Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 9522:2012 - EN 15851:2010

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA
TCVN 9522 : 2012
EN 15851 : 2010
THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH AFLATOXIN B1 TRONG THỰC PHẨM CHẾ BIẾN TỪ NGŨ CỐC DÀNH CHO
TRẺ SƠ SINH VÀ TRẺ NHỎ - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CÓ LÀM
SẠCH BẰNG CỘT ÁI LỰC MIỄN NHIỄM VÀ DETECTOR HUỲNH QUANG
Foodstuffs - Determination of aflatoxin B1 in cereal based foods for infants and young children - HPLC
menthod with immunoaffinity column cleanup and fluorescence detection
Lời nói đầu
TCVN 9522 : 2012 hoàn toàn tương đương với EN 15851 : 2010;
TCVN 9522 : 2012 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy
mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH AFLATOXIN B1 TRONG THỰC PHẨM CHẾ BIẾN TỪ NGŨ CỐC DÀNH
CHO TRẺ SƠ SINH VÀ TRẺ NHỎ - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CÓ
LÀM SẠCH BẰNG CỘT ÁI LỰC MIỄN NHIỄM VÀ DETECTOR HUỲNH QUANG
Foodstuffs - Determination of aflatoxin B1 in cereal based foods for infants and young children HPLC menthod with immunoaffinity column cleanup and fluorescence detection
CẢNH BÁO - Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác
gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đưa ra được tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc
sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và
xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn
1 Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng aflatoxin B 1 trong thức ăn cho trẻ nhỏ bằng
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có làm sạch bằng cột ái lực miễn nhiễm và detector huỳnh quang.
Phương pháp này đã được kiểm tra xác nhận trong nghiên cứu liên phòng thử nghiệm qua việc phân tích
cả hai mẫu: nhiễm tự nhiên và mẫu thêm chuẩn trong khoảng 0,7 μg/kg đến 0,18 μg/kg.
Thông tin thêm về kiểm tra xác nhận, xem Điều 9 và Phụ lục B.
2 Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi
năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp
dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật

và phương pháp thử.
3 Nguyên tắc
Phần mẫu thử được chiết bằng hỗn hợp metanol và nước. Dịch chiết được lọc, pha loãng với nước muối
trong dung dịch đệm phosphat (PBS) đến nồng độ dung môi quy định và đưa lên cột ái lực miễn nhiễm
có chứa các kháng thể đặc hiệu với aflatoxin B1. Aflatoxin B1 được tinh sạch và cô đặc trên cột rồi được
rửa giải bằng metanol ra khỏi các kháng thể của cột. Aflatoxin B 1 được định lượng bằng sắc kí lỏng hiệu
năng cao pha đảo (RP-HPLC) có dẫn xuất sau cột (PCD) với brom hóa sau đó bằng detector huỳnh
quang.
Việc tạo dẫn xuất sau cột được thực hiện bằng brom được sinh ra từ phương pháp điện hóa hoặc bằng
pyridinium hydrobromua perbromua (PBPB).
4 Thuốc thử


4.1 Yêu cầu chung
Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước đáp ứng yêu cầu loại 1 quy định trong TCVN
4851 : 1989 (ISO 3696:1987) trừ khi có qui định khác. Các dung môi phải đạt chất lượng sử dụng để
phân tích sắc kí, trừ khi có quy định khác. Có thể sử dụng các dung dịch bán sẵn có các đặc tính tương
đương với các loại được liệt kê dưới đây.
CẢNH BÁO: Việc thải các dung môi không sử dụng phải tuân thủ các quy định và pháp luật về
môi trường. Tổ chức quốc tế nghiên cứu về ung thư (IARC) đã thông báo về quy trình xử lý khử
nhiễm đối với chất thải phòng thử nghiệm, xem [4].
4.2 Khí nén heli tinh khiết.
4.3 Nitơ.
4.4 Dinatri hydro phosphat, Na2HPO4 khan hoặc Na2HPO4.12H2O.
4.5 Kali bromua.
4.6 Kali clorua.
4.7 Kali dihydro phosphat, KH2PO4.
4.8 Natri clorua.
4.9 Natri hydroxit.
4.10 Dung dịch axit clohydric, w(HCl) = 37 % phần khối lượng trong nước.

4.11 Dung dịch axit clohydric, nồng độ mol c(HCl) = 0,1 mol/l.
Pha loãng 8,28 ml dung dịch axit clohydric (4.10) đến 1 lít bằng nước.
4.12 Dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = 0,1 mol/l.
Hòa tan 4 g natri hydoxit (4.9) trong 1 lít bằng nước.
4.13 Dung dịch nước muối trong dung dịch đệm phosphat (PBS), c(NaCl) = 120 mmol/l, c(KCl) = 2,7
mmol/l, c(đệm phosphat) = 10 mmol/l, pH = 7,4.
Hòa tan 8,0 g natri clorua (4.8), 1,2 g dinatri hydro phosphat khan hoặc 2,9 g Na 2HPO4.12H2O (4.4), 0,2 g
kali dihydro phosphat (4.7) và 0,2 g kali clorua (4.6) trong 900 ml nước. Sau khi hòa tan, chỉnh pH đến
7,4 bằng dung dịch axit clohydric (4.11) hoặc dung dịch natri hydroxit (4.12) một cách thích hợp rồi thêm
nước đến 1 lít.
Cách khác,có thể chuẩn bị dung dịch PBS với tỉ lệ tương đương từ nguyên liệu PBS có bán sẵn.
4.14 Pyridinium hydrobromua perbromua (PBPB), [CAS: 39416-48-3].
4.15 Axetonitril
CẢNH BÁO: Axetonitril là chất độc và khi trộn mẫu phải dùng máy nghiền trộn chống nổ đặt trong
tủ hút. Sau khi trộn, mẫu phải được lọc bên trong tủ hút.
4.16 Metanol, loại dùng cho HPLC.
4.17 Metanol, loại kỹ thuật.
4.18 Toluen.
4.19 Dung môi chiết.
Trộn tám phần thể tích metanol (4.17) với hai phần thể tích nước.
4.20 Axit nitric, c(HNO3) = 4 mol/l.
4.21 Pha động A dùng cho HPLC, để dùng với PBPB.
Trộn sáu phần thể tích nước với hai phần thể tích axetonitril (4.15) và ba phần thể tích metanol (4.16).
Khử khí pha động, ví dụ bằng khí heli (4.2).


4.22 Pha động B dùng cho HPLC, để dùng với brom được điều chế bằng điện hóa.
Trộn sáu phần thể tích nước với hai phần thể tích axetonitril (4.15) và ba phần thể tích metanol (4.16).
Thêm 120 ml kali bromua (4.5) và 350 μl axit nitric (4.20) trên lít pha động. Khử khí pha động B, ví dụ
bằng khí heli (4.2).

4.23 Thuốc thử sau cột.
Hòa tan 50 mg PBPB (4.14) trong 1 lít nước. Được sử dụng với dung môi pha động A (4.21). Dung dịch
này bền đến bốn ngày nếu được bảo quản nơi tối ở nhiệt độ phòng.
4.24 Hỗn hợp toluen và axetonitril.
Trộn chín phần thể tích toluen (4.18) với một phần thể tích axetonitril (4.15).
4.25 Cột ái lực miễn nhiễm.
Cột ái lực miễn nhiễm này phải chứa các kháng thể miễn nhiễm với aflatoxin B 1. Cột này phải có khả
năng giữ đến 100 ng aflatoxin B1 và phải cho độ thu hồi không nhỏ hơn 80 % khi 5 ng aflatoxin B 1 được
sử dụng làm dung dịch chuẩn trong hỗn hợp gồm mười phần thể tích metanol và 90 phần thể tích nước.
4.26 Aflatoxin B1, dạng tinh thể hoặc dạng màng trong ampule hoặc dạng dung dịch aflatoxin B 1 bán
sẵn.
CẢNH BÁO: Aflatoxin bị phân hủy bởi ánh sáng. Bảo vệ khu vực thử nghiệm tránh ánh sáng khi
tiến hành phân tích. Có thể sử dụng giấy kim loại hấp thụ tia cực tím (UV) để phủ lên kính cửa sổ
kết hợp với việc sử dụng ánh sáng dịu (không được để ánh nắng chiếu trực tiếp) hoặc rèm chắn
hoặc màn che mờ kết hợp với ánh sáng nhân tạo (có thể sử dụng đèn ống huỳnh quang).
Bảo vệ dung dịch chứa aflatoxin tránh ánh sáng (giữ bình ở nơi tối, dùng giấy nhôm hoặc bình
thủy tinh màu hổ phách).
4.27 Dung dịch gốc aflatoxin B1, c ≈ 10 μg/ml.
Chuẩn bị dung dịch aflatoxin B1 trong hỗn hợp toluen và axetonitril (4.24) để có được dung dịch nồng độ
khối lượng khoảng 10 μg/ml.
Để xác định nồng độ khối lượng chính xác, dùng máy đo phổ UV (5.14) ghi đường hấp thụ ở bước sóng
từ 330 nm đến 370 nm trong cuvet thạch anh 1 cm chứa hỗn hợp toluen và axetonitril (4.24) làm dung
dịch đối chứng. Nhận biết bước sóng cho độ hấp thụ cực đại (trong khoảng từ 330 nm đến 370 nm). Tính
nồng độ khối lượng của aflatoxin B1, ρafl, tính bằng μg/ml, theo Công thức (1):
afl

A max M 100
b

Amax

là độ hấp thụ cực đại xác định được trên đường hấp thụ (bước sóng từ 330 nm đến 370 nm);

M

là khối lượng mol của aflatoxin B1 (M = 312 g/mol), tính bằng g/mol;

ε
là hệ số hấp thụ mol của aflatoxin B1, trong hỗn hợp toluen và axetonitril (4.24) (1 930 m 2/mol,
xem [5]) tính bằng mét vuông trên mol (m2/mol);
b

là chiều dài đường quang của cuvet thạch anh, tính bằng centimet (cm).

Bảo quản dung dịch này trong tủ lạnh ở nhiệt độ khoảng -18 oC. Để cho dung dịch đạt nhiệt độ phòng
trước khi mở. Dung dịch được bảo quản bằng cách này có thể bền được trong 12 tháng. Nếu bảo quản
quá 12 tháng thì cần kiểm tra lại nồng độ của dung dịch.
4.28 Dung dịch chuẩn aflatoxin B1, ρ = 5,00 ng/ml.
Dùng pipet lấy một lượng dung dịch gốc aflatoxin B1 (4.27) chứa chính xác 1,00 μg aflatoxin B1 cho vào
bình định mức dung tích 200 ml đã hiệu chuẩn, thêm hỗn hợp toluen và axetonitril (4.24) đến vạch. Dung
dịch này chứa 5,00 ng/ml aflatoxin B1.


Bọc kín bình chứa mẫu bằng giấy nhôm và bảo quản ở nhiệt độ dưới 4 oC. Trước khi sử dụng, không mở
giấy nhôm cho đến khi lượng chứa trong bình đạt đến nhiệt độ phòng để tránh dung dịch hấp thụ nước
do ngưng tụ. Dung dịch được bảo quản theo cách này có thể bền ít nhất 4 tuần.
4.29 Dung dịch aflatoxin B1 để bổ sung vào mẫu, ρ = 2 μg/ml.
Dùng pipet lấy một lượng dung dịch gốc aflatoxin B1 (4.27) chứa chính xác 20 μg aflatoxin B1 cho vào
bình định mức dung tích 10 ml đã hiệu chuẩn. Cho bay hơi hỗn hợp dung dịch toluen và axetonitril dưới
dòng nitơ ở nhiệt độ phòng. Thêm metanol (4.16) đến vạch và lắc mạnh. Nồng độ của dung dịch thêm

chuẩn đối với aflatoxin B1 là 2 μg/ml.
Bọc kín bình chứa mẫu bằng giấy nhôm và bảo quản ở nhiệt độ dưới 4 oC. Trước khi sử dụng, không
được mở giấy nhôm cho đến khi lượng chứa trong bình đạt đến nhiệt độ phòng để tránh dung dịch hấp
thụ nước do ngưng tụ. Dung dịch được bảo quản theo cách này có thể bền ít nhất 3 tháng.
5 Thiết bị, dụng cụ
CẢNH BÁO - Mọi dụng cụ thủy tinh tiếp xúc với dung dịch aflatoxin phải được rửa bằng dung
dịch axit trước khi sử dụng. Cần chú ý khi có nhiều máy rửa dụng cụ thử nghiệm. Cách khác,
ngâm dụng cụ thủy tinh đã tiếp xúc với dung dịch aflatoxin trong axit sulfuric (c = 2 mol/l) (ví dụ
15 h) rồi tráng kỹ (ít nhất 3 lần) bằng nước để loại hết các vết axit. Dùng giấy pH để kiểm tra xem
có còn axit hay không.
Việc xử lý này là cần thiết vì việc dùng dụng cụ không được rửa bằng axit có thể làm thất thoát
aflatoxin. Trong thực tế, việc xử lý cũng cần thiết đối với các bình đáy tròn, bình định mức, ống
đong, các lọ hoặc ống nghiệm dùng cho dung dịch hiệu chuẩn và dịch chiết cuối cùng (đặc biệt là
các lọ lấy mẫu tự động) và pipet Pasteur, nếu chúng được dùng để chuyển dung dịch hiệu chuẩn
hoặc dịch chiết.
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thủy tinh của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
5.1 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,0001 g.
5.2 Cân phòng thử nghiệm, có thể cân chính xác đến 0,01 g.
5.3 Máy lắc dọc hoặc máy lắc ngang.
5.4 Giấy lọc, ví dụ đường kính 24 cm, được gấp nếp.
5.5 Bình nón, dung tích 500 ml, có nắp vặn hoặc nắp thủy tinh.
5.6 Màng lọc vi sợi thủy tinh, cỡ hạt được giữ lại 1,6 μm hoặc nhỏ hơn.
5.7 Bình chứa, dung tích 75 ml có bộ ống và đầu nối để nối với cột ái lực miễn nhiễm (IAC).
5.8 Bơm tay, xyranh 20 ml có đầu nối hoặc nút cao su để nối với IAC.
5.9 Bình định mức, dung tích 5 ml, 10 ml, 20 ml, 150 ml và 200 ml có sai số lớn nhất là 0,5 %.
5.10 Bộ lọc xyranh dùng một lần, cỡ lỗ 0,45 μm.
Trước khi sử dụng, cần kiểm tra xác nhận aflatoxin không bị thất thoát trong quá trình lọc (thử nghiệm độ
thu hồi).
CHÚ THÍCH: Các chất liệu lọc khác nhau có khả năng giữ aflatoxin khác nhau.
5.11 Pipet định mức, dung tích 2 ml và 10 ml.

5.12 Xyranh microlit đã được hiệu chuẩn hoặc pipet microlit, có dung tích từ 25 μl đến 500 μl.
5.13 Thiết bị HPLC, gồm có các bộ phận sau:
5.13.1 Hệ thống bơm mẫu, có thể bơm, ví dụ 1000 μl. Nên dùng bơm vòng.
Trong trường hợp dùng các thể tích khác nhau, thì cần bảo đảm rằng giới hạn phát hiện (LOD) đối với hệ
thống là ≤ 0,05 μg/kg (tỷ lệ tín hiệu/nhiễu = 3) và giới hạn định lượng (LOQ) ≤ 0,1 μg/kg đối với aflatoxin
B1. Việc đo LOQ được thực hiện bằng cách bơm nhiều lần (n = 10) dung dịch chuẩn aflatoxin B 1 (nồng độ


tương đương với mức nhiễm là 0,1 μg/kg). Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của tín hiệu thu được không
được vượt quá 10 %. Dữ liệu này phải được nêu trong báo cáo thử nghiệm.
5.13.2 Bơm pha động, có khả năng duy trì tốc độ dòng thể tích 1,0 ml/min.
5.13.3 Detector huỳnh quang, có bộ lọc bước sóng kích thích λ = 360 nm và bộ lọc bước sóng phát xạ
λ > 420 nm, hoặc loại tương đương (ví dụ: detector có ánh sáng đơn sắc có thể chỉnh được).
5.13.4 Máy ghi, máy tích phân hoặc máy vi tính có hệ thống xử lý dữ liệu.
5.13.5 Cột tách HPLC pha đảo phân tích, ví dụ Cột C18 hoặc ODS-2 và cột bảo vệ pha đảo tương ứng
phù hợp.
Cột này phải bảo đảm cho đường nền có độ phân giải tách được pic aflatoxin B 1 ra khỏi các pic khác.
Mức tối đa các pic chồng lên nhau phải nhỏ hơn 10 % chiều cao tối đa của pic. Do vậy cần chỉnh (tốc độ)
pha động đủ để phân giải đường nền. Cần sử dụng tiền cột thích hợp.
5.13.6 Hệ thống dẫn xuất sau cột, có PBPB (chỉ để sử dụng với pha động A, xem 4.21).
Gồm có bơm HPLC không xung thứ hai, thể tích khoang chết hình chữ T, ống phản ứng
polytetrafloetylen (PTFE) dài tối thiểu 45 cm và đường kính trong 0,5 mm.
5.13.7 Hệ thống dẫn xuất có brom được điều chế bằng điện hóa, ví dụ KOBRA cell® 1) (chỉ để sử
dụng với pha động B, xem 4.22).
Nên cài đặt detector ở bước sóng 365 nm (bước sóng kích thích) và 435 nm (bước sóng phát xạ) và
băng thông là 18 nm.
5.13.8 Máy khử khí (tùy chọn).
5.14 Máy đo phổ UV, có cuvet thạch anh phù hợp.
6 Cách tiến hành
6.1 Chiết mẫu

Trộn kỹ mẫu trước khi lấy phần mẫu thử phân tích.
Cân 50 g phần mẫu thử là thức ăn cho trẻ nhỏ (công thức dành cho trẻ sơ sinh), chính xác đến 0,1 g, cho
vào bình nón dung tích 500 ml (5.5). Thêm 5 g natri clorua (4.8) và 250 ml dung môi chiết (4.19). Đầu tiên
dùng tay lắc mạnh bình nón từ 15 s đến 30 s, sau đó dùng máy (5.3) lắc trong 30 min. Dùng giấy lọc gấp
nếp (5.4) lọc dịch chiết và dùng pipet (5.11) lấy 10 ml dịch lọc trong cho vào bình định mức đã hiệu chuẩn
(5.9) dung tích 100 ml và thêm PBS (4.13) đến vạch. Lọc lại qua bộ lọc vi sợi thủy tinh (5.6) và chuyển 50
ml đến 100 ml dịch lọc trong vào bình hứng (5.7), bình này được nối với cột ái lực miễn nhiễm được bảo
ôn (xem 4.25). Chuyển dung dịch lên cột như mô tả trong 6.2.
6.2 Làm sạch cột ái lực miễn nhiễm
Có thể làm sạch cột bằng chân không với áp suất dương hoặc cho các thể tích quy định chảy qua cột
dưới trọng lực. Không được vượt qua tốc độ dòng quy định tối đa. Đặc biệt chú ý khi dùng bộ hút chân
không.
Chuẩn bị cột ái lực miễn nhiễm (4.25) theo hướng dẫn của nhà sản xuất, chú ý không để cột bị khô, nếu
có quy định. Cột phải đạt đến nhiệt độ phòng trước khi bảo ôn.
Cho dịch chiết chạy qua cột ở tốc độ khoảng 3 ml/min (khoảng 1 giọt/giây). Không để tốc độ dòng vượt
quá 5 ml/min. Rửa cột bằng khoảng15 ml PBS (4.13), tiến hành vài lần mỗi lần khoảng 5 ml với tốc độ tối
đa 5 ml/min và sau đó làm khô bằng hút chân không nhẹ trong 5 s đến 10 s hoặc bằng cách dùng xyranh
bơm không khí qua cột ái lực miễn nhiễm trong 10 s.
6.3 Chuẩn bị dung dịch mẫu thử
1)

 KOBRA cell® là tên thương mại của sản phẩm phù hợp bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện
cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng các sản phẩm
tương tự nếu cho kết quả tương đương.


Rửa giải aflatoxin B1 bằng cách chuyển 0,50 ml metanol (4.16) lên cột và để cho metanol đi qua cột dưới
trọng lực. Thu lấy chất rửa giải vào một bình định mức đã hiệu chuẩn dung tích 5 ml (5.9).
Chờ trong 1 min và cho thêm 0,75 ml metanol (4.16) lên cột. Thu lấy dịch chiết càng nhiều càng tốt bằng
cách ép khí qua cột. Thêm nước vào bình đến vạch và lắc kỹ. Nếu dung dịch trong thì có thể được dùng

trực tiếp để phân tích HPLC. Nếu dung dịch không trong thì lọc dung dịch qua bộ lọc sử dụng một lần
(5.10) trước khi bơm vào cột HPLC.
CHÚ THÍCH: Các phương pháp nạp mẫu lên cột ái lực miễn nhiễm có sự khác nhau về rửa cột và rửa
giải giữa các nhà sản xuất cột và do đó phải tuân thủ hướng dẫn của nhà sản xuất kèm theo.
6.4 Quy trình thêm chuẩn
Để xác định độ thu hồi, tiến hành quy trình thêm chuẩn, dùng dung dịch thêm chuẩn metanol (4.29). Mức
thêm chuẩn phải trong dải hiệu chuẩn (tốt nhất giá trị tương ứng khoảng giữa của đường chuẩn). Chú ý
không được cho quá 2 ml (5.11) dung môi thêm chuẩn và quá trình làm bay hơi sau đó xảy ra ở nơi tối
và kéo dài trong khoảng 0,5 h đến 2 h.
7 Phân tích HPLC
7.1 Điều kiện vận hành HPLC
Aflatoxin B1 được tách bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo đẳng dòng (RP-HPLC) ở nhiệt độ môi
trường có cột pha đảo (5.13.5) và pha động phù hợp (xem 4.21 hoặc 4.22). Thể tích bơm là 1000 μl (để
đảm bảo bơm vòng (xem 5.13.1) có độ chụm cao nhất, cần theo các hướng dẫn của nhà sản xuất van
bơm HPLC hoặc cổng bơm). Đối với cột có đường kính trong 4,6 mm, thì tốc độ dòng pha động nên 1
ml/min. Có thể sử dụng kích thước cột khác, với điều kiện đảm bảo giới hạn định lượng yêu cầu. Điều
kiện này phải được kiểm chứng. Vì vậy, tốc độ dòng có thể được điều chỉnh theo kích thước cột.
Aflatoxin B1 được rửa giải với thời gian lưu khoảng 11 min và được tách ra khỏi các chất gây nhiễu, nếu
có. Pha động có thể được chỉnh bằng cách thêm nước, metanol (4.16) hoặc axetonitril (4.15) để phân
giải pic tối đa và hiệu quả. Sắc đồ điển hình được nêu trong Phụ lục A.
7.2 Tạo dẫn xuất sau cột
Khi dùng PBPB, lắp hệ thống tạo dẫn xuất sau cột (xem 5.13.6), sau đó vận hành theo các thông số sau
đây:
- tốc độ dòng pha động 1,0 ml/min;
- tốc độ dòng thuốc thử tạo dẫn xuất là 0,30 ml/min (tốc độ này có thể điều chỉnh theo tốc độ của pha
động).
Khi sử dụng brom được điều chế bằng điện hóa (KOBRA cell ® 2)), lắp đặt cuvet và vận hành theo các
hướng dẫn của nhà sản xuất, sử dụng các thông số sau đây:
- tốc độ dòng pha động 1,0 ml/min;
- cường độ dòng điện 100 μA.

7.3 Chuẩn bị các dung dịch hiệu chuẩn đối với HPLC
Dùng pipet lấy dung dịch aflatoxin B1 (4.28) với thể tích như trong Bảng 1 cho vào bình định mức dung
tích 10 ml đã hiệu chuẩn, rồi cho bay hơi hỗn hợp dung dịch toluen và axetonitril đến khô dưới dòng nitơ
ở nhiệt độ phòng. Cho vào mỗi bình 3,5 ml metanol (4.16), thêm nước đến 10 ml và lắc kỹ để hòa tan
aflatoxin B1. Các dung dịch này bao trùm dải nồng độ aflatoxin B 1 từ 0,05 μg/kg đến 0,35 μg/kg trong các
điều kiện của tiêu chuẩn này.
CHÚ THÍCH: Metanol và nước khi được trộn với nhau thì thể tích của chúng bị giảm đi.
Bảng 1 - Chuẩn bị các dung dịch hiệu chuẩn HPLC
2)

 KOBRA cell® là tên thương mại của sản phẩm phù hợp bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện
cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng các sản phẩm
tương tự nếu cho kết quả tương đương.


Dung dịch hiệu chuẩn HPLC

Thể tích lấy từ dung dịch chuẩn Nồng độ khối lượng aflatoxin B1
trong dung dịch hiệu chuẩn
aflatoxin B1, ρ = 5,00 ng/ml
(xem 4.28)
ng/ml
μl

1

20

0,01

2

40

0,02

3

60

0,03

4

80

0,04

5

100

0,05

6

120

0,06

7

140

0,07

Việc chuẩn bị các dung dịch hiệu chuẩn có thể được thực hiện bằng cách sử dụng pipet hoặc dụng cụ
thủy tinh đã hiệu chuẩn sẵn có.
7.4 Đường chuẩn
Chuẩn bị đường chuẩn bằng cách bơm 1 000 μl các dung dịch hiệu chuẩn được nêu trong Bảng 1 vào hệ
thống HPLC bắt đầu mỗi ngày phân tích. Vẽ diện tích pic dựa vào khối lượng của aflatoxin B 1 đã bơm và
kiểm tra đường chuẩn về độ tuyến tính.
Chuẩn bị đường chuẩn thích hợp trong trường hợp hàm lượng aflatoxin B 1 trong mẫu nằm ngoài dải hiệu
chuẩn. Cách khác, dung dịch bơm để phân tích HPLC có thể được pha loãng đến hàm lượng aflatoxin B 1
thích hợp cho đường chuẩn đã thiết lập.
7.5 Xác định aflatoxin B1 trong dung dịch mẫu thử
Bơm phần dịch lỏng của dung dịch mẫu thử (6.3) vào hệ thống HPLC, sử dụng cùng một điều kiện như
đã dùng đối với chuẩn bị đường chuẩn.
7.6 Khẳng định aflatoxin B1
Để khẳng định aflatoxin B1, tháo cột HPLC ra khỏi thiết bị brom hóa và nối HPLC trực tiếp với detector
huỳnh quang. Tín hiệu aflatoxin B1 giảm đáng kể (10 lần hoặc nhiều hơn) khi tháo hệ thống tạo dẫn xuất
ra khỏi HPLC. Không ngắt dòng điện thiết bị brom hóa đang được kết nối vì brom có thể vẫn còn sót lại
trong màng cuvet.
Cách khác: có thể áp dụng kỹ thuật nhận biết bằng đo khối phổ bằng cách tiến hành phân tích sắc ký
lỏng khối phổ (LC-MS) hoặc sắc ký lỏng với khối phổ hai lần (LC-MS/MS).
8 Tính kết quả
Xác định nồng độ khối lượng aflatoxin B1, biểu thị bằng nanogam trên mililit (ng/ml) trong dung dịch bơm
từ đường chuẩn. Tính phần khối lượng, wafla, của aflatoxin B1 biểu thị bằng nanogam trên gam (ng/g),
theo Công thức (2):
w afla

V1 V3
V2 ms

afla

(2)

Trong đó:
ρafla
là nồng độ của aflatoxin B1 trong dung dịch thử đã được bơm và thu được từ đường chuẩn, tính
bằng nanogam trên mililit (ng/ml);
V1

là thể tích của dung môi đã lấy để chiết (ở đây là 250 ml), tính bằng mililit (ml);

V2
là thể tích của dịch chiết mẫu chưa pha loãng được lấy để làm sạch trên cột ái lực miễn nhiễm
(trong trường hợp này là 5 ml đến 10 ml), tính bằng mililit (ml);


V3
là thể tích thu được sau rửa giải khỏi cột ái lực miễn nhiễm (trong trường hợp này là 5 ml), tính
bằng mililit (ml);
ms

là khối lượng mẫu được lấy để phân tích (trong trường hợp này là 50 g) tính bằng gam (g).

9 Độ chụm
9.1 Yêu cầu chung

Các chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được nêu trong Bảng
B.1. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng cho các dải nồng
độ và các dải nồng độ phân tích và các chất nền khác với dải nồng độ phân tích và các chất nền đã nêu
trong Phụ lục B.
9.2 Độ lặp lại
Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm riêng rẽ thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau, do
một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, thực hiện trong cùng một khoảng thời gian ngắn nhất, không
được quá 5 % giá trị giới hạn lặp lại.
Các giá trị đối với thực phẩm dành cho trẻ nhỏ (thức ăn theo công thức dành cho trẻ sơ sinh) là:
x = 0,10 μg/kg

r = 0,011 μg/kg

(đã bổ sung aflatoxin B1)

x = 0,18 μg/kg

r = 0,067 μg/kg

(đã bổ sung aflatoxin B1)

x = 0,07 μg/kg

r = 0,028 μg/kg

x = 0,09 μg/kg

r = 0,020 μg/kg

x = 0,17 μg/kg

r = 0,059 μg/kg

9.3 Độ tái lập
Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm riêng rẽ thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến
hành thử trên vật liệu thử giống hệt nhau, được báo cáo từ hai phòng thử nghiệm không được quá 5 %
giá trị giới hạn tái lập R.
Giá trị đối với thực phẩm dành cho trẻ nhỏ (thức ăn theo công thức dành cho trẻ sơ sinh) là:
x = 0,10 μg/kg

r = 0,034 μg/kg

(đã bổ sung aflatoxin B1)

x = 0,18 μg/kg

r = 0,118 μg/kg

(đã bổ sung aflatoxin B1)

x = 0,07 μg/kg

r = 0,048 μg/kg

x = 0,09 μg/kg

r = 0,022 μg/kg

x = 0,17 μg/kg

r = 0,109 μg/kg

10 Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ:
a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu (loại mẫu, nguồn gốc của mẫu, ký hiệu);
b) viện dẫn tiêu chuẩn này;
c) ngày lấy mẫu và quy trình lấy mẫu (nếu biết);
d) ngày nhận mẫu;
e) ngày thử nghiệm;
f) kết quả thử nghiệm và các đơn vị biểu thị kết quả;
g) các điểm đặc biệt quan sát được trong quá trình thử nghiệm;


h) mọi chi tiết thao tác khác với quy định trong tiêu chuẩn này hoặc tùy chọn cũng như các sự cố bất kỳ
có thể ảnh hưởng đến kết quả.
Phụ lục A
(tham khảo)
Sắc đồ điển hình

CHÚ DẪN:
X

thời gian (phút)

Y

huỳnh quang (mV)

1

aflatoxin B1

Các điều kiện vận hành:
Cột

LC-18 Supelcosil® 3), đường kính trong 4,6 mm, dài 25 cm

Tốc độ dòng

1 ml/min

Pha động

HPLC pha động B, xem 4.22

Nhiệt độ cột

Nhiệt độ phòng

Thể tích bơm

1000 μl

Dẫn xuất

Brom được điều chế bằng phương pháp điện hóa

Detector
18 nm.

Huỳnh quang, bước sóng kích thích 365 nm, bước sóng phát xạ 435 nm, dải thông

Hình A.1 - Sắc đồ điển hình của aflatoxin B1, trong thức ăn theo công thức dành cho trẻ sơ sinh
sau khi làm sạch bằng cột ái lực miễn nhiễm (mức nhiễm aflatoxin B 1 là 0,1 μg/kg)
3)

 Supelcosil cell® là tên thương mại của sản phẩm phù hợp bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện
cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng các sản phẩm
tương tự nếu cho kết quả tương đương.


Phụ lục B
(tham khảo)
Dữ liệu về độ chụm
Dữ liệu sau đây (xem Bảng B.1) đã thu được trong nghiên cứu liên phòng thử nghiệm do Chương trình
Tiêu chuẩn, đo lường và thử nghiệm [6] của Ủy ban châu Âu tổ chức, thực hiện phù hợp với TCVN 69102 (ISO 5725-2) [1], TCVN 6910-4 (ISO 5725-4) [2] và TCVN 6910-6 (ISO 5725-6) [3]. Mẫu thử là thức ăn
dành cho trẻ nhỏ (thức ăn theo công thức dành cho trẻ sơ sinh), gồm mẫu nhiễm aflatoxin B 1 tự nhiên và
mẫu thêm chuẩn có aflatoxin B1. Giới hạn định lượng của phương pháp này đã được xác định là 0,05
μg/kg, tùy thuộc vào thiết bị sử dụng.
Bảng B.1 - Dữ liệu về độ chụm trong nghiên cứu liên phòng thử nghiệm đối với thực phẩm dành
cho trẻ nhỏ (thức ăn theo công thức dành cho trẻ sơ sinh)
1

2

3a

4a

5a

1999

1999

1999

1999

1999

Số lượng phòng thử nghiệm

14

14

14

14

14

Số lượng mẫu kép

1

1

1

1

1

Số lượng phòng thử nghiệm được giữa lại sau khi trừ
ngoại lệ

11

14

14

11

13

Số lượng ngoại lệ (phòng thử nghiệm)

3

0

0

3

1

Số lượng các kết quả được chấp nhận

11

14

14

11

13

Giá trị trung bình, x , μg/kg

0,10

0,18

0,07

0,09

0,17

Độ lệch chuẩn lặp lại, sr, μg/kg

0,004

0,024

0,010

0,007

0,021

3,5

13

14

8

12

Giới hạn lặp lại, r[r = 2,8 x sr], μg/kg

0,011

0,067

0,028

0,020

0,059

Độ lệch chuẩn tái lập, sR, μg/kg

0,012

0,042

0,017

0,008

0,039

12

23

23

9

23

0,034

0,118

0,048

0,022

0,109

Độ thu hồi, %

101

92

-

-

-

Giá trị HorRat, theo [7]

0,19

0,39

0,34

0,14

0,39

Giá trị HorRatR, theo [8]

0,55

1,05

1,01

0,41

1,05

Mẫu
Năm tiến hành phép thử liên phòng thử nghiệm

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSDr, %

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSDR, %
Giới hạn lặp lại, R[R = 2,8 x sR], μg/kg

a

Mẫu nhiễm tự nhiên
THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 6910-2 : 2001 (ISO 5725-2 : 1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và
kết quả đo - Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu
chuẩn.
[2] TCVN 6910-4 : 2001 (ISO 5725-4 : 1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và
kết quả đo - Phần 4: Phương pháp cơ bản xác định độ đúng của phương pháp đo tiêu chuẩn.
[3] TCVN 6910-6 : 2002 (ISO 5725-6 : 1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và
kết quả đo - Phần 6: Sử dụng các giá trị độ chính xác trong thực tế.


[4] Castegnaro M.; Barek J.; Fremy J.M; Lafontaine M; Sansone Ε.B.; Telling G.M., Laboratory
decontamination and destruction of carcinogens in laboratory wastes: some mycotoxins. IARC Scientific

Publication No. 113, International Agency for Research on Cancer, Lyon (France), 1991, p.63.
[5] Nesheim, S.; Trucksess, M.W.; Page, S.W., Molar absorptivities of aflatoxin B-1, B-2, G(1), and G(2) in
acetonitrile, methanol, and toluene-acetonitrile (9+1) (modification of AOAC official method 971.22):
Collaborative study, Journal of AOAC international, 1999, 82 (2), p. 251-258.
[6] Stroka, J.; Anklam, Ε.; Joerissen, U.; Gilbert, J., Immunoaffinity column clean-up with liquid
chromatography using post-column bromination for the determination of aflatoxin B 1 in baby food:
Collaborative study. Journal of AOAC International, 2001, 84, p. 1116.
[7] Horwitz, W.; Albert, R., The Horwitz Ratio (HorRat): A useful Index of Method Performance with
Respect to Precision. Journal of AOAC International, 2006, 89, p. 1095-1109.
[8] Thompson M., Recent trends in inter-laboratory precision at ppb and sub-ppb concentrations in
relation to fitness for purpose criteria in proficiency testing, Analyst, 2000, 125, p. 385-386.