Phân lập, định danh virus viêm gan vịt ở một số tỉnh đồng bằng sông cửu long và sản xuất kháng thể phòng bệnh tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã ngành: 62 42 01 07

TÊN NCS: PHẠM CÔNG UẨN

PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VIRUS VIÊM GAN VỊT
Ở MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG
VÀ SẢN XUẤT KHÁNG THỂ PHÒNG BỆNH

Cần Thơ, 2019


CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Người hướng dẫn chính: PGS.TS. Hồ Thị Việt Thu

Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường.
Họp tại: Phòng Bảo vệ luận án tiến sĩ, Lầu 2, Nhà Điều hành, Trường Đại học Cần
Thơ
Vào lúc …………. ngày ………. tháng …….. năm ………..

Phản biện 1: …………………………..
Phản biện 2: …………………………..
Phản biện 3: ………………………….
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

………………………………………..

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
1. Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ.
2. Thư viện Quốc gia Việt Nam.


CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
1. Phạm Công Uẩn và Hồ Thị Việt Thu, 2014. Phân lập và định danh virus viêm gan vịt type 1 ở tỉnh Hậu
Giang. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. Số chuyên đề: Nông nghiệp, 2: 116-121
2. Phạm Công Uẩn và Hồ Thị Việt Thu, 2016. Khảo sát độc lực và tính gây bệnh của 1 chủng virus viêm gan
vịt A genotype 3 trên phôi vịt. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. Số chuyên đề: Nông nghiệp, 42: 710
3. Phạm Công Uẩn và Hồ Thị Việt Thu, 2018. Khảo sát độc lực của virus viêm gan vịt phân lập từ đàn vịt tỉnh
Hậu Giang. Tạp chí Khoa học Trường Đại Học Cần Thơ. Số chuyên đề: Nông nghiệp, 54 (1B):1-6

PHẦN MỞ ĐẦU
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1 Tính cấp thiết của luận án
Bệnh viêm gan vịt do virus là bệnh nguy hiểm gây tổn thất lớn cho ngành chăn nuôi vịt do tỷ lệ bệnh và
chết rất cao. Hiện nay, bệnh rất phổ biến và phát triển rất nhanh trên các đàn vịt con, đặc biệt là ở đồng bằng
sông Cửu Long. Tuy nhiên cho đến nay chưa nhiều nghiên cứu về bệnh nđược thực hiện, cho nên, bệnh vẫn còn
là mối đe dọa lớn đến sức khỏe đàn vịt cũng như ảnh hưởng đến hiệu quả kinh tế của những người chăn nuôi vịt
trong vùng. Việc xác định loại virus gây bệnh chủ yếu trong tự nhiện và sử dụng chúng làm kháng nguyên trong
việc sản xuất vacxin và kháng thể điều cần thiết trong công tác phòng và trị bệnh đặc hiệu, nhằm bảo vệ sức
khỏe đàn vịt một cách tốt nhất. Xuất phát yêu cầu thực tiễn trên, nghiên cứu “Phân lập, định danh virus viêm
gan vịt ở một số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long và sản xuất kháng thể phòng bệnh” được thực hiện.
1.2 Mục tiêu luận án
Phân lập, định danh virus gây bệnh viêm gan vịt từ các ổ dịch ngoài tự nhiên.
Nghiên cứu mối quan hệ di truyền về nguồn gốc của virus viêm gan vịt phân lập được.
Sản xuất kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà, thử nghiệm phòng và trị bệnh từ chủng virus phân lập.

1.3 Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Phân lập và định danh virus gây bệnh viêm gan vịt ở 5 tỉnh ĐBSCL.
Nội dung 2: Nghiên cứu mối quan hệ di truyền của các chủng virus gây viêm gan vịt phân lập được tai 5
tỉnh đồng bằng sông Cửu Long
Nội dung 3: Khảo sát độc lực và tính gây bệnh của một chủng virus DHAV-3 đại diện, ký hiệu: DHAV3-HG2
Nội dung 4: Sản xuất kháng thể kháng virus viêm gan vịt bằng công nghệ tạo kháng thể IgY ở gà và ứng
dụng trong phòng, trị bệnh.
1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện từ năm 2012 đến năm 2016. Mẫu bệnh phẩm của vịt bệnh viêm gan do virus
được thu thập từ thành phố Cần Thơ và các tỉnh Vĩnh Long, Trà Vinh, Kiên Giang, Hậu Giang. Việc phân lập,
định danh virus được thực hiện tại phòng thí nghiệm Virus học (Bộ môn Thú Y, Khoa Nông Nghiệp và Sinh
Học ứng dụng) và phòng Sinh học phân tử của viện Công Nghệ Sinh Học, Đại học Cần Thơ. Việc giải trình tự
nucleotide được thực hiện bởi công ty Macrogen, Hàn Quốc.
1.5 Những đóng góp mới của luận án
Xác định được virus viêm gan vịt type I genotype 3 (DHAV-3) là tác nhân chủ yếu gây ra bệnh viêm gan
vịt tại ĐBSCL. Chủng DHAV-3 khá đồng nhất về trình tự nucleotide của đoạn gen khảo sát từ vị trí nucleotide
2.842 đến vị trí nucleotide 3.081 thuộc tổ hợp gen P2 trong bộ gen của DHAV-3 và phân dòng thành một nhóm
riêng biệt khi so sánh với chủng DHAV-3 khác trong nước và châu Á.
Sản xuất thành công kháng thể IgY tinh chế từ chủng DHAV-3 phân lập ở ĐBSCL và đã thử nghiệm
phòng trị bệnh viêm gan vịt đạt hiệu quả trong điều kiện thí nghiệm.
1.6 Bố cục của luận án

1


Luận án dài 173 trang, gồm 5 chương: giới thiệu, lược khảo tài liệu, vật liệu và phương pháp nghiên
cứu, kết quả và thảo luận, kết luận và đề nghị, phần tài liệu tham khảo và phụ lục. Luận án có 30 Bảng, 32 Hình
và 1141 tài liệu tham khảo.
PHẦN NỘI DUNG
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Bệnh viêm gan vịt do virus gây ra bởi ba loại virus khác nhau gọi là virus viêm gan vịt type I, type II và
type III. Virus viêm gan vịt type I hay còn gọi là virus viêm gan vịt A (DHAV) thuộc họ Picornaviridae, chi
Avihepatovirus. DHAV có 3 kiểu gen khác nhau là virus viêm gan vịt type I genotype 1 (DHAV-1), virus viêm
gan vịt type I genotype 2 (DHAV-2) và virus viêm gan vịt type I genotype 3 (DHAV-3). Virus viêm gan vịt
type II được phân loại là Astrovirus vịt type 1 ( DAstV-1 ), virus viêm gan vịt type III là Astrovirus vịt type 2 (
DAstV-2 ) thuộc họ Astroviridae. DAstV-1 được báo cáo chủ yếu ở Anh, còn DAstV-2 chỉ được báo cáo ở Mỹ
(OIE, 2010)
ĐBSCL là khu vực sản xuất vịt quan trọng nhất cả nước và bệnh viêm gan do virus vịt xảy ra thường
xuyên, gây ra thiệt hại lớn cho người chăn nuôi vịt nhưng chưa có nghiên cứu về bệnh này. Do đó, việc xác định
loại virus gây bệnh chủ yếu trong tự nhiện và sử dụng chúng làm kháng nguyên trong việc sản xuất vacxin và
kháng thể điều cần thiết trong công tác phòng và trị bệnh đặc hiệu, nhằm bảo vệ sức khỏe đàn vịt một cách tốt
nhất. Ngày nay, cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật gen, nên việc xác
định được chủng virus gây bệnh, nghiên cứu đặc điểm di truyền và mối quan hệ về nguồn gốc của chúng là cơ
sở quan trọng để xây dựng qui trình phòng và trị bệnh một cách hiệu quả.
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phương pháp phân lập, định danh và nghiên cứu di truyền của virus
3.1.1 Phương pháp phân lập virus viêm gan vịt trên môi trường phôi trứng vịt
92 huyễn dịch bệnh phẩm (HDBP) gan, lách từ 92 đàn vịt nghi ngờ bệnh được thu thập ở ĐBSCL được
tiêm vào xoang niệu mô phôi vịt 12 ngày tuổi, huyễn dịch bệnh phẩm của mỗi con được tiêm vào 1 phôi; sau đó
theo dõi: thời gian phôi chết; bệnh tích đại thể biểu hiện trên phôi.
3.1.2 Phương pháp tiêm truyền virus trên môi trường tế bào xơ phôi vịt
Dịch niệu mô và gan phôi cùng một trứng được đồng nhất và tiếp tục cấy truyền trên môi trường tế bào xơ
phôi vịt. Sau đó thu dịch tế bào phục vụ cho việc định danh và chuẩn độ virus bằng kỹ thuật RT-PCR.
3.2 Phân tích di truyền virus viêm gan vịt type I genotype 3
3.2.1 Giải trình tự nucleotide
Mười sản phẩm RT-PCR đại diện, ký hiệu: DHAV-3-CT2, DHAV-3-CT6, DHAV-3-HG2, DHAV-3HG4, DHAV-3-KG1, DHAV-3-KG12, DHAV-3-TV2, DHAV-3-TV5, DHAV-3-VL3, DHAV-3-VL8 trong 63
chủng virus phân lập được dùng cho giải trình tự nucleotide và dùng trong phân tích di truyền
3.2.2 Phân tích di truyền của các chủng DHAV-3 phân lập
Việc phân tích di truyền của 10 chủng DHAV-3 đại diện trên được thực hiện bằng cách so sánh tương
đồng nucleotide và axít amin của những chủng này với 31 chủng virus DHAV-3 từ Ngân hàng gen Thế giới,

trong đó có 3 chủng phân lập từ Việt Nam, 5 chủng phân lập từ Hàn Quốc và 23 chủng phân lập từ Trung Quốc.
Việc phân tích được thực hiện bằng phần mềm BioEdit và thiết lập mối quan hệ phả hệ bằng phần mềm MEGA
5.1.
3.3 Khảo sát độc lực của 01 chủng DHAV-3-HG2 trên phôi vịt và trên vịt con
3.3.1 Xác định liều gây nhiễm 50% tế bào xơ phôi vịt (TCID50)
Thí nghiệm (TN) tiến hành trên đĩa 96 giếng, dịch virus pha loãng theo bậc 10 từ 100 đến 10-10, mỗi độ
pha loãng cho vào 8 giếng trong cùng một cột, mỗi giếng 100 l, bắt đầu từ nồng độ pha loãng cao nhất và 8
giếng đối chứng, mỗi giếng 100l môi trường duy trì. Tính chỉ số TCID50 theo phương pháp của Reed và
Muench (1938). Chỉ tiêu theo dõi: chỉ số TCID50/0,1ml
3.3.2 Xác định liều gây chết 50% trên phôi vịt và bệnh lý trên phôi
Bố trí TN: TN sử dụng 50 trứng vịt có phôi 12 ngày tuổi chia thành 10 lô, mỗi lô 5 trứng vịt; 9 lô TN
được tiêm dịch virus tương ứng với mỗi độ pha loãng từ 10-4 đến 10-12 và 1 lô đối chứng tiêm dung dịch nước

2


sinh lý. Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ chết phôi theo nồng độ virus; chỉ số ELD50; thời gian chết phôi trung

bình theo nồng độ; tần suất xuất hiện bệnh tích trên phôi.
3.3.3 Xác định liều gây chết 50% vịt thí nghiệm và đặc điểm bệnh lý gây ra do chủng virus DHAV-3-HG2
Bố trí TN: TN được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 6 nghiệm thức (NT) với 3 lần lăp lại; có 5 NT
tương ứng với độ pha loãng từ 10-1 đến 10-5 và một NT đối chứng chỉ tiêm dung dịch nước sinh lý, mỗi NT sử
dụng 5 vịt. Thời gian theo dõi trong đợt TN là 14 ngày. Chỉ tiêu theo dõi: Chỉ số LD50; số vịt chết theo thời
gian; tần suất xuất hiện triệu chứng; tần suất xuất hiện bệnh tích; bệnh tích vi thể trên vịt TN.
3.4 Sản xuất KT kháng virus DHAV-3 bằng công nghệ tạo KT IgY ở gà và ứng dụng trong phòng, trị bệnh
3.4.1 Sản xuất KT kháng virus DHAV-3
3.4.1.1 Tạo miễn dịch cho gà mái
Bố trí TN như Bảng 3.1, với khoảng cách giữa 2 lần tiêm là 2 tuần.
Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm gây miễn dịch gà mái
Thí

nghiệm

1

2

3

Nghiệm
Thức

Số gà thí
nghiệm

Liều virus
(ELD50/ml)

Liều
tiêm (ml)

Đường
tiêm

Số lần
tiêm

104/1

3

104

1

Cơ ức

1

104/2

3

104

1

Cơ ức

2

104/3

3

104

1

Cơ ức

3

106/1

3

106

1

Cơ ức

1

106/2

3

106

1

Cơ ức

2

106/3

3

106

1

Cơ ức

3

108/1

3

108

1

Cơ ức

1

108/2

3

108

1

Cơ ức

2

108/3

3

108

1

Cơ ức

3

ĐC

3

PBS

1

Cơ ức

3

3.4.1.2 Tách chiết kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà
Kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà được tách chiết bằng phương pháp kết tủa muối (NH4)2SO4 nồng độ
bảo hòa 40%, sau đó thẩm tích để loại muối. Dung dịch sau thẩm tích được phân tích nồng độ protein bằng
phương pháp Bradford và xác định HGKT IgY bằng phương pháp trung hòa virus.

3.4.1.3 Kiểm tra hiệu giá kháng thể IgY trong huyết thanh gà mái và lòng đỏ trứng gà
Hiệu giá kháng thể (HGKT) IgY được xác định bằng phản ứng trung hòa virus.
Chỉ tiêu theo dõi: Liều KN tạo được miễn dịch tốt nhất; Số lần tiêm KN gây đáp ứng miễn dịch kéo dài và ổn
định; Mối tương quan giữa HGKT IgY trong huyết thanh gà mái và lòng đỏ trứng gà.
3.4.1.4 Xác định liều an toàn của dịch kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà đối với tế bào xơ phôi vịt
Bố trí TN: TN được tiến hành trên đĩa 96 giếng với 10 nồng độ dịch IgY pha loãng theo cơ số 2 (1/2,
1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256, 1/512, 1/1024), nồng độ IgY ban đầu là 13,5 mg/ml. Mỗi nồng độ lặp lại
8 lần. [ĐC(-)] là môi trường tế bào xơ phôi không cho dịch IgY vào mà chỉ cho môi trường duy trì.
Chỉ tiêu theo dõi: Hình thái thảm tế bào (có hay không có CPE và mức độ CPE); Giá trị OD sau khi
nhuộm MMT (thể hiện tỷ lệ tế bào sống).
3.4.1.5 Khảo sát hoạt tính kháng DHAV-3 của dịch kháng thể IgY trên tế bào xơ phôi vịt 24 giờ trước và
24 giờ sau khi gây nhiễm
Bố trí TN: TN được tiến hành trên đĩa 96 giếng với bốn nồng độ pha loãng dịch KT IgY theo bậc 10 từ
100 đến 10-3 và được cho vào môi trường tế bào DEF lần lượt 24 giờ trước và 24 giờ sau khi gây nhiễm với
huyễn dịch DHAV-3 liều 500TCID50/0,1ml/giếng. Nồng độ KT IgY ban đầu là x= 1,68 mg/ml, ở những nồng
độ tiếp theo là nồng độ KT IgY pha loãng theo bậc 10. Mỗi nồng độ lập lại 20 lần. [ĐC(-)] là tế bào xơ phôi chỉ
cho môi trường duy trì vào. [ĐC(+)] là môi trường tế bào xơ phôi không cho dịch KT IgY vào nhưng cho dịch

3


virus vào với liều 500TCID50/0,1ml/giếng. Chỉ tiêu theo dõi: Hình thái thảm tế bào (có hay không có CPE và
mức độ CPE); giá trị OD (thể hiện tỷ lệ tế bào sống).
3.4.1.6 Xác định liều bảo hộ 50% phôi vịt của kháng thể IgY lòng đỏ
TN được thực hiện trên phôi vịt 12 ngày tuổi và được bố trí như Bảng 3.2. Tính liều bảo hộ 50% phôi vịt
(EPD50) dựa vào chỉ số EPD50 tiến hành chọn 3 liều KT IgY là 10EPD50, 30EPD50, 50EPD50 để sử dụng cho TN
phòng và trị bệnh DHAV-3.
Bảng 3.2 Bố trí TN xác định liều bảo hộ 50% phôi vịt của kháng thể IgY
Độ pha loãng
kháng thể

1 (100)
1/2 (10-0,3)
1/4 (10-0,6)
1/8 (10-0,9)
1/16 (10-1,2)
1/32 (10-1,5)
1/64 (10-1,8)
1/128 (10-2,1)
1/256 (10-2,4)
1/512 (10-2,7)
1/1024 (10-3,0)

Liều
virus
(LD50)
102
102
102
102
102
102
102
102
102
102
102

Số lượng
trứng vịt có
phôi

5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5

Liều tiêm
(kháng thể + virus)
(ml)
0,1 + 0,1
0,1 + 0,1
0,1 + 0,1
0,1 + 0,1
0,1 + 0,1
0,1 + 0,1
0,1 + 0,1
0,1 + 0,1
0,1 + 0,1
0,1 + 0,1
0,1 + 0,1

Vịt trí tiêm

Xoang niệu mô

Xoang niệu mô
Xoang niệu mô
Xoang niệu mô
Xoang niệu mô
Xoang niệu mô
Xoang niệu mô
Xoang niệu mô
Xoang niệu mô
Xoang niệu mô
Xoang niệu mô

3.4.2 Ứng dụng kháng thể IgY trong phòng, trị bệnh
3.4.2.1 Ứng dụng trong phòng bệnh
Thí nghiệm khảo sát hiệu quả phòng bệnh DHAV -3 bằng kháng thể IgY được bố trí hoàn toàn ngẫu
nhiên trên vịt con 3 ngày tuồi với 3 loại liều và 3 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức sử dụng 5 vịt. Bố trí thí nghiệm
được thực hiện qua Bảng 3.3. Sau khi cấp kháng thể 24 giờ qua đường uống và tiêm cơ ức, vịt được công cường
độc bằng virus DHAV -3 (chủng DHAV-3-HG2) với liều 103,3LD50. Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ vịt sống ở các
nghiệm thức sau khi cường độc virus.
Bảng 3.3 Thí nghiệm phòng bệnh do DHAV-3 bằng kháng thể IgY lòng đỏ và kháng thể K.T.V

Nghiệm
thức

Đường
cấp

Liều cấp KT
(0,5ml/con)

1

2
3

Uống
Uống
Uống

4

Uống

10 EPD50
30 EPD50
50 EPD50
K.T.V
0,5ml/con

5
6
7
8
ĐC (-)
ĐC (+)

Tiêm cơ
ức
Tiêm cơ
ức
Tiêm cơ
ức

Tiêm cơ
ức
Tiêm cơ
ức
Tiêm cơ
ức

10 EPD50

Liều cấp virus
(0,5ml/con)

Số lần
Lập
lại

103,3LD50
103,3LD50
103,3LD50

3
3
3

Số vịt
trong
nghiệm
thức (con)
5
5

5

103,3LD50
103,3LD50

3

5

3

5

3

5

3

5

3

5

3

5

3

5

3,3

30 EPD50

10 LD50
3,3

50 EPD50
K.T.V
0,5ml/con
0,5 ml IgY-âm
0,5 ml IgY-âm

10 LD50

103,3LD50
0,5 ml PBS
103,3LD50

3.4.2.2 Ứng dụng trong trị bệnh
TN thử nghiệm hiệu quả trị bệnh do DHAV -3 bằng kháng thể IgY được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên trên
vịt con 3 ngày tuổi với 3 loại liều và 3 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức sử dụng 5 vịt. TN được bố trí như Bảng 3.4.

4


Sau khi công cường độc virus với liều 103,3LD50 sau 12 giờ tiến hành tiêm kháng thể. Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ

vịt sống sau khi tiêm kháng thể.
Bảng 3.4 Thí nghiệm trị bệnh do DHAV-3 bằng KT IgY lòng đỏ và kháng thể K.T.V
Nghiệm
thức

1
2
3
4
5
6
7
8
ĐC (+)
ĐC (-)

Thời
điểm
cấp KT

Đường
cấp

Sau 12
giờ
Sau 12
giờ
Sau 12
giờ
Sau 12

giờ
Sau 24
giờ
Sau 24
giờ
Sau 24
giờ
Sau 24
giờ
Sau 24
giờ
Sau 24
giờ

Tiêm cơ
ức
Tiêm cơ
ức
Tiêm cơ
ức
Tiêm cơ
ức
Tiêm cơ
ức
Tiêm cơ
ức
Tiêm cơ
ức
Tiêm cơ
ức

Tiêm cơ
ức
Tiêm cơ
ức

Liều virus
(0,5ml/con)

Liều cấp KT
(0,5ml/con)

103,3LD50

10 EPD50

Số lần
Lặp
lại

Số vịt
thí
nghiệm
(con)

3

5

3

5

3

5

3

5

3

5

3

5

3

5

3

5

3

5

3

5

3,3

10 LD50

30 EPD50

3,3

10 LD50

50 EPD50

3,3

K.T.V 1
ml/con

10 LD50
103,3LD50

10 EPD50

103,3LD50

30 EPD50

103,3LD50

50 EPD50

3,3

K.T.V 1
ml/con

10 LD50
3,3

10 LD50

0,5ml IgY-âm

0,5ml PBS

0,5ml IgY-âm

3.5 Phương pháp xử lý số liệu
Việc truy cập gen từ Ngân hàng Thế giới được thực hiện bằng chương trình BLAST, việc sánh trình tự
nucleotide và axít amin được thực hiện bằng phần mềm BioEdit, sơ đồ phả hệ được thiết lập bằng phần mềm
MEGA 5.1. Các tỷ lệ được xử lý bằng phép thử Chi square, bằng phần mềm Minitab 16.0 (Ryan et al, 1972)

Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả phân lập và định danh virus gây bệnh viêm gan vịt ở một số tỉnh ĐBSCL
4.1.1 Kết quả phân lập virus viêm gan vịt trên môi trường phôi vịt
Bảng 4.1 cho thấy, trong tổng số 92 mẫu huyễn dịch virus từ 92 đàn khảo sát thì 78 mẫu gây chết phôi với
tỷ lệ trung bình 84,8%. Thời gian gây chết phôi từ 48-72 giờ.

Bảng 4.1 Kết quả phân lập virus gây bệnh viêm gan vịt trên phôi vịt
Địa
điểm
lấy
mẫu
(tỉnh)
Kiên
Giang
Hậu
Giang
Cần
Thơ
Vĩnh
Long
Trà
Vinh
Tổng

Số
phôi
theo
dõi

Liều
tiêm

22

0,2

25

0,2

0

0

7

28,0

14

56,0

1

15

0,2

0

0

3

20,0

9

60,0

12

0,2

0

0

3

25,0

6

18

0,2

0

0

4

22,2

0

0

22

23,9

92

(ml)

18-24
Số
Tỷ
phôi
lệ
chết (%)
0
0

Phôi chết theo thời gian (giờ)
24-48
48-72
72-96
Số
Tỷ
Số
Tỷ
Số

Tỷ
phôi
lệ
phôi
lệ
phôi
lệ
chết (%) chết (%) chết (%)
5
22,7
11
50,0
3
13,6

5

Tổng
số
phôi
chết

Tỷ
lệ
(%)

19

86,4

4,0

22

88,0

2

13,3

14

93,3

50,0

1

8,3

10

83,3

8

44,4

1

5,6

13

72,2

48

52,2

8

8,7

78

84,8


4.1.2 Kết quả cấy truyền virus viêm gan vịt trên môi trường tế bào xơ phôi vịt sơ cấp từ huyễn dịch bệnh
phẩm từ phôi vịt
Tất cả 78 dịch niệu mô và gan phôi mẫu đều gây bệnh lý tế bào có nhiều dạng như tế bào co tròn dần dần
lại, sau đó kết cụm lại hay nối với nhau tạo các liên bào và cuối cùng các tế bào hoại tử tạo thành những vệt tan.
4.1.3 Kết quả định danh virus viêm gan vịt bằng kỹ thuật sinh học phân tử
Sản phẩm RT-PCR khuếch đại chuỗi gen có kích thước 286 bp từ vị trí nucleotide 3.527 đến vị trí
nucleotide 3.777 thuộc tổ hợp gen P2 trong bộ gen của DHAV-3

Hình 4.1 Phổ điện di sản phẩm RT-PCR trên gel agarose 1,5%
Ghi chú: M: Marker kích thước 100bp. Giếng 1, 2, 3, 4 (KG1, KG5, KG8, KG12). Giếng 5, 6, 7 (HG2, HG4, HG5). Giếng 8, 9, 10
(CT2, CT6, CT13). Giếng 11, 12, 13 (VL1, VL3, VL8). Giếng 14, 15, 16 (TV5, TV5, TV8).

Bảng 4.2 cho thấy, trong 78 dịch tế bào có bệnh lý nghi ngờ có 56 mẫu dương tính với cặp mồi DHAV3F, DHAV-3R chiếm 71,8% (56/78), trong đó Kiên Giang (84,2%), Hậu Giang (81,8%), Trà Vinh (61,5%),
Vĩnh Long (60,0%) và Cần Thơ (57,1%). Kết quả cho thấy, DHAV-3 lưu hành phổ biến trên các đàn vịt ở 5 tỉnh
thuộc khu vực ĐBSCL. Chưa phát hiện được DHAV-1, DHAV-2 và virus viêm gan vịt type II.
Bảng 4.2 Tỷ lệ dương tính của các type virus viêm gan vịt
Địa điểm

DHAV-1

DHAV-2

(tỉnh)

(n) (+) %)

(n) (+)

Kiên Giang

19

0

0

19

0

Hậu giang

22

0

0

22

0

Cần Thơ

14

0

0

14

Vĩnh Long

10

0

0

Trà Vinh

13

0

Tổng cộng

78

0

DHAV-3

(%)

DAsTV-1

(n) (+) (%)

(n)

(+) (%)

0

19

16 84,2

19

0

0

0

22

18 81,8

22

0

0

0

0

14

8 57,1

14

0

0

10

0

0

10

6 60,0

10

0

0

0

13

0

0

13

8 61,5

13

0

0

0

78

0

0

78

56 71,8

78

0

0

4.2 Kết quả khảo sát đặc điểm di truyền phân tử của các chủng DHAV-3 đã phân lập
4.2.1 Kết quả giải trình tự nucleotide sản phẩm RT-PCR
Kết quả giải trình tự 10 sản phẩm RT-PCR trong tổng số 56 sản phẩm cho kết quả đoạn gen có kích thước
240 nucleotide.
4.2.2 So sánh trình tự nucleotide và axít amin giữa 10 chủng phân lập với các chủng khác trong Ngân
hàng gen Thế giới
Trong 10 chủng khảo sát thì 9 chủng: DHAV-3-CT2, DHAV-3-CT6, DHAV-3-HG2, DHAV-3-HG4,

DHAV-3-KG1, DHAV-3-KG12, DHAV-3-TV2, DHAV-3-TV5, DHAV-3-VL8 có tỷ lệ tương đồng nucleotide
(98-100%) và axít amin (97-100%) trong đó chủng DHAV-3-VL3 có tỷ lệ tương đồng cao nucleotide (93-94%)
và axit amin (89-92%).

6


Hình 4.2 Mối liên hệ phả hệ giữa các chủng DHAV-3 phân lập với các chủng DHAV-3 khác trong Ngân hàng gen Thế
giới
Ghi chú: dấu * là các chủng phân lập được trong nghiên cứu này; dấu ** là các chủng phân lập từ Việt Nam

Hình 4.2 cho thấy, mười chủng virus phân lập ở ĐBSCL tạo thành 1 nhóm riêng và có mối quan hệ rất
gần gũi về nguồn gốc với chủng DHAV-NT phân lập ở tỉnh Ninh Thuận của Việt Nam và 3 chủng của Trung
Quốc DHAV-12-01, DHAV-B-N, DHAV-Du-090905. Các chủng DHAV-NT, DHAV-DN2 và DHAV-NC
được phân lập ở những vùng khác nhau của Việt Nam ngoài khu vực ĐBSCL phân thành những nhánh khác
nhau. Trong khi đó, Trong 23 chủng của Trung Quốc và 5 chủng của Hàn Quốc cũng phân thành những nhánh
khác nhau trên cây phả hệ.
4.3 Kết quả khảo sát độc lực của DHAV-3 trên phôi vịt và vịt con
4.3.1 Kết quả khảo sát độc lực và tính gây bệnh của DHAV-3 trên phôi vịt
4.3.1.1 Kết quả xác định liều gây chết 50% phôi vịt thí nghiệm.
Kết quả xác định liều gây chết 50% của virus DHAV-3 trên phôi vịt cho thấy trong 0,2ml huyễn dịch có
chứa 108,17LD50 (ELD50= 108,17/0,2ml).
4.3.1.2 Kết quả khảo sát thời gian chết phôi trung bình theo nồng độ
Bảng 4.3 Thời gian chết phôi trung bình theo nồng độ của dịch virus
Số phôi chết theo thời gian (giờ)
Độ
pha
loãng
10-4
10-5

10-6
10-7
10-8
10-9
10-10
10-11
10-12
ĐC

<18

24

30

36

42

48

54

60

66

72

78

Thời gian
chết phôi
trung bình
(giờ)

0
0
0
0
0
0
0
0
0
0

1
0
0
0
0
0
0
0
0
0

2
2

0
0
0
0
0
0
0
0

2
2
1
1
0
0
0
0
0
0

0
1
2
0
1
0
0
0
0
0

0
0
1
1
0
0
0
0
0
0

0
0
1
2
0
0
0
0
0
0

0
0
0
0
1
1
0

0
0
0

0
0
0
0
1
0
0
0
0
0

0
0
0
0
0
0
0
0
0
0

0
0
0
0

0
0
0
0
0
0

24,8 ± 3,3
27,6 ± 3,9
33,4 ± 4,7
36± 4,58
39,3± 5,3
36,4 ± 5,0
0,0
0,0
0,0
0,0

7

Tỷ
lệ
phôi
chết
(%)
100
100
100
80,0
60,0

20,0
0,0
0,0
0,0
0,0


Bảng 4.3 cho thấy, ở các nồng độ virus cao từ 10-4 - 10-6 tỷ lệ phôi chết là 100%, ở nồng độ 10-7 - 10-9 tỷ lệ
phôi chết giảm dần và từ nồng độ 10-7 - 10-9 không gây chết phôi. Ở nồng độ 10-4 thời gian chết phôi trung bình
thấp nhất với 24,8 ± 3,3 giờ, thời gian chết phôi trung bình cao nhất là ở nồng độ 10-8 (39,3± 5,3 giờ).
4.3.1.3 Biểu hiện bệnh tích trên phôi vịt thí nghiệm
Kết quả khảo sát cho thấy, bệnh tích da phôi xuất huyết chiếm tỷ lệ cao nhất (100%), kế đến là bệnh tích
phôi còi cọc chậm phát triển (87%), gan sưng xuất huyết (78,26%), phôi phù tích nước (43,5%), gan có màu
vàng nhạt (21,8%). Đây là những biểu hiện bệnh lý điển hình của bệnh do DHAV-3 qua khảo sát những phôi
vịt chết sau khi gây nhiễm.
Bảng 4.4 Tần suất xuất hiện bệnh tích trên phôi vịt thí nghiệm (n=23)
Bệnh tích

Tần suất xuất hiện bệnh tích trên phôi vịt theo nồng độ

Phôi còi cọc
Da phôi xuất
huyết
Phôi phù,
tích nước
Gan sưng,
xuất huyết
Gan màu
vàng nhạt

Tổng
số

Tỷ lệ
(%)

10-4

10-5

10-6

10-7

10-8

10-9

10-10

10-11

10-12

5
5

4
5

5
5

3
4

2
3

1
1

0
0

0
0

0
0

20/23
23/23

87,0
100

3

2

3

1

1

0

0

0

0

10/23

43,5

4

5

4

2

2

1

0

0

0

18/23

78,3

0

0

1

2

2

0

0

0

0

5/23

21,8

4.3.2 Kết quả khảo sát độc lực và tính gây bệnh của DHAV-3 trên vịt con

4.3.2.1 Kết quả xác định liều gây chết 50% trên vịt con
Kết quả khảo sát độc lực của virus DHAV- 3 trên vịt con cho thấy trong 0,5ml huyễn dịch có 103,3LD50
(LD50/0,5ml = 103,3)
4.3.2.2 Khảo sát thời gian vịt chết trung bình theo nồng độ virus khác nhau
Bảng 4.5 Thời gian vịt chết trung bình theo nồng độ dịch virus
Độ pha
loãng
virus

< 24

24-48

48-72

72-96

96-120

120-144

10-1
10-2
10-3
10-4

10-5
ĐC

4
4
0
0
0
0

4
2
2
1
0
0

2
3
3
2
2
0

3
2
2
2
2
0

0
0
1
1
0
0

0
0
0
0
0
0

Số vịt chết theo thời gian (giờ)

Thời gian
vịt chết
trung bình
(giờ)

Tỷ lệ
vịt
chết
(%)

48 ± 15,5
48 ± 15,5
60 ± 17,0

60 ±17,0
48 ± 15,5
0,0

86,7
73,3
53,3
40,0
26,7
0,0

Tỷ lệ vịt chết cao nhất được ghi nhận ở huyễn dịch 10-1 với thời gian là 48 ± 15,5 giờ. Tỷ lệ vịt chết giảm dần
ở những độ pha loãng cao và thấp nhất là ở huyễn dịch 10-5 (26,7%).
4.3.2.3 Khảo sát triệu chứng lâm sàng ở vịt thí nghiệm
Bảng 4.6 Tần suất xuất hiện triệu chứng ở vịt thí nghiệm (n = 75)
Triệu
chứng
Suy nhược,
không đi lại
Khô chân
Bỏ ăn, ủ rũ
Tiêu chảy
phân trắng
Co giật
Nằm
nghiêng
sườn, đầu
ngửa lên
lưng
Chảy dịch

mũi

14

Tỷ lệ
(%)
93,3

Tần suất xuất hiện triệu chứng theo nồng độ
10-2
Tỷ lệ
10-3
Tỷ lệ
10-4
Tỷ lệ
(%)
(%)
(%)
12
80,0
12
80,0
10
66,7

12
12
8

80,0

80,0
53,3

8
10
5

53,3
66,7
33,3

7
8
5

46,7
53,3
33,3

4
5
4

5
11

33,3
73,3

5

9

33,3
60,0

3
7

20,0
46,7

6

40,0

5

33,3

3

20,0

10-1

8

Tổng
cộng
(con)

58/75

Tỷ lệ
(%)

10

Tỷ lệ
(%)
66,7

26,7
33,3
26,7

2
3
3

13,0
20,0
20,0

33/75
38/75
25/75

44,0
50,7
33,3

1
7

6,7
46,7

0
2

0,0
13,3

14/75
36/75

18,7
48,0

1

6,7

1

6,7

16/75

21,3

10-5

77,3


Triệu chứng vịt suy nhược không thể đi lại chiếm tỷ lệ cao (77,3%); vịt bỏ ăn, ủ rũ (50,7%); vịt chết nằm
nghiêng sườn hoặc đầu ngửa lên lưng (48%); khô chân (44,0%); tiêu chảy phân trắng (33,3%); chảy dịch mũi
(21,3%) và thần kinh co giật (18,7%).
4.3.2.4 Khảo sát bệnh tích đại thể trên vịt thí nghiệm qua mổ khám
Bảng 4.7 Tần suất xuất hiện bệnh tích ở vịt trong thí nghiệm (n =30)
Tần suất xuất hiện bệnh tích theo nồng độ
10-2
Tỷ
10-3 Tỷ lệ
10-4
Tỷ
lệ
(%)
lệ
(%)
(%)
7
100
6
100
4
100

10-5

Tỷ lệ
(%)

Tổng
cộng
(con)

Tỷ
lệ
(%)

3

100

30/30

100

50,0

2

66,7

22/30

73,3

0
2
0

0,0
50,0
0,0

1
3
0

33,3
100
0,0

5/30
19/30
7/30

16,6
63,3
23,3

66,7

2

50,0

1

33,3

17/30

56,6

1

16,7

0

0,0

0

0,0

2/30

6,7

1

16,7

0

0,0

0

0,0

3/30

10,0

Bệnh tích

10-1

Gan sưng,
sưng xuất
huyết
Mật căng
phồng
Thận sưng
Lách sưng
Cơ tim nhạt
màu
Phổi xuất
huyết
Dạ dày cơ
xuất huyết
Dạ dày tuyến
xuất huyết

10

Tỷ
lệ
(%)
100

8

80,0

6

85,7

4

66,7

2

2
6
3

20,0
60,0
30,0

1

4
3

14,3
57,1
42,9

1
4
1

16,7
66,7
16,7

5

50,0

5

71,4

4

1

10,0

0

0,0

1

10,0

1

14,3

Bệnh tích phổ biến nhất trên vịt khảo sát là gan sưng xuất huyết với tỷ lệ 100%, kế đến túi mật căng
phồng (73,3%), lách sưng (63,3%) và phổi xuất huyết (56,6%); thận sưng (16,6%), và thấp nhất và bệnh tích cơ
tim nhạt màu (23,3%).
4.3.2.5 Khảo sát bệnh tích vi thể trên vịt thí nghiệm
Kết quả khảo sát bệnh tích vi thể cho thấy tất cả các mẫu gan đều có xuất huyết ở bề mặt mô, tế bào gan
bị hoại tử, có sự xuất hiện nhiều tế bào bạch cầu trong mô gan, tế bào gan bị viêm, thoái hóa mỡ. Mô liên kết
quanh ống mật dày lên, tế bào biểu mô tăng sinh, bong tróc. Tế bào gan thoái hóa mỡ do rối loạn chức năng
chuyển hóa mỡ ở gan, phản ứng viêm xảy ra nhiều mức độ khác nhau nên dẫn đến thâm nhiễm nhiều tế bào
viêm và tế bào gan bị hoại tử. Ở thận, tiểu thể Malpighi teo nhỏ, có một ít bạch cầu trong mô kẽ thận, ống lượn
gần bị hoại tử.
4.3.3 Kết quả xác định liều gây độc 50% tế bào xơ phôi vịt của DHAV-3

Kết quả xác định liều gây chết 50% của virus DHAV-3 trên tế bào cho thấy trong 0,1ml huyễn dịch có
chứa 103,4TCID50 (TCID50=103,4TCID50/0,1ml).
4.4 Kết quả sản xuất kháng thể kháng DHAV-3 bằng công nghệ tạo kháng thể IgY ở gà mái
4.4.1 HGKT IgY trong huyết thanh gà mái sau khi gây miễn dịch
Bảng 4.8 Hiệu giá kháng thể IgY trung bình trong huyết thanh gà mái qua các thí nghiệm
Thí nghiệm

104ELD50/ml

106ELD50/ml

108ELD50/ml

Nghiệm
thức

A1
B1
C1
A2
B2
C2
A3
B3
C3

HGKT IgY qua các tuần sau khi gây miễn dịch (xlog2)
T1

T2

T3

T4

T5

T6

T7

T8

4,2
4,33
4,5
5,00
5,43
5,4
5,67
6,07
6,33

4,67
5,33
5,33
5,67
6,5
6,33
6,0
6,87
7,0

4,83
5,0
6,0
5,75

6,2
6,33
6,67
6,77
8,33

5,33
5,67
6,0
5,72
6,33
7,4
6,67
6,67
8,0

5,07
5,27
6,33
5,7
6,3
7,33
6,7
6,8
8,67

5,33
5,0
6,33
5,67

6,42
7,4
6,67
6,87
8,67

5,6
5,44
7,0
6,0
7,33
7,67
7,33
7,33
8,7

6,05
6,0
6,67
6,3
7,0
7,6
7,3
8,0
8,67

HGKT
IgY
trung
bình

(xlog2)
5,0d
5,3d
6,0bcd
5,7cd
6,4bc
6,9b
6,62bc
6,92b
8,1a

Ghi chú: Những số trong cùng một cột có chữ cái mũ khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05). A1, A2, A3:
gây miễn dịch 1 lần. B1, B2, B3: gây miễn dịch 2 lần. C1, C2, C3: gây miễn dịch 3 lần. T: Tuần

Bảng 4.8 cho thấy, gà ở cả 3 TN đều đáp ứng miễn dịch tốt, gà được gây miễn dịch sau 1 tuần thì
HGKT trong máu tăng cao. Ở những NT gà được tiêm KN lặp lại 2 lần, 3 lần thì HGKT tăng cao có ý nghĩa (P<
0,05) so với NT gà chỉ được gây miễn dịch 1 lần. Đặc biệt ở những NT gây nhiễm với liều 108ELD50/ml với 3
lần lặp lại thì HGKT trung bình trong máu đạt 8,1 log2 cao hơn so với NT khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05).

9


4.4.2 Mối tương quan giữa hàm lượng KT IgY trong máu gà và trứng gà sau khi gây miễn dịch
Bảng 4.9 cho thấy, có sự tương quan thuận giữa HGKT trong máu gà và lòng đỏ trứng gà tương ứng, sự
tương quan thuận rất cao với hệ số tương quan (0,92  r2  0,97).
Bảng 4.9 HGKT IgY trong máu và trứng gà sau khi gây miễn dịch
Nghiệm
thức

G1

T1
G2
T2
G3
T3
G4
T4
G5
T5
G6
T6
G7
T7
G8
T8
G9
T9

Hiệu giá kháng thể qua các tuần sau khi gây miễn dịch
(xlog2)

Hệ số tương
quan (r2)

1

2

3

4

5

6

7

8

4,2
3,0
4,33
3,0
4,5
3,5
5,00
3,67
5,43
4,0
5,4
4,0
5,67
4,0
6,07
4,0
6,33
5,0

4,67

3,67
5,33
4,0
5,33
4,0
5,67
4,0
6,5
4,67
6,33
4,7
6,0
4,67
6,87
5,0
7,0
5,33

4,83
3,67
5,0
3,67
6,0
4,33
5,75
4,2
6,2
4,33
6,33
4,67

6,67
5,0
6,77
5,0
8,33
7,0

5,33
4,0
5,67
4,0
6,0
4,33
5,72
4,2
6,33
4,67
7,4
6,3
6,67
5,0
6,67
5,0
8,0
7,0

5,07
3,67
5,27
4,0

6,33
5,0
5,7
4,1
6,3
4,67
7,33
6,0
6,7
5,2
6,8
5,2
8,67
7,3

5,33
4,0
5,0
3,67
6,33
5,0
5,67
4,0
6,42
4,67
7,4
6,3
6,67
5,0
6,87

5,2
8,67
7,3

5,6
4,0
5,44
4,0
7,0
5,67
6,0
4,4
7,33
5,27
7,67
6,27
7,33
5,67
7,33
5,4
8,7
7,33

6,05
4,67
6,0
4,67
6,67
5,0
6,3

4,6
7,0
5,33
7,6
6,27
7,3
5,67
8,0
6,67
8,67
7,33

0,92
0,94

0,92
0,94
0,92
0,97
0,96
0,95
0,97

Ghi chú: G1, T1: huyết thanh, trứng gà gây miễn dịch 1 lần; G2, T2: huyết thanh, trứng gà gây miễn dịch 2 lần; G3, T3:
huyết thanh, trứng gà gây miễn dịch 3 lần với liều 104ELD50/ml; G4, T4: huyết thanh, trứng gà gây miễn dịch 1 lần; G5,
T5: huyết thanh, trứng gà gây miễn dịch 2 lần; G6, T6: huyết thanh, trứng gà gây miễn dịch 3 lần với liều 106ELD50/ml;
G7, T7: huyết thanh, trứng gà gây miễn dịch 1 lần; G8, T8: huyết thanh, trứng gà gây miễn dịch 2 lần; G9, T9: huyết
thanh, trứng gà gây miễn dịch 3 lần với liều 108ELD50/ml

4.4.3 Kết quả ly trích KT IgY từ lòng đỏ trứng gà bằng phương pháp tủa phân đoạn muối Amonium

sulphat 40%
Sau quá trình ly trích và tinh sạch KT IgY kết quả thu được trung bình 63,2mg/trứng.
4.4.4 Khảo sát độc tính của dịch kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà đối với tế bào xơ phôi vịt và tính kháng
DHAV-3 trên tế bào xơ phôi vịt
4.4.4.1 Kết quả xác định liều an toàn của dịch kháng thể IgY lòng đỏ
đối với tế bào xơ phôi vịt
Bảng 4.10 Giá trị OD và tỷ lệ tế bào sống trung bình ở các độ pha loãng của dịch KT IgY lòng đỏ
Độ pha loãng
dịch kháng
thể IgY
½
¼
1/8
1/16
1/32
1/64
1/128
1/256
1/512
1/1024
ĐC

Nồng độ dịch
kháng thể IgY
(mg/ml)
13,5
6,75
3,37
1,68
0,843

0,422
0,210
0,105
0,052
0,026

Giá trị OD
(X

 SD )

0,088c  0,006
0,107c  0,016
0,108c  0,014
0,109c  0,015
0,154b  0,022
0,214a  0,016
0,221a  0,032
0,234a  0,020
0,237a  0,029
0,238a  0,018
0,239a  0,032

Tỷ lệ tế bào
sống trung
bình (%)
36,8
44,8
45,2
45,6

64,5
89,5
92,5
97,9
99,2
99,6
100

Ghi chú: Các số trong cùng một cột có chữ cái mũ khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05)

10


Bảng 4.10 cho thấy, ở độ pha loãng 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 dung dịch IgY vẫn còn gây độc tế bào. Từ độ pha
loãng 1/64 trở đi dịch IgY không còn ảnh hưởng đến tế bào, thể hiện qua các giá trị OD khác biệt không có ý
nghĩa thống kê so với giá trị OD đối chứng (P>0,05).
4.4.4.2 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng DHAV-3 của dịch KT IgY lòng đỏ trên tế bào xơ phôi vịt ở 24
giờ trước và sau khi gây nhiễm
* Kết quả khảo sát sử dụng IgY ở 24 giờ trước khi gây nhiễm
Bảng 4.11 Giá trị OD và tỷ lệ tế bào sống trung bình ở các nồng độ pha loãng dịch kháng thể IgY khi cấp 24 giờ
trước khi gây nhiễm DHAV-3
Hàm lượng dịch kháng
thể IgY (mg/ml)
1,68
0,168
0,0168

Trước 24 giờ gây nhiễm DHAV-3
Tỷ lệ tế bào sống
Giá trị OD ( X  SD )

trung bình (%)
73,3
0,173b  0,054
57,6
0,136c  0,017
56,8
0,134c  0,025

0,00168
ĐC (-)
ĐC (+)

0,117c  0,011
a

0,236  0,008
0,134c  0,005

49,6
100,0
56,8

Ghi chú: Các số trong cùng một cột mang chữ cái mũ khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05).

Kết quả Bảng 4.11 cho thấy, dung dịch KT IgY ở nồng độ 1,68 mg/ml có khả năng ức chế sự phát triển
của virus trên môi trường tế bào, với giá trị OD = 0,173 và tỷ lệ tế bào sống trung bình đạt 73,3% khác biệt có ý
nghĩa thống kê so với các nồng độ còn lại và đối chứng dương (P<0,05). Từ nồng độ 0,168 mg/ml đến 0,00168
mg/ml, dịch KT IgY lòng đỏ không ngăn cản được sự phát triển của DHAV-3 trên môi trường tế bào xơ phôi
vịt.
* Kết quả khảo sát sử dụng IgY ở 24 giờ sau khi gây nhiễm

Bảng 4.12 Giá trị OD và tỷ lệ tế bào sống trung bình ở các nồng độ pha loãng dịch kháng thể IgY khi cấp 24 giờ sau
khi gây nhiễm DHAV-3.

Hàm lượng dịch kháng thể
IgY
(mg/ml)
1,68
0,168
0,0168
0,00168
ĐC (-)
ĐC (+)

Sau 24 giờ gây nhiễm DHAV-3
Giá trị OD
Tỷ lệ tế bào sống
Trung bình (%)
( X  SD )
0,108b  0,033
0,081c  0,025
0,074c  0,02
0,073c  0,031
0,196a  0,045
0,087bc  0,025

56,7
41,3
37,8
37,2
100

44,4

Ghi chú: Các số trong cùng một cột có chữ cái mũ khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05).

Bảng 4.12 cho thấy, các độ pha loãng 1,68 mg/ml; 0,168 mg/ml; 0,0168 mg/ml và 0,00168 mg/ml đều
không có khả năng ức chế sự phát triển của DHAV-3 trên môi trường tế bào xơ phôi vịt được thể hiện ở các giá
trị OD khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với đối chứng dương (P>0,05).
Từ kết quả Bảng 4.11 và 4.12 cho thấy, chỉ với nồng 1,68mg/ml và đưa vào tế bào trước 24 giờ, kháng thể
IgY mới có khả năng bảo vệ tế bào xơ phôi đối với virus viêm gan vịt.
4.4.5 Ứng dụng dịch KT IgY trong phòng và trị bệnh DHAV-3
4.4.5.1 Kết quả xác định liều bảo hộ 50% phôi vịt của dịch KT IgY
Kết quả khảo sát cho thấy trong 0,1ml có chứa 20 liều bảo hộ (101.3/0,1ml). Chỉ số EPD50 là
1,0
10 EPD50/0,1ml.

11


4.4.5.2 Kết quả phòng bệnh viêm gan vịt do DHAV-3 bằng KT IgY lòng đỏ trên vịt con 3 ngày tuổi
Bảng 4.13 Hiệu quả phòng bệnh DHAV-3 bằng dịch kháng thể IgY
Nghiệm
thức

Đường
cấp

1
2
3

Uống
Uống
Uống

4

Uống

5
6
7
8
ĐC (-)
ĐC (+)

Tiêm cơ
ức
Tiêm cơ
ức
Tiêm cơ
ức
Tiêm cơ
ức
Tiêm cơ
ức
Tiêm cơ
ức

Liều cấp
KT

(0,5ml/con)
10EPD50
30 EPD50
50 EPD50
K.T.V
0,5ml/con
10 EPD50
30 EPD50
50 EPD50
K.T.V
0,5ml/con
0,5 ml/con
IgY-âm
0,5 ml/con
IgY-âm

Liều cấp
virus
(0,5ml/con)
103,3LD50
103,3LD50
103,3LD50

Số
vịt
chết
6
5
2
4

103,3LD50
103,3LD50

5

103,3LD50

3

103,3LD50

1

Tỷ lệ
sống
(%)
60,0ae
66,7aef
86,7acf
73,3aef

11
10

66,7bef

12

80,0becf

14

93,3bcf

13

86,7becf

15

100,0c

2

15,3d

2

103,3LD50
0,5 ml PBS
103,3LD50

Số
vịt
sống
9
10
13

0
13

Ghi chú: Các số trong cùng một cột mang chữ cái mũ khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05).

Kết quả Bảng 4.13 cho thấy, hiệu quả phòng bệnh cao nhất của dung dịch IgY là ở liều 50 EPD50
(86,7%) so với NT đối chứng nhưng khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P>0,05). Cấp kháng thể qua đường
tiêm cơ ức cho hiệu quả cao hơn đường uống.
4.4.5.3 Kết quả trị bệnh DHAV-3 của dịch kháng thể IgY lòng đỏ trên vịt con 3 ngày tuổi
Bảng 4.14 Hiệu quả trị bệnh DHAV-3 bằng dịch kháng thể IgY

Nghiệm
thức

Thời điểm
cấp KT

1
2
3

Sau 12 giờ
Sau 12 giờ
Sau 12 giờ

4

Sau 12 giờ

5

6
7

Sau 24 giờ
Sau 24 giờ
Sau 24 giờ

8

Sau 24 giờ

Đường cấp
Tiêm cơ ức
Tiêm cơ ức
Tiêm cơ ức
Tiêm cơ ức
Tiêm cơ ức
Tiêm cơ ức
Tiêm cơ ức
Tiêm cơ ức

Liều cấp
kháng thể
IgY
(0,5ml/con)
10 EPD50
30 EPD50
50 EPD50
K.T.V
1 ml/con

10 EPD50
30 EPD50
50 EPD50
K.T.V
1 ml/con

Liều virus
(0,5ml/con
)

Số vịt
chết
(con)

Số vịt
sống
(con)

103,3LD50
103,3LD50
103,3LD50

4
3
2

11
12
13

103,3LD50
103,3LD50
103,3LD50
103,3LD50
103,3LD50

3

12

7
5
3

8
10
12

4

11

15

0

0

15

3,3

ĐC (+)

Sau 24 giờ

ĐC (-)

Sau 24 giờ

Tiêm cơ ức
Tiêm cơ ức

0,5ml IgY-âm
0,5ml IgY-âm

10 LD50
0,5ml PBS

Tỷ lệ vịt
sống
(%)
73,3a
80,0ac
86,7ac
80,0ac
53,3b
66,7ba
80,0bac
73,3bac

0,0d
100,0c

Ghi chú: Các số trong cùng một cột có chữ cái mũ khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05).

KT IgY được cấp tại thời điểm 12 giờ sau khi gây nhiễm DHAV-3 thì liều 50EPD50 cho hiệu quả cao
nhất.
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết luận
Đã phân lập, định danh được 56 chủng DHAV-3 từ 92 mẫu huyễn dịch bệnh phẩm thu từ 92 ổ dịch ngoài tự
nhiên ở 5 tỉnh thuộc khu vực ĐBSCL chiếm tỷ lệ 61,1%. Trong nghiên cứu này chưa phát hiện được DHAV-1,

12


DHAV-2 và virus viêm gan vịt type II từ các mẫu phân lập. Virus viêm gan vịt type I genotype 3 lưu hành phổ biến
ngoài tự nhiên ở khu vực ĐBSCL.
Các chủng DHAV-3 phân lập đều có mối quan hệ gần gũi với nhau và có chung nguồn gốc với chủng DHAVNT (chủng phân lập từ Việt Nam) và 3 chủng có nguồn gốc từ Trung Quốc như DHAV-12-01, DHAV-B-N, DHAV090905, tỷ lệ tương đồng nucleotide đạt từ 97-99%.
Virus có độc lực cao trên phôi vịt có đến 108,17ELD50/0,2ml và 103,3LD50/0,5ml trên vịt con. Virus gây chết
phôi từ 24-78 giờ sau khi tiêm truyền và gây bệnh tích trên phôi như da phôi xuất huyết, gan sưng xuất huyết,
phôi phù tích nước và cơ tim nhạt màu. Vịt con có triệu chứng ít đi lại, bỏ ăn, ủ rũ, chết nằm nghiêng sườn hoặc
đầu ngửa lên lưng, co giật và có bệnh tích gan sưng, gan xuất huyết, gan nhạt màu.
Bệnh tích vi thể xuất huyết bề mặt mô gan, tế bào bạch cầu nhiều trong mô gan, gan bị viêm và thoái hóa
mỡ nặng. Tiểu thể Malpighi bị teo nhỏ, có ít bạch cầu lẫn trong mô thận, tế bào ống lượn gần bị hoại tử.
Đã sản xuất thành công kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà và ứng dụng có hiệu quả trong phòng và trị
bệnh bằng cách sử dụng DHAV-3 làm kháng nguyên gây tối miễn dịch cho gà mái với liều 108ELD50/ml và
tiêm lập lại 3 lần thì khả năng đáp ứng miễn dịch tốt, kéo dài và ổn định.
Phòng và trị bệnh cho vịt con bằng kháng thể IgY lòng đỏ theo đường tiêm cơ ức hiệu quả hơn đường
uống. Liều phòng và trị bệnh DHAV-3 trên vịt con tốt nhất là liều 50EPD50 (1 liều EPD50 tương đương với
0,135mg kháng thể IgY lòng đỏ).

5.2 Đề nghị
Tiếp tục nghiên cứu phân lập các genotype khác của virus viêm gan vịt type I như DHAV-1, DHAV-2,
virus viêm gan vịt type II và type III để hiểu rõ thêm về tính chất dịch tễ và bệnh lý gây ra bởi những chủng
virus viêm gan vịt trong vùng.
Tiếp tục thử nghiệm phòng và trị bệnh viêm gan vịt bằng dịch kháng thể IgY lòng đỏ trong nghiên cứu
của đề tài trên những đàn vịt nuôi ngoài tự nhiên.
Nghiên cứu điều chế vaccine bằng những chủng virus hiện đang lưu hành ngoài tự nhiên ở ĐBSCL nói
riêng và Việt Nam nói chung để phòng bệnh cho đàn vịt .
Cần có biện pháp ngăn ngừa và hạn chế dịch bệnh qua việc giám sát công tác nhập con giống từ nước
ngoài và ngăn ngừa vịt tiếp xúc với chim hoang.

13