Xác Định Phương Pháp Tinh Sạch Npv (Nuclear Polyhedrosis Virus)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH NPV
(NUCLEAR POLYHEDROSIS VIRUS)
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Hai
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1151110260

: Trương Hùng Phong
Lớp: 11DSH04

TP. Hồ Chí Minh, 2015
i


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

LỜI CAM ĐOAN
- - - - - - - - -- - - - - - - - -

Tôi tên: Trương Hùng Phong
Sinh ngày 17 tháng 09 năm 1993
Sinh viên lớp 11DSH04 - Công Nghệ Sinh Học - Trường ĐH Kỹ Công Nghệ TP
Hồ Chí Minh.
Tôi xin cam đoan : Đề tài "Xác định phương pháp tinh sạch NPV (Nuclera

Polyhedrosis Virus)" do Tiến sĩ Nguyễn Thị Hai hướng dẫn là đề tài của riêng tôi. Các
số liệu, kết quả trong luận văn tốt nghiệp là trung thực và chưa từng được ai công bố
trong bất kỳ công trình luận văn nào trước đây. Những thông tin tham khảo trong khóa
luận đều được trích dẫn cụ thể nguồn sử dụng.
Tất cả những nội dung trong đồ án đúng như nội dung đề tài và yêu cầu của giáo
viên hướng dẫn. Nếu có sai sót tôi xin chịu trách nhiệm trước hội đồng.

Sinh viên thực hiện

Trương Hùng Phong

i


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

LỜI CẢM ƠN
- - - - - - - - -- - - - - - - - Để hoàn thành đề tài này ngoại sự nổ lực, cố gắng của bản thân, em còn nhận
được sự hỗ trợ rất nhiều từ nhiều người, tôi chân thành gửi lời "CẢM ƠN" tới :
Con xin kính dâng lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến Ba Mẹ cùng tất cả những
người thân trong gia đình đã nuôi con khôn lớn nên người và tận tâm lo lắng, tạo mọi
điều kiện cho con được học tập cho đến ngày hôm nay.
Ngôi trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, nơi em đã gắn bó
suốt bốn năm học qua, giúp em có thể tiếp cận được những điều bổ ích, những kinh
nghiệm trong cuộc sống.
Ban chủ nhiệm khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, các thầy cô trong bộ
môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP HCM đã trang
bị cho em những kiến thức cơ bản, làm nền móng để tôi thực hiện đề tài và làm tốt
công việc sau này.
Tiến sĩ Nguyễn Thị Hai, đã tận tình hướng dẫn, cung cấp những tư liệu quý giá.

truyền đạt kinh nghiệm và động viên tinh thần để em có thể hoàn thành đồ án của
mình.
Thầy Huỳnh Văn Thành, thầy Nguyễn Trung Dũng phòng thí nghiệm khoa Môi
Trường và Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP HCM đã
quan tâm, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài.
Các bạn trong tập thể lớp 11DSH04 cùng tập thể các bạn cùng thực hiện trong
phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh Học trường Đại học Kỹ Thuật Công nghệ Tp.Hồ
Chí Minh, các bạn đã luôn quan tâm, ủng hộ và động viên tinh thần giúp em vượt qua
những khó khăn trong quá trình thực hiện đồ án.
Em xin chân thành "CẢM ƠN" những sự giúp đỡ đó.
ii


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

MỤC LỤC
MỤC LỤC ........................................................................................................................iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................. vi
DANH MỤC CÁC BẢNG ..............................................................................................vii
DANH MỤC HÌNH ẢNH............................................................................................. viii
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 4
1.1.

Giới thiệu chung về sâu khoang (Spodoptera litura).......................................... 4

1.1.1.

Phân bố .......................................................................................................... 4

1.1.2.

Ký chủ ........................................................................................................... 4

1.1.3.

Đặc điểm hình thái và sinh học .................................................................... 4

1.1.4.

Tập tính sống và cách gây hại ...................................................................... 8

1.1.5.

Thiên địch và biện pháp phòng trừ ............................................................... 9

1.2.

Khái quát về virus diệt côn trùng ...................................................................... 11

1.2.1.

Lịch sử nghiên cứu virus diệt côn trùng ..................................................... 11

1.2.2.

Cơ sở khoa học sử dụng virus diệt côn trùng trong đấu tranh sinh học .... 11

1.2.3.

Hình thái và cấu trúc chung của virus ........................................................ 12

1.2.4.

Những nhóm virus chính gây bệnh côn trùng ............................................ 14

1.2.4.1. Nhóm Baculovirus (Baculoviridae) ........................................................ 14
1.2.4.2. Nhóm Cytoplasmic polyhedrosis virus - CPV (Reoviridae) .................. 16
1.2.4.3. Nhóm iridovirut (iridoviridae) ................................................................ 16
1.2.4.4. Nhóm Densevirut (Parvoviridae) ............................................................ 17
1.2.4.5. Nhóm các virut RNA (picornaviridae) ................................................... 17
1.2.4.6. Nhóm sigmavirut (Rhabdoviridae) ......................................................... 17
1.2.4.7. Nhóm ascoviridae .................................................................................... 17
1.2.5.

Giới thiệu về virus NPV gây bệnh côn trùng ............................................. 17
iii


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

1.2.5.1. Cấu trúc ................................................................................................... 18
1.2.5.2. Cơ chế gây bệnh của NPV ...................................................................... 19
1.2.5.3. Phương thức lây truyền nguồn bệnh virus .............................................. 21
1.2.5.4. Triệu chứng của bệnh virus trên sâu khoang .......................................... 21
1.3.2.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu lực của virus và cách hạn chế khi sử
dụng chế phẩm virus ............................................................................................. 23
1.2.5.5. Ưu và nhược điểm của việc sử dụng chế phẩm NPV trong phòng trừ
dịch hại . ................................................................................................................ 24
1.3.

Giới thiệu về phương pháp ly tâm ..................................................................... 25

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 28
2.1

Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..................................................................... 28

2.2

Vật liệu ............................................................................................................... 28

2.2.1

Dụng cụ ....................................................................................................... 28

2.2.2

Hóa chất ...................................................................................................... 29

2.3

Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 29

2.3.1 Thí nghiệm 1 :Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn dịch gốc tới chất lượng
của virus .................................................................................................................... 29
2.3.1.1 Bố trí thí nghiệm...................................................................................... 29
2.3.1.2 Tiến hành ................................................................................................. 30
2.3.2 Thí nghiệm 2: Xác định số vòng ly tâm phù hợp để loại bỏ xác sâu và các
thể hòa tan ................................................................................................................. 35

2.3.2.1 Bố trí thí nghiệm...................................................................................... 35
2.3.2.2 Tiến hành ................................................................................................. 36
2.3.3

Thí nghiệm 3: Xác định số vòng ly tâm lần thứ 2 để tinh sạch NPV ........ 39

2.3.3.1 Bố trí thí nghiệm...................................................................................... 39
2.3.3.2 Tiến hành ................................................................................................. 39
2.3.4

Phương pháp xử lý số liệu .......................................................................... 40

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................. 41
3.1

. Ảnh hưởng của dịch gốc đến hiệu quả nhân NPV trong sâu khoang ............ 41
iv


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

3.2

Xác định số vòng ly tâm phù hợp để loại bỏ xác sâu và các thể hòa tan ......... 44

3.3

Xác định số vòng ly tâm lần 2 để tinh sạch virus NPV .................................... 52

3.4

Tối ưu hóa công thức ly tâm tinh sạch NPV ..................................................... 59

CHƯƠNG 4:KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................... 62
4.1.

Kết luận .............................................................................................................. 62

4.2.

Kiến nghị............................................................................................................ 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 63

v


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

NPV

Virus đa diện nhân (Nuclear Polyhedrosis Virus)

SENPV

Spodoptera exigua Nuclear Polyhedrosis Virus

BVTV

Bảo vệ thực vật

DDT

Thuốc trừ sâu (Dichloro diphenyl trichlorothane)

EPN

Tuyến trùng ký sinh côn trùng (Entomopathogenic Nematodes)

PPI

Chất kiềm hãm sinh trưởng

CT

Công thức

IPM

Biện pháp phòng trừ dịch hại tổng hợp (Integrated Pest
Management

CPVs

Virus đa diện tế bào chất (Cytoplasmic polyhedrosis viruses).

IB

Thể vùi (Inclusion Body)

OB

Thể vùi (Occlusion Body)

PIB

Thể vùi (Polyhedral inclusion body)

DNP

Deoxyribo Nucleo Protein

PCA

Plate Count Agar

vi


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Thành phần công thức thức ăn nhân tạo ........................................................ 33
Bảng 3.1 Số sâu chết sau các ngày phơi nhiễm dịch NPV (con) .................................. 42
Bảng 3.2 Hiệu lực diệt sâu (%) của dịch NPV .............................................................. 43
Bảng 3.3 Tổng số vi sinh vật hiếu khí trong dịch virus ................................................ 43
Bảng 3.4 Tổng vi sinh vật hiếu khí trong dịch NPV sau khi li tâm lần 1 ..................... 45
Bảng 3.5 Số PIB của dịch virus NPV ở các chế độ li tâm ............................................ 47

Bảng 3.6 Hiệu lực diệt sâu (%) của dịch NPV ............................................................. 50
Bảng 3.7 Hiệu lực diệt sâu, số PIB và tổng vi sinh vật hiếu khí của dịch virus ở các
công thức ly tâm .............................................................................................................. 51
Bảng 3.8 Tổng vi sinh vật hiếu khí trong dịch NPV sau khi li tâm lần 2 ..................... 53
Bảng 3.9 Số PIB của dịch virus NPV ở các chế độ li tâm ............................................ 54
Bảng 3.10 Hiệu lực diệt sâu (%) của các công thức ở các ngày sau nhiễm ................ 56
Bảng 3.11 Hiệu lực diệt sâu, tổng số vi sinh vật hiếu khí và số PIB của các CT ở các
chế độ ly tâm 2 lần........................................................................................................... 58
Bảng 3.12 Hiệu lực diệt sâu, số PIB và tổng vi sinh vật hiếu khí của dịch virus ....... 60

vii


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình1.1: Vòng đời sâu khoang....................................................................................... 5
Hình1.2: Trứng sâu khoang ............................................................................................. 6
Hình1.3: Ấu trùng sâu khoang ....................................................................................... 7
Hình1.4: Nhộng sâu khoang ............................................................................................ 7
Hình1.5: Bướm sâu khoang ............................................................................................. 8
Hình1.6: Một số hình dạng của virus ............................................................................ 13
Hình1.7: Cấu trúc của virus.......................................................................................... 14
Hình1.8: Cấu trúc của thể vùi (Kalmakoff et al,2003) ................................................. 18
Hình1.9: Sâu khoang chết do nhiễm virus .................................................................. 22
Hình 2.1: Các bước tiến hành phương pháp đổ đĩa ....................................................... 32
Hình 2.2: A: Hộp nhựa 20x12x7 cm; B: Sau khi cho thức ăn nhân tạo; C: Sâu được
nuôi trong thức ăn nhân tạo sau khi quét dịch virus ....................................................... 35
Hình 2.3: Buồng đếm hồng cầu ...................................................................................... 36
Hình 2.4: Cấu tạo buồng đếm hồng cầu ......................................................................... 37

Hình 2.5: Quy tắc đếm bằng buồng đếm hồng cầu ........................................................ 38
Hình 2.6: Hình dáng virus trên buồng đếm hồng cầu (vật kính 40X) ........................... 39
Hình 3.1: Diễn biến số sâu chết qua các ngày phơi nhiễm ............................................ 42
Hình 3.2: Biểu đồ thể hiện tổng số vi sinh vật hiếu khí của dịch virus NPV ................ 46
Hình 3.3: Khuẩn lạc của vi sinh vật hiếu khí trên môi trường PCA ............................. 46
Hình 3.4: PIB virus trong buồng đếm hồng cầu (vật kính 40X) ................................... 48
Hình 3.5: Biểu đồ thể hiện lượng PIB trong dịch virus ở các CT ly tâm ...................... 48
Hình 3.6: Hiệu lực diệt sâu qua các ngày phơi nhiễm ................................................... 50
Hình 3.7: So sánh hiệu lực diệt sâu, số PIB và tổng vi sinh vật hiếu khí của các công
thức
....................................................................................................................... .52
Hình 3.8: Biểu đồ thể hiện tổng số vi sinh vật hiếu khí của dịch virus NPV ................ 53
Hình 3.9: Biểu đồ thể hiện lượng PIB trong dịch virus NPV ........................................ 55
viii


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 3.10: Sâu chết với các dấu hiệu đặc trưng của nhiễm virus ................................ 56
Hình 3.11: Diễn biến hiệu lực diệt sâu qua các ngày phơi nhiễm............................... 57
Hình 3.12: Diễn biến hiệu lực diệt sâu qua các ngày phơi nhiễm................................ 61

ix


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Sâu khoang Spodoptera litura là đối tượng gây hại nghiêm trọng trên phạm vi

toàn thế giới cũng như ở Việt Nam. Trong những năm gần đây sâu khoang xuất hiện
khá phổ biến ở các ruộng rau màu tại địa bàn thành phố Hồ Chí Minh và các vùng lân
cận. Phạm vi ký chủ của sâu sâu khoang khá rộng với trên 290 loài cây bao gồm cả cây
thực phẩm, rau quả, cỏ dại và cây cảnh. Chúng tấn công trên lá, ăn hết phần thịt lá chỉ
còn lại gân lá. Để phòng trừ sâu khoang thì biện pháp hóa học là biện pháp được sử
dụng phổ biến hơn cả bởi tính tiện lợi, đơn giản, dễ sử dụng lại cho hiệu quả . Tuy
nhiên, việc sử dụng thuốc hóa học không hợp lý trong một thời gian dài và không đúng
cách đã dẫn đến tình trạng kháng thuốc của sâu khoang, gây hậu quả nghiêm trọng tới
môi trường quan trọng hơn hết còn là vấn đề sức khỏe của con người. Lượng thuốc hóa
học còn tồn đọng trong nông sản sẽ gây ra những ảnh hưởng rất nghiêm trọng tới sức
khỏe.
Đứng trước thực trạng như hiện nay, thì việc nghiên cứu và tìm ra những tác nhân
sinh học phòng trừ sâu khoang an toàn cho con người là một điều hết sức cần thiết.
Trong số các tác nhân đã được nghiên cứu thì virus NPV được xem là có triển vọng vì
hiệu lực diệt sâu cao, mức độ lây lan trong quần thể rộng và kéo dài lại không độc hại
với con người và môi trường. Trên thế giới cũng đã có nhiều công trình nghiên cứu về
virus NPV. Việc sản xuất NPV cho đến nay chủ yếu là lây nhiễm trên sâu ký chủ và
thu nhận virus thông qua cơ thể sâu chết. Do vậy, dịch NPV thường bị tạp nhiễm cao
bởi nhiều thành phần như da, thể mỡ và có cả các vi sinh vật khác. Các tác nhân này
ảnh hưởng xấu đến chất lượng dịch gốc dùng để nhiễm sâu, hiểu quả sản xuất chế
phẩm NPV cũng như việc bảo quản chế phẩm này. Tại Việt Nam, việc nghiên cứu quy

1


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

trình ly tâm tinh sạch NPV phục vụ cho sản xuất chế phẩm này vẫn chưa được quan
tâm. Xuất phát từ thực tiễn trên sinh viên tiến hành nghiên cứu và thực hiện đề tài
“XÁC ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH NPV (Nuclear Polyhedrosis Virus)”.

2. Tình hình nghiên cứu
Đối với loài sâu khoang Spodoptera litura thì virus NPV được coi là tác nhân hứa
hẹn nhất và cho kết quả tương đương với thuốc hóa học (Ravishanka and Venkatesha,
2010).
NPV đã được quan tâm nghiên cứu và sử dụng ở Việt Nam từ đầu những năm
1980. Khởi đầu là việc nghiên cứu và sử dụng NPV để trừ sâu xanh hại bông của Viện
nghiên cứu Bông và Viện bảo vệ Thực vật. Sau đó là SENPV trừ sâu xanh da láng
(Spodoptera exigua) trên bông, nho, hành tỏi cũng được phát triển khá mạnh và sử
dụng rất hiệu quả. Các kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra rằng NPV có hiệu lực trừ sâu
tương đương hoặc cao hơn so với thuốc hóa học (Phạm Hữu Nhượng và CTV, 2005;
Hoàng Thị Việt và ctv,1999, 2000; Ngô Trung Sơn, 2001; Nguyễn Văn Tuất, 2004).
Chính vì vậy, virus NPV đã dành được nhiều mối quan tâm của các tác giả trong nước
cũng như ngoài nước.
Các nghiện cứu đều chỉ ra rằng NPV có hiệu lực gây chết rất cao trên sâu khoang.
Sâu càng nhỏ mức độ mẫn cảm càng cao (Mohammad et al, 2002). Cụ thể Tran Thi
Kieu Trang et al (2002) cho biết, sâu 2 ngày tuổi mẫn cảm gấp 1.500.000 lần so với sâu
8 ngày tuổi.
Năm 2000, Monobrullah và Nagata nghiên cứu và cho biết, sản lượng NPV cao
nhất khi sử dụng sâu 9 ngày tuổi (trọng lượng 125 – 155mg) để nhiễm virus. Và sau 7
ngày nhiễm sản lượng virus đạt cao nhất. Sâu gần chết thích hợp hơn để thu nhận virus
so với sâu chết. Việc phối trộn NPV với nhiều sản phẩm khác như: thuốc trừ sâu, chế
phẩm Neem, acid boric, rỉ đường… sẽ làm tăng hiệu lực trừ sâu và rút ngắn thời gian ủ

2


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

bệnh do virus NPV. Rabindra và cộng sự (1997) cho biết phối hợp NPV (liều lượng 5 x
105 PIB/ml) + mật đường (1%) + dịch chiết neem (0,1%) cho hiệu quả diệt sâu khoang

tăng hơn so với không trộn. Ngoài ra, nhằm kích thích sự ăn của sâu ký chủ hoặc tăng
cường hiệu lực gây chết của virus thì các chất phụ gia cũng được cho thêm
Bên cạnh các vần đề về việc tăng cường hiệu lực diệt sâu khoang của các virus
NPV, sản xuất virus NPV, quy trình sản xuất tạo chế phẩm… thì những vấn đề liên
quan đến bảo quản chế phẩm virus NPV cũng đang được quan tâm.
Các nghiên cứu đều cho rằng, hiệu lực của virus ảnh hưởng bởi thời gian và biện
pháp bảo quản. Rodrigo Lasa và cộng sự (2008) cho biết, hiệu lực trừ sâu xanh da láng
của virus SENPV bị giảm 16,67 lần sau 18 tháng bảo quản ở nhiệt độ 250C và hiệu lực
không thay đổi nếu bảo quản virus ở điều kiện 40C và -200C. Nhóm tác giả cũng cho
biết thêm, bổ sung các chất kháng khuẩn và chất chống oxy hóa có thể duy trì hiệu lực
của virus trong vòng 18 tháng ở điều kiện bảo quản trong tủ lạnh.
3. Mục tiêu nghiên cứu
- Tìm ra công thức ly tâm phù hợp nhằm làm giảm lượng vi sinh vật hiếu khí có
trong dịch virus
- Xác định công thức ly tâm phù hợp để thu nhận virus (số PIB)
- Tối ưu hóa số vòng li tâm để tinh sạch virus NPV
4. Mục đích nghiên cứu
Mục đích của đề tài là tìm ra được công thức ly tâm virus để loại bỏ tối đa lượng
vi sinh vật hiếu khí bước đầu tinh sạch dịch NPV.

3


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về sâu khoang (Spodoptera litura)
Tên khoa học: Spodoptera litura
Họ: Ngài đêm (Noctuidae)
Bộ: Cánh vẩy (Lepidoptera)

1.1.1. Phân bố
Sâu khoang phân bố khắp nơi trên thế giới và gây hại nặng cho nhiều nước nhiệt
đới như : Ấn Độ, Pakistans, Banglades, Srilanca, Indonesia, Philippin, Nhật Bản, Hàn
Quốc, Trung Quốc, Úc, Hawaii, các nước Đông Nam Á. Ở Việt Nam sâu khoang hiện
diện khắp nơi.
1.1.2. Ký chủ
Sâu khoang là loài đa thực, chúng phá hoại trên 290 loài cây trồng thuộc 99 họ
thực vật khác nhau. Gây hại phổ biến nhất trên đậu nành, bắp, cải xanh, cải bắp, rau
muống và đậu phộng. Ngoài ra còn có trên ớt, cà chua, khoai lang, khổ qua và lúa non
(Phạm Huỳnh Thanh Vân và Lê Thị Thùy Minh, 2001). Sâu non tuổi nhỏ thường gây
hại nghiêm trọng nhất bởi vì hàng trăm con sâu non tập trung lại ăn lá cây và nhanh
chóng làm lá cây xơ xác. Sâu non còn có thể gặm ăn vỏ quả làm giảm phẩm chất.
1.1.3. Đặc điểm hình thái và sinh học

4


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình1.1: Vòng đời sâu khoang
Vòng đời trung bình 35 - 40 ngày, trong đó thời gian sâu non sống và phá hoại
khoảng 20 - 25 ngày (Phạm Văn Biên et al., 2003).
* Giai đoạn trứng
Trứng có hình bán cầu, đường kính 0,4 - 0,5 mm. Bề mặt trứng có những đường
dọc từ đỉnh trứng xuống đến đáy và bị cắt ngang bởi những đường khía ngang tạo
thành những ô nhỏ. Trứng mới đẻ có màu trắng vàng, sau chuyển thành màu tro, lúc
sắp nở có màu tro đậm. Ổ trứng có phủ lông từ bụng bướm mẹ. Sau khi đẻ khoảng 2 3 ngày trứng sẽ nở.

5

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình1.2: Trứng sâu khoang
* Giai đoạn ấu trùng
Sâu có 5 - 6 tuổi tùy điều kiện môi trường và phát triển trong thời gian từ 20 - 25
ngày. Sâu lớn đủ sức dài 35 - 53 mm, hình ống tròn. Sâu tuổi nhỏ có màu xanh lục,
càng lớn sâu chuyển dần thành màu nâu đậm (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen,
2004). Điểm đặc trưng nhất của ấu trùng sâu khoang là chấm đen ở đốt thân thứ nhất
rất to, rõ gần như giao nhau tạo thành khoang do đó sâu còn được gọi là sâu khoang.
Trên các đốt còn lại vẫn có chấm đen nhưng không lớn như ở đốt thứ nhất. Trên cơ thể
sâu có 4 sọc màu vàng cam (2 sọc nằm trên lưng và 2 sọc nằm 2 bên hông). Ở mỗi đốt,
lỗ khí khổng nằm ở bên hông và lớn dần theo tuổi của sâu. Sâu có phần bụng màu nhạt
hơn phần lưng (Phạm Huỳnh Thanh Vân và Lê Thị Thùy Minh, 2001). Sâu non lột xác
5-6 lần, sâu tuổi nhỏ ăn biểu bì của lá, sâu tuổi lớn ăn cả thịt lá chỉ chừa lại gân lá. Khi
mật độ sâu cao có thể làm cho lá rụng nhanh. Tuy nhiên sự gây hại thường không
nghiêm trọng lắm do khả năng tự đền bù của cây.

6


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình1.3: Ấu trùng sâu khoang
* Giai đoạn nhộng
Nhộng dài 18 - 20 mm, màu nâu tươi hoặc nâu tối, hình ống tròn. Theo Phạm
Huỳnh Thanh Vân và Lê Thị Minh (2001), khi mới được hình thành nhộng sâu khoang
có màu xanh đọt chuối, rất mềm sau đó chuyển dần sang màu vàng xanh, cuối cùng có
màu nâu, thân cứng dần và có màu nâu đỏ. Khi sắp vũ hóa nhộng có màu nâu đen, các
đốt cuối cùng của nhộng có thể cử động được. Thời gian nhộng là 7 ± 1 ngày.

Hình1.4: Nhộng sâu khoang
* Giai đoạn thành trùng

7


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Bướm có chiều dài thân 20 - 25 mm, sải cánh rộng 35 - 45 mm. Cánh trước màu
nâu vàng. Phần giữa từ cánh trước đến cánh sau có một vân ngang rộng, màu trắng.
Trong vân trắng này có 2 vân màu nâu. Cánh sau màu trắng óng ánh. Bướm có đời
sống trung bình từ 1 - 2 tuần tùy điều kiện thức ăn. Trung bình một bướm cái đẻ 300
trứng, nhưng điều kiện thích hợp bướm có thể đẻ từ 900 - 2000 trứng. Thời gian đẻ
trứng trung bình của bướm kéo dài từ 5 - 7 ngày, đôi khi đến 10 hoặc 12 ngày (Nguyễn
Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004).

Hình1.5: Bướm sâu khoang
1.1.4. Tập tính sống và cách gây hại
Bướm thường vũ hóa vào buổi chiều và bay ra hoạt động vào lúc vừa tối, ban
ngày bướm đậu ở mặt sau lá hoặc trong các bụi cỏ. Bướm bay rất nhanh, có khi xa đến
vài chục mét và cao đến 6 - 7 m. Sau khi vũ hóa vài giờ bướm có thể bắt cặp và một
ngày sau thì đẻ trứng (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004). Bướm có xu tính
thích các chất có mùi chua ngọt và ánh sáng bước sóng ngắn.
Sâu khoang phá nhiều loại cây nên có mặt quanh năm trên đồng ruộng. Sâu cắn
phá mạnh vào lúc sáng sớm nhưng khi có ánh nắng sâu chui xuống dưới tán lá để ẩn
nắp. Chiều mát sâu bắt đầu hoạt động trở lại và phá hại suốt đêm.

8

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Sâu khoang thường phát sinh phá hại nhiều trong điều kiện thời tiết ấm, ít nắng và
nhiệt độ không cao lắm, khoảng 20 - 25oC (Phạm Văn Biên et al., 2003). Theo Nguyễn
Đức Khiêm (2006), Sâu khoang là loài ưa điều kiện nóng ẩm, nhiệt độ thích hợp nhất
cho sâu sinh trưởng phát dục là 29 - 30oC và độ ẩm không khí thích hợp là trên 90%.
Sâu vừa nở sống tập trung, nếu bị khua động nhẹ chúng có thể bò phân tán ra
chung quanh hoặc nhả tơ buông mình xuống đất. Ở giai đoạn này sâu chỉ gặm mặt dưới
lá, chừa biểu bì trên và gân. Sang tuổi 2 sâu bắt đầu phân tán và ăn gặm lá nhiều hơn.
Từ tuổi 4 sâu bắt đầu có phản ứng rõ rệt đối với ánh sáng nên ban ngày sâu ẩn ở những
nơi tối hoặc chui xuống kẻ đất nứt, ban đêm sâu leo lên cây. Ở tuổi lớn sâu có tập quán
ăn thịt lẫn nhau và không những ăn phá lá cây mà còn ăn trụi cả thân cây, cành và trái
non. Khi sắp làm nhộng sâu chui xuống đất làm thành một khoang và nằm yên trong đó
hóa nhộng (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004).
1.1.5. Thiên địch và biện pháp phòng trừ
* Thiên địch
- Các loài ăn mồi: Bọ rùa, kiến, bọ xít ăn thịt, bọ cánh cứng.
- Ong kí sinh: Cotesia prodeniae, Telenomus remus.
- Vi khuẩn BT, virus NPV.
* Biện pháp phòng trừ
Biện pháp canh tác: Vệ sinh đồng ruộng, sau thu hoạch phải thu gôm các tàn
dư cây trồng đem đốt hoặc ủ làm phân. Đất trước khi trồng cần phải được cày,
phơi và xử lý thuốc trừ sâu hoặc cho ruộng ngập nước 2 - 3 ngày để diệt nhộng,
sâu non có trong đất. Phải thường xuyên đi thăm ruộng để kịp thời phát hiện sâu
nếu sâu phát sinh nhiều thì ban đêm có thể soi đèn để bắt, ngắt bỏ ổ trứng hoặc
tiêu diệt sâu non mới nở khi chưa phát tán đi xa. Ngài sâu khoang có khuynh

9

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

hướng thích mùi chua ngọt và ánh sáng đèn, do đó có thể dùng bả chua ngọt để
thu hút bướm khi chúng phát triển rộ.
Biện pháp hóa học: Atabron được dùng làm nền phối hợp với các loại thuốc
còn lại hoặc với các loại thuốc Cúc tổng hợp sẽ cho hiệu quả phòng trị rất tốt. Sâu
khoang cũng rất dễ kháng thuốc, nên luân phiên nhiều loại thuốc để phun.
Biện pháp Phòng trừ Dịch hại tổng hợp (IPM):
- Vệ sinh đồng ruộng, tiêu diệt nhộng, phơi đất hay ngâm ruộng một thời gian.
- Dùng hoa hướng dương hay các loài cây có thể dẫn dụ sâu khoang trồng xung
quanh ruộng canh tác để dễ dàng tiêu diệt.
- Hàng ngày theo dõi dự báo sự phát triển của sâu qua bẫy pheromone, thường
xuyên ngắt bỏ ổ trứng và diệt ấu trùng trên những ruộng dẫn dụ.
Biện pháp sinh học:
Hiện nay có nhiều tác nhân đặc trưng được sử dụng để làm giảm mật độ sâu
khoang nhưng bảo tồn thiên địch, một số tác nhân như chất điều hòa sinh trưởng côn
trùng hoặc vi khuẩn Bt, các tác nhân này chỉ có hiệu quả trên ấu trùng rất nhỏ và cần áp
dụng nhiều trên một thế hệ. Do đó pheromone giới tính được kết hợp sử dụng không
chỉ làm giảm thành trùng mà còn để theo dõi sự xuất hiện của ấu trùng và dự đoán
được sự nở của ấu trùng (Shinoda, 2001).
Dùng sản phẩm sinh học có nguồn gốc nấm (Beauveria sp. và Nomureasp. ), vi
khuẩn (vi khuẩn Bt), virus (NPV), protozoa,… khi có những dấu hiệu cắn phá lá đầu
tiên và thông thường 10 ngày sau phải phun thuốc lại 1 lần. Tuy nhiên vẫn chưa được
áp dụng rộng rải do chi phí sản xuất cao, bảo quản còn khó khăn, và ảnh hưởng của
yếu tố môi trường và sinh vật và còn ngần ngại vì đưa ra một tác nhân lạ có thể gây rủi

10

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ro như tác động môi trường và chuyển gen vào các sinh vật bản địa (Munoz et al.,
1997).
1.2. Khái quát về virus diệt côn trùng
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu virus diệt côn trùng
Lịch sử cổ đại đã ghi nhận những phát hiện về bệnh do virus trên tằm dâu và ong
khi con người bắt đầu nuôi dưỡng hai loài côn trùng có ích này để phụ vụ đời sống.
Năm 384 - 322 trước công nguyên Aristolte đã miêu tả bệnh của ong, tuy nhiên
người Trung Quốc đã có những quan sát về bệnh tằm dâu từ 2.700 năm trước Công
Nguyên (Tanada và Kaya, 1993).
Sau đó năm 1856 hai nhà khoa học trên thể giới là Cornilia và Maestri đã mô tả
thật kỹ lưỡng bệnh này trên tằm nghệ. Chính hai nhà khoa học này đã tìm thấy thể đa
diện trên cơ thể tằm.
Tuy nhiên, vào năm 1898 Bolle lại là người đầu tiên phát hiện ra sự hòa tan thể
đa diện (thể vùi) trong ruột tằm và giải phóng ra các hạt virus nhỏ (thể siêu vi).
Tiếp sau đó Akkva (1919), Komarek và Breindl (1924) đã tiến hành lọc chất dịch
từ tằm và sâu róm (Lymmantria monacha) bị bệnh và khẳng định bản chất virus của
các bệnh tạo nên thể đa diện ở côn trùng.
Người đầu tiên nhìn thấy virus gây bệnh côn trùng là Bergold trong những công
trình công bố 1943-1947 sau khi có kính hiển vi điện tử.
1.2.2. Cơ sở khoa học sử dụng virus diệt côn trùng trong đấu tranh sinh học
Khi xâm nhập vào cơ thể côn trùng, các virus nhân lên ngay trong nhân hoặc
trong chất nguyên sinh của tế bào, phá huỷ các mô và làm cho vật chủ chết. Những côn
trùng còn sống sót vẫn tiếp tục bị ảnh hưởng trong giai đoạn nhộng (nhộng bị thối, ngài
vũ hoá bị biến dạng), trong giai đoạn ngài (khả năng đẻ trứng giảm) và ảnh hưởng tới
11


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

các thế hệ sau. Nguồn virus tồn đọng trong tự nhiên lại gây lây nhiễm cho các thế hệ
mới. Trên cơ sở khoa học này, virus gây bệnh côn trùng ngày càng được chú ý nghiên
cứu và được coi là một trong những nhân tố có triển vọng trong phương pháp đấu tranh
sinh học phòng chống sâu hại cây trồng trong tương lai.
Năm 1923, Tanaka và Kaya đã miêu tả hơn 20 nhóm (họ) virus gây bệnh cho côn
trùng. Trong đó 2 họ được nghiên cứu nhiều là Baculoviridae và Reoviridae. Đại diện
của họ Baculoviridae là virus đa diện nhân (NPV- Nuclear polyhedrosis viruses) và đại
diện của họ Reoviridae là virus đa diện tế bào chất (CPV - Cytoplasmic polyhedrosis
viruses).
Theo Hukuhara và Bonami (1991) thì CPVs ký sinh trong 4 bộ côn trùng hay gặp
nhất là bộ cánh vảy - Lepidoptera có 201 vật chủ, bộ hai cánh - Diptera - 39 vật chủ..
Mặc dù thuốc CPV có hiệu quả diệt sâu, nhưng người ta vẫn ít quan tâm để phát triển
nó hơn Baculovirut, vì lí do chủ yếu là CPVs chỉ tấn công tế bào biểu mô ruột của sâu
và có xu hướng gây ra nhiễm trùng mãn tính. Hơn nữa trong điều kiện tự nhiên, chúng
gây bệnh dịch với tỷ lệ thấp và ít ảnh hưởng tới quần thể vật chủ như Baculovirut. Tuy
nhiên chúng có thể nhân nuôi theo qui mô lớn trong công nghiệp.
Theo các tác giả Tanada và Kaya (1993), có hơn 600 loài sâu thuộc bộ
Lepidoptera, Hymenoptera, Coleoptera, Diptera... là vật chủ của Baculovirut. Do đó có
rất nhiều nghiên cứu và sản xuất thuốc trừ sâu virus tập trung vào nhóm virus này. Hầu
hết Baculovirus thuộc tính chuyên hoá cao, chỉ ký sinh trong một loài sâu, thậm chí ký
sinh một số mô nhất định nào đó của sâu. Những tác động có hại của Baculovirus đối
với thiên địch và các ong kí sinh trưởng thành chưa được phát hiện trong tự nhiên
(Groner, 1990).
1.2.3. Hình thái và cấu trúc chung của virus

12


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Tất cả các virus đều có cấu tạo gồm hai thành phần cơ bản: lõi là acid nucleic (tức
genome) và vỏ là protein gọi là capsid bao bọc bên ngoài để bảo vệ acid nucleic.
Capsid bao gồm nhiều capsomer. Phức hợp bao gồm acid nucleic và vỏ capsid gọi là
nucleocapsid. Genome của virus có thể là AND hoặc ARN, sợi đơn hoặc sợi kép. Một
số loại virus có màng bao (envelop).
Virus có cấu trúc hình học, 5 - 6 đến 20 cạnh với nhiều nhóm virus khác nhau.
Hình thái của virus do vỏ capsid qui định. Vỏ capsid có kích thước và cách sắp xếp
khác nhau khiến cho virus có hình dạng khác nhau.

Hình1.6: Một số hình dạng của virus (Presscott L. M. et al. , Microbiology. 6th ed. Intern.
Ed. 2005)
Khi có bộ gen trong vỏ capsid thì gọi là virion hoặc là hạt virus. Vậy virion là hạt
virus đầy đủ về hình thái, nó có thể là một nucleocapsid có vỏ bọc gọi là virus có vỏ,
hoặc là một nucleocapsid trần gọi là virus không vỏ

13


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình1.7: Cấu trúc của virus
1.2.4. Những nhóm virus chính gây bệnh côn trùng
Phân loại virus hại côn trùng gắn liền với lịch sử phát minh và những cấu trúc đặc
trưng của chúng. Virus ký sinh trên vật chủ riêng biệt cho nên tên của virus được gắn
với tên của ký chủ. Ví dụ, virus đa diện nhân của sâu xanh đục quả có tên virus đa diện
nhân Helicoverpa armigera, viết tắt là HaNPV…
Virus côn trùng được phân thành 14 nhóm. Mỗi nhóm được miêu tả như một
“họ” mặc dù phân loại virus côn trùng vẫn đang phát triển, đặc biệt là các đặc điểm hóa
sinh, cho nên việc phân nhóm này không nên coi như là một quyết định cuối cùng.

1.2.4.1. Nhóm Baculovirus (Baculoviridae)
Nhóm Baculovirut này được nghiên cứu rất kỹ do khả năng diệt sâu của chúng.
Hơn nữa, gần đây những nghiên cứu về vai trò của vectơ biểu hiện đối với một số gen
có hoạt tính sinh học. Đặc điểm cơ bản của Baculovirus thuộc họ này là có mặt một sợi
đôi DNA trong hệ gen (genome) của chúng. Cho tới nay người ta đã xác định bệnh do
nhóm virus này gây ra ở côn trùng thuộc 6 bộ sau:

14


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

-

Lepidoptera - Bộ cánh vẩy

-

Diptera - Bộ hai cánh

-

Coledoptera - Bộ cánh cứng

-

Hymenoptera - Bộ cánh màng

-

Orthoptera - Bộ cánh thẳng

-

Neuroptera - Bộ cánh mạch

Theo Jayaraj (1985) có khoảng 300 mẫu virus phân lập ở bộ cánh vảy, cánh màng
và bộ hai cánh. Baculovirus bao gồm một vỏ lipoprotein bao quanh 1 protein lõi DNA
(Nucleocapsid). Các virion được bao bọc một tinh thể dạng lưới có bản chất protein
được gọi là thể vùi (Inclusion Body - IB). Hệ gen của Baculovirut bao gồm một sợ đôi
DNA vòng với trọng lượng phân tử từ 50 - 100 x 106.
Theo Kelly (1985), Baculovirus bao gồm một số loại sau:
- Virus đa diện nhân (Nuclear polyhedrosis virus - NPV) là virus gây bệnh cho
côn trùng có thể protein hình khối đa diện, trong chứa nhiều hạt virus (virion)
hình que.
- Virus hạt (Granulos virus - GV) là virus có thể protein dạng hạt hoặc dạng viên,
trong chỉ chứa 1 virion, rất hiếm khi có hai virion. Virion hình que, chúng xâm
nhiễm chủ yếu vào tế bào lớp hạ bì, mô mỡ và huyết tương. Nuclear polyhedrosis
virus (NPV) và Granulosis virus (GV) với virion có các thể vùi (PIB) dạng
protein tinh thể được gọi là polyhedral và granulin.
- Virus có các thể protein khác nhau và cũng chứa các virion.
- Virus không tạo thành thể vùi hoặc rất mỏng (virus không thể tạo thể protein).

15