Nghiên cứu chiết xuất cao đặc giàu flavonoid từ hạt cây cần tây ( Apium graveolens L.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN VĂN PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT
CAO ĐẶC GIÀU FLAVONOID
TỪ HẠT CÂY CẦN TÂY
(Apium graveolens L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
----------

NGUYỄN VĂN PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT
CAO ĐẶC GIÀU FLAVONOID
TỪ HẠT CÂY CẦN TÂY
(Apium graveolens L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU - DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN
MÃ SỐ: 8720206
Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Thu Hằng

HÀ NỘI 2019


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và lời cảm ơn chân thành nhất
đến PGS. TS. Nguyễn Thu Hằng, người đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và
giúp đỡ tôi vượt qua những khó khăn trong suốt thời gian qua, không chỉ trong quá trình
làm luận văn mà còn trong cả cuộc sống hàng ngày.
Bên cạnh đó, tôi cũng đã nhận được rất nhiều sự hỗ trợ từ các thầy cô, các anh
chị đang công tác trên bộ môn Dược liệu. Xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến mọi
người vì đã hết sức tạo điều kiện giúp tôi trong quá trình làm thực nghiệm tại bộ môn.
Để hoàn thành luận văn này cũng không thể không nhắc tới sự giúp đỡ nhiệt tình
của các anh chị, các bạn và các em đang nghiên cứu khoa học trên bộ môn. Đặc biệt, tôi
xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến hai em sinh viên: Ngô Minh Khoa và Lê Thị
Trang, những người đã gắn bó, đồng hành và sát cánh cùng tôi trong suốt thời gian qua.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Nhà trường, các phòng ban, cùng
toàn thể các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn tạo điều kiện tốt nhất
cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại trường.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt nhất đến gia đình, những người bạn đã
luôn giúp đỡ, chia sẻ, động viên, khích lệ tôi trong cuộc sống và học tập!
Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân còn hạn chế, nên
luận văn không tránh khỏi nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các
thầy cô, bạn bè để luận văn được hoàn thiện hơn.
Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 28 tháng 03 năm 2019
Học viên

Nguyễn Văn Phương


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 2
1.1. Tổng quan về hạt cần tây ..................................................................................... 2
1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố loài Apium graveolens L...............................2
1.1.2. Thành phần hóa học.......................................................................................3
1.1.3. Tác dụng sinh học ..........................................................................................7
1.1.4. Một số sản phẩm điều trị bệnh gút từ hạt cần tây trên thị trường ...............10
1.2. Các quy trình chiết xuất hạt cần tây ................................................................ 11
1.2.1. Quy trình chiết xuất của tác giả Nguyễn Thu Hằng và cộng sự ..................11
1.2.2. Quy trình chiết xuất của tác giả Chen Haisheng và cộng sự .......................11
1.2.3. Quy trình chiết xuất của tác giả Li Jianfeng và cộng sự .............................12
1.3. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất ........ 12
1.3.1. Phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT) .................................................12
1.3.2. Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) ..........................................................13
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 20
2.1. Nguyên liệu, thiết bị............................................................................................ 20
2.1.1. Nguyên liệu .................................................................................................20
2.1.2. Hóa chất, thiết bị..........................................................................................21
2.2. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................... 21
2.2.1. Nội dung 1: Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng flavonoid

toàn phần trong cao cần tây ...................................................................................22
2.2.2. Nội dung 2: Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cao
cần tây ....................................................................................................................22
2.2.3. Nội dung 3: Xây dựng quy trình chiết xuất hoàn chỉnh ..............................22
2.2.4. Nội dung 4: Khảo sát một số chỉ tiêu kiểm nghiệm cao cần tây .................22


2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 22
2.3.1. Quy trình chiết xuất dự kiến ........................................................................22
2.3.2. Phương pháp định lượng flavonoid toàn phần trong cao cần tây................23
2.3.3. Phương pháp khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cao
cần tây ....................................................................................................................24
2.3.4. Phương pháp xây dựng quy trình chiết xuất cao cần tây ............................26
2.3.5. Phương pháp khảo sát một số chỉ tiêu kiểm nghiệm cao cần tây ................26
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................. 28
3.1. Kết quả xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng flavonoid toàn phần
trong cao cần tây........................................................................................................ 28
3.1.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc ....................................................................28
3.1.2. Chuẩn bị dung dịch thử ...............................................................................28
3.1.3. Thẩm định phương pháp..............................................................................28
3.2. Kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cao cần
tây ................................................................................................................................ 34
3.2.1. Khảo sát kích thước dược liệu .....................................................................34
3.2.2. Khảo sát số lần chiết xuất ............................................................................35
3.2.3. Khảo sát thời gian chiết xuất .......................................................................36
3.2.4. Khảo sát tỷ lệ parafin : dược liệu ................................................................36
3.2.5. Khảo sát dung môi chiết xuất, nhiệt độ và tỷ lệ dung môi : dược liệu ........37
3.3. Kết quả xây dựng quy trình chiết xuất cao cần tây ........................................ 47
3.3.1. Quy trình chiết xuất cao cần tây ở quy mô 15 g dược liệu/mẻ....................47
3.3.2. Quy trình chiết xuất cao cần tây ở quy mô 500 g dược liệu/mẻ .................48

3.4. Khảo sát một số chỉ tiêu kiểm nghiệm cao cần tây.......................................... 48
3.4.1. Mô tả ............................................................................................................49
3.4.2. pH ................................................................................................................49
3.4.3. Định tính ......................................................................................................49
3.2.4. Mất khối lượng do làm khô .........................................................................52
3.2.5. Định lượng ...................................................................................................52


CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ........................................................................................... 55
4.1. Về nguyên liệu hạt cần tây ................................................................................. 55
4.2. Về các quy trình chiết xuất hạt cần tây đã công bố ........................................ 56
4.3. Về các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cao cần tây ..................... 57
4.4. Về kết quả xây dựng quy trình chiết xuất cao cần tây ................................... 60
4.5. Về kết quả khảo sát một số chỉ tiêu kiểm nghiệm cao cần tây ....................... 62
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ......................................................................................... 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
3nB

3 - n – butylphtalid

95%CI

khoảng tin cậy 95%

ADP

adenosine diphosphate

APTT

thời gian Thromboplastin từng phần hoạt hóa
(Activated partial thromboplastin time)

CCD

mô hình phức hợp trung tâm (Central composite design)

GC/MS

sắc ký khí - khối phổ (Gas chromatography–mass spectrometry)

LOD

giới hạn phát hiện (Limit of detection)

LOQ

giới hạn định lượng (Limit of quantification)

kl/tt

khối lượng/thể tích

NP

thuốc thử Natural Product

OFAT

phương pháp thay đổi một yếu tố (One factor at a time)

PT

thời gian Prothrombin (Prothrombin time)

RSM

phương pháp bề mặt đáp ứng (Response surface methodology)

SD

độ lệch chuẩn (Standard deviation)

SKLM

sắc ký lớp mỏng

STT

số thứ tự

TB

trung bình

TT

thời gian Thrombin (Thrombin time)

tt/tt

thể tích/thể tích

XO

xanthin oxidase


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Tên bảng

Trang

1.1

Các hợp chất flavonoid trong hạt cần tây

3

3.1

Kết quả khảo sát độ phù hợp hệ thống của phương pháp định lượng

28

3.2

Kết quả đo độ hấp thụ của dãy dung dịch chuẩn

29

3.3

Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng

31

3.4

Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng

32

3.5

Kết quả xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng
(LOQ)

33

3.6

Kết quả khảo sát kích thước dược liệu

34

3.7

Kết quả khảo sát số lần chiết xuất

35

3.8

Kết quả khảo sát thời gian chiết xuất

36

3.9

Kết quả khảo sát tỷ lệ parafin : dược liệu

37

3.10

Thiết kế thí nghiệm chiết xuất cao cần tây và kết quả thực nghiệm

40

3.11

Kết quả phân tích phương sai ANOVA của các mô hình

40

3.12

Kết quả đánh giá sai số của các mô hình

44

3.13

Kết quả kiểm định mô hình bằng thực nghiệm

46

3.14

Kết quả thực hiện quy trình chiết xuất quy mô 500 g dược liệu/mẻ

48

3.15

Kết quả pH dung dịch 1% (kl/tt) trong nước của 6 mẫu cao cần tây

49

3.16

Kết quả các phản ứng định tính flavonoid trong 6 mẫu cao cần tây

50

3.17

Kết quả xác định mất khối lượng do làm khô của 6 mẫu cao cần tây

52

3.18

Kết quả định lượng flavonoid toàn phần trong 6 mẫu cao cần tây

53


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình
1.1
1.2

1.3

1.4

2.1

Tên hình
Khung cấu trúc của flavonoid trong hạt cần tây
Sơ đồ các bước tối ưu hóa quy trình chiết xuất bằng phương pháp bề

mặt đáp ứng (RSM)
Sơ đồ thiết kế thí nghiệm tối ưu theo mô hình phức hợp trung tâm
(CCD)
Số lượng công bố về tối ưu hóa quy trình chiết xuất bằng RSM hàng
năm trong giai đoạn 2009 – 2018
Ảnh chụp mẫu dược liệu hạt cần tây dưới kính lúp soi nổi Leica
EZ4

Trang
3
15

17

19

20

2.2

Sơ đồ tóm tắt dự kiến quy trình chiết xuất cao cần tây

23

3.1

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ apigenin

30

3.2

3.3

3.4
3.5

Đồ thị biểu thị sự phụ thuộc của hàm lượng flavonoid toàn phần vào
nồng độ ethanol và nhiệt độ chiết xuất
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của tỷ lệ cao chiết được vào nồng độ
ethanol, nhiệt độ chiết xuất và tỷ lệ dung môi : dược liệu
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hàm kỳ vọng vào nồng độ ethanol
và nhiệt độ chiết xuất
Ảnh chụp sắc ký đồ định tính cao cần tây bằng SKLM

42

43

46
51


ĐẶT VẤN ĐỀ

Cần tây (Apium graveolens L.) là loại cây rau ăn được trồng rất phổ biến trên thế
giới và đã được di thực về trồng ở Việt Nam. Hạt cần tây được đánh giá là dược liệu
tiềm năng để phát triển sản phẩm phòng và điều trị bệnh gút do tác dụng hạ acid uric
[57], ức chế xanthin oxidase [5], chống viêm [65], giảm đau [63] của dược liệu này đã
được chứng minh trên thực nghiệm. Tại một số quốc gia đã có sản phẩm từ hạt cần tây

để điều trị hoặc hỗ trợ điều trị bệnh gút như Cachets Lesourd (Gabriel Lesourd
Laboratoires - Pháp), Celery Plus (Swiss Bio Pharma - Thụy sĩ), Rheumatic Pain (The
Cantassium Company - Anh), Arthritic Pain Herbal Formula 1 (Mayne Pharma - Mỹ),
Apium Graveolens (Standard Homeopathic - Canada)…[82].
Flavonoid là một trong những thành phần chính của hạt cần tây [38], đồng thời
cũng là nhóm hợp chất liên quan đến tác dụng hạ acid uric và chống viêm của dược liệu
này [32]. Vì vậy, việc nghiên cứu chiết xuất nhóm hợp chất flavonoid từ hạt cần tây làm
cơ sở để phát triển các dạng bào chế từ dược liệu này là cần thiết.
Tại Việt Nam, cao cần tây chiết xuất theo quy trình của tác giả Nguyễn Thu Hằng
và cộng sự có tác dụng hạ acid uric, chống viêm và giảm đau in vivo [3], [26]. Tuy nhiên,
quy trình chiết xuất trong nghiên cứu trên vẫn còn một số nhược điểm. Các yếu tố ảnh
hưởng đến quá trình chiết xuất chưa được khảo sát để đưa ra điều kiện chiết xuất tối ưu.
Do đó, để tiếp tục hoàn thiện quy trình, đề tài luận văn thạc sĩ “Nghiên cứu chiết
xuất cao đặc giàu flavonoid từ hạt cây cần tây (Apium graveolens L.)” được thực hiện
với hai mục tiêu:
1. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng và điều kiện thích hợp đến quá trình chiết xuất
cao đặc chứa flavonoid từ hạt cần tây.
2. Khảo sát một số chỉ tiêu kiểm nghiệm cao hạt cần tây.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về cây cần tây và hạt cần tây
1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố loài Apium graveolens L.
Tên Việt Nam: Cần tây
Tên tiếng Anh: Celery
Tên khoa học: Apium graveolens L., họ Cần (Apiaceae)
1.1.1.1. Đặc điểm thực vật
Cây thảo, có mùi thơm, sống 1-2 năm, thân mọc đứng, có rãnh dọc, phân nhánh, cao

khoảng 15 - 150 cm. Lá thuôn dài hoặc hình trứng, dài 7 - 18 cm, rộng 3,5 - 8 cm, xẻ 3
thùy hình tam giác. Thùy cuối có răng cưa hoặc khía, dài 1,2 - 2,5 cm, rộng 0,8 - 2,5 cm.
Lá phía trên có cuống ngắn, phiến hình tam giác, xẻ sâu 3 thùy, thùy cuối hình trứng.
Lá ở gốc có cuống, bẹ to rộng, hình tam giác, xẻ 3 - 5 thùy hình tam giác, đầu tù, mép
khía răng to, không lông. Cụm hoa dạng tán, rộng 1,5 - 4,0 cm, mọc đối diện với lá, gồm
nhiều tán dài, ngắn không đều, các tán ở đầu có cuống dài hơn các tán bên trong và có
kích thước 4 - 15 mm. Tán kép mang 8 - 12 tán, tán hoa có 7 - 25 hoa, kích thước 6 - 9
mm theo chiều ngang. Hoa phía ngoài có 3-8 (-16) cánh hoa mảnh, kích thước 0,5 2,5cm, cuống dài 1 - 1,5 mm. Quả (thường được gọi là hạt [19]) dạng trứng, hơi dẹt,
tròn hai đầu, nhẵn, có 5 cánh lồi chạy dọc thân, đường kính 1,3 - 1,5 mm, chiều dài 1-2
mm [2], [54].
Mùa ra hoa và quả vào tháng 4 - 6 [54].
1.1.1.2. Phân bố
Cây có nguồn gốc ở khu vực bờ biển Đại Tây Dương và Địa Trung Hải, được trồng
rộng rãi ở các nước phương Tây. Tại Việt Nam, cần tây được di thực, trồng ở nhiều nơi
làm rau ăn [2].

2


1.1.2. Thành phần hóa học
Hạt cần tây có chứa flavonoid, tinh dầu, saponin, coumarin, tanin, đường khử, lipid,
caroten. Trong đó, thành phần hóa học chính là các hợp chất flavonoid, tinh dầu và
coumarin [4], [33].
1.1.2.1. Flavonoid
Flavonoid là một trong những nhóm chất chuyển hóa thứ cấp quan trọng nhất trong
hạt cần tây [43]. Theo các tài liệu thu thập được, cho đến nay đã phát hiện được 19 hợp
chất flavonoid trong hạt cần tây với khung cấu trúc được thể hiện ở hình 1.1. Trong đó,
hai thành phần chính là apigenin và apiin [46], [79], [80].

Hình 1.1. Khung cấu trúc của flavonoid trong hạt cần tây

Các hợp chất flavonoid trong hạt cần tây được trình bày tóm tắt ở bảng 1.1.
Bảng 1.1. Các hợp chất flavonoid trong hạt cần tây

TT

Tên hợp chất

R1

R2

R3

1

Apigenin

H

H

H

2

Apiin

H

H

3

TLTK
[46],[62],
[80]

[46],[62],
[80]


Apigenin-7-O[2′′-O-(5′′′-O3

feruloyl)-β-d-

H

H

[80]

H

H

[46]

H

H

[46]

H

OCH3

[46]

H

OCH3

[46]

H

OCH3

[80]

apiofuranosyl]-βd-glucopyranosid

4

6''-Malonylapiin

Apigenin 7-O5

malonylapiosylglucosid

Chrysoerinol-7O-apiosyl

6

glucosid
(Graveobiosid B)

7

Chrysoerinol-7O-glucosid
Chrysoeriol-7-O[2′′-O-(5′′′-O-

8

feruloyl)-β-Dapiofuranosyl]-βd-glucopyranosid

4


Chrysoeriol 7-O9

6′′-malonyl

H

OCH3

[46]

H

OCH3

[46]

H

OCH3

[46]

H

OH

[67], [79]

OCH3

OH

[46]

H

OH

[46]

H

OH

[46]

apiosylglucosid

Chrysoeriol 7-O10

6′′-malonyl
glucosid

Chrysoeriol 7-O11

malonylapiosylglucosid

12

Luteolin

H

Luteolin-3-methyl
13

ether-7-apiosyl
glycosid

Luteolin-7-O14

apiosyl glucosid
(Graveobiosid A)

15

Luteolin-7-Oglucosid

5


Luteolin 7-O-6′′16

malonyl-

H

OH

[46]

H

OH

[46]

H

OH

[46]

OH

H

[79], [80]

apiosylglucosid

17

Luteolin 7-O-6′′malonyl glucosid
Luteolin 7-O-

18

malonylapiosylglucosid

19

Kaempferol

H

Nhận xét: Các flavonoid trong hạt cần tây đều có cấu trúc flavon. Trong đó, chủ
yếu là các dẫn xuất glycosid của apigenin, luteolin và chrysoerinol. Một số nghiên cứu
đã chỉ ra rằng flavonoid trong hạt cần tây, đặc biệt là apigenin và apiin có các tác dụng
dược lý liên quan đến bệnh gút như hạ acid uric, ức chế xanthin oxidase, giảm đau và
chống viêm [35], [45], [53].

1.1.2.2. Tinh dầu
Bằng phương pháp cất kéo hơi nước, đã xác định được hàm lượng tinh dầu của
hạt cần tây là 2,52%. Phân tích tinh dầu hạt cần tây bằng phương pháp sắc ký khí kết
hợp khối phổ (GC/MS), kết quả xác định được 28 thành phần với thành phần chính là
β-selinen (48,22%) [27], [33], limonen (24,32%) [14], [27], [33]. Căn cứ vào cấu trúc,
các thành phần trong tinh dầu hạt cần tây gồm 3 nhóm: dẫn xuất phthalid, terpen và các
chất có cấu trúc khác. Trong đó, đáng chú ý là các hợp chất thuộc nhóm dẫn xuất phthalid
như 3-n-butyl phthalid [16], sedanolid [58], sedanenolid [72].

6


1.1.2.3. Coumarin
Theo các tài liệu đã công bố, cho đến nay, 20 hợp chất furanocoumarin đã được
phát hiện trong hạt cần tây [10], [11], [15]. Một số hợp chất điển hình như: umbelliferon
[52], psoralen [10], [20], bergapten [20], [81], xanthotoxin [20], [81] và isopimpinellin
[17].
1.1.2.4. Lipid
Hạt cần tây chứa một lượng lớn lipid, do đó, trong quá trình chiết xuất có thể gây
ảnh hưởng đến chất lượng dịch chiết. Ngoài ra, lipid cũng có thể gây ra một số vấn đề
trong quá trình xay nghiền như hiện tượng quá nhiệt làm ảnh hưởng đến quá trình vận
hành của thiết bị hay làm phân hủy hoạt chất [70]. Hàm lượng lipid trong hạt cần tây
dao động trong khoảng 15,0% - 25,4%, trong đó chủ yếu là triester của acid petroselinic
(38,7%) và các acid béo không no khác như acid oleic, acid linoleic…[60], [70].
1.1.3. Tác dụng sinh học
1.1.3.1. Tác dụng hạ acid uric và ức chế xanthin oxidase
Cao ethanol chiết từ hạt cần tây cả 3 liều 250 mg/kg, 500 mg/kg và 1000 mg/kg,
uống liên tục trong 5 ngày có tác dụng làm giảm nồng độ acid uric huyết thanh trên
chuột nhắt so với lô chứng lần lượt là 59,3%; 52,6% và 43,8%. Mặt khác, cao cần tây
liều 250 mg/kg, 500 mg/kg làm giảm hoạt độ xanthin oxidase (XO) gan chuột thí nghiệm

tương ứng 12,1% và 10,5% [26].
Một nghiên cứu khác được tiến hành trên chuột, sử dụng dịch chiết hạt cần tây
với ethanol 95% sau khi tinh chế bằng dung môi hữu cơ (ethyl acetat, cloroform...) và
sắc kí cột. Kết quả, sau 7 ngày sử dụng dịch chiết trên với mức liều 3,3g/kg trên mô hình
gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat, nồng độ acid uric trong máu của lô thử giảm
42,7% so với lô chứng [37]. Trên mô hình tương tự song thay đổi quy trình chiết xuất,
sử dụng phương pháp chiết hồi lưu với dung môi ethanol 80% (1 giờ/lần x 3 lần), nồng
độ acid uric lô thử giảm 17,74% so với lô chứng (p < 0,05) sau 6 tuần uống dịch chiết
cần tây với mức liều 2,25 g/kg [31].

7


Dịch chiết ethanol toàn phần và các phân đoạn dịch chiết từ hạt cần tây đã được
đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase in vitro. Kết quả cho thấy phân đoạn
cloroform và phân đoạn ethyl acetat từ hạt cần tây đều thể hiện tác dụng ức chế XO in
vitro một cách rõ rệt ở cả 3 nồng độ thí nghiệm 10 µg/ml, 50 µg/ml và 100 µg/ml. Dịch
chiết ethanol toàn phần hạt cần tây chỉ thể hiện tác dụng ức chế XO ở 2 nồng độ cao là
50 µg/ml và 100 µg/ml [5].
1.1.3.2. Tác dụng chống viêm
Trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan, cao ethanol chiết từ hạt
cần tây liều 250 mg/kg và 500 mg/kg đều có tác dụng ức chế phù bàn chân chuột so với
lô chứng tại thời điểm 1 giờ sau khi gây viêm (p < 0,05). Tỷ lệ ức chế phù của lô thử so
với lô chứng lần lượt là 37,6% và 60,6% [3].
Trên mô hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối bằng tinh thể natri urat, cao
ethanol chiết từ hạt cần tây liều 250 mg/kg uống liên tục trong 5 ngày làm giảm triệu
chứng viêm so với lô chứng tại thời điểm 4 và 5 giờ sau khi gây viêm (p < 0,01 và p <
0,05). Cao cần tây liều 500 mg/kg uống liên tục trong 5 ngày làm giảm triệu chứng viêm
so với lô chứng tại cả ba thời điểm 4; 5 và 6 giờ sau khi gây viêm (p < 0,01 và p < 0,05
[3].

1.1.3.3. Tác dụng giảm đau
Trên mô hình Randall-Selitto, cao ethanol chiết từ hạt cần tây liều 250 mg/kg và
500 mg/kg có tác dụng tăng ngưỡng phản ứng đau của chuột so với lô chứng tại các thời
điểm 1 giờ và 2 giờ sau khi tiêm carrageenan (p < 0,05) [3]. Trên mô hình tương tự song
sử dụng dịch chiết ethanol của hạt cần tây đã được tinh chế bằng CO2 siêu tới hạn cho
kết quả: dịch chiết sử dụng với mức liều 70mg/kg có tác dụng tương đương với ibuprofen
liều 200mg/kg thể trọng chuột.
Trên mô hình gây quặn đau bằng acid acetic (phương pháp Koster), cao ethanol
chiết từ hạt cần tây liều 250 mg/kg làm giảm số cơn quặn đau của chuột nhắt trắng so
với lô chứng trong khoảng thời gian từ phút thứ 10 đến 15 (p < 0,01); từ phút 15 đến 20
(p < 0,05); từ phút 20 đến 25 (p < 0,01) [3].

8


Theo tác giả S. Nasri, dịch chiết ethanol từ hạt cần tây thể hiện tác dụng giảm
đau thông qua cơ chế tương tác với receptor NMDA và tác động vào quá trình sản sinh
NO [63].
1.1.3.4. Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu và kéo dài thời gian đông máu
Dịch chiết ethanol hạt cần tây thể hiện tác dụng ức chế rõ rệt sự ngưng tập tiểu
cầu in vitro gây ra bởi ADP so với mẫu chứng ở nồng độ rất thấp (0,05 mg/ml) (p <
0,05) và ở các nồng độ 0,10 mg/ml; 1,00 mg/ml; 2,00 mg/ml và 3,00 mg/ml dịch chiết
hạt cần tây thể hiện tác dụng mạnh hơn dung dịch aspirin 81 µg/ml (p < 0,01) với % ức
chế tương ứng là 54,08%; 63,78%; 67,35% và 72,44% (% ức chế của aspirin 81 µg/ml
là 47,88%) [6]. Trong đó, apigenin, một hợp chất flavonoid, đóng vai trò quyết định đến
tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu của dịch chiết hạt cần tây [34], [70]
Dịch chiết ethanol hạt cần tây ở các nồng độ 6,0 mg/ml; 7,5 mg/ml và 10,0 mg/ml
có tác dụng kéo dài các thời gian đông máu PT, APTT và TT so với mẫu chứng (p <
0,05) [6].
1.1.3.5. Tác dụng hạ huyết áp

Dịch chiết n-hexan, methanol và ethanol 80% của hạt cần tây đều có tác dụng
làm giảm huyết áp và tăng nhịp tim so với lô chứng trên chuột. Ở mức liều 300 mg/kg,
dịch chiết n-hexan, methanol và ethanol 80% của hạt cần tây làm giảm huyết áp tương
ứng 38, 24 và 23 mmHg, đồng thời làm tăng nhịp tim tương ứng là 60, 25 và 27
nhịp/phút. Mức liều được quy đổi cho người trưởng thành nặng 60 kg là 3000 mg [56].
Cơ chế có thể liên quan đến tác dụng chẹn kênh calci của 3-n-butylphthalid (3nB), một
thành phần quan trọng trong tinh dầu hạt cần tây [70].
Trong một thử nghiệm lâm sàng đơn nhóm trên 30 bệnh nhân tăng huyết áp vừa
và nhẹ, sử dụng dịch chiết hạt cần tây chuẩn hóa chứa 85% 3-n-butylphthalid với mức
liều 150mg/ngày trong 6 tuần làm giảm huyết áp tâm thu và huyết áp tâm trương lần
lượt 8,2 mmHg (p < 0,005) và 8,5 mmHg (p < 0,005) [47].

9


1.1.3.6. Tác dụng chống ung thư
Hạt cần tây chiết bằng CO2 siêu tới hạn được đánh giá tác dụng chống ung thư in
vitro trên dòng tế bào Hs746T (ung thư dạ dày) bằng mô hình MTT. Ở mức liều 300
µg/ml, dịch chiết cần tây ức chế 23,1% quá trình tăng trưởng tế bào Hs746T thông qua
tăng cường biểu hiện gen Cx43 (p < 0,01), một gen đóng vai trò quan trọng trong chu
trình tự chết tế bào (apoptosis) [30].
Một số nghiên cứu in vitro và in vivo đã chỉ ra apigenin - một flavonoid có trong
hạt cần tây, có thể kích hoạt chu trình tự chết tế bào apoptosis và/hoặc quá trình tự thực
bào autophagy. Đây là hai quá trình đóng vai trò then chốt trong việc thúc đẩy và ngăn
chặn sự phát triển của khối u [71].
1.1.3.7. Tác dụng hạ đường huyết
Trên mô hình gây tăng đường huyết bằng streptozotocin, dịch chiết n-hexan hạt
cần tây liều 200mg/kg làm giảm nồng độ glucose trong máu 57%, so với nhóm chứng
(glibenclamid) là 53%, nồng độ insulin tăng từ 5,2 đến 10,73 μIU/ml, so với nhóm chứng
là 10,87 μIU/ml [74].

1.1.3.8. Một số tác dụng khác
Bên cạnh các tác dụng trên, hạt cần tây còn thể hiện một số tác dụng khác như:
hạ lipid máu [49], cải thiện trí nhớ [18], [73], chống dị ứng, kháng khuẩn [14], [61],
[75], kháng nấm [50], chống oxy hóa [12], [24], chống loét dạ dày [14], trừ muỗi [42],
giải độc và bảo vệ gan [64].
1.1.4. Một số sản phẩm điều trị bệnh gút từ hạt cần tây trên thị trường
Một số quốc gia trên thế giới đã có sản phẩm điều trị hoặc hỗ trợ điều trị bệnh
gút từ hạt cần tây trên thị trường. Có thể kể đến một số thương hiệu như Arthritic Pain
Herbal Formula 1 (Mayne Pharma – Mỹ), Celery Plus (Swiss Bio Pharma - Thụy Sĩ),
Apium Graveolens (Boiron - Pháp), Thompson celery (Thompson – Úc)... với các dạng
bào chế đa dạng, linh hoạt từ viên nang, viên nén tới bột, trà...[82]. Một số sản phẩm
đáng chú ý bao gồm:

10


Loạt các sản phẩm Holland & Barret Celery Seed Capsules, GNC Live Well
Celery Seed Capsules, Life Cycle Celery Seed Capsules, Nature’s Garden Celery Seed
Capsules và Nature’s Bounty Celery Seed Capsules được sản xuất bởi công ty NBTY
Europe Limited dưới dạng bào chế viên nang gồm các thành phần bột cao khô cần tây
và tá dược vừa đủ. Các sản phẩm này đã được Cục quản lý Dược Anh cấp phép đăng ký
sản phẩm thuốc cổ truyền (Traditional herbal medicinal product - THMP) ngày
5/10/2011 với chỉ định cho các bệnh nhân gút vừa và nhẹ.
Solgar Celery Seed Capsules: Được sản xuất bởi công ty Solgar UK Ltd. dưới
dạng bào chế viên nang cứng. Mỗi viên nang chứa 112mg cao khô từ hạt cần tây và các
tá dược vừa đủ. Sản phẩm cũng được Cục quản lý Dược Anh cấp phép đăng ký sản
phẩm thuốc cổ truyền ngày 16/12/2011 với chỉ định trong các trường hợp bệnh nhân gút
vừa và nhẹ.
1.2. Các quy trình chiết xuất hạt cần tây
1.2.1. Quy trình chiết xuất của tác giả Nguyễn Thu Hằng và cộng sự

Hạt cần tây được phơi khô, xay nhỏ và ngâm với ethanol 96% ở nhiệt độ phòng
3 lần, mỗi lần 72 giờ. Gộp các dịch chiết, đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm
thu được dịch chiết đặc. Phân tán dịch chiết đặc trong nước, lắc với ether dầu hỏa đến
khi không còn chất béo. Dịch chiết sau khi lắc với ether dầu hỏa được đem cô cách thủy
ở 80oC tới khi thu được cao đặc [3].
1.2.2. Quy trình chiết xuất của tác giả Chen Haisheng và cộng sự
Hạt cần tây phơi khô, chiết với ethanol 75% - 95% (tt/tt) bằng phương pháp chiết
nóng. Tỷ lệ dung môi : dược liệu là 15 - 20 ml/g. Tiến hành chiết 3 - 4 lần, thời gian mỗi
lần là 1 - 1,5h. Dịch chiết được cô dưới áp suất giảm ở 55℃ tới khi không còn ethanol.
Pha loãng dịch chiết 1 - 2 lần bằng nước và lắc 3 lần với ether dầu hỏa (60 - 90℃) tỷ lệ
3:1. Dịch chiết nước sau khi loại tạp được chiết với ethyl acetat 4 lần. Gộp dịch chiết,
cất thu hồi ethyl acetat thu được cao đặc [32].

11


1.2.3. Quy trình chiết xuất của tác giả Li Jianfeng và cộng sự
Hạt cần tây xay nhỏ, chiết hồi lưu với ethanol 95% (tt/tt) 1 - 2 lần, mỗi lần 0,5 1,5h. Thể tích dung môi sử dụng là 2 - 4 ml ứng với 1g dược liệu. Gộp dịch chiết, cất
thu hồi dung môi dưới áp suất giảm tới khi không còn ethanol. Pha loãng dịch chiết đặc
với nước và lắc với ethyl acetat nhiều lần. Gộp các dịch chiết ethyl acetat, làm khan và
loại dung môi thu được cao đặc [37].
1.3. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất
1.3.1. Phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT)
Phương pháp thay đổi một yếu tố (One factor at a time - OFAT) dựa trên nguyên
tắc thay đổi giá trị của thông số cần khảo sát trong khi giữ nguyên các thông số khác ở
điều kiện tối ưu đã được xác định từ các thí nghiệm khảo sát trước đó. So sánh kết quả
giữa các thí nghiệm này có thể cho phép xác định trực tiếp liệu yếu tố khảo sát có thực
sự ảnh hưởng và ảnh hưởng như thế nào tới quy trình chiết xuất [23].
Trong các thí nghiệm thiết kế theo phương pháp OFAT, chỉ một yếu tố được phép
thay đổi. Các yếu tố khác sẽ được giữ cố định và kiểm soát chặt chẽ. Ảnh hưởng của

những yếu tố này đến quy trình chiết xuất phải được chuẩn hóa, loại trừ hoặc đảm bảo
không đổi giữa các thí nghiệm. Nếu không, sẽ rất khó khăn cho nhà nghiên cứu trong
việc phân tích ảnh hưởng của yếu tố đang xét đến quy trình chiết xuất [36].
Phương pháp OFAT là một trong những phương pháp thường dùng để xác định
ảnh hưởng của các yếu tố đến quy trình với nhiều ưu điểm như đơn giản, dễ thực hiện,
không đòi hỏi thống kê và phân tích dữ liệu. Phương pháp này còn đặc biệt tỏ ra hữu
dụng trong những trường hợp số lượng các yếu tố hay giá trị cần khảo sát không nhiều,
các biến hoàn toàn độc lập và không có tương tác, ảnh hưởng của yếu tố gây nhiễu là
rất nhỏ so với các yếu tố khảo sát [21].
Tuy nhiên, phương pháp này cũng có một vài hạn chế như đòi hỏi một lượng lớn
thí nghiệm, đặc biệt khi số lượng yếu tố khảo sát tăng lên. Thứ hai, phương pháp này
không xét đến ảnh hưởng gây ra bởi sự tương tác giữa các yếu tố. Tương tác này thường
không thể hiện ra trong nghiên cứu theo phương pháp OFAT song có thể nhận ra khi

12


lựa chọn được phương pháp thí nghiệm thích hợp. Ngoài ra, phương pháp này chỉ đưa
ra điều kiện tối ưu nằm trong các giá trị khảo sát. Do đó, đối với những yếu tố có khoảng
khảo sát rộng, ví dụ nhiệt độ, để tìm ra điều kiện tối ưu trong toàn bộ khoảng khảo sát
là hết sức tốn kém về thời gian, công sức và chi phí. Để khắc phục những nhược điểm
trên, một loạt các phương pháp thiết kế thí nghiệm dựa trên những nguyên lý thống kê
(Design of Experiments – DoE) đã được đưa ra. Trong đó, bề mặt đáp ứng là một trong
số những phương pháp thường được sử dụng nhất [21].
1.3.2. Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)
Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response surface methodology - RSM) là một tập
hợp những nguyên lý về thống kê để xây dựng, phát triển, cải thiện và tối ưu hóa một
công thức cũng như một quy trình nhất định [59].
1.3.2.1. Giải thích thuật ngữ
- Biến đầu ra (Biến phụ thuộc, đáp ứng): Là các kết quả của thí nghiệm mà người

làm thí nghiệm cần phải đo đạc và đánh giá. Ví dụ: tỷ lệ cao chiết được, hàm
lượng hoạt chất...
- Biến đầu vào (Biến độc lập, yếu tố): Là các thông số, điều kiện ban đầu khi thay
đổi sẽ làm thay đổi biến đầu ra. Căn cứ vào khả năng kiểm soát, người ta chia
biến đầu vào làm 2 loại: biến kiểm soát được (ví dụ: nhiệt độ, dung môi...) và
biến không kiểm soát được (ví dụ độ ẩm môi trường...).
- Mức yếu tố: Mỗi mức yếu tố là một giá trị của biến đầu vào trong thiết kế thí
nghiệm. Ví dụ: khảo sát nhiệt độ chiết xuất với 3 mức tương ứng là: 20, 25, 30°C.
- Bề mặt đáp ứng: Là đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của biến đầu ra vào các biến
đầu vào.
- Mô hình: Là một phương trình biểu diễn sự phụ thuộc của biến đầu ra vào một
hoặc nhiều biến đầu vào. Trong RSM thường sử dụng 3 loại mô hình chính: mô
hình tuyến tính (linear model), mô hình tương tác bậc 2 (interaction model) và
mô hình bậc 2 (quadratic model). Trong đó, mô hình bậc 2 thường được sử dụng
phổ biến hơn cả để xác định giá trị tối ưu của biến đầu ra. Trường hợp tổng quát
của mô hình này có dạng:
13


𝑛

𝑛

𝑛−1

𝑛

𝑌 = 𝛽0 + ∑ 𝛽𝑖 𝑋𝑖 + ∑ 𝛽𝑖𝑖 𝑋𝑖2 + ∑ ∑ 𝛽𝑖𝑗 𝑋𝑖 𝑋𝑗
𝑖=1

Trong đó:

𝑖=1

𝑖=1 𝑗=𝑖+1

Y là biến đầu ra
Xi là các biến đầu vào
βi là các hệ số tương ứng

- Hàm mục tiêu (hàm kỳ vọng): Là một hàm số được lập ra trên cơ sở tiêu chuẩn
tối ưu đã được lựa chọn. Hàm mục tiêu là hàm thể hiện kết quả mà người thực
hiện phải đạt được, là tiêu chuẩn tối ưu ở dạng hàm, phụ thuộc vào yếu tố đầu
vào.
- Tối ưu hóa: Tối ưu hoá một quy trình là việc tìm ra các thông số (hay điều kiện
tiến hành) của quy trình để sản phẩm làm ra đạt chất lượng tốt nhất trong giới
hạn mong muốn của người làm thí nghiệm [48].
1.3.2.2. Quy trình tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)
Các bước tối ưu hóa quy trình chiết xuất bằng RSM được trình bày tóm tắt ở sơ
đồ hình 1.2 [39].

14


Lựa chọn biến đầu vào, biến đầu ra

Thiết kế thí nghiệm

Xây dựng mô hình

Sàng lọc biến

Đánh giá mô hình

Không

Mô hình có đạt
chất lượng tốt?

Có
Tối ưu hóa

Kiểm chứng bằng thực nghiệm

Hình 1.2. Sơ đồ các bước tối ưu hóa quy trình chiết xuất
bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) [39]
Lựa chọn biến đầu vào, biến đầu ra
Giai đoạn này còn được gọi là giai đoạn sàng lọc (screening experiment). Mục
tiêu của bước sàng lọc này là để giảm thiểu số lượng biến đầu vào từ một danh sách các
yếu tố ảnh hưởng, chỉ giữ lại những biến độc lập quan trọng, có ảnh hưởng lớn đến biến
phụ thuộc. Nhờ đó, giúp làm giảm đáng kể số lượng thí nghiệm cần phải thực hiện.
Các biến đầu vào được lựa chọn phải thỏa mãn các điều kiện sau:

15


- Là biến độc lập, có thể dễ dàng điều chỉnh. Sự thay đổi giá trị của từng biến này
dẫn đến sự thay đổi của biến đầu ra là hoàn toàn độc lập, không phụ thuộc và kéo
theo sự thay đổi của các yếu tố khác.
- Là các biến định lượng. Do đó các yếu tố định tính không có trị số xác

định cụ thể như: loại dung môi, loại tá dược… không thể đưa vào làm yếu tố đầu
vào của RSM. Tuy nhiên, với sự phát triển của các công cụ toán học hiện nay,
nhiều mô hình đã cho phép đánh giá ảnh hưởng của các biến định tính.
Để lựa chọn các biến độc lập, có thể căn cứ vào: cơ sở lý thuyết, ý kiến chuyên
gia, các nghiên cứu tương tự hay trực tiếp tiến hành các thí nghiệm thăm dò và sàng lọc.
Thiết kế thí nghiệm
Phương pháp thiết kế thí nghiệm được Fisher đưa ra lần đầu tiên vào năm
1926, sau đó được tiếp tục phát triển và hoàn thiện bởi các tác giả Box, Hunter, Scheffé,
Tagushi. Tính cho tới thời điểm hiện tại, đã có nhiều phương pháp thiết kế thí nghiệm
được đưa ra như Box–Behnken (BBD), Doehlert (DD), mô hình đầy đủ… Trong số đó,
mô hình phức hợp trung tâm (Central composite design - CCD), hay còn gọi là mô hình
Box–Wilson, là một trong những mô hình thông dụng và phổ biến nhất. Thiết kế thí
nghiệm theo mô hình CCD cho phép đánh giá đầy đủ và chính xác vai trò của một yếu
tố tới biến đầu ra với số lượng thí nghiệm phải thực hiện giảm đi đáng kể so với các
phương pháp khác. Lấy ví dụ với 4 biến đầu vào, mỗi biến có 3 mức yếu tố, nếu thiết kế
theo mô hình đầy đủ, số thí nghiệm phải thực hiện tối thiểu là 34 = 81 thí nghiệm. Trong
khi đó, theo mô hình CCD, chỉ cần 27 thí nghiệm là đủ để xây dựng mô hình [59].
Trước khi thiết kế thí nghiệm, các biến đầu vào cần được mã hóa, chuyển giá trị
khảo sát về khoảng [-1;1] để đảm bảo thiết kế thí nghiệm có tính trực giao và tính xoay
cũng như giảm thiểu sai số trong quá trình tính toán, hạn chế sai sót do chênh lệch đơn
vị của các biến độc lập [59].
Trong mô hình phức hợp trung tâm (CCD) có k biến độc lập X1-k, số lượng thí
nghiệm phải thực hiện là N = 2k + 2k + C0, với 2k là số thí nghiệm tiến hành theo mô
hình đầy đủ 2 mức (các biến đầu vào lần lượt nhận giá trị -1 hoặc 1), 2k là số thí nghiệm
tại điểm sao (1 biến nhận giá trị α, các biến còn lại đều bằng 0) và C0 là số thí nghiệm
16