Phân lập, định danh virus viêm gan vịt ở một số tỉnh đồng bằng sông cửu long và sản xuất kháng thể phòng bệnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

PHẠM CÔNG UẨN

PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VIRUS VIÊM GAN VỊT
Ở MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG
VÀ SẢN XUẤT KHÁNG THỂ PHÒNG BỆNH

LUẬN ÁN TIẾN SỸ
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC

NĂM 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

PHẠM CÔNG UẨN

PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VIRUS VIÊM GAN VỊT
Ở MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG
VÀ SẢN XUẤT KHÁNG THỂ PHÒNG BỆNH

LUẬN ÁN TIẾN SỸ
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC
MÃ NGÀNH: 62 42 01 07

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
PGS.TS.HỒ THỊ VIỆT THU

NĂM 2019


LỜI CẢM TẠ
Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:
PGS.TS.Hồ Thị Việt Thu đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và tạo điều
kiện thuận lợi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận án.
PGS.TS.Trần
Nhân
Dũng,
PGS.TS.Nguyễn
Văn
Thành,
PGS.TS.Nguyễn Minh Chơn, TS.Dương Thị Hương Giang, TS.Bùi Thị Minh
Diệu đã động viên và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được thực hiện các nội
dung nghiên cứu trong phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Công nghệ
Enzyme trong suốt quá trình thực hiện luận án.
Các Sinh viên, Học viên Cao học chuyên ngành thú y đã giúp đỡ tôi
trong quá trình thực hiện các nội dung nghiên cứu của luận án.
Cán bộ phòng thí nghiệm Virus và Miễn dịch học của Bộ môn Thú y,
Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng; phòng thí nghiệm Sinh học phân tử,
Công nghệ Enzyme của Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học,
trường Đại học Cần thơ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận án.
Quý Thầy Cô và các anh chị em đồng nghiệp của Bộ môn Thú y,
trường Đại học Cần thơ
Quý Thầy Cô giảng dạy Chương trình Nghiên cứu sinh chuyên ngành
Vi sinh vật học, đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong thời gian
học tập.
Xin chân thành cảm ơn tất cả người thân đã giúp đỡ và động viên tôi
trong thời gian thực hiện và hoàn thành luận án này.

Tác giả

Phạm Công Uẩn

i


CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những kết quả trình bày trong luận án này là công
trình nghiên cứu của NCS Phạm Công Uẩn với sự hướng dẫn của PGS.TS.Hồ
Thị Việt Thu.
Tất cả các số liệu, kết quả trình bày trong luận án hoàn toàn trung thực
và chưa từng được ai công bố riêng lẻ trong bất kỳ công trình nào trước đây.

Người hướng dẫn khoa học

Tác giả luận án

PGS.TS.Hồ Thị Việt Thu

NCS.Phạm Công Uẩn

ii


MỤC LỤC

Trang
Lời cảm tạ…………………………………………………………………...….i
Lời cam đoan………………………………………..........................................ii
Mục lục………………………………………………………………………..iii
Danh sách bảng……………………………………..........................................ix
Danh sách hình…………………………………………………………….......xi
Danh mục từ viết tắt……………………………………………………….....xiii
Tóm tắt……………………………………………………………………….xv
Abstract …………………………………………………………………….xvii
Chương 1. Giới thiệu……………………………………………………….....1
1.1 Đặt vấn đề…………………………………………………………………..1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài……………………………………………..2
1.3 Những đóng góp mới về khoa học…………………………………………2
Chương 2. Lược khảo tài liệu………………………………………………...3
2.1. Lịch sử phát hiện bệnh viêm gan vịt do virus ….....................................3
2.2 Bệnh viêm gan vịt do virus.........................................................................4
2.2.1 Đặc điểm tác nhân gây bệnh.……………….............................................4
2.2.2 Sự xâm nhập và đường lây lan...................................................................4
2.2.3 Cơ chế sinh bệnh........................................................................................5
2.2.4 Đặc điểm dịch tễ.........................................................................................5
2.2.5 Triệu chứng và bệnh tích............................................................................6
2.2.5.1 Triệu chứng.............................................................................................6
2.2.5.2 Bệnh tích.................................................................................................7
2.2.6 Chẩn đoán và phòng bệnh..........................................................................8
2.2.6.1 Chẩn đoán................................................................................................8
2.2.6.2 Phòng bệnh..............................................................................................9
2.3 Sinh học phân tử virus viêm gan vịt …………………………………….9
2.3.1 Hình thái và cấu tạo của virus viêm gan vịt type I ………………………9

iii

2.3.2 Thành phần hệ gen của virus viêm gan vịt type I ………………………10
2.3.3 Cấu trúc hệ gen và protein của virus viêm gan vịt type I ………………10
2.3.4 Đặc tính kháng nguyên và khả năng gây bệnh của virus ……………….12
2.3.5 Xếp loại virus viêm gan vịt ……………………………………………..12
2.4 Đặc tính sinh học của virus viêm gan vịt.................................................13
2.4.1 Nuôi cấy trên phôi trứng...........................................................................13
2.4.2 Nuôi cấy trên môi trường tế bào...............................................................14
2.4.3 Nuôi cấy trên động vật cảm thụ................................................................14
2.4.4 Sức đề kháng của virus viêm gan vịt........................................................15
2.5 Tình hình nghiên cứu bệnh viêm gan vịt do virus trong nước và trên
thế giới trong thời gian gần đây ………………………………………..15
2.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới ……………………………………..15
2.5.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam …………………………………….16
2.6 Kháng thể IgY của gà ………………………………...............................17
2.6.1 Tính chất phân tử của kháng thể IgY ……………………………….......18
2.6.2 Đặc tính hóa lý của kháng thể IgY ……………………………………. 19
2.6.3 Sự truyền kháng thể IgY từ máu gà mẹ sang lòng đỏ trứng.....................20
2.7 Phương pháp sản xuất kháng thể từ lòng đỏ trứng gà ….…………….20
2.7.1 Gây tối miễn dịch cho gà mái...................................................................20
2.7.2 Đường tiêm chủng cho gà mái..................................................................21
2.7.3 Tần số và khoảng cách giữa các lần tiêm chủng cho gà mái...................21
2.7.4 Chiết xuất kháng thể IgY..........................................................................21
2.7.5 Các phương pháp tinh sạch kháng thể IgY...............................................22
2.7.5.1 Phương pháp kết tủa bằng muối ammonium sulphat ............................22
2.7.5.2 Phương pháp thẩm tích.............................. ...........................................22
2.7.5.3 Sắc ký trao đổi ion.................................................................................23
2.8 Những ứng dụng kháng thể IgY trong phòng và trị bệnh trên
gia cầm .......................................................................................................23

2.9 Thành tựu phòng và trị bệnh viêm gan vịt do virus ở Việt Nam ……26

iv


Chương 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu...........................................28
3.1 Nội dung nghiên cứu.................................................................................28
3.2 Phương tiện nghiên cứu............................................................................28
3.2.1 Thởi gian và địa điểm...............................................................................28
3.2.2 Vật liệu nghiên cứu..................................................................................29
3.2.3 Hóa chất và môi trường............................................................................29
3.3 Phương pháp nghiên cứu..........................................................................30
3.3.1 Phân lập và định danh virus viêm gan vịt ở một số tỉnh
đồng bằng sông Cửu Long ....................................................................30
3.3.1.1 Phương pháp lấy mẫu............................................................................30
3.3.1.2 Phương pháp xử lý mẫu..................................................................................31

3.3.1.3 Phương pháp phân lập virus viêm gan vịt trên môi trường phôi
trứng vịt................................................................................................31
3.3.1.4 Phương pháp cấy truyền virus viêm gan vịt trên môi trường tế bào
xơ phôi vịt sơ cấp..................................................................................31
3.3.1.5 Định danh virus viêm gan vịt bằng sinh học phân tử............................32
3.3.2 Nghiên cứu di truyền virus viêm gan vịt type I genotype 3.................33
3.3.2.1 Giải trình tự nucleotide sản phẩm RT-PCR...........................................33
3.3.2.2 Nghiên cứu di truyền của các chủng virus viêm gan vịt
type I genotype 3 phân lập được…...…………………………………. 34
3.3.3 Khảo sát độc lực của 01 chủng virus viêm gan vịt type I genotype 3
trên phôi vịt và trên vịt con….………………………………………..34
3.3.3.1 Xác định liều gây nhiễm 50% tế bào xơ phôi vịt của 01 chủng
virus viêm gan vịt type I genotype 3 …………………………………34

3.3.3.2 Xác định liều gây chết 50% phôi vịt và khảo sát bệnh tích biểu hiện
trên phôi của 01 chủng virus viêm gan vịt type I genotype 3 ………..35
3.3.3.3 Xác định liều gây chết 50% vịt thí nghiệm và khảo sát đặc điểm bệnh
lý của 01 chủng virus viêm gan vịt type I genotype 3 …..…………….36
3.3.3.4 Khảo sát bệnh tích vi thể từ mẫu bệnh phẩm của vịt khảo sát LD50 .....38

v


3.3.4 Sản xuất kháng thể kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3 bằng
công nghệ tạo kháng thể IgY ở gà mái và ứng dụng trong phòng,
trị bệnh....................................................................................................38
3.3.4.1 Tạo miễn dịch cho gà mái …………….................................................38
3.3.4.2 Tách chiết kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà.......................................40
3.3.4.3 Kiểm tra hiệu giá kháng thể IgY trong huyết thanh gà mái và
lòng đỏ trứng gà....................................................................................40
3.3.4.4 Xác định liều an toàn của dịch kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà đối
với tế bào xơ phôi vịt.............................................................................41
3.3.4.5 Khảo sát hoạt tính kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3 của
dịch kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà trên tế bào xơ phôi vịt ở 24 giờ
trước khi gây nhiễm……………………………………………………43
3.3.4.6 Khảo sát hoạt tính kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3 của
dịch kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà trên tế bào xơ phôi vịt ở 24 giờ
sau khi gây nhiễm……………………………………………………...44
3.3.4.7 Xác định liều bảo hộ 50% phôi vịt 12 ngày tuổi của kháng thể
IgY lòng đỏ trứng gà bằng phản ứng trung hòa virus............................44
3.3.4.8 Thử nghiệm hiệu quả phòng bệnh do virus viêm gan vịt type I
genotype 3 của dịch kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà trên vịt con…….46
3.3.4.9 Thử nghiệm hiệu quả trị bệnh do virus viêm gan vịt type I
genotype 3 của dịch kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà trên vịt con……..47

3.3.5 Phương pháp xử lý số liệu.....................................................................50
Chương 4. Kết quả và thảo luận....................................................................51
4.1 Kết quả phân lập và định danh virus gây bệnh viêm gan vịt
ở một số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long.................................................51
4.1.1 Kết quả phân lập virus viêm gan vịt trên môi trường phôi vịt.................51
4.1.2 Kết quả cấy truyền virus viêm gan vịt trên môi trường tế bào xơ phôi
vịt sơ cấp....................................................................................................53
4.1.3 Kết quả định danh virus viêm gan vịt bằng kỹ thuật sinh học phân tử.....55
4.2 Kết quả khảo sát đặc điểm di truyền phân tử của các chủng virus
viêm gan vịt type I genotype 3 đã phân lập............................................57
4.2.1 Kết quả giải trình tự nucleotide sản phẩm RT-PCR.................................57

vi


4.2.2 Tìm kiếm sự tương đồng với virus viêm gan vịt type I genotype 3
khác đã đăng ký trong Ngân hàng gen Thế giới........................................60
4.2.3 So sánh tỷ lệ tương đồng nucleotide và axít amin giữa các chủng phân
lập với các chủng khác trong Ngân hàng gen Thế giới...………………..60
4.3 Kết quả khảo sát độc lực của virus viêm gan vịt type I genotype 3
trên phôi vịt và trên vịt con……………………………………………..65
4.3.1 Kết quả khảo sát độc lực và tính gây bệnh của virus viêm gan vịt
type I genotype 3 trên phôi vịt…………………………………………65
4.3.1.1 Kết quả xác định liều gây chết 50% phôi vịt thí nghiệm…………….65
4.3.1.2 Kết quả khảo sát thời gian chết phôi trung bình theo nồng độ……….66
4.3.1.3 Biểu hiện bệnh tích trên phôi vịt thí nghiệm………………………….69
4.3.2 Kết quả khảo sát độc lực và tính gây bệnh của virus viêm gan vịt
type I genotype 3 trên vịt con…………………………………………...71
4.3.2.1 Kết quả xác định liều gây chết 50% trên vịt con……………………...71
4.3.2.2 Khảo sát thời gian vịt chết trung bình theo nồng độ virus khác

nhau…………………………………………………………………..72
4.3.2.3 Khảo sát triệu chứng lâm sang ở vịt thí nghiệm ……………………...74
4.3.2.4 Khảo sát bệnh tích đại thể trên vịt thí nghiệm qua mổ khám ………...76
4.3.2.5 Khảo sát bệnh tích vi thể trên vịt thí nghiệm …………………………79
4.4 Sản xuất kháng thể kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3
bằng công nghệ tạo kháng thể IgY ở gà mái…………………………...83
4.4.1 Kết quả phân tích hiệu giá kháng thể IgY trong huyết thanh
gà mái………............................................................................................83
4.4.2 Mối tương quan giữa hàm lượng kháng thể IgY trong máu gà và trong
trứng gà sau khi gây miễn dịch…………………………………………90
4.4.3 Trích ly kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà bằng phương pháp tủa
phân đoạn muối Amonium sulphat 40%................................................91
4.4.4 Khảo sát độc tính của dịch kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà đối với
tế bào xơ phôi vịt và tính kháng virus viêm gan vịt type I
genotype 3 trên tế bào xơ phôi vịt………………………………………93
4.4.4.1 Kết quả xác định liều gây nhiễm 50% tế bào xơ phôi vịt của
virus viêm gan vịt type I genotype 3……………………………….....93

vii


4.4.4.2 Kết quả xác định liều an toàn của dịch kháng thể IgY lòng đỏ đối với
tế bào xơ phôi vịt……………………………………………………94
4.4.4.3 Hoạt tính kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3 của dịch kháng
thể IgY lòng đỏ trên tế bào xơ phôi vịt ở 24 giờ trước khi gây
nhiễm………......................................................................................96
4.4.4.4 Hoạt tính kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3 của dịch
kháng thể IgY lòng đỏ trên tế bào xơ phôi vịt ờ 24 giờ sau khi
gây nhiễm……………………………………………………………..97
4.4.5 Ứng dụng dịch kháng thể IgY lòng đỏ trong phòng và trị bệnh

viêm gan vịt do virus type I genotype 3………………………………..99
4.4.5.1 Kết quả xác định liều bảo hộ 50% phôi vịt 12 ngày tuổi của dịch
kháng thể IgY lòng đỏ………………………………………………99
4.4.5.2 Kết quả phòng bệnh viêm gan vịt do virus viêm gan vịt type I
genotype 3 bằng dịch kháng thể IgY lòng đỏ trên vịt con 3 ngày
tuổi…………………………………………………………………...101
4.4.5.3 Kết quả trị bệnh viêm gan vịt do virus type I genotype 3 của
dịch kháng thể IgY long đỏ trên vịt con 3 ngày tuổi………………...102
Chương 5. Kết luận và đề nghị…………………………………………….106
5.1 Kết luận………………………………………………………………….106
5.2 Đề nghị…………………………………………………………………..106
Tài liệu tham khảo………………………………………………………….108
Phụ lục………………………………………………………………………

viii


DANH SÁCH BẢNG
Bảng 3.1

Số lượng mẫu thu thập ở 5 tỉnh Đồng bằng sông Cửu
Long…………………………………………………......

30

Bảng 3.2

Các trình tự mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR…......

33

Bảng 3.3

Bố trí thí nghiệm
vịt………….........

phôi

36

Bảng 3.4

Bố trí thí nghiệm gây nhiễm trên vịt con………………..

37

Bảng 3.5

Bố trí thí nghiệm gây miễn dịch gà mái………………...

39

Bảng 3.6

Bố trí thí nghiệm xác định liều bảo hộ 50% phôi vịt của
kháng thể IgY…………………………………...............

45

Bảng 3.7

Bảng 3.8

Bảng 4.1

gây

nhiễm

trên

Bố trí thí nghiệm phòng bệnh do virus viêm gan vịt type
I genotype 3 bằng kháng thể IgY lòng đỏ và kháng thể
K.T.V……………………………………………………
Bố trí thí nghiệm trị bệnh do virus viêm gan vịt type I
genotype 3 bằng kháng thể IgY lòng đỏ và kháng thể
K.T.V…………………………........................................
Kết quả phân lập virus gây bệnh viêm gan vịt trên phôi
vịt ............................................................................................

47

49
52

Bảng 4.2

Tỷ lệ dương tính của các type virus viêm gan vịt….........

Bảng 4.3

So sánh tỷ lệ % tương đồng về nucleotide và axít amin
của 10 chủng DHAV-3 phân lập được với các chủng
khác trong Ngân hàng gen Thế giới ……………………

62

Bảng 4.4

Tỷ lệ phôi vịt chết ở các nồng độ virus khác nhau……...

66

Bảng 4.5

Thời gian chết phôi trung bình theo nồng độ của huyễn
dịch virus ……………………………………………….

68

Bảng 4.6

Tần suất xuất hiện bệnh tích trên phôi vịt thí nghiệm…..

69

Bảng 4.7

Tỷ lệ vịt con chết ở các nồng độ virus khác nhau…........

71

Bảng 4.8

Thời gian vịt chết trung bình theo nồng độ huyễn dịch
virus …………………………………………………….

73

Tần suất xuất hiện triệu chứng ở vịt thí nghiệm ………..

75

Bảng 4.9

ix

56


Bảng 4.10

Tần suất xuất hiện bệnh tích ở vịt trong thí nghiệm…….

78

Bảng 4.11

Hiệu giá kháng thể IgY trong huyết thanh gà mái theo
tuần liều kháng nguyên 104ELD50 /ml…………………..

83

Hiệu giá kháng thể IgY trong huyết thanh gà mái theo
tuần liều kháng nguyên 106ELD50/ml…………………...

85

Hiệu giá kháng thể IgY trong huyết thanh gà mái theo
tuần liều kháng nguyên 108ELD50 /ml………………….

86

So sánh hiệu giá kháng thể IgY trung bình trong huyết
thanh gà mái qua các thí nghiệm ……………………….

99

Bảng 4.12
Bảng 4.13
Bảng 4.14
Bảng 4.15

Bảng 4.16
Bảng 4.17
Bảng 4.18

Bảng 4.19

Bảng 4.20

Bảng 4.21
Bảng 4.22

Hiệu giá kháng thể IgY trong máu và trong trứng gà sau
khi
gây
miễn
dịch………………………………………..

90

Tỷ lệ xuất hiện CPE do DHAV-3 gây ra theo nồng độ
virus trên tế bào xơ phôi vịt……………………………..

93

Giá trị OD và tỷ lệ tế bào sống trung bình ở các nồng độ
pha loãng của dịch kháng thể IgY lòng đỏ……………...

95

Giá trị OD và tỷ lệ tế bào sống trung bình ở các nồng
độ pha loãng của dịch kháng thể IgY lòng đỏ khi cấp 24
giờ trước khi gây nhiễm DHAV-3………………………

96

Giá trị OD và tỷ lệ tế bào sống trung bình ở các nồng độ
pha loãng của dịch kháng thể IgY lòng đỏ khi cấp 24
giờ sau khi gây nhiễm DHAV-3………………………..

98

Tỷ lệ phôi vịt chết qua các nồng độ pha loãng dịch
kháng thể IgY ………..…………………………………

100

Hiệu quả phòng bệnh DHAV-3 bằng dịch kháng thể
IgY …………………………….......................................

101

Hiệu quả trị bệnh virus viêm gan vịt type I genotype 3
bằng kháng thể IgY …………………………………..

103

x


DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1

Vịt bị co giật do nhiễm virus viêm gan vịt type I……….

6

Hình 2.2

Bệnh tích gan vịt xuất huyết do nhiễm virus viêm gan
vịt type I…………............................................................

7

Hình 2.3

Hình ảnh vi thể gan vịt nhiễm virus viêm gan vịt type I.

8

Hình 2.4

Mô hình cấu trúc không gian của Picornavirus

10

Hinh2.5

Trật tự sắp xếp các gen trong hệ gen virus viêm gan vịt
nhóm A …………………………………………………

11

Hình 2.6

So sánh cấu trúc phân tử IgG của thỏ và IgY của gà……

19

Hình 3.1

Sơ đồ phân lập và định danh virus

30

Hình 3.2

Bố trí thí nghiệm xác định liều TCID50/0,1ml………......

35

Hình 3.3

Bố trí thí nghiệm xác định liều an toàn của dịch kháng
thể IgY lòng đỏ đối với tế bào xơ phôi vịt………………

42

Bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính kháng virus viêm
gan vịt type I genotype 3 của dịch kháng thể IgY lòng
đỏ trên tế bào xơ phôi vịt ở 24 giờ
trước khi gây nhiễm …………………………………….

43

Lớp tế bào xơ phôi vịt sơ cấp bình thường, quan sát
dưới kính hiển vi soi ngược ở độ phóng đại
100X………………………………………………….....

55

Tế bào co tròn, quan sát dưới kính hiển vi soi ngược ở
độ phóng đại 100X sau 24 giờ nuôi cấy
virus…………………………………………………

55

Hình 4.3

Phổ điện di sản phẩm RT-PCR trên gel agarose 1,5%.....

56

Hình 4.4

Một đoạn giản đồ giải trình tự thành phần nucleotide
chuỗi gen của một chủng virus viêm gan vịt type I
genotype 3………………………………………………. 59

Hình 4.5

Mối liên hệ phả hệ giữa các chủng DHAV-3 phân lập
với các chủng DHAV-3 khác trong Ngân hàng gen Thế
giới………………………………………………………

63

Hình 4.6

Gan phôi vịt 15 ngày tuổi có màu vàng cam …………..

70

Hình 4.7

Da phôi vịt 15 ngày tuổi xuất huyết, phôi tích nước …..

70

Hình 3.4

Hình 4.1

Hình 4.2

xi


Hình 4.8

Phôi vịt 16 ngày tuổi có cơ tim nhạt màu………………

70

Hình 4.9

Vịt 1 ngày sau khi gây nhiễm có triệu chứng khô chân,
ít đi lại……………………………………………......

76

Hình 4.10

Gan vịt 5 ngày tuổi sưng, xuất huyết................................

79

Hình 4.11

Túi mật vịt 5 ngày tuổi căng phồng..................................

79

Hình 4.12

Tế bào gan vịt bình thường …………................................

80

Hình 4.13

Tế bào gan vịt sau khi nhiễm virus …………..................

80

Hình 4.14

Mạch máu, tế bào gan vịt sau khi nhiễm virus ................

81

Hình 4.15

Ống dẫn mật vịt nhiễm virus viêm gan ………………… 81

Hình 4.16

Thận vịt nhiễm virus viêm gan …………........................ 82

Hình 4.17

Tiều cầu thận: ống lượn bị thoái hóa ...............................

82

Hình 4.18

Tế bào chất của ống lượn gần bị thoái hóa, tế bào bị
hoại tử …………………………………………………..

83

Biểu đồ mô tả hiệu giá kháng thể IgY trong huyết thanh
gà mái theo tuần với liều 104ELD50 /ml............................

84

Biểu đồ mô tả hiêu giá kháng thể IgY trong huyết thanh
gà mái theo tuần với liều 106ELD50 /ml............................

85

Biểu đồ mô tả hiệu giá kháng thể IgY trong huyết thanh
gà mái theo tuần với liều 108ELD50 /ml............................

87

Các lớp tế bào xơ phôi vịt dưới tác dụng bảo vệ của dịch
kháng thể IgY lòng đỏ với các độ pha loãng khác nhau
trong thí nghiệm trị bệnh và mật độ quang trên đĩa nuôi
cấy sau khi nhuộm MTT...................................................

99

Hình 4.19
Hình 4.20
Hình 4.21
Hình 4.22

xii


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Viết tắt
ANOVA
AS
BLAST
CC50

cDNA
CFU
CO2

CPE
DAstV
DEF
ddNTP
DHAV
DHV
DMEM

DMSO
DPBS

DPV
EDTA
ELD50
ELISA
Fab
FBS
Fc
FCS
ĐBSCL
ĐC
HGKT
G

IRES
IgA

IgG
IgM
IgY
KT

LD50
MEGA

Nguyên chữ
Analysis of variance
Ammonium sulfate
Basic local alignment search tool
Cytotoxic Concentration 50%
Complementary deoxyribonucleic acid
Colony-Forming Unit
Carbon dioxit
Cytopathic effect
Duck Astrovirus
Duck Embryo Fibroblast
Dideoxynucleotide triphosphates
Duck hepatitis A virus
Duck hepatitis virus
Dulbecco’s Modified Eagle’s medium
Dimethy Sulfoxide
Dulbecco’s phosphate buffered saline
Duck Picornavirus
Ethylene diamine tetra acetic acid
Embryo lethal dose 50%
Enzyme Linked-immunosorbent assay
Antigen binding fragment

Foetal bovine serum
Crystalized fragment
Fetal calf serum

Đồng bằng sông Cửu Long
Đối chứng
Hiệu giá kháng thể
Guanine
Internal Ribosome Entry Site
Immunoglobulin A
Immunoglobulin G
Immunoglobulin M
Yolk Immunoglobulin
Kháng thể
Lethal dose 50%
Molecular evolutionary geneties analysis

xiii


MEM
MTDT
MTPL
MTTT
NaCl
NCBI

ORF
OIE
OD

PAGE
PBS
PCR
PD50
Protein L

RNA
RT
SDS

SFV
SN

TAE
TCID50
Tm
YDS
IU
UTR
UV
VPg

Minimum essential medium
Môi trường duy trì
Môi trường pha loãng
Môi trường tăng trưởng
Natri clorua
National Center Biotechnology Information
Open Reading Frame
Office international des epizootics

Optical density
Polyacrylamide gel electrophoresis
Phosphate buffered saline
Polymerase chain reaction
Protection dose 50%

Leader protein
Ribonucleic acid
Reverse transcriptase
Sodium dodecyl sulphate
Semliki Forest virus
Serum Neutralization
Tris-acetate-EDTA
Tissue culture infectious dose 50%
Melting temperature
Sialyloligosaccharides
International Unit
Untranslated Region
Ultraviolet
Viral Protein genome linked

xiv


TÓM TẮT
Đề tài: “Phân lập, định danh virus viêm gan vịt ở một số tỉnh Đồng
bằng sông Cửu Long và sản xuất kháng thể phòng bệnh” được thực hiện bằng
cách phân lập virus viêm gan vịt từ các ổ dịch ngoài tự nhiên ở 5 tỉnh Đồng
bằng sông Cửu Long (Kiên Giang, Hậu Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long và Trà
Vinh). Virus được nuôi cấy trên môi trường phôi vịt và cấy truyền trên môi

trường tế bào xơ phôi vịt sơ cấp, ứng dụng kỹ thuật PCR với 4 cặp mồi để phát
hiện được virus viêm gan vịt type I genotype 1, type I genotype 2, type I
genotpye 3 và type II. Độc lực và tính gây bệnh của virus viêm gan vịt type I
genotype 3 chủng DHAV-3-HG2 được khảo sát trên phôi vịt và vịt con 3 ngày
tuổi. Chủng virus này được sử dụng để sản xuất kháng thể IgY lòng đỏ trứng
gà và thử nghiệm phòng, trị bệnh cho vịt con 3 ngày tuổi. Kết quả cho thấy:
Phân lập 92 mẫu huyễn dịch bệnh phẩm qua môi trường phôi vịt, có 78
mẫu gây chết phôi, chiếm tỷ lệ 84,8%. Bệnh phẩm thu từ 78 trứng chết phôi
tiếp tục nuôi cấy trên môi trường tế bào cho thấy, tất cả các mẫu đều gây bệnh
tích tế bào. Kết quả định danh virus viêm gan vịt bằng kỹ thuật RT-PCR cho
thấy có 56/78 (71,79%) chủng virus phát hiện là virus viêm gan vịt type I
genotype 3 (DHAV-3). Tỷ lệ dương tính DHAV-3 ở các tỉnh Kiên Giang, Hậu
Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long, Trà Vinh lần lượt là 84,2% (16/19), 81,8%
(18/22), 57,1% (8/14), 60% (6/10), 61,5% (8/14). Không phát hiện được virus
viêm gan vịt type I genotype 1, genotype 2 và virus viêm gan vịt type II từ các
mẫu nghiên cứu.
Mười chủng virus viêm gan vịt đại diện (DHAV-3-CT2, DHAV-3CT6, DHAV-3-HG2, DHAV-3-HG4, DHAV-3-KG1, DHAV-3-KG12,
DHAV-3-TV2, DHAV-3-TV5, DHAV-3-VL3, DHAV-3-VL8) được giải trình
tự nucleotide và phân tích di truyền, dựa vào đoạn gen khuếch đại từ
nucleotide 2.841 đến 3.081. Kết quả cho thấy 10 chủng này có độ tương đồng
cao về trình tự nucleotide (98-100%) và axít amin (97-100%) và có quan hệ
rất gần gũi với các chủng DHAV-NT phân lập từ Miền Trung Việt Nam và
DHAV-12-01, DHAV-B-N, DHAV-Du-090905 phân lập từ Trung Quốc.
Kết quả xác định độc lực và tính gây bệnh của chủng DHAV-3-HG2
trên phôi vịt và vịt con cho thấy, chủng virus này có độc lực cao,
108,17 ELD50/0,2ml và 103,3LD50/0,5ml. Thời gian gây chết phôi từ 18 - 78 giờ,
trung bình là 24,8 ± 3,3 giờ. Phôi chết có bệnh tích đặc trưng như da phôi xuất
huyết (100%), phôi còi cọc chậm phát triển (87%), gan sưng xuất huyết
(78,3%), gan có màu vàng nhạt (21,8%), phôi phù tích nước (43,5%). Vịt con
nhiễm bệnh biểu hiện triệu chứng điển hình như vịt ít hoặc không đi lại

(77,3%); vịt bỏ ăn, ủ rũ (50,7%); trước khi chết vịt nằm nghiêng sườn hoặc co
xv


giật với tư thế đầu ngửa lên lưng (48%), thần kinh co giật (18,7%). Bệnh tích
tập trung chủ yếu ở gan như gan sưng xuất huyết (100%); túi mật căng phồng
(73,3%), lách sưng (63,3%). Kết quả quan sát bệnh tích vi thể cho thấy, xuất
huyết bề mặt mô gan, tế bào gan bị hư hại, tế bào bạch cầu nhiều trong mô gan.
Các mẫu thận: tiểu thể Malpighi bị teo nhỏ, tế bào ống lượn gần bị hoại tử.
Kết quả gây tối miễn dịch cho gà mái đẻ bằng chủng DHAV-3-HG2
với 3 lần tiêm liều 108ELD50/ml, khoảng cách thời gian giữa các lần tiêm
kháng nguyên là 14 ngày, gà cho đáp ứng miễn dịch tốt và ổn định với hiệu
giá kháng thể IgY trong lòng đỏ đạt trung bình cao nhất đến 8,1log2. Hàm
lượng IgY trong lòng đỏ trứng được xác định là 27 mg/ml và trung bình trong
một trứng gà cho 63,9mg. Dịch kháng thể IgY được xác định có thể bảo vệ tế
bào xơ phôi vịt khi gây nhiễm bằng virus viêm gan vịt type I genotype 3.
Kết quả thử nghiệm phòng và trị bệnh cho thấy, kháng thể IgY lòng đỏ
tiêm cơ ức hiệu quả hơn đường uống và liều 50PD50 có hiệu quả cao nhất
trong phòng và trị bệnh viêm gan vịt do virus type I genotype 3 với tỷ lệ sống
trong phòng và trị bệnh đạt trên 80% sau khi công cường độc.
Kết quả nghiên cứu cho thấy virus viêm gan vịt type I genotype 3 lưu
hành phổ biến nhất ở Đồng bằng sông Cửu Long. Sản xuất thành công kháng
thể IgY từ lòng đỏ trứng gà kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3 và
bước đầu cho thấy hiệu quả cao trong phòng và trị bệnh viêm gan vịt do virus
trong in vivo.
Từ khóa: virus gây bệnh viêm gan vịt, genotype 3, đặc tính di truyền phân tử,
đặc tính gây bệnh, kháng thể lòng đỏ, phòng và trị bệnh.

xvi

ABSTRACT
A study on isolation and identification in duck hepatitis virus of some
provinces in Mekong Delta and production of antibody for disease prevention
was carried by isolation of duck hepatitis virus from field outbreaks in five
provinces in Mekong Delta (Kien Giang, Hau Giang, Can Tho, Vinh Long,
Tra Vinh). Viruses were cultured in duck embryo and duck embryo fibroblast,
multiplex PCR with 4 primers to detect special genes of duck hepatitis viruses
comprising type I genotype 1, type I genotype 2, type I genotype 3 and type II.
Virulence and pathogenicity of duck hepatitis virus strain DHAV-3-HG2 ware
examined in duck embryos and 3 day old ducklings. This strain was also used
to produce egg yolk antibody and trials on disease prevention and treatment in
3 day old duckling by that antibody were carried out. The results showed that:
Seventy eight out of 92 (84.8%) sample suspensions from internal
organs of suspicious hepatitis ducklings which were cultured in duck embryo
caused embryo dead. Seventy eight fluid of these death embryos were
continuously inoculated in duck embryo fibroblast. All of cultured from78
embryo fluids showed CPE lesions. The results of identification duck hepatitis
virus by RT-PCR showed that 56/78 (71.79%) virus strains identified were of
type 1 genotype 3 duck hepatitis virus (DHAV-3). The DHAV-3 positive rates
in Kien Giang, Hau Giang, Can Tho, Vinh Long and Tra Vinh provinces were
84.2% (16/19), 81.8% (18/22), 57.1%(8/14), 60%(6/10 ), 61.5%(8/14). Duck
hepatitis viruses of type 1 genotype 1, genotype 2 and type 2 were not detected
from these testing samples.
Ten representative strains (DHAV-3-CT2, DHAV-3-CT6, DHAV-3HG2, DHAV-3-HG4, DHAV-3-KG1, DHAV-3-KG12, DHAV-3-TV2,
DHAV-3-TV5, DHAV-3-VL3, DHAV-3-VL8) were sequenced and
genetically analysed, which based on gene from 2.841 nucleotide to 3.081
nucleotide. The results showed that they were highly homologous on
nucleotide (98-100%) and amino acid (97-100%) sequences, and had close
relationships with strains DHAV-NT which were isolated in Viet Nam and

DHAV-12-01, DHAV-B-N, DHAV-Du-090905 which were isolated in China.
The results of virulence and pathogenicity examination from strain
(HG2) in duck embryo and duckling showed this strain had high virulence,
108.17 ELD50/0.2ml and 103.3LD50/0.5ml. Embryo death time was 18-78h,
average embryo death time was 24.8 ± 3.3h. Death fetuses showed typical
lesions such as hemorrhagic skin (100%), stunted embryos (87%), vinflamed
and hemorrhagic liver (78.3%), pale yellow liver (21.8%), edema fetus
(43.5%) and pale heart muscle (21.8%). Ill ducklings showed typical
symptoms such as reluctant to move (77.3%), anorexa and suppression
(50.7%). Before death, ducks convulsed with head on the back position (48%),
convulsion (18.7%). The gross lesions were mainly concentrated in the liver
such as hemorrhagic liver (100%), swollen gall bladder (73.3%), swollen
spleen (63.3%). Microscopic examination showed hemorrhage in hepatic
tissue surface hemorrhage, damage in hepatic tissues, lot of white blood cells
in liver tissues, atrophy Malpighi tube, necrotic proximal tubules.

xvii


Hyper-immune to laying hens by strain DHAV-3-HG2 with three
inoculation of 108ELD50/ml for each triggered maximum immune response
and stable antibody level with antibody titers 8.1log2. Each ml of egg yolk
contained 27 mg IgY, each egg contained average 63.9mg IgY antibodies.
IgY antibody fluid was determined to be able to protect DEFs from DHAV-3HG2 challenging.
The results of prevention and treatment trials showed that produced IgY
antibodies were effective with percentage of protection of 93.3% by chest
intramuscular inoculation and 86.7% by oral route, and the dose of 50 PD50
showed highest effectiveness in both duck hepatitis prevention and treatment
caused by DHAV-3 with 80% challenging ducks protected.
The study results showed that duck hepatitis virus type 1 genotype 3

was the most common type circulating in Mekong delta. IgY antibodies
against DHV virus type 1 genotype 3 were successfully produced from
chicken yolk sacs and initially showed efficiency in prevention and treatment
of duck virus hepatitis in vivo.
Key words: duck hepatitis virus, genotype 3, molecular characterization,
pathogenic property, egg yolk antibody, prevention and treatanenh

xviii


Chương 1. GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Chăn nuôi vịt là một nghề chăn nuôi truyền thống, lâu đời của người
dân ở một số tỉnh thuộc khu vực đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL). Hàng
năm, nghề nuôi vịt đã cung cấp một lượng thực phẩm đáng kể cho nhu cầu
tiêu dùng trong nước và xuất khẩu. Những năm gần đây, số lượng đàn vịt gia
tăng nhanh chóng và đã trở thành nguồn thu nhập chính của nhiều nông hộ.
Tuy nhiên, trong những năm qua tình hình dịch bệnh xảy ra trên vịt diễn biến
ngày càng phức tạp và gây chết nhiều vịt của người chăn nuôi. Những căn
nguyên gây bệnh trên vịt có thể do vi khuẩn, virus như bệnh tụ huyết trùng gia
cầm, bệnh dịch tả vịt, bệnh cúm gia cầm .v.v. tương tự như những bệnh truyền
nhiễm này thì bệnh viêm gan vịt do virus là một trong những bệnh truyền
nhiễm nguy hiểm, gây thiệt hại rất lớn cho nền chăn nuôi vịt đặc biệt là vịt con.
Bệnh viêm gan vịt do virus thường bộc phát cấp tính, lây lan nhanh, do nhiều
type virus khác nhau gây bệnh như virus viêm gan vịt type I, virus viêm gan
vịt type II và virus viêm gan vịt type III; phổ biến nhất là virus viêm gan vịt
type I (Kim et al, 2006; Tseng et al, 2007). Bệnh xảy ra chủ yếu ở vịt con từ 1
đến 28 ngày tuổi, với bệnh tích đặc trưng là gan sưng và xuất huyết lốm đốm
trên bề mặt gan, lách và thận sưng (Woolcock, 2004), khi vịt nhiễm bệnh thì tỷ
lệ chết cao từ 90-100% và gây thành dịch trên diện rộng (Shane, 2005). Bệnh

viêm gan vịt do virus gây thiệt hại nặng nề cho nền chăn nuôi vịt ở nhiều nước
trên thế giới, trong đó có Việt Nam (Woolcock, 2003).
Ở Việt Nam, bệnh viêm gan vịt do virus được ghi nhận vào năm 1978
nhưng chưa phân lập được mầm bệnh. Giai đoạn 1979 – 1983, bệnh xảy ra ở
nhiều địa phương và làm chết nhiều vịt con (Trần Minh Châu và Lê Thu Hồng,
1985). Theo thống kê của Tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) thì bệnh viêm gan vịt
do virus gây thiệt hại nặng nề cho nền chăn nuôi vịt ở Việt Nam (OIE, 2006).
Hiện nay, bệnh viêm gan vịt do virus thường xuyên xuất hiện và đã xảy ra rất
nhiều ổ dịch trên vịt con ở các tỉnh ĐBSCL với những triệu chứng thần kinh
co giật hoặc chết rất nhanh không kịp thể hiện các triệu chứng. Khi chúng tôi
mổ khám đã quan sát được bệnh tích rất đặc trưng của bệnh viêm gan do virus
như gan nhạt màu và có nhiều điểm, đốm xuất huyết trên bề mặt gan, nhưng
điều trị bằng kháng sinh không hiệu quả.
Bệnh viêm gan vịt do virus có tính chất nguy hiểm như tỷ lệ chết cao
và diễn biến phức tạp nhưng đến nay chưa có nghiên cứu nào về bệnh này
được thực hiện ở ĐBSCL. Cho nên, bệnh vẫn còn là mối đe dọa lớn đến sức
khỏe đàn vịt cũng như ảnh hưởng đến hiệu quả kinh tế của những người chăn

1


nuôi vịt trong vùng. Ngày nay, cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học
phân tử, đặc biệt là kỹ thuật gen, nên việc xác định được chủng virus gây bệnh,
nghiên cứu đặc điểm di truyền và mối quan hệ về nguồn gốc của chúng là cơ
sở quan trọng xây dựng qui trình phòng và trị bệnh cho đàn vịt hiệu quả, là
yêu cầu cấp thiết để có biện pháp phòng chống bệnh hữu hiệu nhằm bảo vệ
sức khỏe đàn vịt ở địa phương, để đáp ứng những yêu cầu cấp thiết đó, đề tài:
“Phân lập, định danh virus viêm gan vịt ở một số tỉnh đồng bằng sông
Cửu Long và sản xuất kháng thể phòng bệnh” được thực hiện.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

Mục tiêu của đề tài là phân lập, định danh virus gây bệnh viêm gan vịt
trên các đàn vịt nuôi nghi bệnh do virus viêm gan vịt, đồng thời nghiên cứu
mối quan hệ di truyền về nguồn gốc của virus viêm gan vịt phân lập được và
sản xuất kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà, thử nghiệm phòng và trị bệnh từ
chủng virus phân lập.
1.3 Những đóng góp mới về khoa học
Xác định được virus viêm gan vịt type I genotype 3 (DHAV-3) là tác
nhân chủ yếu gây ra những ổ dịch viêm gan vịt trên vịt con tại ĐBSCL. Chủng
DHAV-3 khá đồng nhất về trình tự nucleotide trong đoạn gen khảo sát và
phân dòng thành một nhóm riêng biệt khi so sánh với chủng DHAV-3 khác
trong nước và khu vực châu Á.
Sản xuất thành công kháng thể IgY tinh chế từ chủng DHAV-3 phân
lập ở ĐBSCL và đã thử nghiệm phòng trị bệnh viêm gan vịt đạt hiệu quả trong
điều kiện thí nghiệm.

2


Chương 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Lịch sử phát hiện bệnh viêm gan vịt do virus
Bệnh viêm gan vịt do virus được phát hiện lần đầu tiên vào mùa Xuân năm
1945 ở Mỹ, vào thời điểm này chưa phân lập được mầm bệnh. Năm 1950, Levine
và Fabricant theo dõi một bệnh tương tự trên đàn vịt Bắc Kinh trắng tại Long
Island (Mỹ), phát hiện nhiều vịt bệnh trong hơn 70 trại chăn nuôi vịt với qui
mô lớn. Trong thời gian đầu, những trại có vịt nhiễm bệnh nặng thì tỷ lệ chết
lên tới 95%, vào thời gian cuối một số trại có tỷ lệ vịt chết giảm dần chỉ còn
15%, bằng phương pháp nuôi cấy trên phôi gà đã phân lập được virus viêm
gan vịt type I (Levine and Fabricant, 1950).
Năm 1956, nhiều trận dịch được phát hiện ở các bang: Illinois,
Michigan, Massachusetts của nước Mỹ. Sau đó, bệnh viêm gan vịt do virus

được phát hiện ở nhiều nước trên thế giới như Anh, Canada, Hà Lan, Ai Cập,
Tây Ban Nha, Bỉ. Từ đó bệnh viêm gan do virus ở vịt con được xếp vào bệnh
truyền nhiễm bắt buộc phải khai báo (Woolcock and Fabricant, 1991).
Năm 1965, bệnh viêm gan vịt do virus lại xảy ra ở Norfolk (Anh) trên
những đàn vịt con đã được tiêm phòng vaccine virus viêm gan vịt type I nhược độc.
Từ các ổ dịch này, các nhà khoa học đã phân lập được một loại virus mới khác hẳn
với virus viêm gan vịt type I và gọi là virus viêm gan vịt type II (Asplin, 1965). Tại
Long Island (Mỹ), bệnh viêm gan vịt do virus cũng xảy ra trên đàn vịt con đã
được tiêm phòng vaccine virus viêm gan vịt type I nhược độc. Bệnh xảy ra
nhẹ hơn so với bệnh do virus viêm gan vịt type I và tỷ lệ chết ở vịt con ít khi
vượt quá 30%. Phân lập virus từ bệnh phẩm của đàn vịt này đã phát hiện được
một loại virus mới có đặc điểm khác với virus viêm gan vịt type I và type II,
nên đặt tên virus này là virus viêm gan vịt type III (Toth, 1969)
Ở Việt Nam, đã ghi nhận có bệnh viêm gan vịt do virus vào năm 1978,
nhưng vào thời điểm này chưa phân lập được mầm bệnh. Giai đoạn năm 19791983, bệnh xảy ra ở nhiều địa phương và làm chết nhiều vịt con. Sau đó, có
nhiều nghiên cứu về bệnh này và các nhà khoa học đã xác định được căn
nguyên gây ra các ổ dịch ngoài tự nhiên là virus viêm gan vịt type I (Trần
Minh Châu và Lê Thu Hồng, 1985). Đến năm 2009, virus viêm gan vịt được
phân lập từ một ổ dịch tại tỉnh Đồng Nai và lần đầu tiên xác định thuộc type I
genotype 3 (Đoàn Thị Thanh Hương và ctv, 2009).

3


2.2 Bệnh viêm gan vịt do virus
2.2.1 Đặc điểm tác nhân gây bệnh
Bệnh viêm gan vịt gây ra bởi ba loại virus khác nhau gọi là virus viêm
gan vịt type I, type II và type III. Virus viêm gan vịt type I (DHV-1) đã được
phân loại là Avihepatovirus, một chi mới trong họ Picornaviridae (Tseng et al
2007) và được xác định gồm có 3 kiểu gen khác nhau của virus viêm gan vịt A

(DHAV) genotype 1, genotype 2, genotype 3 (Wang et al, 2008). Tác nhân
gây bệnh lây lan mạnh là virus viêm gan vịt type I genotype 1 (DHAV-1),
trước đây được gọi là virus viêm gan vịt type I, hai genotype bổ sung trong chi
Avihepatovirus là virus viêm gan vịt type I genotype 2 (DHAV-2) và virus
viêm gan vịt type I genotype 3 (DHAV-3) (Kim et al, 2006; Tseng and Tsai,
2007a; Wang et al, 2008)
Virus viêm gan vịt type II (DHV-2) đã được phân loại là một loài
Avastrovirus thuộc họ Astroviridae (Gough et al, 1985) và đã được đổi tên
thành Astrovirus vịt type 1 (DAstV-1). Virus viêm gan vịt type 3 (DHV-3)
cũng được phân loại là một loài Avastrovirus (Kim et al, 2008; Todd et al,
2009) và đã được đổi tên thành Astrovirus vịt type 2 (DAstV-2). Phân tích
trình tự gen cho thấy, Astrovirus vịt type 1 (DAstV-1) và Astrovirus vịt type 2
(DAstV-2) có kiểu gen khác nhau và đại diện cho loài (Todd et al, 2009).
Những virus viêm gan vịt này khác với virus viêm gan B ở vịt (DHBV), virus
viêm gan B ở vịt (DHBV) là một Avihepadnavirus, chúng không gây bệnh lâm
sàng đáng kể ở vịt (Yang et al 2008).
2.2.2 Sự xâm nhập và đường lây lan
Trong tự nhiên virus xâm nhập vào cơ thể vịt qua thức ăn, nước uống
do nhiễm từ chất bài tiết của vịt. Virus viêm gan vịt có sức đề kháng mạnh với
ngoại cảnh nên các yếu tố lây truyền gián tiếp như con người, dụng cụ chăn
nuôi, máy ấp trứng bị vấy nhiễm trở thành nhân tố truyền bệnh nguy hiểm.
Trong những nơi có dịch lưu hành, vịt bệnh, vịt khỏi bệnh nhưng có mang
trùng, có thể là nguyên nhân trực tiếp làm dịch phát sinh (Hwang and
Dougherty, 1962). Bệnh viêm gan vịt do virus không lây truyền qua đường
trứng, vịt con nở ra từ trứng của vịt mẹ bị nhiễm bệnh vẫn phát triển tốt
(Asplin, 1958). Một số loài chim hoang dã như le le, vịt trời là những loài vật
mang trùng, những loài vật này khi di trú có thể mang virus đi xa hàng trăm
kilomet, chúng bài thải virus theo phân vào nguồn nước và làm lan truyền
bệnh, điều này có thể là nguyên nhân gây ra những vụ dịch mới ở nơi xa (Priz,
1973). Trong cùng điều kiện thực địa, bệnh viêm gan vịt do virus type I truyền

4


lan nhanh cho tất cả các vịt con mẫn cảm sống chung đàn, tỷ lệ gây chết cao
và truyền lây nhanh giữa các trang trại chăn nuôi (Hanson and Tripathy, 1976).
Đối với virus viêm gan vịt type II, mầm bệnh có thể truyền qua đường
tiêu hóa, lỗ huyệt và dưới da. Các vịt còn sống sau trận dịch thường là những
con mang trùng và bài thải virus trong ít nhất 1 tuần sau khi khỏi bệnh (Guo
and Pan, 1984).
2.2.3 Cơ chế sinh bệnh
Virus xâm nhập vào cơ thể qua niêm mạc đường hô hấp, tiêu hóa hoặc
vết thương rồi vào máu. Theo máu, virus đến cơ quan phủ tạng đặc biệt là gan,
đây là cơ quan thích hợp nhất đối với virus và diễn biến của bệnh được biểu
hiện qua 2 giai đoạn: ở giai đoạn đầu, virus gây rối loạn trao đổi chất ở gan,
làm rối loạn quá trình trao đổi mỡ ở gan, đặc biệt là cơ chế trao đổi cholesterol
bị đình trệ, từ đó hàm lượng glucose trong gan giảm thấp nhưng lượng lipid lại
tăng cao, ở giai đoạn sau, virus trực tiếp phá hoại tế bào gan, tế bào nội mô
huyết quản, gây ra xuất huyết đặc trưng ở bề mặt gan. Virus sinh sản trong tế
bào gan, nhất là tế bào thuộc hệ võng mạc nội mô như tế bào Kupffer, tổ chức
tế bào gan bị phá hoại, cơ thể không được giải độc làm con vật chết do ngộ
độc. Vì vậy, vịt chết khi bị nhiễm virus viêm gan vịt có bệnh tích tập trung ở
gan, thận, lách (Woolcock and Fabricant, 1997).
2.2.4 Đặc điểm dịch tễ
Trong tự nhiên virus viêm gan vịt type I gây bệnh chủ yếu ở vịt con từ
1-28 ngày tuổi, nhưng cũng có thể gặp ở vịt mới nở hoặc vịt 5-6 tuần tuổi. Vịt
trưởng thành bị nhiễm bệnh thường không biểu hiện triệu chứng lâm sàng và
không ảnh hưởng đến sản lượng trứng nhưng vẫn có thể truyền bệnh cho con
khác; ngan, ngỗng cũng có thể bị nhiễm bệnh (Shane, 2005). Đối với virus
viêm gan vịt type II, dường như chỉ có loài vịt là mẫn cảm (Gough, 1986).

Trong phòng thí nghiệm, virus viêm gan vịt type III thể hiện tính gây bệnh yếu
cho vịt con, sau khi công cường độc từ 2-4 ngày, tỷ lệ chết có thể 20% (Gough
et al, 1985).
Virus viêm gan vịt type I và virus viêm gan vịt type III có thể tồn tại
nhiều tuần trong phân vịt bệnh. Các đàn vịt có thể bị nhiễm bệnh do tiếp xúc
với vịt và các loài chim mang trùng, người và dụng cụ chăn nuôi mang mầm
bệnh. Trong tự nhiên, vịt bệnh phục hồi vẫn có thể bài thải virus trong phân
của chúng cho đến 8 tuần sau khi khỏi bệnh (Woolcock, 1986). Sự truyền lây
ngang xảy ra khi có sự tiếp xúc giữa vịt khỏe với vịt bị nhiễm bệnh hoặc vật
mang trùng. Sự truyền lây dọc không xảy ra, nhưng vịt con mới nở có thể bị
nhiễm bệnh do virus bám dính trên bề mặt vỏ trứng. Nếu vỏ trứng được sát

5