nhiều có thể chia đáy đĩa petri thành các phần bằng nhau: 2, 4,  
8, 16  rồi đếm số vi khuẩn trong 1 phần, sau nhân với 2, 4, 8, 16 phần tương ứng

B2. 

Cách chọn đĩa môi trường để đếm

B2.1.  Chọn những đĩa khuẩn lạc mọc riêng biệt, số lượng từ 30 ­ 300 vi khuẩn.
B2.2.  Nếu 2 đậm độ  pha loãng kế  tiếp nhau có cùng số  đếm từ  30 ­ 300 thì lấy số  đếm được ở 
từng đĩa nhân với bội số pha loãng, so sánh tỷ  lệ  giữa hai giá trị, nếu nhỏ  hơn 2 thì lấy số 
đếm bình quân của cả 2 giá trị. Nếu lớn hơn 2 thì lấy số có giá trị thấp
B2.3.  Nếu các đậm độ  pha loãng đều có số  đếm trên 300 thì chọn đĩa môi trường có bội số  pha  
loãng cao nhất.
B2.4.  Nếu các đậm độ  pha loãng đều có số đếm ít hơn 30 thì chọn đĩa môi trường có bội số  pha  
loãng thấp nhất.
B3. 

Cách tính lại số lượng vi khuẩn: Căn cứ vào kết quả giám định 5 khuẩn lạc đại diện cho 
mỗi nhóm để  tính lại số đếm (B2). Nếu cả  5 đều dương tính thì nhóm đó được tính 100% 
dương tính, nếu có 3 dương tính thì chỉ được tính là 60% dương tính.

B4. 

Cách tính số vi khuẩn trong 1 gam và trên 100 cm2 mẫu thử theo công thức:
X 1gam= sè khuÈnl¹c ®Õm®­îc x

1
1
x
khèi l­îng mÉuthö béi sè phalo·ng mÉuthö

X 100 cm2 = 100 x sè khuÈnl¹c ®Õm®­îc x

1
1
x
khèi l­îng mÉuthö béi sè phalo·ng mÉuthö

B4.1.   Số  khuẩn lạc đếm được là số  lượng bình quân trên 2 đĩa môi trường có cùng độ  đậm pha  
loãng hoặc ở 2 độ pha loãng kế tiếp nhau và đã được xác minh lại (B3).
B4.2.  Trước khi tính cần làm tròn số  đếm: Dưới 10 thì làm tròn số  hàng chục; dưới 5 thì lấy số 
tròn hàng chục dưới, trên 5 thì lấy tròn số  hàng chục trên, trên 100 nếu số hàng đơn vị  là 5 
thì lấy số tròn chia chẵn cho 20, các trưòng hợp khác thì lấy số tròn chia chẵn cho 10.
B4.3.  Thí dụ và cách tính:

4

Tiªu chuÈn ch¨n nu«i

TCVN 5155 - 90

B4.3.1. Thí dụ: 1 ml mẫu thử ở độ đậm pha loãng 10 ­2 được cấy đều trên 2 đĩa môi trường. Đĩa 1 có  
65 khuẩn lạc gồm 55 điển hình và 10 không điển hình. Đĩa 2 có 85 khuẩn lạc gồm 82 điển 
hình và 3 không điển hình.
B4.3.2. Cách tính:
-

Tổng số khuẩn lạc đếm được trên 2 đĩa 150 gồm 137 điển hình và 13 không điển hình.

-

Sau khi chọn và giám định lại 5 khuẩn lạc  ở mỗi nhóm thì thấy (giả  thiết) cả  5 khuẩn  
lạc  ở nhóm điển hình đều dương tính. chiếm tỷ  lệ  100% (5/5). Có 3 trong nhóm không 
điển hình dương tính chiếm tỷ lệ 60% (3/5).

-

Căn cứ vào tỷ lệ trên, số khuẩn lạc được tính lại như sau:

Đĩa 1 + 2 = 137 + 13 x 60%
 

    = 137 + 7,8
    = 137+ 8 (số tròn)
    = 145

    = 140 (làm số tròn)

140
Số bình quân =  2   = 70
1
1
X 1g = 70 x x ­2 = 70 x 102 = 7 x 103
1 10

­ Nếu tính số vi khuẩn trên 100 cm2 diện tích mẫu thử cũng tính như trên rồi nhân với 100.

5