Ảnh hưởng của acid acetic đến khả năng lên men ethanol của kluyveromyces marxianus cố định trong gel alginate

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

LƯU HỒ YẾN NGỌC

ẢNH HƯỞNG CỦA ACID ACETIC ĐẾN KHẢ NĂNG LÊN
MEN ETHANOL CỦA KLUYVEROMYCES MARXIANUS CỐ
ĐỊNH TRONG GEL ALGINATE

Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm
Mã sổ: 60540101

LUẬN VẤN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2018


CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - ĐHQG - HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: GS.TS Lê Văn Việt Mẩn
PGS.TS Hoàng Kim Anh
Cán bộ chấm nhận xét 1:.....................................................................................
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)

Cán bộ chấm nhận xét 2:.....................................................................................
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp. HCM ngày 13
tháng 01 năm 2018
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)
1 .............................................................
2 .............................................................
3 .................................................................
4 .................................................................
5 .................................................................
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau
khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƯỞNG KHOA


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: Lưu Hồ Yến Ngọc

MSHV: 1570432

Ngày sinh: 10/07/1992

Nơi sinh: Bạc Liêu

Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm

Mã số: 60540101

I. Tên đề tài
ẢNH HƯỞNG CỦA ACID ACETIC ĐẾN KHẢ NĂNG LÊN MEN
ETHANOL CỦA KLUYVEROMYCES MARXIANUS CỐ ĐỊNH TRONG GEL
ALGINATE
II. Nhiệm vụ và nội dung
Nhiệm vụ
•

Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ acid acetic đến khả năng lên men ethanol của

nấm men Kluyveromyces marxianus tự do và cố định trong gel alginate.
•

Khảo sát sự thay đổi của thành phần lipid trong màng tế bào của nấm men cố định

trong gel alginate và tự do khi môi trường lên men có acid acetic.
•

Tái sử dụng nấm men cố định trong gel alginate để lên men ethanol ở điều kiện tĩnh

theo chu kỳ khi môi trường lên men có acid acetic ở qui mô phòng thí nghiệm.


Nội dung
•

Xác định khả năng lên men của nấm men Kluyveromyces marxianus tự do và cố

định trong gel alginate khi môi trường lên men ban đầu có acid acetic.
•

Xác định khả năng ứng dụng của nấm men Kluyveromyes marxianus cố định ttong

gel alginate khi lên men ethanol ở điều kiện tĩnh theo chu kì.

III. Ngày giao nhiệm vụ
01/12/2016

IV. Ngày hoàn thành nhiệm vụ
01/12/2017

Cán bộ hưóng dẫn

V.
•

GS. TS. Lê Văn Việt Man

•

PGS. TS. Hoàng Kim Anh
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 02 tháng 01 năm 2018

Cán bộ hướng dẫn

Chủ nhiệm bộ môn

l.GS.TS. Lê Văn Việt Man

GS. TS.Lê Vãn Việt Mẩn
Trưởng khoa Kỹ Thuật Hóa Học
2. PGS. TS. Hoàng Kim Anh


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, con xin cảm on ba má và anh hai đã luôn động viên, thôi thúc con tiếp tục phấn đấu
và học tập nhiều hơn mỗi ngày. Thành quả đạt được ngày hôm nay của con là nhờ vào sự thúc đẩy
của gia đình.
Em xin chân thành cảm ơn thầy GS.TS Lê Văn Việt Man đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn cho
em trong suốt quá trình thực hiện luận văn này. Em cũng gửi lời cảm ơn chân thành đến cô PGS.TS
Hoàng Kim Anh và anh NCS. Nguyễn Thanh Sang đã luôn bên cạnh hỗ trợ và định hướng giúp em
tránh khỏi nhiều sai sót.
Ke đen, em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến tập thể quý thầy cô bộ môn Công nghệ thực phẩm,
những người đã dẫn dắt, chỉ dạy cho em những kiến thức cần thiết để hoàn thiện hơn về chuyên
môn.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn bạn Mần và Thảo cũng như các bạn bè khác đã luôn quan tâm, giúp
đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận vãn này. Tôi sẽ mãi trân họng những gì các
bạn đã dành cho tôi.
TP. Hồ Chí Minh, ngày 02 tháng 01 năm 2018
Học viên thực hiện

Lưu Hồ Yến Ngọc


TÓM TẮT LUẬN VĂN
Acid acetic là một hợp chất được sinh ra từ quá trình deacetyl hóa hemicellulose khi thủy
phân nguyên liệu thực vật trong quy trình sản xuất ethanol sinh học. Trong phạm vi nghiên cứu của
luận văn này, chúng tôi trình bày ảnh hưởng của acid acetic đến khả năng lên men của nấm men

Kluyveromyces marxianus cố định trong gel alginate với điều kiện lên men tĩnh theo mẻ. Với nồng
độ acid acetic từ 6, 8 hoặc lOg/L nhận thấy có sự ức chế sinh trưởng và khả năng lên men của
Kluyveromyces marxianus. Khi nồng độ acid acetic hong môi trường càng tăng làm giảm tốc độ
sinh trưởng của tế bào và làm tăng lượng đường sót ttong cả nghiệm thức nấm men tự do và cố
định. Tuy nhiên, kết quả cho thấy nấm men cố định ừong gel alginate cho lượng sản phẩm ethanol
cao hơn nấm men tự do khi cùng điều kiện thí nghiệm. Các hạt nấm men trong gel alginate có thể
được tái sử dụng bằng cách ngâm với dung dịch CaCỈ2 và kết quả cho thấy nấm men cố định có
khả năng tái sử dụng 28 chu kì và cao hơn so với nấm men tự do 6 chu kì.

ii


ABTRACT
Acetic acid is generated by de-acetylation of hemicellulose during the pretteatment of
lignocellulosic materials in bioethanol production. In this study, the effects acetic acid on ethanol
fermentation by free and immobilized Kluyveromyces marxianus cells were investigated in batch
cultures. Acetic acid at concentration of 6, 8 or 10 g/L was shown to be an inhibitor of cellular
growth and ethanol production by Kluyveromyces marxianus. Incresae in acetic acid concenttation
significantly decreased the cell proliferation and increased the residual sugar level for both the
immobilized and free yeast. However, the immobilized yeast cells in alginate gel produced ethanol
at a higher rate and higher yield in comparison with the free cells. The alginate yeast beads could
be regenerated using CaCh 0.05M and the beads which reused in 28 cycles are more than free yeast
6 cycles.

3


LỜI CAM ĐOAN
Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tác giả. Các kết quả nghiên
cứu và các kết luận trong luận án này là trung thực, và không sao chép từ bất kỳ một nguồn nào và

dưới bất kỳ hình thức nào. Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được thực hiện trích dẫn và ghi
nguồn tài liệu tham khảo đúng theo yêu cầu.
Tác giả luận án

Lưu Hồ Yến Ngọc

4


LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

......................................................... * i

TÓM TẮT LUẬN VĂN ................................................................................................................ ii
ABTRACT .................................................................................................................................... iii
LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................................................... iv
MỤC LỤC .....................................................................................................................................V
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................................... vii
DANH MỤC BẢNG................................................................................................................... viii
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU .......................................................................................................... 1
CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN......................................................................................................... 3
2.1. Nấm men Kluyverromyces marxỉanus .............................................................................. 3
2.1.1. Đặc điểm sinh học ...................................................................................................... 3
2.1.2. Khả năng ứng dụng của Kluyverromyces marxianus cố định ừong quá trình lên
men ethanol ............................................................................................................................. 4
2.2. Acid acetic ......................................................................................................................... 7
2.2.1. Sự hình thành acid acetic hong quá hình tiền xử lý lignocellulose........................... 7
2.2.2. Cơ che ức che nấm men của acid acetic ................................................................... 9

2.2.3. Cơ che đáp ứng của te bào nấm men đối với sừess acid acetic ................................... 11
2.3.

Điểm mới của đề tài ..................................................................................................... 13

CHƯƠNG 3. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 14
3.1. Nguyên liệu ..................................................................................................................... 14
3.1.1. Nấm men .................................................................................................................. 14
3.1.2. Chất ức chế ............................................................................................................... 14
3.1.3. Chất mang................................................................................................................. 14
3.1.3. Môi trường................................................................................................................ 14
3.2. Mục đích và nội dung nghiên cứu ................................................................................... 15
3.2.1. Mục đích ................................................................................................................... 15
3.2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................ 16
3.2.3. Phương pháp phân tích ............................................................................................. 20
3.2.4. Xử lý kết quả ............................................................................................................ 21

V


3.2.5. Phương pháp xử lí số liệu ......................................................................................... 23
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................................................ 24
4.1. Ảnh hưởng của nồng độ acid acetic đến quá trình lên men sử dụng nấm men
Kluỵvermỵces marxỉanus cố định trên gel alginate .................................................................. 24
4.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ acid acetic đến khả năng sinh trưởng của nấm men tự
do và cố định ừên gel alginate............................................................................................... 24
4.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ acid acetic đen khả năng sử dụng cơ chất của nấm men
tự do và cố định ừong gel alginate ........................................................................................ 27
4.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ acid acetic đen khả năng sinh tổng hợp ethanol của nấm
men tự do và cố định ưong gel alginate ................................................................................ 31

4.1.4. Ảnh hưởng của nồng độ acid acetic đến thành phần lipid ừong màng tế bào của
nấm men tự do và cố định ừên gel alginate........................................................................... 34
4.2. Khả năng tái sử dụng nấm men cố định trong gel alginate ở điều kiện stress acid
acetic ......................................................................................................................................... 39
4.2.1. Thời gian lên men ừong quá trình tái sử dụng nấm men.......................................... 39
4.2.2. Khả năng sinh tổng họp ethanol của các lần tái sử dụng nấm men .......................... 41
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 46
5.1. Kết luận ........................................................................................................................... 46
5.2. Kiến nghị ......................................................................................................................... 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................................... 48
PHỤ LỤC..................................................................................................................................... 57
LÝ LỊCH TRÍCH NGANG........................................................................................................ 76

vi


DANH MỤC HÌNH

•
Hình 2.1. Mối liên hệ giữa Kluyveromyces marxianus và Kluyveromyces lactis ...........................3
Hình 2. 2. Giới thiệu khái quát những chất ức che nấm men lên men ethanol từ quá trình tiền xử lý
nguyên liệu lignocellulose ...............................................................................................................8
Hình 2.3. Phản ứng deacetyl của hemicellulose .............................................................................8
Hình 2.4. Cơ chế ức chế tế bào nấm men của acid hữu cơ, hydroxymethylfurfurol, furfural và các
hợp chất phenolic .............................................................................................................................9
Hình 2. 5. Các con đường gây chết tế bào do các hợp chất ROS được hình thành từ acid acetic 11
Hình 2.6. Các cơ chế đáp ứng của tế bào nấm men với điều kiện stress ......................................13
Hình 3.1. Sơ đồ nghiên cứu ..........................................................................................................16
Hình 3.2. Quy ttình cố định nấm men trong gel alginate ..............................................................17

7


DANH MỤC BANG
•

Bảng 2.1. Một số nghiên cứu ứng dụng Kluyveromyces marxianus để lên men ethanol từ các nguồn
sinh khối lignocellulose ................................................................................................................... 5
Bảng 2. 2. So sánh khả năng lên men của nấm men Kluyveromyces marxianus tự do và cố định, sử
dụng dịch whey phomai làm môi trường lên men (Guo và cộng sự, 2010) .................................... 7
Bảng 3.1. Công thức thành phần môi trường được sử dụng ......................................................... 15
Bảng 4.1. Mật độ tế bào cực đại và tốc độ sinh trưởng của nấm men tự do và cố định trong môi
trường có nồng độ acid acetic thay đổi .......................................................................................... 27
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của nồng độ acid acetic đến khả năng sử dụng đường của nấm men tự do và
cố định............................................................................................................................................ 29
Bảng 4. 3. Nồng độ ethanol cực đại, tốc độ sinh tổng hợp ethanol, hiệu suất sinh tổng hợp ethanol
của nấm men tự do và cố định trong điều kiện môi trường nồng độ acid acetic khác nhau .......... 33
Bảng 4. 4. Thời gian kết thúc chu kì lên men trong quá trình tái sử dụng nấm men cố định và tự do
....................................................................................................................................................... 39
Bảng 4. 5. Nồng độ ethanol cuối của các chu kì lên men ừong quá trình tái sử dụng nấm men cố
định và tự do .................................................................................................................................. 42
Bảng 4. 6. Hiệu suất sinh tổng họp ethanol của các chu kì lên men ừong quá trình tái sử dụng nấm
men cố định và tự do...................................................................................................................... 44

8


CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
Trong những thập niên gần đây, the giới luôn cảnh báo về nguồn nhiên liệu hóa thạch đang
dần cạn kiệt. Trước tình hình đó, con người càng quan tâm đến những nguồn năng lượng mới, đặc

biệt là nhiên liệu sinh học. Tiêu biểu nhất là sử dụng vi sinh vật để sản xuất ethanol từ các nguồn
sinh khối lignocellulose rẻ tiền và phổ biến ở khắp mọi nơi. Tuy nhiên, quá trình xử lý sinh khối
ừong quy trình sản xuất ethanol sẽ tạo nên những thành phần không mong muốn cho quá ttình lên
men tiếp theo, cụ thể là sự hình thành các acid yếu (acid acetic, acid formic, acid levulinic), furfural,
5-hydroxymethyl-2-furfural và các họp chất phenolic. Những họp chất này ức chế nấm men giống
làm cho thời gian lên men kéo dài và nồng độ ethanol thu được trong dung dịch lên men bị giảm,
từ đó làm tăng giá thành sản phẩm (Orts và cộng sự, 2008).
Acid acetic được xem là một chất ức chế nấm men mạnh mẽ. Các nghiên cứu về cơ chế gây
độc của acid acetic với nấm men đã được khảo sát (Giannattasio và cộng sự, 2013). Acid acetic có
thể khuếch tán qua màng tế bào và gây ra sự acid hóa tế bào chất làm vô hoạt enzyme, kết quả là tế
bào sẽ bị thiếu năng lượng để duy trì hoạt động trao đổi chất (Kitanovic và cộng sự, 2012). Acid
acetic còn gây ra sự tích tụ các phân tử hóa học chứa oxy có khả năng phản ứng (Reactive oxygen
speicies) có thể gây sừess oxy hóa cho tế bào, thậm chí gây chết cho tế bào (Giannattasio và cộng
sự, 2013).
Đe sản xuất ethanol ở quy mô công nghiệp từ nguồn sinh khối lignocellulose, việc phát triển
các vi sinh vật có khả năng chuyển hóa hoặc chịu được chất ức chế nồng độ cao sau quá trình tiền
xử lý nguyên liệu thực vật đã trở thành điều kiện tiên quyết (Persson và cộng sự, 2002). Một trong
những giải pháp được đưa ra là cố định tế bào trong chất mang. Khi đó chất mang sẽ “bảo vệ” tế
bào và làm tăng khả năng chịu ức chế của tế bào khi môi trường lên men có các chất ức chế
(Taherzadeh và cộng sự, 2001). Trong số các phương pháp cố định khác nhau, bao gói tế bào được
xem là một phương pháp đầy hứa hẹn vì có nhiều ưu điểm so với các phương pháp cố định khác
(Park và cộng sự, 2000).


Kluyveromyces marxianus là một loài nấm men được nghiên cứu nhiều ttong thời gian gần
đây để lên men ethanol do có khả năng lên men được nhiều loại đường khác nhau, chịu được nhiệt
độ cao và tốc độ sinh trưởng nhanh. Tuy nhiên, ảnh hưởng của acid acetic đến quá trình lên men
ethanol bởi tế bào K. marxianus tự do và cố định đến nay vẫn chưa được công bố.
Mục đích của nghiên cứu này là khảo sát khả năng sinh trưởng và lên men ethanol của nấm
men Kluyveromyces marxianus cố định trong môi trường có chứa acid acetic. Ket quả nghiên cứu

sẽ là cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo để có thể sử dụng K. marxianus cố định ttong sản xuất
ethanol ở quy mô công nghiệp.

2


CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN
2.1. Nấm men Kluyverromyces marxianus
2.1.1. Đặc điểm sinh học
Đen nay đã có khá nhiều kết quả nghiên cứu liên quan đến Kluyverromyces marxianus được
công bố. Tuy nhiên, phần lớn các nghiên cứu này thường tập trung vào mục tiêu chính là các ứng
dụng K. marxianus ttong công nghiệp mà không chú trọng vào các nghiên cứu về đặc tính sinh lý
cũng như quá trình trao đổi chất ở mức độ tế bào của chúng. Hầu như các đặc điểm sinh học tế bào
của K. marxianus đều được suy đoán từ một họ hàng gần phổ biến của chúng là Kluyverromyces
lactis (Lane và cộng sự, 2010) (Hình 2.1).

Lrtlữtt

fflyiL'M

MrthrTlU-r*

0 37

*

SS’C

I ---------- KA1 fvararĩfũũt ử-omưA

rVu

*

-WC

----------- r™?.1crmữf;fanj -

n-M

-

J3C

0.43

-

17C

0-iD

■

ST'C

ũ HŨ

4

sac

nì!

4

wc

XAJ /viraoyrcs MŨk o.nbj,™
----- myvtfiwyw I sens

t

----- uvwnam .TiAri'.iWLi

+

HUr/VfrnUjtM AtìírtđlMíiĩ

Hình 2.1. Mối liên hệ giữa Kluyveromyces marxianus và Kluyveromyces lactis
(Lane và cộng sự, 2010)
Gozalez - Siso và cộng sự (2000) cho rằng K. marxianus là một loài nấm men lên men
ethanol kị khí điển hình. Nhiều nghiên cứu đã ghi nhận K. marxianus có khả năng sử dụng các loại
đường khác nhau như xylose, glucose, fructose, saccharose, maltose, lactose, cellobiose
(Christensen và cộng sự, 2010; Fonseca và cộng sự, 1991; Fonseca và cộng sự, 2007). Thậm chí,
trong một số nghiên cứu các tác giả còn cho thấy K. marxianus còn có khả năng lên men lactose
với nồng độ đường rất cao có thể lên đến 200 g/L (Hoang và cộng sự, 2013).
Bên cạnh đó, khả năng lên men ethanol ở nhiệt độ cao của K. marxianus là một ưu điểm nổi
3

bật so vói loài nấm men lên men ethanol phổ biến hiện nay là Saccharomỵces cerevisiae. Hầu hết
các nghiên cứu cho thấy K. marxianus có khả năng lên men tốt ttong khoảng nhiệt độ từ 37°c đến
42°c và có thể tồn tại ở khoảng nhiệt độ 45°c - 52°c (Lane và cộng sự, 2010 - 2011; Hoang và cộng
sự, 2013; Fonseca và cộng sự, 2008; Christensen và cộng sự, 2010).
Một điều cần lưu ý về khả năng sinh trưởng của K. marxianus là sự khác nhau đáng kể về
các thông số tăng trưởng của chúng như tốc độ sinh trưởng riêng cực đại (gmax) và tốc độ sinh
trưởng trung bình giữa những chủng khác nhau trong cùng một loài hay thậm chí là cùng một chủng
nhưng được kiểm tra ừong những điều kiện thực hiện thí nghiệm khác nhau (Fonseca G.G. và cộng
sự, 2007). Tuy nhiên, các nghiên cứu đều kết luận K. marxianus có thời gian thế hệ tương đối ngắn
vả chỉ xấp xỉ 70 phút (Fonseca và cộng sự, 2007)
2.1.2. Khả năng ứng dụng của Kluyverromyces marxianus cố định trong quá trình lên men
ethanol
Vói các đặc điểm sinh học lý tưởng cho quá trình lên men ethanol, đặc biệt là quá trình lên
men ethanol từ nguồn sinh khối lignocellulose, K. marxianus ttở thành loài nấm men được quan
tâm hàng đầu trong lĩnh vực nghiên cứu ứng dụng (Bảng 2.1). Tuy nhiên, việc sử dụng trực tiếp tế
bào K. marxianus tự do để lên men sinh khối lignocellulose có nhiều bất lợi vì thành phần môi
trường có nhiều hợp chất có khả năng ức chế nấm men. Vì vậy, nhiều giải pháp đã được đưa ra
nhằm cải thiện khả năng lên men của nấm men trong quy trình sản xuất ethanol từ lignocellulose.
Các giải pháp phổ biến là cải tạo gen của nấm men, loại bỏ độc tố trong môi trường lên men và cố
định tế bào nấm men. Đen nay, các nghiên cứu về sử dụng tế bào K. marxianus cố định để lên men
ethanol từ lignocellulose vẫn còn hạn chế.

4


Bảng 2.1. Một số nghiên cứu ứng dụng Kluyveromyces marxianus để lên men ethanol từ
các nguồn sinh khối lignocellulose
Nguồn
sinh khối

Hàm
Giống nấm

Phương pháp

men

lượng
ethanol
(g/L)

Vỏ quả

Kỉuyveromyces

cam

marxianus
Kluyveromyces

Bùn giấy

Rom lúa
mì

Lúa miến
ngọt

Vỏ ttấu

lên men

Mark và cộng

trực tiếp

15

37

40

38

SSF và

36907

SHF

Lina và cộng

Lên men
SSF và

CECT10875

PSSF

Kluyveromyces

Cố định ừong

marxỉanus

natri- alginate

DBKKUY-103

và polyvinyl

Kluyveromyces

Lên men

marxỉanus CK8

SSF

môn

marxianus K21

sự, 2010.

Antonio và cộng

marxianus

Kluyveromyces

sự, 2007

Lên men

16.7

42

81.56

40

sự, 2013

Kanchana và
cộng sự, 2015

Nachaiwieng và
15.63

43

Lên men
Vỏ khoai

Tác giả

(°C)

Lên men

marxianus ATCC

Kỉuyveromyces

Nhiêt đô

cộng sự, 2015

Wei và cộng sự

SSF và

48.98

SHF

5

40

2016


Thủy phân
Kluyveromyces
Bã điều

và lên men
marxianus

Emanuel và
58

đồng thời

40

cộng sự, 2017

ATCC36907
(SSF)

Y. Kourkoutasa và cộng sự (2004) cho rằng quá trình cố định nấm men trên chất mang sẽ
mang lại những ưu điểm:
-

Kéo dài và ổn định hoạt động của các chất xúc tác sinh học. Chất mang đóng vai trò bảo vệ
tế bào nấm men ttánh khỏi các tác động tiêu cực của môi trường bên ngoài như pH thấp,
nhiệt độ cao, môi trường có chứa các chất ức chế nấm men,...

-

Mật độ tế bào trong môi trường lên men cao hơn dẫn đến năng suất sản phẩm cao hơn, thòi
gian lên men ngắn hơn, rút ngắn pha sinh trưởng của tế bào.

-

Tăng khả năng sử dụng cơ chất và hiệu suất sinh tổng họp sản phẩm.

-

Tăng tính liên tục của quá trình sản xuất nhờ vào khả năng tái sử dụng nhiều lần.

-

Tăng khả năng sử dụng cơ chất trong môi trường nồng độ cơ chất cao và giảm sự ức chế
của sản phẩm lên tế bào.

-

Tăng tính khả thi của quá trình lên men ở nhiệt độ thấp.

-

Dễ thu hồi sản phẩm hơn do không cần phải ly tâm hoặc vi lọc để tách tế bào ra khỏi dịch
lên men, làm giảm năng lượng và chi phí thiết bị.
Một số loại chất mang đã được nghiên cứu để cố định K. marxianus và thu được hiệu quả

tích cực như: alginate, agar (Guo và cộng sự, 2010; Christensen và cộng sự, 2011), bẹ lá dừa nước
(Vu và cộng sự, 2016), gelatin (Puri và cộng sự, 2010). Guo và cộng sự (2010) báo cáo rằng K.
marxianus cố định trên alginate cho hàm lượng ethanol cuối cao hơn nấm men tự do 1.08 lần (Bảng
2.2). Nhìn chung, các nghiên cứu nói trên khi tiến hành so sánh nấm men K. marxianus cố định và
tự do đều kết luận rằng nấm men cố định cho kết quả lên men tốt hơn nấm men tự do.
Một số nghiên cứu khác cũng đánh giá cao khả năng lên men của K. marxianus cố định khi
sử dụng các phương pháp lên men khác nhau như lên men chu kỳ, lên men chu kỳ sử dụng nồng độ
cơ chất cao, lên men chu kỳ có bổ sung cơ chất và lên men liên tục (Christensen và cộng sự, 2011;
6

Taherzadeh và cộng sự, 2001; Behera và cộng sự, 2010).
Bảng 2. 2. So sánh khả năng lên men của nấm men Kluyveromyces marxianus tự do và
cố định, sử dụng dịch whey phomai làm môi trường lên men (Guo và cộng sự, 2010)

Hàm lượng ethanol cuối (% v/v)

3.8

4.1

Hàm lượng đường sót (g/100 mL)

0.42

0.32

Tốc độ sinh tổng hợp ethanol (g/ L.h)

0.31

0.68

Tốc độ sử dụng đường (g/ L.h)

0.99

2.00

58.76

63.14

Lượng ethanol thực te/ lượng ethanol lý
thuyết (%)

2.2. Acid acetic
2.2.1. Sự hình thành acid acetic trong quá trình tiền xử lý lignocellulose
Quá trình tiền xử lý nguyên liệu giàu cellulose nhằm loại bỏ lignin, phá hủy cấu trúc tinh thể
của cellulose và tăng độ xốp của nguyên liệu. Khi đó, các phân tử polysaccharide sẽ được giải
phóng ra ở dạng riêng lẻ và dễ dàng tạo phức với các phân tử enzyme thủy phân để chuyển hóa
thành các đường lên men. Tuy nhiên, quá trình này sẽ sinh ra nhiều chất ức chế sự sinh trưởng và
khả năng lên men ethanol của nấm men (Hình 2.2), trong đó có acid acetic là họp chất được hình
thành từ quá ưình deacetyl của hemicellulose và có khả năng ức chế nấm men rất mạnh (Hình 2.3)
Tỉ lệ các họp chất ức chế được hình thành ttong quá trình tiền xử lý phụ thuộc vào loại sinh
khối và các điều kiện công nghệ như nhiệt độ, thời gian, áp suất, pH, thế oxi hóa khử, bản chất và
nồng độ các chất xúc tác được bổ sung.

7


Ligni n1

Cọllụlose

Hemltrilulose

PIKJL-UIIL evcikjhf IklklL

(ilacotc

Gfllactow

irvliokvaiHlivIlMriural

Le-1'uLn.k acid

Hình 2. 2. Giới thiệu khái quát những chất ức chế nấm men lên men ethanol từ quá trình
tiền xử lý nguyên liệu lignocellulose.
(Palmqvist và cộng sự - 2000)

_ ____ _________________________________________ $ ...,,
Pdycxe
- H .o
Pdvosjj Ý°H + CH.J-C-OH

Hình 2. 3. Phản ứng deacetyl của hemicellulose

Trong một số nghiên cứu đã được công bố trước đây, hàm lượng acid acetic sinh ra có mức
dao động khá lớn từ 1.6 g/L đến hơn 10 g/L tùy theo loại sinh khối và phương pháp

8


xử lý nguyên liệu. Aguilar và cộng sự (2002) khi thủy phân bã mía ở nhiệt độ cao ừong môi trường
pH thấp thu được nồng độ acid acetic tối đa là 5.1 g/L. Klinke và cộng sự (2003) thủy phân thân
lúa mì thu được nồng độ acid acetic là 1.6 g/L ttong khi Nilvebrant và cộng sự (2003) thủy phân
gỗ cây tùng thu được acid acetic với nồng độ 2.4 g/L.
2.2.2. Cơ chế ức chế nấm men của acid acetic

"Furlu ral.

jncmbrineo

NADH^Ý Fractote-1,6diP

Ncuưal pH

NAir NADH

J
Plwyim
nieinhrane

Io

LWoupkrig
Reactive 02 Species

Anion.
ticcvrnu lotion
----->A- + H

pyruvaJtc ......... y eiliimól

I
—

1r

IA + H*

LiS* £11

Hình 2. 4. Cơ chế ức chế tế bào nấm men của acid hữu cơ, hydroxymethylfurfurol,
furfural và các họp chất phenolic.
Acid acetic ức chế quá trình lên men
củaacids
nấm men thông qua sự sụt giảm lượng sinh khối tế
Weak
bào và nồng độ ethanol ừong dịch lên men. Không có sự ức chế tương hỗ giữa các acid hữu cơ vói
nhau (Larsson và cộng sự, 1999). Hiệu quả ức chế của acid acetic được cho là do sự giảm pH nội
bào (Russell, 1992). Acid acetic phân ly kém nên có thể khuếch tán từ môi trường lên men qua màng
tế bào chất (Verduyn, 1992; Verduyn và cộng sự, 1992) và phân ly trong tế bào chất (Hình 2.4), từ
đó làm giảm pH dịch bào (Pampulha và cộng sự, 1989).
Sự giảm pH ừong tế bào sẽ được hạn chế bởi các ATPase của màng tế bào chất thông qua
quá trình bơm proton [H+] ra khỏi tế bào nhờ sự hỗ ừợ của quá trình thủy phân ATP nội bào (Verduyn
và cộng sự, 1992). Hiện tượng này làm cho nồng độ ATP nội bào bị giảm xuống, từ đó làm lượng
sinh khối nấm men được sinh ra ừong quá trình lên men 9


bị giảm theo. Trước đây, Oliva và cộng sự (2006) đã ghi nhận sự giảm đáng kể lượng sinh khối của
tế bào nấm men Kluyveromyces marxianus tự do khi lên men trong điều kiện môi trường có chất ức
chế là acid acetic. Tuy nhiên, một số nghiên cứu cũng chỉ ra rằng ở nồng độ thấp, acid acetic làm
tăng nồng độ ethanol trong dịch lên men (Larsson và cộng sự, 1999; Palmqvist và cộng sự-a, 1999).
Đó là do nồng độ acid thấp sẽ kích thích quá trình sinh ATP theo con đường lên men ethanol (Viegas
và cộng sự, 1991). Tuy nhiên với nồng độ acid cao, nhu cầu ATP của te bào quá cao và sẽ làm te
bào chất bị acid hóa gây ức chế một số enzyme của quá trình chuyển hóa đường thành ethanol, từ
đó làm giảm nồng độ ethanol trong dịch lên men (Larsson và cộng sự, 1999).

Acid hữu cơ còn có khả năng ức chế sự tăng trưởng nấm men bằng cách làm giảm sự hấp
thu các acid amin thơm từ môi trường, có thể là do hậu quả của sự ức chế protein vận chuyển amino
acid thơm Tat2p (Bauer và cộng sự, 2003).
Ngoài ra, acid acetic còn được xem là một chất độc đối với tế bào do nó có khả năng hình
thành các gốc chứa oxy có khả năng phản ứng (Reactive Oxygen Species - ROS) khi acid xâm nhập
vào tế bào chất và phân ly. Đe chống lại quá trình giảm pH nội bào, tế bào tăng cường sản xuất ATP
để bơm [H+] ra môi trường bên ngoài. Quá trình này đồng thời cũng thúc đẩy sinh tổng họp
cytochrome c (cyt c), caspase (cysteine aspartic protease) và H2O2 là những tác nhân có khả năng
tạo nên các nhóm ROS ừong tế bào gây hư hỏng cấu trúc DNA của nấm men. Theo Guaragnella và
cộng sự (2010), quá trình gây chết tế bào s. cerevisiae bởi các hợp chat ROS sinh ra từ acid acetic
là do 2 nguyên (Hình 2.5). Theo các tác giả này, nguyên nhân thứ nhất là do gen YCA1 ừong tế bào
nấm men điều khiển quá trình giải phóng cyt c từ đó hoạt hóa caspase và sinh ra các gốc chứa oxy
có khả năng phản ứng. Nguyên nhân thứ hai là không liên quan đến gen YCA1 và cyt c không được
giải phóng ra, lúc này quá trình hoạt hóa caspase để sinh ra ROS vẫn chưa rõ cơ chế. Eisenberg và
cộng sự (2007) cho rằng 2 cơ chế này có thể liên quan đến sự có mặt của DNA ty thể.

10


YEAST AA-PCD PATHWAYS

acetic acid
time
nos

15 min

150 min
JOO min

ROS-de pen dent
AA-PCD
PCD

ROS-lndependent
AA-PCD

Hình 2. 5. Các con đường gây chết tế bào do các hợp chất ROS được hình thành từ acid
acetic
(Guaragnella và cộng sự - 2010)

2.2.3. Cơ chế đáp ứng của tế bào nấm men đối vói stress acid acetic
Vi sinh vật lên men ethanol hiệu quả phải có khả năng lên men nhiều loại đường (pentose và
hexose) và bền trước các tác động gây sừess. Khi đó, giống vi sinh vật phải có khả năng chịu đựng
và thích nghi với các chất ức chế được sinh ra ừong quá trình tiền xử lý nguyên liệu lignocellulose.
Đen nay, cơ chế ở mức độ phân tử được các vi sinh vật lên men ethanol sử dụng để chống
lại các họp chất ức chế này vẫn chưa được nghiên cứu chuyên sâu. Tuy nhiên, một số cơ chế phản
ứng stress tổng quát đã được nghiên cứu cho nhóm vi sinh vật lên men ethanol. Chúng bao gồm các
cơ chế duy ưì sự ổn định pH và tính toàn vẹn của màng tế bào, kích hoạt các phản ứng đáp ứng stress
toàn diện và thoái hóa chất ức chế.
Đối vói nhóm chất ức chế gồm các acid hữu cơ mà cụ thể là acid acetic, tế bào cần phải duy
trì một cơ chế cân bằng pH nhằm ổn định pH nội bào cũng như đồng thời phải duy trì và bảo vệ tính
toàn vẹn của màng tế bào.
* Cơ chế cân bang pH của tế bào:
Một giải pháp để cân bằng giá ừị pH nội bào khi tế bào chất bị acid hóa tế bào là gia tăng quá
trình sinh tổng hợp amoniac (NH3) trong te bào (Mobley và cộng sự, 1995). Khi đó, NH3 sẽ kết hợp
với các ion H+ dư thừa có mặt ừong te bào chất để tạo thành ion amoni (NI I/|') nhằm làm tăng giá
trị pH nội bào (Mobley và cộng sự, 1995). Một số enzyme đã được xác định là giữ vai ừò quan trọng
11

trong quá trình sinh tổng hợp amoni, bao gồm urease và arginine deiminase nội bào. Urease xúc tác
phản ứng chuyển urê thành NH3 và CO2 ttong khi arginine deiminase xúc tác phản ứng chuyển đổi
L-arginine thành NH3 và L-citrulline (Mobley và cộng sự, 1995; Chen và cộng sự, 1996; Cunin và
cộng sự, 1986).
Hơn nữa, sự kích hoạt của amino acid decarboxylase kết hợp vói permease (antiporter) là rất
cần thiết. Khi đó, các amino acid (arginine, glutamate hay lysine) sẽ được vận chuyển từ bên ngoài
vào bên trong tế bào và ngược lại các sản phẩm decarboxyl hóa (agmatine, butyrate Ỵ-amino hoặc
cadaverine) sẽ được vận chuyển từ bên ừong ra bên ngoài tế bào. (Lin và cộng sự, 1996; Cunin và
cộng sự, 1986)
* Cơ chế chong gốc tự do của tế bào
Đe chống lại sự hình thành các gốc tự do gây hại cho DNA của tế bào như là các gốc ROS
được tạo thành từ acid acetic, tế bào kích hoạt quá trình sản sinh một số họp chất chống oxy hóa như
n-acetyl-l-cysteine (NAC) thông qua việc giảm sự hình thành cyt c hoặc giảm khả năng hoạt động
của caspase (Guaragnella và cộng sự - 2010). Ngoài ra, tế bào còn kích hoạt quá trình sản xuất một
số loại enzyme có thể giảm khả năng hoạt động của cyt c như catalase bằng cách tạo liên kết với cyt
c (Giannattasio và cộng sự, 2005) (Hình 2.6).
CH.e
pn « ua

Hình 2. 6. Các cơ chế đáp ứng của tế bào nấm men với điều kiện sttess
12


•
•

Mũi tên xanh lá: con đường gây độc tế bào của acid acetic.
Mũi tên đỏ: con đường giải độc acid acetic của tế bào.

2.3. Điểm mói của đề tài
Hiện nay có rất ít các nghiên cứu khoa học đã công bố nghiên cứu về nấm men K. marxianus
cố định cũng như ứng dụng của loài nấm men cố định này ừong quá ttình lên men ethanol từ sản
phẩm tiền xử lý nguồn sinh khối lignocellulose. Bên cạnh đó, gel alginate canxi là một loại chất
mang rất phổ biến trong ngành công nghiệp lên men hiện nay vì có nhiều ưu điểm như giá thành rẻ,
hiệu quả bảo vệ nấm men cao.
Trong nghiên cứu này, nấm men K. marxianus được cố định ừong gel alginate canxi để lên
men ethanol trong môi trường có chứa các nồng độ acid acetic khác nhau. Kết quả của nghiên cứu
này sẽ giúp làm sáng tỏ khả năng lên men của tế bào nấm men K. marxianus cố định trong gel
alginate ở điều kiện môi trường lên men có chất ức chế so với nấm men tự do.

CHƯƠNG 3. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
3.1.

Nguyên liệu

3.1.1. Nấm men
Nấm men sử dụng trong đề tài nghiên cứu này là loài Klyveromyces marxianus do phòng thí
nghiệm Công nghệ thực phẩm - Bộ môn Công nghệ Thực phẩm - Khoa Kỹ thuật Hóa Học - Trường
Đại Học Bách Khoa TPHCM cung cấp.
Nấm men được bảo quản trên môi trường thạch nghiêng có bổ sung glycerol ở -18°c. Trước
khi sử dụng, nấm men được nhân giống trên môi trường lỏng với ba cấp nhân giống; huyền phù nấm
men được đem ly tâm với tốc độ 5000 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng ừong thời gian 5 phút. Sinh khối
nấm men thu được sau quá trình ly tâm sẽ được cố định ttong gel alginate.
3.1.2. Chất ức chế
Chất ức chế acid acetic được mua từ công ty Sigma-Aldrich (Hoa Kỳ), độ tinh khiết > 99%.
3.1.3. Chất mang
Trong quy trình tạo hạt gel cố định nấm men cần những hóa chất như sau:
-

Chất mang được sử dụng là natri alginate (C()I IyNaO /) được cung cấp bởi Công ty
KOMICA - Nhật Bản. Độ nhớt của dung dịch natri alginate 1% ở 20°C dao động ừong
khoảng 300 - 400 mPa.s.
13