Xác định gen DREB3 của cây quýt (Citrus clementina) bằng phương pháp in silico

KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG

XÁC ĐỊNH GEN DREB3 CỦA CÂY QUÝT (Citrus clementina)
BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN SILICO
Cao Phi Bằng, Bùi Thị Hải Yến, Nguyễn Thị Ánh
Trường Đại học Hùng Vương
TÓM TẮT
DREB3 thuộc về họ gen DREB (dehydration-responsive element binding), họ tác nhân điều hòa
phiên mã có vai trò quan trọng ở thực vật. Trong công trình này, nhờ sử dụng các phương pháp nghiên
cứu in silico, chúng tôi đã xác định được gen DREB3 của cây quýt. CclDREB3 khá giống với các DREB
thuộc phân nhóm A3 của các loài thực vật khác. Gen này có độ dài 1050 pb, mã hóa cho phân tử protein
có kích thước 349 amino acid. Protein CclDREB3 có tính kiềm yếu với giá trị pI bằng 7,10. Mô hình cấu
trúc 3D cho thấy vùng bảo thủ AP2 của CclDREB3 có cấu trúc bậc hai gồm một xoắn α và ba chuỗi β
chạy song song ngược chiều.
Từ khóa: cây quýt, DREB3, đặc điểm hóa - lí, in silico, mô hình 3D, xác định gen.

1. MỞ ĐẦU
Cây quýt (Citrus clementina) thuộc họ Cam (Rutaceae), một trong những họ cây ăn quả quan
trọng nhất trên thế giới. Quả của họ Cam có giá trị dinh dưỡng cao và rất giàu vitamin. Diện tích
trồng các cây thuộc họ này ước đạt 8.785.549 ha trên toàn thế giới, sản lượng ước đạt khoảng trên
131 triệu tấn (FAOSTAT 2012). Ở Việt Nam, sản lượng hàng năm của các cây thuộc họ Cam, quýt
đạt trên dưới 700 nghìn tấn (Thống kê Việt Nam 2012). Do có giá trị cao về kinh tế cũng như dinh
dưỡng, cây quýt được lựa chọn để giải trình tự hệ gen.
DREB nhóm A3 của Arabidopsis, còn được biết đến qua tên gọi ABI4 (protein không mẫn
cảm với ABA-4, ABI4) thuộc họ các tác nhân điều hòa phiên mã DREB. Các protein thuộc họ này
có chứa một vùng gắn ADN tên là AP2 (Apetala 2), vùng này có khả năng tương tác đặc hiệu với
yếu tố DRE (yếu tố trả lời sự mất nước) có trình tự A/GCCGAC trong vùng khởi động của các gen
thực thi. Qua đó hoạt hóa gen thực thi.
Nhiều công trình nghiên cứu đã chỉ ra rằng ABI4 là các tác nhân chính tham gia vào khả
năng chịu khô hạn và ánh sáng cường độ mạnh ở thực vật. ABI4 được cảm ứng bởi các tác nhân
hữu sinh và vô sinh. Đến lượt mình ABI4 kiểm soát sự biểu hiện các gen liên quan tới sự trả lời với

tín hiệu đường, sự nảy mầm của hạt giống.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi hướng tới xác định trình tự của gen DREB3 của cây quýt.
Các đặc trưng vật lý và hóa học của các protein, kết quả phân tích cấu trúc và cây phả hệ sẽ được
giới thiệu trong công trình này.
2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Cơ sở dữ liệu
Trình tự hệ gen của cây quýt được lấy từ Wu và nnk. Trình tự DREB3 của cây Arabidopsis
(AtAIB) được lấy từ Sakuma và nnk.
2.2. Xác định các gen DREB3 ở cây quýt
Protein DREB3 của cây Arabidopsis được dùng làm khuôn dò, chương trình TBLASTN
90 KHCN 2 (31) - 2014


KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG
được sử dụng để tìm kiếm các gen tương đồng trên dữ liệu hệ gen của cây quýt với giá trị e-value
ở mức e-5.
2.3. Xác định các motif bảo thủ
Các protein DREB3 của các cây Arabidopsis, cây nho, cây dương, cây lúa và cây quýt được
sắp dãy bằng cách sử dụng phần mềm MEME.
2.4. Tạo cây phả hệ
Các trình tự protein DREB3 và DREB2 của các cây Arabidopsis, cây nho, cây dương, cây
lúa và DREB3 của cây quýt được sắp dãy bằng cách dùng phần mềm MAFFT [4]. Cây phả hệ
được xây dựng từ các trình tự protein đã sắp dãy nhờ phần mềm MEGA5 nhờ sử dụng phương pháp
Maximum Likelihood và tuân theo các tham biến: mẫu Jones-Taylor-Thornton (JTT), dữ liệu được
xử lý là tất cả các vị trí và phương pháp Bootstrap với 1.000 lần lặp lại.
2.5. Các đặc điểm hóa - lý và cấu trúc không gian
Các đặc điểm vật lí, hóa học của protein nghiên cứu được khảo sát nhờ các phần mềm của
ExPASy.
Cấu trúc không gian của phân tử protein được xây dựng nhờ sử dụng phần mềm Phyre2.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Xác định gen DREB3 ở cây quýt
Bảng 1. DREB3 của cây quýt và đặc điểm.
Tên
CclDREB3

Locus
Ciclev10033578m

Kích thước Kích thước
Khối lượng
gen (pb) protein (aa) phân tử (kDa)
1050

349

37,51

Số lượng
Intron

pI
7,10

0

Chương trình TBLASTN được sử dụng để tìm gen tương đồng trên toàn bộ hệ gen của cây
quýt với khuôn dò là protein AtAIB của cây Arabidopsis (AT2G40220). Bước đầu chúng tôi xác
định được một gen có thể mã hóa cho DREB thuộc nhóm A3 (DREB3) của cây quýt (bảng 1).
Kết quả phân tích motif bảo thủ bằng phần mềm MEME cho thấy, protein suy diễn của gen
này có chứa vùng AP2 (hình 1a) đặc trưng cho các protein cùng họ DREB. Bên cạnh đó, motif KGGPxN (hình 1b) đặc trưng cho các DREB thuộc nhóm A2 và A3 cũng có mặt trên protein DREB3.

Trong vùng AP2, amino acid K26 đứng trước motif WLG đặc trưng cho các DREB3. Tương tự,
amino acid R1 cũng được tìm thấy đứng phía trước motif KGGPxN.

Hình 1: Trình tự vùng bảo thủ AP2 và motif KGGPxN được xây dựng từ các gen DREB3 của
các cây Arabidopsis, cây lúa, cây táo, cây nho và cây quýt.
Protein này được dùng làm khuôn để tìm các protein tương đồng ở các loài khác (orthologs)
có trong cơ sở dữ liệu của NCBI, kết quả được trình bày ở bảng 2. Protein suy diễn có độ tương
đồng cao với các DREB thuộc nhóm A3 của nhiều loài thực vật khác, mức độ tương đồng đạt trên
75%. Phép kiểm tra này cho phép khẳng định gen tìm được là DREB3.
KHCN 2 (31) - 2014 91


KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG
Bảng 2. Các protein tương đồng khác loài gần nhất với các DREB3 của cây quýt
có trong cơ sở dữ liệu của NCBI
Miêu tả trên NCBI
PREDICTED: ethylene-responsive
transcription factor ABI4-like [Setaria
italica]
hypothetical protein
SORBIDRAFT_09g016550 [Sorghum
bicolor]
abscisic acid insensitive 4-1 [Genlisea
aurea]
Os05g0351200 [Oryza sativa Japonica
Group]
hypothetical protein OsI_19581 [Oryza
sativa Indica Group]
hypothetical protein [Oryza sativa Japonica
Group]

PREDICTED: ethylene-responsive
transcription factor ABI4 [Zea mays]
PREDICTED: dehydration-responsive
element-binding protein 2F-like [Glycine
max]
PREDICTED: dehydration-responsive
element-binding protein 2F-like isoform
X2 [Glycine max]
PREDICTED: dehydration-responsive
element-binding protein 2F-like isoform
X1 [Glycine max]

Chỉ
Chỉ
số cực số
đại
tổng

Mức
Mức độ
Giá trị
độ so
tương
E-value
sánh
đồng

Ký hiệu
Genbank

112

112

18%

2E-26

89%

XP_004963859.1

111

111

18%

2E-26

89%

XP_002440922.1

120

120

20%

2E-29

88%

EPS59065.1

113

113

20%

9E-27

84%

NP_001174376.1

113

113

20%

9E-27

84%

EAY97659.1

113

113

20%

1E-26

84%

AAV44075.1

112

112

22%

8E-27

75%

XP_008649551.1

113

113

19%

2E-26

75%

XP_003535164.2

110

110

19%

3E-26

75%

XP_006575245.1

112

112

19%

3E-26

75%

XP_003518110.1

3.2. Đặc điểm của DREB3 của cây quýt
Gen DREB3 của cây quýt là gen mã hóa liên tục, với chiều dài 1050 pb. Protein suy diễn
của nó có kích thước 349 amino acid, tương ứng với khối lượng 37,51 kDa. Protein DREB3 của
cây quýt có tính kiềm yếu, với giá trị pI bằng 7,10 (bảng 1). Những đặc điểm này giống với đặc
điểm của nhiều thành viên thuộc họ DREB của các loài
thực vật khác.
3.3. Cấu trúc không gian vùng bảo thủ AP2 của
DREB3 của cây quýt
Cấu trúc không gian vùng bảo thủ AP2 của
CclDREB3 được xây dựng nhờ chương trình Phyre2
(hình 2). Kết quả chỉ ra vùng này có ba chuỗi b và một
xoắn a. Cấu trúc xoắn này giống với cấu trúc vùng AP2
của nhiều protein khác trong họ DREB, đảm bảo cho
các DREB có khả năng tương tác với yếu tố cis trong Hình 2: Mô hình 3D cấu trúc bậc hai
vùng AP2 của CclDREB3
promoter của các gen đích.
92 KHCN 2 (31) - 2014


KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG
3.4. Phân tích cây phả hệ
Cây phả hệ được thiết lập từ các protein DREB2
và DREB3 của cây Arabidopsis, cây lúa, cây dương,
cây nho và DREB3 của cây quýt. Phù hợp với kết quả
về phân tích motif bảo thủ cũng như xếp loại, DREB3
của cây quýt nằm trên cùng nhánh với các DREB3
của các thực vật khác.
4. KẾT LUẬN
Trong công trình này chúng tôi đã xác định
được một gen DREB3 của cây quýt trong hệ gen của

loài cây này. Gen mã hóa DREB3 mã hóa liên tục, có
chiều dài 1050 pb. Protein suy diễn có chiều dài 349
amino acid. Protein này có độ tương đồng cao với các
DREB thuộc phân nhóm A3 của các thực vật khác.
Hơn nữa, protein này có mang vùng bảo thủ AP2 và
motif KGGPxN và nhiều amino acid đặc trưng cho
DREB thuộc phân nhóm A3. Riêng vùng AP2 có cấu
trúc bậc hai gồm 3 chuỗi b và một xoắn a. Kết quả
bước đầu này có ý nghĩa quan trọng, mở đường cho
việc nghiên cứu chức năng của DREB3 ở loài cây này.

Hình 3: Cây phả hệ được xây dựng từ
các DREB2 và DREB3

Lời cảm ơn
Công trình này được hoàn thành với sự hỗ trợ kinh phí từ chương trình nghiên cứu khoa học
cơ bản của Trường Đại học Hùng Vương.
Tài liệu tham khảo
1. Bailey TL, Williams N, Misleh C, Li WW. 2006. MEME: discovering and analyzing
DNA and protein sequence motifs. Nucleic acids research 34:W369-W73
2. Foyer CH, Kerchev PI, Hancock RD. 2012. The ABA-INSENSITIVE-4 (ABI4) transcription factor links redox, hormone and sugar signaling pathways. Plant Signal Behav 7:276-81
3. Gasteiger E, Gattiker A, Hoogland C, Ivanyi I, Appel RD, Bairoch A. 2003. ExPASy: the
proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res 31:3784-8
4. Katoh K, Standley DM. 2013. MAFFT multiple sequence alignment software version 7:
improvements in performance and usability. Mol Biol Evol 30:772-80
5. Kelley LA, Sternberg MJ. 2009. Protein structure prediction on the Web: a case study using
the Phyre server. Nat Protoc 4:363-71
6. Liu Y, Heying E, Tanumihardjo SA. 2012. History, Global Distribution, and Nutritional
Importance of Citrus Fruits. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 11:530-45
7. Mizoi J, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. 2012. AP2/ERF family transcription factors is plant abiotic stress responses. Biochem Biophys Acta 1819:86-96

8. Sakuma Y, Liu Q, Dubouzet JG, Abe H, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. 2002.
DNA-binding specificity of the ERF/AP2 domain of arabidopsis DREBs, transcription factors
KHCN 2 (31) - 2014 93