Ảnh Hưởng Của Nano Bạc Lên Quá Trình Khử Trùng Mẫu Trong Vi Nhân Giống Cây Hoa African Violet

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM

---------------------------

DƢƠNG BẢO TRINH

ẢNH HƯỞNG CỦA NANO BẠC
LÊN QUÁ TRÌNH KHỬ TRÙNG MẪU
TRONG VI NHÂN GIỐNG
CÂY HOA AFRICAN VIOLET
(SAINTPAULIA IONANTHA H. WENDL.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số ngành: 60420201

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 8 năm 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM

---------------------------

DƢƠNG BẢO TRINH

ẢNH HƯỞNG CỦA NANO BẠC
LÊN QUÁ TRÌNH KHỬ TRÙNG MẪU
TRONG VI NHÂN GIỐNG
CÂY HOA AFRICAN VIOLET

(SAINTPAULIA IONANTHA H. WENDL.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số ngành: 60420201
CÁN BỘ HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Dƣơng Tấn Nhựt
NCS. Nguyễn Phúc Huy
TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 8 năm 2017


TRƢỜNG ĐH CÔNG NGHỆ TP. HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
PHÒNG QLKH – ĐTSĐH

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

TP.HCM, ngày..… tháng…..năm 2017

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: DƢƠNG BẢO TRINH

Giới tính:

NỮ

Ngày, tháng, năm sinh: 07/03/1993

Nơi sinh:

Bà Rị – V ng Tàu

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

MSHV:

1541880014

I- TÊN ĐỀ TÀI:
Ảnh hƣởng của nano bạc lên quá trình khử trùng mẫu trong vi nhân
giống cây hoa african violet (Saintpaulia ionantha H. WendL.)
II- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
 Thứ nhất: So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng thông dụng
[HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] trong khử trùng và cảm ứng mẫu cấy.
 Thứ hai: So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng thông dụng
[HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] trong phát sinh hình thái mẫu cấy in vitro.
 Thứ ba: So sánh sự sinh trƣởng và phát triển của cây african violet in vitro từ
mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc so với các chất khử trùng thông dụng [HgCl2,
Ca(ClO)2, AgNO3] ở gi i đoạn vƣờn ƣơm.
III- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ:
IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:

i


V- CÁN BỘ HƢỚNG DẪN: PGS.TS. Dƣơng Tấn Nhựt
NCS. Nguyễn Phúc Huy
Cán bộ hƣớng dẫn

Khoa quản lý chuyên ngành

(Họ tên và chữ ký)

(Họ tên và chữ ký)

CBHDI

CBHDII

PGS.TS. Dƣơng Tấn Nhựt

NCS. Nguyễn Phúc Huy

ii


CÔNG TRÌNH ĐƢỢC HOÀN THÀNH TẠI
VIỆN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC TÂY NGUYÊN
Cán bộ hƣớng dẫn kho học :

CBHDI

PGS.TS. Dƣơng Tấn Nhựt

CBHDII

NCS. Nguyễn Phúc Huy

Luận văn Thạc sĩ đƣợc bảo vệ tại Trƣờng Đại học Công nghệ TP. HCM
ngày … tháng … năm …
Thành phần Hội đồng đánh giá Luận văn Thạc sĩ gồm:
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn Thạc sĩ)

TT
1
2
3
4
5

Họ và tên

Chức danh Hội đồng
Chủ tịch
Phản biện 1
Phản biện 2
Ủy viên
Ủy viên, Thƣ ký

Xác nhận củ Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận s u khi Luận văn đã đƣợc
sử chữ (nếu có).
Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV

iii


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin c m đo n nghiên cứu “Khảo sát ảnh hƣởng củ n no bạc lên quá trình
khử trùng trong vi nhân giống cây ho african violet (Saintpaulia ionantha H.
WendL.)” là công trình nghiên cứu củ tôi dƣới sự hƣớng dẫn củ PGS.TS. Dƣơng
Tấn Nhựt và NCS. Nguyễn Phúc Huy. Nghiên cứu này c ng là một phần trong
nhánh số 3 củ Dự án trọng điểm cấp Viện Hàn lâm Kho học và Công nghệ Việt

Nam “Nghiên cứu tác động củ hạt n no kim loại lên khả năng tái sinh, sinh trƣởng
phát triển và tích l y hoạt chất trong quá trình nhân giống một số cây trồng có giá
trị kinh tế c o ở Việt N m” thuộc Hợp phần IV: “Nghiên cứu cơ chế tác động và
đánh giá n toàn sinh học củ các chế phẩm n no”, mã số: VAST.TĐ.NANO.04/1518. Những kết quả nghiên cứu củ ngƣời khác và các số liệu đƣợc trích dẫn trong
luận văn có chú thích đầy đủ. Đề tài đƣợc tiến hành tại Phòng Sinh học Phân tử và
Chọn tạo giống cây trồng – Viện Nghiên cứu Kho học Tây Nguyên. Các số liệu,
kết quả, đánh giá đƣ r trong luận văn chƣ đƣợc i công bố trong bất kỳ luận văn
nào trƣớc đây. Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm với nhà trƣờng về c m đo n này.
Tác giả luận văn
Ký tên

Dƣơng Bảo Trinh

iv


LỜI CẢM ƠN
Chắc hẳn trong mỗi con ngƣời i c ng có những khoảnh khắc khó quên của
cả cuộc đời, có thể là vui hay buồn,... Nhƣng với tôi có hai dấu ấn mà tôi mãi khắc
ghi đến suốt cả cuộc đời. Đó là lúc tôi chập chững với những bƣớc đi cùng mẹ trong
những ngày đầu tiên đi học, khi còn thơ bé. Và giờ đây, cái cảm giác ấy một lần nữa
lại ùa về khi tôi bƣớc chân vào phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo giống cây
trồng. Chính các thầy cô, anh chị, các bạn ở đây đã tạo cho tôi có một sự tự tin, nỗ
lực hơn trong cuộc sống c ng nhƣ trong học tập. Để hoàn thành luận văn này, tôi
biết bản thân đã nhận rất nhiều sự giúp đỡ của mọi ngƣời.
Đầu tiên, với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin đƣợc bày tỏ lời
cảm ơn chân thành tới Thầy, PGS. TS. Dƣơng Tấn Nhựt. Thầy đã tận tình chỉ bảo
cho tôi biết thế nào là nghiên cứu kho học, qu sự giảng dạy củ Thầy, cả chân trời
tri thức nhƣ rực sáng trƣớc mắt tôi. Có lẽ, tôi sẽ không b o giờ biết đƣợc những
điều kỳ diệu ấy nếu nhƣ không có sự tâm huyết, nhiệt tình, tận tụy củ Thầy. Làm

sao tôi quên đƣợc từng lời răng dạy nghiêm khắc trong những buổi họp, h y những
câu chuyện hóm hỉnh trong bàn ăn, đặc biệt là hình ảnh đôi t y khẳng khiu, run run
củ Thầy trong những ngày bệnh nhƣng vẫn cố gắng gƣợng, đích thân chụp hình
kết quả thí nghiệm cho chúng tôi cốt là để số liệu, hình ảnh thu đƣợc chính xác và
sắc nét nhất. Chính giây phút ấy, tôi biết bản thân thật m y mắn khi đƣợc trở thành
học trò củ Thầy – “Ngƣời Thầy Toàn Tâm”.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến NCS. Nguyễn Phúc Huy đã chi sẻ nhiều kinh
nghiệm, những kiến thức thực tế, những lời động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành tốt
luận văn tốt nghiệp.
Xin chân thành cảm ơn B n lãnh đạo Viện Nghiên cứu Kho học Tây
Nguyên; Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo s u Đại học, các giảng viên củ Trƣờng
Đại học Công nghệ TP.HCM đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong
suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài này.
Tôi xin cảm ơn tới các cán bộ phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo giống
cây trồng – Viện Nghiên cứu Kho học Tây Nguyên: TS. V Quốc Luận, NCS. V
Thị Hiền, TS. Nguyễn Bá N m, NCS. Hoàng Th nh Tùng, cô Phi Phƣợng. Cảm ơn
mọi ngƣời đã nhiệt tình, dành nhiều thời gi n để chỉ bảo, giúp đỡ tôi.

v


Tôi c ng xin đƣợc gửi lời cảm ơn đến tập thể các nh chị cán bộ, nhân viên
tại công ty CP Công nghệ Sinh học Thái Dƣơng đã giúp tôi có những buổi kiến tập
thực tế bổ ích.
Xin cảm ơn tập thể lớp 15SSH21 trƣờng Đại học Công nghệ Thành phố Hồ
Chí Minh, cùng tất cả các nh chị, các bạn học sinh, sinh viên, học viên củ các
trƣờng Đại học Kho học Tự nhiên, Đại học Đà Lạt, Đại học Yersin Đà Lạt, Đại
học Huế, Đại học Tôn Đức Thắng,… đã và đ ng thực tập tại phòng Sinh học Phân
tử và Chọn tạo giống cây trồng – Viện Nghiên cứu Kho học Tây Nguyên.
Bằng sự tin yêu và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn đến

ThS. BS. CKII. Trần Trọng Nhật Huy, kho Nội, Trung tâm Y tế Vietsovpetro –
bác sĩ điều trị, ngƣời đã cứu sống tôi không chỉ một mà rất nhiều lần, cảm ơn nh vì
đã luôn tận tình cứu chữ , qu n tâm, đồng hành cùng tôi trong cuộc sống. Tôi sẽ
không thể có đủ sức khỏe để hoàn thành luận văn này nếu không có anh.
Trên hết, con xin gửi lời cảm ơn đến b mẹ, chị h i và út. Dù có đi đâu, làm
gì, con (em, chị) vẫn mãi là ngƣời con, ngƣời em, ngƣời chị trong gi đình; vẫn luôn
cần một điểm tự , để đƣợc dỗ dành những phút con mít ƣớt, yếu lòng nhất. Con biết
mọi ngƣời thƣơng con, lo cho sức khỏe củ con nên đã từng rất giận khi con quyết
định rời x gi đình mình. Ông bà t thƣờng nói “Đi một ngày đàng, học một sàng
khôn”, quả đúng là nhƣ thế, bởi con cảm thấy bản thân đã chín chắn hơn rất nhiều
s u khoảng thời gi n rèn luyện. Và đặc biệt, khi càng x mọi ngƣời, con mới càng
nhận r không đâu bằng gi đình. Con xin lỗi và cảm ơn mọi ngƣời vì đã luôn tin
tƣởng con, ủng hộ cho lý tƣởng sống củ con, dẫu rằng con vẫn chƣ thành công
nhƣ mọi ngƣời kỳ vọng. Nhà là nơi để về, là nơi để yêu thƣơng đong đầy, con mãi
yêu mọi ngƣời.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn Đà Lạt – Mảnh đất thân thƣơng gắn với những câu
chuyện về “Lòng ngƣời và những Bài học trong Cuộc sống”. Trân trọng cảm ơn!
TP. Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 07 năm 2017
Người thực hiện luận văn

Dƣơng Bảo Trinh

vi


TÓM TẮT
Khử trùng mẫu cấy là gi i đoạn vô cùng quan trọng của quá trình tạo nguồn
mẫu b n đầu trong nuôi cấy in vitro. Các chất khử trùng hiện n y thƣờng có tính
độc cao gây ảnh hƣởng trực tiếp hoặc gián tiếp cho sức khỏe con ngƣời và môi
trƣờng.

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh nano bạc không chỉ kháng khuẩn hiệu quả
mà còn n toàn cho con ngƣời. Do đó, n no bạc đ ng đƣợc sử dụng rộng rãi trong
nhiều lĩnh vực khác nh u nhƣ: y học, dƣợc phẩm, mỹ phẩm, sinh học, nông
nghiệp,… Tuy nhiên, các báo cáo về ảnh hƣởng của nano bạc trong gi i đoạn khử
trùng mẫu cấy thực vật vẫn còn hạn chế.
Trong nghiên cứu này, các chất khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2,
AgNO3] và nano bạc đã đƣợc sử dụng để khử trùng mẫu cấy african violet
(Saintpaulia ionantha H. Wendl.) với dãy nồng độ, thời gian khử trùng khác nhau
nhằm khảo sát khả năng khử trùng và cảm ứng mẫu cấy của nano bạc trong giai
đoạn khử trùng mẫu. Sau khi khử trùng, chúng tôi tiến hành theo dõi và đánh giá sự
sinh trƣởng, phát triển của mẫu cấy qu các gi i đoạn khác nhau.
Kết quả cho thấy, mẫu cấy đƣợc khử trùng bằng nano bạc ở nồng độ 0,05%
trong 15 phút cho hiệu quả tốt nhất mà không có tác động xấu đến sự sinh trƣởng và
phát triển của mẫu cấy. Nano bạc kích thích sự cảm ứng của mẫu cấy. Đây là
nghiên cứu đầu tiên về khả năng khử trùng c ng nhƣ v i trò của nano bạc lên sự
sinh trƣởng và phát triển của cây african violet (Saintpaulia ionantha H. Wendl.).

vii


ABSTRACT
Surface sterilization is the most important step in preparation of explants for
micropropagation, because controlling fungal and bacterial contamination of plant
from field sources is very difficult. Most of surface disinfectants are now highly
toxic influence either directly or indirectly to human health and the environment.
Many studies have demonstrated not only nano silver antibacterial effect
efficient but also extremely safe for humans. So, the silver nanoparticles have been
widely used in many different fields of life, such as medicine, pharmaceuticals,
cosmetics, biological, agricultural,... However, reports on the effect of silver
nanoparticles for surface sterilization of plant explants are still limited.

Nano silver and typical disinfectants [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] were tested
for sterilization of african violet (Saintpaulia ionantha H. WendL.), by varying their
concentration and time of exposure. The target of this study was to examine
evaluated the possibility of sterilization and stimulate explants of nano silver for
micropropagation. After performing the decontamination step, we observed to
evaluate the growth and development of explants through subsequent stages of the
micropropagation process of african violet.
The results indicated that among these sterilizing agents nano silver at
concentration of 0.05% for 15 minutes was the best for controlling the infection.
Nano silver could be applied without adverse effects on the plant growth and
development. The induction of the explants in culture was also stimulated by silver
nanoparticles. This is the first report on in vitro establishment using nano silver to
reduce bacterial infections, as well as the role of silver nanoparticles on the growth
and development of african violet (Saintpaulia ionantha H. WendL.).

viii


MỤC LỤC
Trang
NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ ........................................................................... i
LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... iii
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................v
TÓM TẮT ................................................................................................................ vii
CHƢƠNG 1. MỞ ĐẦU ..............................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ...........................................................................................................1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu ...........................................................................................2
1.3. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................2
1.4. Ý nghĩ đề tài......................................................................................................2
1.4.1. Ý nghĩ kho học .........................................................................................2

1.4.2. Ý nghĩ thực tiễn ..........................................................................................3
1.5. Kết cấu luận văn .................................................................................................3
CHƢƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................1
2.1. Tổng quan về cây african violet .........................................................................4
2.1.1. Phân loại và đặc điểm ..................................................................................4
2.1.2. Tình hình nghiên cứu african violet .............................................................5
2.2. Sơ lƣợc về gi i đoạn khử trùng trong vi nhân giống thực vật ............................6
2.3. Sơ lƣợc về các chất khử trùng sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật ..................8
2.3.1. Calcium hypochlorite [Ca(ClO)2] ................................................................8
2.3.1.1. Giới thiệu .................................................................................................8
2.3.1.2. Nhƣợc điểm .............................................................................................9
2.3.2. Mercury chloride (HgCl2) ............................................................................9
2.3.2.1. Giới thiệu .................................................................................................9
2.3.2.2. Nhƣợc điểm ...........................................................................................10
2.3.3. Một số chất khử trùng khác .......................................................................10
2.3.3.1. Hydro peroxide (H2O2) ..........................................................................10
2.3.3.2. Nƣớc brom .............................................................................................11

ix


2.3.3.3. Các chất kháng sinh ...............................................................................11
2.3. Sơ lƣợc về nano bạc .........................................................................................11
2.3.1. Nano bạc ....................................................................................................11
2.3.1.1. Giới thiệu về bạc kim loại và cơ chế kháng khuẩn của bạc ..................11
2.3.1.2. Ƣu điểm của nano bạc ...........................................................................12
2.3.2. Nano bạc trong nuôi cấy mô tế bào thực vật .............................................13
2.3.2.1. Các nghiên cứu sinh trƣởng và phát triển của nano bạc trong
nuôi cấy mô tế bào thực vật ...................................................................13
2.3.2.2. Các nghiên cứu về khả năng khử trùng của nano bạc trong nuôi

cấy mô tế bào thực vật ...........................................................................14
CHƢƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............................4
3.1. Đị điểm và thời gian tiến hành đề tài ..............................................................17
3.2. Phƣơng pháp thí nghiệm...................................................................................17
3.2.1. Nguồn mẫu và nguyên liệu ........................................................................17
3.2.2. Môi trƣờng nuôi cấy ..................................................................................17
3.2.3. Điều kiện nuôi cấy .....................................................................................17
3.2.4. Bố trí thí nghiệm ........................................................................................18
3.2.4.1. Nội dung 1: So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng
thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] trong khử trùng và cảm
ứng mẫu cấy...........................................................................................18
3.2.4.2. Nội dung 2: So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng
thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] trong phát sinh hình thái
mẫu cấy in vitro .....................................................................................20
3.2.4.3. Nội dung 3: So sánh sự sinh trƣởng và phát triển của cây african
violet in vitro có nguồn gốc từ mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc
với các chất khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] ở
gi i đoạn vƣờn ƣơm...............................................................................21
3.2. Giải phẫu hình thái và quan sát mô học ...........................................................22
3.3. Chỉ tiêu theo dõi và xử lý số liệu......................................................................23

x


CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................17
4.1. Nội dung 1: So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng thông
dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] trong khử trùng và cảm ứng mẫu cấy .........24
4.2. Nội dung 2: So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng thông
dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] trong phát sinh hình thái mẫu cấy
in vitro ..............................................................................................................46

4.3. Nội dung 3: So sánh sự sinh trƣởng và phát triển của cây african violet
in vitro có nguồn gốc từ mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc với các
chất khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] ở gi i đoạn
vƣờn ƣơm .........................................................................................................55
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................59
5.1. Kết luận ............................................................................................................59
5.1.1. Kết quả đạt đƣợc ........................................................................................59
5.1.2. Quy trình khử trùng mẫu cấy african violet bằng nano bạc ......................59
5.2. Kiến nghị ..........................................................................................................61
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ..........................................................................62
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................63
1. Tài liệu tiếng Việt ...............................................................................................63
2. Tài liệu tiếng Anh ...............................................................................................64
PHỤ LỤC ..................................................................................................................71

xi


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
B5

: Gamborg và đồng tác giả (1968)

BA

: 6-Benzylaminopurine

DNA

: Deoxiribonucleic acid

IBA

: 3-Indol butyric acid

MS

: Murashige và Skoog (1962)

NAA

: Naphthalene acetic acid

SAM

: S-Adenosyl methionine

xii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1.

Đánh giá hiệu quả về nồng độ và thời gian sử dụng của các tác
nhân vô trùng ...........................................................................................8

Bảng 3.1.

So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng thông dụng
trong khử trùng và cảm ứng mẫu cấy ....................................................19

Bảng 3.2.

So sánh sự sinh trƣởng, phát triển của mẫu cấy african violet in
vitro từ nguồn mẫu khử trùng bằng nano bạc với các chất khử
trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] .......................................20

Bảng 3.3.

So sánh sự sinh trƣởng, phát triển và tạo cây hoàn chỉnh của chồi
african violet in vitro có nguồn gốc từ mẫu cấy khử trùng bằng
nano bạc với các chất khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2,
AgNO3] ..................................................................................................21

Bảng 3.4.

So sánh sự sinh trƣởng, phát triển của cây african violet in vitro
có nguồn gốc từ mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc với các chất
khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] ở gi i đoạn
vƣờn ƣơm ..............................................................................................22

Bảng 4.1a. So sánh khả năng khử trùng mẫu lá african violet của nano bạc
và HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 15 ngày nuôi cấy thông qua tỷ
lệ mẫu nhiễm .........................................................................................25
Bảng 4.1b. So sánh khả năng khử trùng mẫu cuống lá african violet của
nano bạc và HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 15 ngày nuôi cấy
thông qua tỷ lệ mẫu nhiễm ....................................................................26
Bảng 4.2a. So sánh khả năng khử trùng mẫu lá african violet của nano bạc
và HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 15 ngày nuôi cấy thông qua tỷ
lệ mẫu cấy chết ......................................................................................27

Bảng 4.2b. So sánh khả năng khử trùng mẫu cuống lá african violet của
nano bạc và HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 15 ngày nuôi cấy
thông qua tỷ lệ mẫu cấy chết .................................................................28

xiii


Bảng 4.3a. So sánh khả năng khử trùng mẫu lá african violet của nano bạc
và HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 15 ngày nuôi cấy thông qua tỷ
lệ mẫu cấy thành công ...........................................................................30
Bảng 4.3b. So sánh khả năng khử trùng mẫu cuống lá african violet của
nano bạc và HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 15 ngày nuôi cấy
thông qua tỷ lệ mẫu cấy thành công ......................................................31
Bảng 4.4.

Sự phát sinh hình thái khác nhau giữa nano bạc và chất khử
trùng thông dụng sau 30 ngày nuôi cấy.................................................41

Bảng 4.5.

So sánh sự sinh trƣởng, phát triển của cụm chồi tái sinh từ mẫu
cấy lá cây african violet khử trùng bằng nano bạc với HgCl2,
Ca(ClO)2, AgNO3 sau 30 ngày nuôi cấy ...............................................47

Bảng 4.6.

So sánh sự sinh trƣởng, phát triển và tạo cây hoàn chỉnh của chồi
tái sinh từ mẫu cấy lá cây african violet khử trùng bằng nano bạc
với HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 ................................................................52

Bảng 4.7.

So sánh sự thích nghi, sinh trƣởng của cây african violet in vitro
có nguồn gốc từ mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc với HgCl2,
Ca(ClO)2, AgNO3 sau 4 tuần ở điều kiện ex vitro .................................55

xiv


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 2.1.

Cây hoa african violet ..............................................................................4

Hình 2.2.

Sơ đồ quy trình khử trùng mẫu cấy .........................................................7

Bảng 2.1.

Đánh giá hiệu quả về nồng độ và thời gian sử dụng của các tác
nhân vô trùng ...........................................................................................8

Hình 4.1.

Sự cảm ứng giữa các mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc và
HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 30 ngày nuôi cấy ...................................42

Hình 4.2.

Giải phẫu hình thái và quan sát mô học của các mẫu cấy khử
trùng bằng nano bạc và các chất khử trùng thông dụng sau 30
ngày nuôi cấy.........................................................................................43

Hình 4.3.

Mẫu lá cây african violet khử trùng bằng nano bạc, HgCl2,
Ca(ClO)2 và AgNO3 trong gi i đoạn tái sinh chồi sau 30 ngày
nuôi cấy .................................................................................................48

Hình 4.4.

Mẫu cấy african violet khử trùng bằng nano bạc, HgCl2,
Ca(ClO)2 và AgNO3 trong gi i đoạn tạo cây hoàn chỉnh sau 30
ngày nuôi cấy.........................................................................................53

Hình 4.5.

Cây con tái sinh từ mẫu cấy lá cây african violet khử trùng bằng
nano bạc với HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 ................................................56

Hình 4.6.

African violet ra hoa sau 4 tháng trồng ngoài vƣờn ƣơm .....................57

Hình 5.1.

Sơ đồ khử trùng mẫu cấy bằng nano bạc trong quy trình nhân
giống cây african violet .........................................................................60

xv


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 4.1a. Biểu đồ thể hiện khả năng khử trùng mẫu lá cây african violet
của HgCl2 ............................................................................................33
Biểu đồ 4.1b. Biểu đồ thể hiện khả năng khử trùng mẫu cuống lá cây african
violet của HgCl2 ..................................................................................33
Biểu đồ 4.2a. Biểu đồ thể hiện khả năng khử trùng mẫu lá cây african violet
của Ca(ClO)2 .......................................................................................34
Biểu đồ 4.2b. Biểu đồ thể hiện khả năng khử trùng mẫu cuống lá cây african
violet của Ca(ClO)2 .............................................................................35
Biểu đồ 4.3a. Biểu đồ thể hiện khả năng khử trùng mẫu lá cây african violet
của AgNO3 ..........................................................................................36
Biểu đồ 4.3b. Biểu đồ thể hiện khả năng khử trùng mẫu cuống lá cây african
violet của AgNO3 ................................................................................36
Biểu đồ 4.4a. Biểu đồ thể hiện tỷ lệ mẫu lá african violet thành công khi khử
trùng bằng nano bạc ............................................................................37
Biểu đồ 4.4b. Biểu đồ thể hiện tỷ lệ mẫu cuống lá african violet thành công
khi khử trùng bằng nano bạc ...............................................................38
Biểu đồ 4.5. Biểu đồ thể hiện số chồi tái sinh từ mẫu cấy lá cây african
violet khử trùng bằng nano bạc với HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3
sau 30 ngày nuôi cấy ...........................................................................49

xvi


Chƣơng 1
MỞ ĐẦU

CHƢƠNG 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Đƣ mẫu từ môi trƣờng ex vitro vào in vitro là gi i đoạn vô cùng khó khăn
bởi vì ở gi i đoạn này mẫu cấy thông thƣờng dễ bị nhiễm nấm, khuẩn, bị chết hoặc
mẫu cấy phát triển chậm, gây tốn kém và mất thời gi n cho ngƣời thực hiện. Có
rất nhiều nguyên nhân dẫn đến tình trạng trên: chất khử trùng, nồng độ và thời
gian khử trùng mẫu cấy chƣ phù hợp là những nguyên nhân chính dẫn đến sự thất
bại trong gi i đoạn vào mẫu b n đầu (Abdi et al., 2012). Phần lớn các chất khử
trùng mẫu đ ng đƣợc sử dụng hiện nay [HgCl2, Ca(ClO)2,…] là các chất mang
tính tẩy rửa cao, kháng vi sinh vật theo cơ chế ăn mòn vách, thành tế bào vi khuẩn
và nấm nên thƣờng gây ảnh hƣởng đến mẫu cấy nhƣng vẫn không hiệu
quả trong khử trùng mẫu (Ines et al., 2013). Ngoài ra, hầu hết các chất đƣợc
sử dụng trong khử trùng mẫu cấy hiện nay đều có tác động xấu tới sức khỏe con
ngƣời (WHO, 2000). Việc tìm ra một loại chất khử trùng mới an toàn cho sức
khỏe, hiệu quả trong khử trùng mẫu và có tác dụng kích thích mẫu cấy là việc vô
cùng cần thiết.
Bạc và các muối bạc đã đƣợc sử dụng phổ biến trong khử trùng y khoa nhờ
đặc tính kháng nấm, kháng khuẩn mà không gây ảnh hƣởng đến sức khỏe và sự
tăng sinh của các mô biểu bì (Abdi et al., 2012). Mặt khác, ion bạc còn đóng v i
trò quan trọng trong việc tác động phát sinh phôi soma, tạo chồi và tạo rễ (Bais et
al., 2000), ảnh hƣởng tích cực trong điều chỉnh quá trình sinh lý bao gồm cả hình
thái của mẫu cấy (Halevy et al., 1981); do đó, ion bạc đã đƣợc sử dụng trong nuôi
cấy mô thực vật nhằm kích thích mẫu cấy c ng nhƣ hạn chế số lƣợng mẫu nhiễm
(Russell et al., 1994; Abdi et al., 2012). Thông thƣờng các ion bạc luôn đi kèm với
các cation tồn tại ở dạng muối nhƣ: bạc nitrate, bạc thiosulph te,… điều này ảnh
hƣởng đến hiệu quả hấp thu và khử trùng của ion bạc.
Công nghệ n no r đời để khắc phục tình trạng trên, với các đặc tính ƣu việt
nhƣ: tăng hiệu quả tiếp xúc bề mặt nên ion dễ dàng bám dính xâm nhập vào tế bào

1


vi sinh vật hay thực vật hơn, dễ dàng di chuyển bên trong thực vật giúp tăng hiệu
quả hấp thu và khử trùng, hứa hẹn sẽ mang lại nhiều thành công vƣợt trội trong
lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào thực vật (Husen, Siddiqi, 2014). Nhiều nghiên cứu
chứng minh nano bạc có khả năng khử trùng đã đƣợc thực hiện, tuy nhiên chƣ có
nghiên cứu nào mang tính hệ thống và đầy đủ về ảnh hƣởng của nano bạc trong
gi i đoạn khử trùng mẫu c ng nhƣ phát sinh hình thái của mẫu cấy từ gi i đoạn in
vitro đến gi i đoạn ex vitro.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
 So sánh khả năng khử trùng mẫu của nano bạc với các chất khử trùng thông
dụng thông qua sự cảm ứng và phát sinh hình thái của các loại mẫu cấy cây
african violet ex vitro khi vào mẫu in vitro bao gồm: Mẫu cấy lá chứa gân
chính, mẫu cấy phiến lá, mẫu cấy cuống lá cắt ngang, mẫu cấy cuống lá cắt dọc.
 Đánh giá ảnh hƣởng của nano bạc thông qua quá trình theo dõi sự sinh trƣởng,
phát triển của chồi và cây con african violet in vitro; sự sinh trƣởng, phát triển
củ cây con khi đƣ r trồng ở điều kiện vƣờn ƣơm.
1.3. Nội dung nghiên cứu
 Nội dung 1: So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng thông dụng
[HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] trong khử trùng và cảm ứng mẫu cấy.
 Nội dung 2: So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng thông dụng
[HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] trong phát sinh hình thái mẫu cấy in vitro.
 Nội dung 3: So sánh sự sinh trƣởng và phát triển của cây african violet in vitro
từ mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc với các chất khử trùng thông dụng [HgCl2,
Ca(ClO)2, AgNO3] ở gi i đoạn vƣờn ƣơm.
1.4. Ý nghĩa đề tài
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
Những tiến bộ về khoa học vật liệu trong những thập niên đầu thế kỷ XXI
đã tạo tiền đề để công nghệ nano có những bƣớc phát triển mạnh mẽ và từng

2


bƣớc có mặt trong nhiều lĩnh vực khoa học và công nghệ nhƣ kho học vật liệu,
vật lý, hóa học, sinh học,… và công nghệ sinh học thực vật. Trong đó, n no bạc
đƣợc nhìn nhận nhƣ một nhân tố mới có hiệu quả trong nuôi cấy mô tế bào thực
vật. Các nghiên cứu về nano bạc hiện chủ yếu đánh giá tác động ngăn sinh tổng
hợp ethylene, từ đó gián tiếp tác động lên sinh trƣởng và phát triển của thực vật.
Ngoài ra, nano bạc còn đƣợc quan tâm vì khả năng kháng khuẩn, nấm cao. Hiện
nay, nano bạc chỉ đƣợc sử dụng nhƣ một tác nhân hỗ trợ khử trùng trong giai
đoạn khử trùng mẫu. Nghiên cứu này mang tính hệ thống đầy đủ về ảnh hƣởng
của nano bạc trong việc khử trùng, phát sinh hình thái của mẫu cấy ex vitro cây
african violet nói riêng và là bƣớc đầu nghiên cứu khả năng sử dụng nano bạc
khử trùng mẫu cấy thực vật nói chung.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Việc khử trùng mẫu cấy ex vitro hiện nay ở các phòng thí nghiệm chủ yếu
sử dụng chất khử trùng mẫu cấy có tính tẩy rử và ăn mòn c o nên có khả năng
gây độc và ức chế mẫu cấy. Ngoài r , đ phần các chất khử trùng hiện nay có
ảnh hƣởng tiêu cực đến sức khỏe con ngƣời; do đó, việc khảo sát và đánh giá
khả năng khử trùng, kháng khuẩn, nấm của nano bạc thay thế cho kháng sinh
hay các chất khử trùng này mang lại lợi ích vô cùng lớn, và là một bƣớc ngoặc
mới trong công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật.
1.5. Kết cấu luận văn
Ngoài phần danh mục tài liệu tham khảo, nội dung chính của luận văn gồm
có 5 chƣơng:
Chƣơng 1. Mở đầu
Chƣơng 2. Tổng quan tài liệu
Chƣơng 3. Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
Chƣơng 4. Kết quả và thảo luận

Chƣơng 5. Kết luận và kiến nghị

3


Chƣơng 2
TỔNG QUAN
TÀI LIỆU


CHƢƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về cây african violet
2.1.1. Phân loại và đặc điểm
Ngành

: Tracheobionta

Phân ngành : Spermatophyta
Lớp

: Magnoliopsida

Bộ

: Scrophulariales

Họ

: Gesneriaceae

Chi

: Saintpaulia

Hình 2.1. Cây hoa african violet

Loài

: Saintpaulia ionantha H. WendL.

(Saintpaulia ionantha H. WendL.)

Saintpaulia spp. thuộc họ Gesneriaceae, giống Saintpaulia H. WendL. đƣợc
phân loại vào nhóm cây cỏ lƣu niên. Thân cây gồm các lá ngắn, dày và kéo dài
chậm chạp, hoặc có thân bò ngang. Rễ mọc ra từ các đốt thân (Jungnickel, Zaid,
1992).
Lá có cuống dày, phiến lá từ dạng hình tim hơi tròn đến hình elip. Các lá mọc
đối, khít với nhau và xếp lại giống nhƣ hình vƣơng miện. Lớp lông c ng góp phần
vào sự phân biệt giữa các loài. Các lông tuyến có cuống ngắn hoặc không có cuống
thì không có giá trị phân loại trong giống này. Các lông che chở trên lá có thể dài
hoặc ngắn, dựng đứng hoặc nằm ngang, sự phân bố các lông trên lá chỉ có ở dạng
thẳng đứng, có lá các lông chỉ ở dạng nằm ngang hoặc có cả hai dạng phân bố trên
cùng một lá (Jungnickel, Zaid, 1992).
Cây african violet phát triển cao khoảng 30 cm. Các lá thuôn tròn thành hình
bầu dục, dài 2,5 – 8,5 cm với một cuống 2 – 10 cm, lông mịn, kết cấu nhiều thịt.
Các ho có đƣờng kính 2 – 3 cm, với một thùy tràng hoa có 3 – 10 bông hoặc nhiều
hơn trên một cành hoa mảnh mai. Các loài hoang dã có màu tím, xanh nhạt, hoặc
trắng. African violet là loài hoa với đ dạng màu sắc, có cánh đơn cánh kép rất đẹp
mắt, có thể nở và sống dƣới ánh sáng trắng, ánh sáng nhân tạo, không gian kín nhƣ
các văn phòng làm việc mà không phải chăm sóc nhiều.

4


2.1.2. Tình hình nghiên cứu african violet
Nhiều giống Saintpaulia đã đƣợc nhân giống thƣơng mại và sự phát triển của
các cây mẹ khỏe mạnh, sạch bệnh đƣợc thu nhận nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng.
Các cây con khỏe mạnh, sạch bệnh và giống nhau về mặt di truyền đã đƣợc lƣu trữ
trong in vitro trong một thời gian dài (Jungnickel, Zaid, 1992).
Theo Bilkey và Cocking (1982), khả năng tái tạo khác nh u củ mô biểu bì và
hạ bì ở Saintpaulia ionantha H. WendL. tùy thuộc vào môi trƣờng muối khoáng cơ
bản đƣợc sử dụng trong nuôi cấy. Môi trƣờng chứa 0,1 mg/l NAA và 0,5 mg/l BA
cho sự tạo thành mô sẹo trên cuống lá cắt ngang còn nguyên lớp tế bào biểu bì và
trên cuống lá bị tách bỏ lớp biểu bì (chỉ còn lớp các tế bào hạ bì). Sự tạo cây chỉ xảy
ra trên cuống lá có chứa các lớp tế bào biểu bì. Trên môi trƣờng B5 với cùng nồng
độ các chất điều hò sinh trƣởng đã diễn ra sự tạo chồi trên cả hai loại mẫu cấy. Khi
trồng các cây thu đƣợc trên cả hai loại mô biểu bì và hạ bì đến khi ra hoa,các tác giả
nhận thấy rằng, các cây thu đƣợc từ mô hạ bì khỏe mạnh hơn, lớn hơn về khối
lƣợng tƣơi 25%, đƣờng kính lá lớn hơn 11%, nhiều lá hơn 28%, cuống lá mập hơn
14% và dài hơn 18% so với các cây thu từ các lớp tế bào biểu bì.
Theo Dallon (1987), từ lá, cuống lá và phần phát hoa của african violet có thể
phát sinh tạo cơ qu n bình thƣờng và hoàn chỉnh trên môi trƣờng có 0,5 mg/l BA
kết hợp với 0,5 mg/l NAA. Theo George (1993), việc nuôi cấy phát hoa in vitro của
các cây african violet thể khảm đã tạo ra các cây con đồng kiểu gene với cây mẹ.
Điều này có thể là do các chồi con đƣợc tạo ra từ đỉnh sinh trƣởng bên hoặc đỉnh
sinh trƣờng củ phát ho đã biệt hóa thành chồi sinh dƣỡng. Chồi con african violet
có thể nuôi cấy đƣợc trong môi trƣờng đơn giản gồm 23 g đƣờng, 240 ml nƣớc cất,
1 viên inositol 125 mg, 1 viên vitamin có chứa B1 và các khoáng tố, 4 muỗng nƣớc
dừa và 1 viên vôi nhỏ để điều chỉnh pH. H koz ki (1993) đã nghiên cứu ảnh hƣởng
của nồng độ đƣờng và pH môi trƣờng lên sự tạo mô sẹo, tái sinh và tăng trƣởng

chồi từ lá african violet. Thời gian hình thành mô sẹo và chồi ngắn nhất trên môi
trƣờng MS có chứ 30 g/l đƣờng, pH 5,8 và đây c ng là môi trƣờng cho chỉ số tái
sinh chồi cao nhất. Shizuk Ohki (1993) đã qu n sát các th y đổi bề mặt mô học của

5