Ứng Dụng Vi Khuẩn Lên Men Lactic Xử Lý Hạt Giống Đậu Phộng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC XỬ LÝ
HẠT GIỐNG ĐẬU PHỘNG

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GVHD:

TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

SVTH:

NGUYỄN THANH HIẾU

MSSV: 1411100748

Lớp: 14DSH04

TP. Hồ Chí Minh, 8/2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC XỬ LÝ
HẠT GIỐNG ĐẬU PHỘNG

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GVHD:

TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

SVTH:

NGUYỄN THANH HIẾU

MSSV: 1411100748

Lớp: 14DSH04

TP. Hồ Chí Minh, 8/2018


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu
trong đồ án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào
khác.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được
cám ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Sinh viên thực hiện luận văn

Nguyễn Thanh Hiếu

i


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, em xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Công nghệ
TP. HCM đã tạo điều kiện cho chúng em được học tập tại Trường. Em cũng xin chân
thành biết ơn sự dạy dỗ tận tình của toàn thể quý thầy cô Viện Khoa học Ứng dụng
Hutech, Trường Đại học Công nghệ TP. HCM đã cho chúng em những kiến thức quan
trọng trong suốt thời gian qua, nhờ vậy chúng em mới có được những tri thức quý giá
để làm hành trang cho con đường sự nghiệp phía trước.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Nguyễn Hoài Hương đã trang bị cho
em những kiến thức bổ ích và luôn theo sát quá trình làm việc của em để kịp thời
hướng dẫn cũng như khắc phục những lỗi sai để công việc đạt kết quả tốt nhất. Cô
luôn chia sẽ cũng như động viên em khi công việc chưa ổn và giúp em tìm được niềm
vui khi thấy được thành quả mình sắp gặt hái được.
Em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình đã tiếp cho em nghị lực, sự
bình yên trong tâm hồn, luôn bên em những lúc khó khăn. Em cũng xin được cảm ơn

tới những người bạn đã gắn bó, động viên và giúp đỡ em suốt quãng thời gian thực
hiện đồ án tốt nghiệp.
Cuối cùng, em xin cảm ơn các Thầy/Cô trong Hội Đồng Phản Biện đã dành thời
gian đọc và nhận xét đồ án tốt nghiệp này. Em xin gửi đến Thầy/Cô lời chúc sức khỏe
va. Trong quá trıǹ h làm đồ án, do kinh nghiệm còn thiếu và kiến thức chưa đầy đủ, nên
có nhiều thiếu sót, mong các Thầy Cô bỏ qua.
TP. HCM, ngày 3 tháng 08 năm 2018
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thanh Hiếu

ii


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

MỤC LỤC ...................................................................................................................iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT...................................................................................iv
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................v
DANH MỤC HÌNH ẢNH ..........................................................................................vi
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
1. Đặt vấn đề ...........................................................................................................1
2. Tình hình nghiên cứu ..........................................................................................2
2.1. Ngoài nước: .....................................................................................................2
2.2.Trong nước: ......................................................................................................3
3.Mục đích nghiên cứu: ..........................................................................................3
4.Mục tiêu nghiên cứu: ...........................................................................................3
5. Nội dung nghiên cứu: .........................................................................................3

6. Phương pháp nghiên cứu: ...................................................................................4
6.1.Phương pháp luận: ...........................................................................................4
6.2.Phương pháp xử lý số liệu: ...............................................................................4
7. Kết quả đạt được: ................................................................................................4
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN .......................................................................................5
1. Tổng quan về xử lý hạt giống: ............................................................................5
1.1. Giới thiệu chung: .............................................................................................5
1.2. Các phương pháp khử nhiễm độc tố: ...............................................................6
1.2.1. Phương pháp vật lý: ......................................................................................6
1.2.2. Phương pháp hóa học: ..................................................................................9
1.2.3. Phương pháp sinh học:..................................................................................9
2. Các vi sinh vật hỗ trợ tăng trưởng cây trồng: .....................................................12

iii


Đồ án tốt nghiệp

2.1. Khả năng phân giải lân: ..................................................................................12
2.1.1. VSV phân giải lân hữu cơ .............................................................................13
2.1.2. VSV phân giải lân vô cơ ...............................................................................14
2.2. Tạo màng sinh học biofilm ..............................................................................15
2.3. Khả năng sinh Indole-3-acetic acid (IAA).......................................................17
3. Tổng quan về vi khuẩn lactic. .............................................................................19
3.1. Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus sp. ....................................................19
3.2. Đặc điểm sinh lý ..............................................................................................20
3.3. Đặc điểm sinh hóa............................................................................................20
3.4. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic .........................................................21
3.5. Quá trình trao đổi chất .....................................................................................23
3.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men, quá trình sinh trưởng và phát triển

của vi khuẩn lactic .......................................................................................28
3.7. Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic ........................................................29
3.7.1. Khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn lactic ....................................29
3.7.2. Các hợp chất kháng nấm ...............................................................................30
3.7.3. Các hợp chất kháng khuẩn khác ...................................................................37
3.8. Ứng dụng của vi khuẩn lactic ..........................................................................40
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................42
2.1. Địa điểm nghiên cứu ........................................................................................42
2.2. Thời gian thực hiện ..........................................................................................42
2.3. Vật liệu nghiên cứu ..........................................................................................42
2.3.1. Vật liệu ..........................................................................................................42
2.3.2. Hóa chất sử dụng ..........................................................................................42
2.3.3. Thiết bị ..........................................................................................................43
2.3.4. Dụng cụ .........................................................................................................43
2.4. Phương pháp luận ............................................................................................44
iv


Đồ án tốt nghiệp

2.4.1. Mục tiêu đồ án ..............................................................................................44
2.4.2. Nội dung .......................................................................................................44
2.5. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................45
2.5.1. Sơ đồ nghiên cứu ..........................................................................................45
2.5.2. Khảo sát độ thuần khiết của vi khuẩn lactic .................................................46
2.5.2.1. Nhuộm gram ..............................................................................................47
2.5.2.2. Nhuộm bào tử ............................................................................................48
2.5.2.3. Thử nghiệm Catalase .................................................................................49
2.5.2.4. Thử nghiệm khả năng lên men đường .......................................................49
2.5.2.5. Khả năng di động .......................................................................................50

2.5.3. Khả năng phân giải lân ................................................................................51
2.5.4. Khả năng sinh IAA .......................................................................................52
2.5.5. Khả năng tạo màng Biofilm ..........................................................................53
2.5.6. Chủng nấm mốc Aspergillus sp. CĐP1. .......................................................54
2.5.6.1. Khảo sát sự phát triển trên các loại môi trường ........................................55
2.5.6.2. Khảo sát hình thái ......................................................................................55
2.5.7. Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn lactic với nấm mốc
Aspergillus sp. CĐP1. ..................................................................................56
2.5.8. Phương pháp khảo sát môi trường lên men thích hợp cho vi khuẩn lactic ..56
2.5.9. Xác định acid lactic.......................................................................................57
2.5.10. Xác định mật độ vi khuẩn ...........................................................................57
2.5.11. Phương pháp khảo sát khả năng bảo quản hạt giống khỏi nấm mốc
Aspergillus sp. CĐP1 ...................................................................................60
2.5.12. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus sp. L5, L3, L2N
đối với sự phát triển của hạt giống...............................................................68
2.5.12.1. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus sp. L5, L3,
L2N đối với sự nảy mầm của hạt. ................................................................68
v


Đồ án tốt nghiệp

2.5.12.2. Ảnh hưởng của vi khuẩn Lactobacillussp. L5, L3, L2N đến độ khỏe mầm ở
cây đạu phộng ..............................................................................................69
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................70
3.1 Khảo sát sinh lý – sinh hoá của chủng vi khuẩn lactic: ....................................70
3.1.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc: .......................................................................70
3.1.2 Nhuộm Gram: ................................................................................................71
3.1.3 Nhuộm bào tử: ...............................................................................................71
3.1.4 Thử nghiệm Catalase: ....................................................................................72

3.1.5 Thử nghiệm tính di động: ..............................................................................73
3.1.6 Thử nghiệm lên men các loại đường .............................................................74
3.2 Khảo sát sự phát triển của chủng nấm Aspergillus sp. CĐP1 ..........................76
3.3. Khảo sát môi trường lên men thích hợp. .........................................................78
3.3.1. Khảo sát khả năng sinh acid lactic và mật độ tế bào của các chủng
Lactobacillus spp. L5, L2N, L3 ...................................................................79
3.3.2. Khảo sát khả năng tạo màng sinh học biofilm của các chủng Lactobacillus
spp. L5, L2N, L3 ..........................................................................................83
3.3.3. Đánh giá khả năng phân giải lân của các chủng Lactobacillus spp. L5, L2N,
L3 .................................................................................................................86
3.3.4. Đánh giá khả năng sinh IAA của các chủng Lactobacillus spp. L5, L2N, L3.
......................................................................................................................91
3.3.5. Đánh giá khả năng kháng nấm invitro của các chủng vi khuẩn lactic .........93
3.5.6. Khảo sát khả năng bảo quản hạt đậu phộng .................................................96
3.3.7. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5, L2N, L3 tới sự
phát triển của hạt giống. ...............................................................................100
3.3.7.1. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5, L2N, L3 tới khả năng
phát triển của cây đậu phộng 7 ngày sau nảy mầm. ....................................100

vi


Đồ án tốt nghiệp

3.3.7.2. Khảo sát khả năng ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5, L2N,
L3 tới cây đậu phộng 14 ngày sau nảy mầm ...............................................104
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................110
4.1. Kết luận ...........................................................................................................110
4.2. Kiến nghị..........................................................................................................110
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................111

vii


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
LAB

Lactic acid bacteria/ Lactobacillales

VSV

Vi sinh vật

VK

Vi khuẩn

BVTV

Bảo vệ thực vật

IAA

Indole-3-acetic acid

EPS

Extracellular polymeric substance

MRS

de Man, Rogosa and Sharpe

PDA

Potato Detrose Agar

ĐC

Đối chứng

TN

Thí nghiệm

NT

Nghiệm thức

KĐC

Không điều chỉnh

MT

Môi trường

viii

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Các cơ chế khử nhiễm sinh học bằng một số chủng vi khuẩn....................10
Bảng 1.2: Một số sản phẩm chuyển hóa của LAB và phương thức hoạt động ...........27
Bảng 1.3: Một số hợp chất tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men ..........................30
Bảng 1.4: Cơ chế kháng nấm của một số hợp chất .....................................................34
Bảng 1.5: Một số bacteriocins được sử dụng rộng rãi (M. P. Zacharof, 2012) ..........38
Bảng 1.6: Khả năng đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng vi khuẩn LAB ...........39
Bảng 2.1: Bố trí thí nghiệm bảo quản trong chai ........................................................67
Bảng 3.1 Khả năng lên men đường của các chủng L5, L3, L2N. ...............................75
Bảng 3.3 Thống kê xếp hạng OD 550nm của các chủng vi khuẩn lactic. .................84
Bảng 3.3. Khả năng phân giải lân của ba chủng vi khuẩn lactic ở ngày 3 .................90
Bảng 3.4: Hàm lượng IAA do 3 chủng vi khuẩn tổng hợp. ........................................92
Bảng 3.5: Tỷ lệ ức chế của 3 chủng vi khuẩn trên các loại môi trường với chủng nấm
mốc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn. ...........................................................94
Bảng 3.6: Ngày xuất hiện tơ nấm trong thí nghiệm bảo quản hạt đậu phộng.............98
Bảng 3.7: Thành phần các nghiệm thức ngâm đậu phộng. .........................................100
Bảng 3.8: Tỷ lệ nảy mầm và độ khoẻ mầm trên các nghiệm thức của đậu phộng .....101
Bảng 3.9: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn đến chiều dài và sinh khối rễ, thân 7
ngày sau nảy mầm. ......................................................................................................103
Bảng 3.10: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy đối với chiều dài của cây đậu phộng sau 14
ngày nảy mầm .............................................................................................................104

ix


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Một số loại auxin phổ biến..........................................................................18
Hình 1.2: Con đường lên men Glucose .......................................................................26
Hình 1.3: Cấu trúc phân tử của các hợp chất kháng nấm ...........................................33
Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu ........................................................................................45
Hình 2.2: Sơ đồ khảo sát độ thuần khiết của vi khuẩn lactic ......................................46
Hình 2.3: Sơ đồ khảo sát khả năng phát triển của chủng nấm CĐP1 .........................53
Hình 2.4: Sơ đồ khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn lactic với nấm mốc
Aspergillus sp. CĐP1. .................................................................................................55
Hình 2.5: Sơ đồ xác định mật độ vi khuẩn ..................................................................58
Hình 2.6: Sơ đồ khảo sát khả năng bảo quản hạt giống khỏi nấm mốc Aspergillus sp.
CĐP1 ...........................................................................................................................60
Hình 2.7: Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus sp. L5, L3,
L2N đối với sự phát triển của hạt giống......................................................................68
Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc các chủng Lactobacillus spp. trên môi trường MRS agar
.....................................................................................................................................70
Hình 3.2: Kết quả nhuộm gram của các vi khuẩn .......................................................71
Hình 3.3: Kết quả nhuộm bào tử của các vi khuẩn .....................................................72
Hình 3.4: Thử nghiệm catalase chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 ........................73
Hình 3.5: Thử nghiệm tính di động của chủng Lactobacillus sp. L5 và chủng vi khuẩn
đối chứng Bacillus subtilis. .........................................................................................74
Hình 3.6: Khả năng lên men các loại đường của vi khuẩn .........................................75
Hình 3.7: Khả năng phát triển của chủng nấm Aspergillus sp. CĐP1 trên môi trường
MRS Agar cải tiến .......................................................................................................77
Hình 3.8: Hình thái nấm nấm Aspergillus sp. CĐP1 ..................................................78
Hình 3.9: Biểu đồ thể hiện mật độ tế bào của chủng vi khuẩn lactic sp. L5...............79
Hình 3.10: Biểu đồ thể hiện mật độ tế bào của chủng vi khuẩn lactic L2N ...............80
x

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.11: Biểu đồ thể hiện mật độ tế bào của chủng vi khuẩn lactic L3 ..................80
Hình 3.12: Hàm lượng acid tổng của chủng L5 trên các môi trường .........................81
Hình 3.13: Hàm lượng acid tổng của chủng L2N trên các môi trường ......................82
Hình 3.14: Hàm lượng acid tổng của chủng L3 trên các môi trường .........................82
Hình 3.15: Biểu đồ đánh giá khả năng tạo màng biofilm của ba chủng vi khuẩn lactic
trên các môi trường. ....................................................................................................84
Hình 3.16: Vi khẩn tạo màng biofilm trên thành ống nghiệm ....................................86
Hình 3.17: Khả năng phân giải lân của chủng vi khuẩn lactic L5 ..............................87
Hình 3.18: Khả năng phân giải lân của chủng vi khuẩn lactic L2N ...........................88
Hình 3.19: Khả năng phân giải lân của chủng vi khuẩn lactic L3 ..............................89
Hình 3.20: Biều đồ so sánh khả năng phân giải lân tổng cộng của ba chủng vi khuẩn
lactic trên 3 môi trường theo ngày. .............................................................................89
Hình 3.21: Biểu đồ thể hiện khả năng phân giải lân của ba chủng vi khuẩn lactic trên
ba môi trường ở ngày 3. ..............................................................................................90
Hình 3.22. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh
IAA của 3 chủng vi khuẩn. .........................................................................................92
Hình 3.23: Khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn trên môi trường khác nhau.....94
Hình 3.24: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ kháng nấm của 3 chủng vi khuẩn trên 3 môi trường
khác nhau.....................................................................................................................95
Hình 3.25: Hình ảnh bảo quản đậu phộng trong chai sau 25 ngày .............................97
Hình 3.26: Cây đậu phộng 7 ngày sau nảy mầm ........................................................101
Hình 3.27: Tỷ lệ nảy mầm và độ khoẻ của mầm trên các nghiệm thức của hạt đậu
phộng ...........................................................................................................................102
Hình 3.28: Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn của 3 nghiệm thức
TN1-TN1, TN3-NT8 và TN1-NT12 đến chiều dài và sinh khối rễ, thân 7 ngày sau nảy
mầm .............................................................................................................................103

xi


Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.29: Đồ thị biểu thị ảnh hưởng dịch nuôi cấy của 3 nghiệm thức TN1-NT1, TN1NT12, TN3-NT8 cây đậu phộng 14 ngày sau nảy mầm. ............................................105
Hình 3.30: Cây đậu phộng 14 ngày sau nảy mầm. .....................................................106

xii


Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Vệ sinh an toàn thực phẩm đang là vấn đề xã hội cần giải quyết kịp thời để bảo vệ
sức khoẻ con người. Ở nước ta, với đặc điểm khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, độ ẩm trong
không khí thường cao, là điều kiện rất thuận lợi cho nấm mốc phát triển gây nhiễm độc
tố cho thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, gây độc cho người và gia súc, gây tổn thương
gan (ung thư gan…). Tình trạng phơi nhiễm của nấm mốc ảnh hưởng đến 25 % mùa
màng trên toàn thế giới, làm tổn thất trung bình 418 triệu đô và ảnh hưởng trên gia súc
472 triệu đô mỗi năm (theo Bô Nông Nghiệp Mỹ, 2009). Tại Việt Nam, mỗi năm bị
ảnh hưởng khoảng 13-16 % lượng nông sản tuỳ loại.
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển trên nông sản (được bảo quản trong kho
tàng , bao bì...), nấm mốc làm giảm nghiêm trọng chất lượng của các loại nông sản
được bảo quản. Nhiều loài nấm mốc phát triển trên nông sản (thóc, ngô, lạc, đậu
tương...) làm cho sản phẩm nông nghiệp biến đổi màu sắc, mùi vị, giảm chất lượng,
đặc biệt là các chất dinh dưỡng như tinh bột, đường, protein, acid amin, lipid, vitamin
và các khoáng chất. Nấm mốc làm thối rữa các sản phẩm nông nghiệp như hoa quả,
rau, hạt ngũ cốc và tạo điều kiện cho nhiều loại vi khuẩn khác phát triển và gây hại làm

ảnh hưởng đến chất lượng hạt, sản lượng thu hoạch và gây thiệt hại cho người sử dụng.
Bên cạnh sử dụng các biện pháp trong lúc trồng trọt như canh tác ruộng đất, bón
phân, phun thuốc,.. thì một trong những xu hướng hiện nay là xử lý hạt giống. Xử lý
nguồn bệnh tồn tại trên hạt giống trước khi gieo trồng là một trong những điều quan
trọng trong việc đảm bảo chất lượng hạt giống, vừa tăng khả năng chống chọi của hạt
khỏi những tác nhân gây bệnh, ngăn ngừa nguồn bệnh lan truyền từ hạt sang đồng
ruộng, vừa làm tăng sản lượng thu hoạch có lợi cho người nông dân, góp phần phát
triển nền nông nghiệp bền vững, không ảnh hưởng môi trường.

1


Đồ án tốt nghiệp

Xử lý hạt giống bằng hóa chất ngày nay được sử dụng rộng rãi để phòng trừ sâu
bệnh hại cây trong nông nghiệp với những ưu điểm tác dụng nhanh, tương đối đơn
giản, đem lại hiệu quả kinh tế cao,…nhưng các hợp chất hóa học dần có những yếu
điểm độc hại với môi trường gây ô nhiễm đất, nguồn nước và không khí, hình thành
các loài kháng thuốc, ảnh hưởng đến quần thể sinh vật và đăc biệt ảnh hưởng đến sức
khỏe con người. Do đó, các hợp chất sinh học được thay thế mang lại hiệu quả và thân
thiện, an toàn với môi trường đặc biệt các hợp chất sinh học từ các loài vi sinh vât. Một
trong những chủng được nghiên cứu và ứng dụng nhiều nhất chính là các chủng sinh
acid lactic. Vi khuẩn dạng này có hoạt tính sinh học khá cao, an toàn, có khả năng tiêu
diệt vi sinh vật có hại và là nguồn vi sinh vật hữu ích, duy trì hệ cân bằng vi khuẩn
đường ruột. Nhận thấy đây là những lý do cần thiết cho đời sống của con người và đó
là lý do chúng tôi thực hiện đề tài “Ứng dụng vi khuẩn lên men lactic xử lý hạt giống
đậu phộng”
2. Tình hình nghiên cứu:
2.1. Ngoài nước:
Trên thế giới, có rất nhiều nghiên cứu về khả năng kháng nấm do vi khuẩn sinh acid

lactic tạo thành, chẳng hạn như:
“Khả năng kháng nấm của 2 chủng Lactobacillus plantarum với mốc Fusarium in
vitro và trong nấu mạch nha lúa mạch” của A. Laitila và công sự (2002).
Năm 2004, Cassandra De Muynck và công sự nghiên cứu “Khả năng kháng nấm
của vi khuẩn sinh acid lactic trong sản xuất hợp chất kháng nấm trong thực phẩm”.
Kim Jeong Dong với “Nghiên cứu hoạt động kháng nấm của vi khuẩn lactic phân
lập từ kimchi kháng Aspergillus fumigatus” năm 2005.
R Muñoz và cộng sự với nghiên cứu “Ngăn cản sự sản xuất độc tố của Aspergillus
nomius vsc 23 của vi khuẩn sinh acid lactic và Saccharosemyces cerevisae” năm 2010.
“Độc tố aflatoxin bị ức chế bởi các vi khuẩn lactic như Lactobacillus casei có hoạt
động mạnh chống sự phát triển của nấm và sự nảy mầm của bào tử nấm” Kim, 2005.
2


Đồ án tốt nghiệp

2.2. Trong nước:
Hiện nay, nước ta cũng một số sản phẩm và công trình nghiên cứu vi khuẩn kháng
nấm bệnh trên các loại cây và hạt khác nhau như:
Công trình nghiên cứu như Chế phẩm EM bảo vệ cây trồng hay ứng dụng trong
thuỷ sản.
Chế phẩm Sadi Bio 1 (là tên gọi của chế phẩm vi sinh Biomix 2) của Viện công
nghệ Môi trường Việt Nam, được sản xuất từ các chủng vi sinh vật hữu ích thuộc nhóm
xạ khuẩn Streptomyces ưa ấm sinh tổng hợp mạnh các enzym ngoại bào, có khả năng
sinh kháng sinh ức chế nấm mốc, vi khuẩn Gram âm.
“Khả năng giảm hàm lượng Aflatoxin từ nấm mốc của vi khuẩn lactic và nấm
Trichoderma” của Lương Thị Phương Thảo (2015).
Chế phẩm vi sinh SB2 của công ty Công nghệ Cát Tường có công dụng phòng
trừ tác nhân gây bệnh cho cây trồng như nấm, vi khuẩn, virus, xạ khuẩn,…
Vi khuẩn lactic chưa được ứng dụng rộng rãi trong xử lý hạt giống trong các nghiên

cứu trong nước ta hiện nay.
3. Mục đích nghiên cứu:
Nghiên cứu, ứng dụng vi khuẩn lên men lactic tạo chế phẩm sinh học bảo quản và
xử lý hạt giống.
4. Mục tiêu nghiên cứu:
Khảo sát khả năng dịch nuôi cấy của vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, L3, L2N trong
bảo quản và phát triển của hạt đậu phộng.
5. Nội dung nghiên cứu:
Hoạt hoá chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, L2N, L3 và chủng nấm Aspergillus
sp. CĐP1
Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh hoá chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, L2N,
L3

3


Đồ án tốt nghiệp

Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng Lactobacillus sp. L5, L2N, L3 với
các chủng nấm Aspergillus sp.CĐP1
Khảo sát môi trường lên men thích hợp của chủng Lactobacillus sp. L5, L2N, L3.
Ứng dụng dịch nuôi cấy của vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, L2N, L3 trong bảo quản
và xử lý hạt đậu phộng.
Xây dựng quy trình sản xuất hạt giống đã xử lý.
6. Phương pháp nghiên cứu:
6.1. Phương pháp luận:
Để ứng dụng vi khuẩn lactic xử lý hạt giống đậu phộng thay cho chất hóa học, vi
khuẩn lactic có nguồn phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống được khảo sát
tuyển chọn theo khả năng sinh acid, tạo sinh khối, tạo màng biofilm, đối kháng nấm,
phân giải lân và sinh hoocmon tăng trưởng thực vật IAA. Đồng thời ảnh hưởng của các

môi trường lên men lên các tính chất này cũng được khảo sát. Sau khi chọn được môi
trường lên men thích hợp, thí nghiệm xử lý hạt đậu phộng và nảy mầm được tiến hành
để so sánh độ khỏe mầm của hạt đậu phộng xử lý và không xử lý.
6.2.

Phương pháp xử lý số liệu:

Phần mềm Excel để tính toán và vẽ đồ thị
Phần mềm thống kê SAS 9.1
7. Kết quả đạt được:
Xác định khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, L3, L2N
đối với chủng nấm mốc Aspergillus sp. CĐP1 phân lập từ hạt đậu phộng.
Xác định được khả năng bảo quản hạt của chủng Lactobacillus sp. L5, L3, L2N
khỏi nấm mốc.
Xác định được ảnh hưởng của dịch nuôi cấy lên sự phát triển của hạt đậu phộng (tỷ
lệ nảy mầm, độ khỏe mầm,..).
Xây dựng được quy trình xử lý hạt đậu phộng.

4


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1. Tổng quan về xử lý hạt giống:
1.1. Giới thiệu chung:
Hiện nay trên thị trường có rất nhiều loại thuốc xử lý hạt giống với nhiều thương
hiệu khác nhau của các công ty thuốc BVTV. Nông dân bắt đầu làm quen với lợi ích
của việc xử lý hạt giống trong bảo vệ cây trước sự tấn công của sâu bệnh, côn trùng, vi
khuẩn, nấm gây hại.

Trước kia việc xử lý giống chỉ có mục đích duy nhất là giúp giữ giống không bị
nấm bệnh hại tấn công. Các hạt giống được áo các loại thuốc trừ nấm như captan,
thiram hay là carbendazim để trừ nấm bệnh trên bề mặt hạt giống. Sau đó hạt giống
này được nhuộm phẩm màu đỏ để cảnh báo người tiêu dùng không được sử dụng làm
thực phẩm. Nhưng carbendazim cùng một số hoạt chất khác bị cấm sử dụng hiện nay
vì là hoạt chất hóa học có độc tính cao, với nhiều tác động tới môi trường, hệ sinh thái
cũng như sức khỏe con người.
Thuốc trừ nấm bảo vệ hạt giống đang nảy mầm và tránh khỏi bị sâu bệnh trong đất
tấn công, giúp tăng tỷ lệ nảy mầm, mọc đều ngay cả trong điều kiện bất lợi như thiếu
hoặc thừa nước. Lợi ích của xử lý hạt giống:
-

Giúp hạt giống nảy mầm nhanh, bắt rễ sớm.

-

Giúp hình thành nốt sần ở cây họ đậu

-

Tiệt kiệm lượng thuốc và công lao động trên cùng đơn vị diện tích so với
phân bón gốc và phân bón lá.

-

Dễ áp dụng hơn phân bón gốc và phân bón lá, chỉ trộn thuốc xử lý hạt với
giống gieo sạ.

Việc xử lý hạt giống còn mở ra nhiều triển vọng mới như :
Tăng cường tính kháng bệnh: Kích thích tính kháng bệnh ở cây trồng (kích kháng)

là phương pháp giúp cho giống cây bị nhiễm bệnh trở nên có khả năng kháng bệnh ở
mức độ nào đó sau khi được xử lý chất kích kháng. Kích kháng không tác động trực

5


Đồ án tốt nghiệp

tiếp lên mầm bệnh mà nó kích thích quá trình tự vệ của cây trồng. Chất kích kháng có
thể có nguồn gốc hóa học hoặc vi sinh vật.
Tăng cường chịu điều kiện bất lợi: Các vi khuẩn sống vùng rễ lúa cố định đạm
như Azospirillum lipoferum, Azospirillum lipoferum; vi khuẩn Pseudomonas sp,
Baccilus sp đều kích thích khả năng tổng hợp các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
như Auxin và Gibberelin giúp bộ rễ cây trồng phát triển tốt hơn, gia tăng diện tích tiếp
xúc của rễ với đất. Các vi khuẩn này vừa tăng cường cung cấp dinh dưỡng cho cây
trồng, vừa tăng cường chống chịu điều kiện bất lợi.
Các chất ly trích thực vật như Lychnis viscaria, xoan Melia azedarach đều có tác
dụng kích hoạt tăng cường cây trồng chống chịu điều kiện bất lợi khi gieo sạ như ngập
úng, hạn hán…
Phòng trừ sâu bệnh: Đây là xu thế phổ biến hiện nay của phần lớn các sản phẩm xử
lý hạt giống trên thị trường. Điển hình là thuốc xử lý hạt giống Cruiser có chứa chất
Thiamethoxam là hoạt chất chuyên trên rầy nâu và bọ trỉ, chất Defenoconazole thuốc
trừ nấm phổ rộng ức chế tổng hợp màng tế bào nấm, chất Fludioxonil là hoạt chất trừ
nấm trên hạt không lưu dẫn, chủ yếu trên bệnh lúa von.
Ngoài ra còn có Gaucho chứa hoạt chất imidacloprid là thuốc trừ sâu ức chế thần
kinh trừ bọ trỉ, rầy nâu. Sunato chứa hoạt chất Fipronil là thuốc trừ sâu thuộc nhóm
phenylpyrazole bảo vệ lúa 7-14 ngày sau khi sạ, cùng với Isotianil là thuốc trừ sâu
thuộc nhóm Cloronicotinyl chuyên trừ rầy nâu, bọ trỉ.
1.2. Các phương pháp khử nhiễm độc tố:
1.2.1. Phương pháp vật lý:

Phân hủy aflatoxin bằng không khí nóng: Dùng không khí nóng thổi qua nguyên
liệu có chứa aflatoxin để làm giảm thiểu lượng aflatoxin đã được nhiều tác giả nghiên
cứu, phương pháp này đã đem lại nhiều kết quả đáng kể. Nếu nhiệt độ không khí nóng
đưa vào là 100 °C – 145 °C ở ngô hạt thì lượng aflatoxin B1 có thể giảm từ 877 ppb

6


Đồ án tốt nghiệp

còn 452 ppb, từ 378 ppb còn 213 ppb. Nếu tăng nhiệt độ lên tới 165°C có thể làm cho
lượng aflatoxin B1 giảm đến 65% (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003).
Phân hủy aflatoxin bằng hấp ướt ở áp suất cao: Phương pháp hấp ướt ở nhiệt độ cao
dưới áp lực hơi nước đem lại kết quả khả quan hơn. Quá trình này phá hủy nhanh
chóng vòng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin. Theo Rehana (1979) nhận thấy
nếu gạo nhiễm aflatoxin từ 40 - 4000 ppb được hấp ướt trong 5 phút ở 120°C (thêm
nước vào gạo tỷ lệ là 1:4) có thể làm giảm hàm lượng aflatoxin đến 68%. Ở đậu phộng
có độ ẩm 10%, chứa 7000 ppb aflatoxin B1 được hấp ướt ở 120°C trong 4 giờ giảm
còn 370 ppb. Ở hàm lượng aflatoxin thấp (760 ppb) được hấp ở 1,5 atm trong vòng
một giờ đã phân hủy hoàn toàn aflatoxin. (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003).
Làm giảm aflatoxin bằng các chất hấp phụ hoặc kết dính độc tố: Các chất hấp phụ
thường là các chất vô cơ hoặc hữu cơ (tự nhiên hoặc nhân tạo) có hoạt tính bề mặt cao.
Các chất có khả năng hấp phụ aflatoxin gồm: Than hoạt tính, một số polymer hữu vô
cơ có bản chất aluminosilicat như bentonite, HSCAS (Hydrated sodium calcium
alumino-silicate), một số chất sét đặc biệt (kaolin, sepiolite, clinoptilolite, zeolite), một
số polymer hữu cơ tự nhiên (alfalfa) hoặc nhân tạo (nhựa trao đổi ion, polyvinyl
polypyrrolidone). Những chất này không được hấp phụ qua ruột mà được bài thải ra
ngoài (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003).
Tách aflatoxin bằng dung môi hữu cơ: Đây là phương pháp có thể áp dụng đối với
thức ăn và nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi, do ít có khả năng tạo sản phẩm khác có

hoạt tính từ aflatoxin và có thể thu hồi được dung môi mà không ảnh hưởng đến thành
phần dinh dưỡng của thức ăn. Những kết quả có nhiều hứa hẹn nhất đã thu được bằng
việc dùng hệ thống chiết suất bao gồm hỗn hợp hexan-methanol, hexan-ethanol, hexanethanol-nước và hexan-acetone-nước. Hệ thống bao gồm 54% acetone, 44% hexan và
2% nước (tính theo trọng lượng) là hệ thống thành công nhất được tìm thấy có thể đồng
thời loại trừ dầu từ các bánh ép khô của lạc gồm 12% - 15% dầu và dư lượng lipid gần
bằng 1% và mức aflatoxin thấp hơn 40 μg/kg.
7


Đồ án tốt nghiệp

Phân hủy aflatoxin bằng hấp ướt ở áp suất cao: Phương pháp hấp ướt ở nhiệt độ cao
dưới áp lực hơi nước đem lại kết quả khả quan hơn. Quá trình này phá hủy nhanh
chóng vòng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin. Theo Rehana (1979) nhận thấy
nếu gạo nhiễm aflatoxin từ 40 - 4000 ppb được hấp ướt trong 5 phút ở 120 °C (thêm
nước vào gạo tỷ lệ là 1:4) có thể làm giảm hàm lượng aflatoxin đến 68%. Ở đậu phộng
có độ ẩm 10%, chứa 7000 ppb aflatoxin B1 được hấp ướt ở 120 °C trong 4 giờ giảm
còn 370 ppb. Ở hàm lượng aflatoxin thấp (760 ppb) được hấp ở 1,5 atm trong vòng
một giờ đã phân hủy hoàn toàn aflatoxin. (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003).
Làm giảm aflatoxin bằng các chất hấp phụ hoặc kết dính độc tố: Các chất hấp phụ
thường là các chất vô cơ hoặc hữu cơ (tự nhiên hoặc nhân tạo) có hoạt tính bề mặt cao.
Các chất có khả năng hấp phụ aflatoxin gồm: Than hoạt tính, một số polymer hữu vô
cơ có bản chất aluminosilicat như bentonite, HSCAS (Hydrated sodium calcium
alumino-silicate), một số chất sét đặc biệt (kaolin, sepiolite, clinoptilolite, zeolite), một
số polymer hữu cơ tự nhiên (alfalfa) hoặc nhân tạo (nhựa trao đổi ion, polyvinyl
polypyrrolidone). Những chất này không được hấp phụ qua ruột mà được bài thải ra
ngoài (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003).
Tách aflatoxin bằng dung môi hữu cơ: Đây là phương pháp có thể áp dụng đối với
thức ăn và nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi, do ít có khả năng tạo sản phẩm khác có
hoạt tính từ aflatoxin và có thể thu hồi được dung môi mà không ảnh hưởng đến thành

phần dinh dưỡng của thức ăn. Những kết quả có nhiều hứa hẹn nhất đã thu được bằng
việc dùng hệ thống chiết suất bao gồm hỗn hợp hexan-methanol, hexan-ethanol, hexanethanol-nước và hexan-acetone-nước. Hệ thống bao gồm 54% acetone, 44% hexan và
2% nước (tính theo trọng lượng) là hệ thống thành công nhất được tìm thấy có thể đồng
thời loại trừ dầu từ các bánh ép khô của lạc gồm 12% - 15% dầu và dư lượng lipid gần
bằng 1% và mức aflatoxin thấp hơn 40 μg/kg.
Phân hủy aflatoxin bằng các tia bức xạ: Aflatoxin rất mẫn cảm với tia cực tím. Ở
bước sóng 365 nm, khả năng hấp phụ của aflatoxin đạt cực đại. Okonkwo (1978) nhận
8


Đồ án tốt nghiệp

thấy, lượng aflatoxin ở bắp (150 ppb và 250 ppb) có thể giảm tới 30% và 16% trong 10
giờ tiếp xúc với ánh nắng mặt trời. (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003).
1.2.2. Phương pháp hóa học:
Phương pháp sử dụng các chất oxi hóa-khử: Các chất oxy hóa-khử như Natri
Hypochlorite (NaOCl), Hydrogen Peroxide (H2O2) được sử dụng để làm mất độc tính
của aflatoxin. Tuy nhiên sử dụng NaOCl để xử lý hạt nhiễm aflatoxin có thể làm mất
màu sắc của hạt và biến chất các acid amin. Khí ozone (O3) cũng được thử nghiệm về
khả năng phân hủy aflatoxin trong mẫu và đạt được hiệu quả tốt, song có bằng chứng
là chất lượng các thành phần của thức ăn bị giảm đặc biệt là protein, vitamin.
Phương pháp sử dụng các chất kiềm: Ammonium Hydroxide (NH4OH) và Natri
Hydroxide (NaOH) là 2 chất kiềm được sử dụng làm vô hoạt aflatoxin. Các chất này
đều có hoạt tính mạnh, có thể phá vỡ vòng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin.
Phương pháp sử dụng khí NH3: Nhiều thí nghiệm đã chứng minh hiệu quả của việc
dùng khí NH3 làm vô hoạt aflatoxin. Xử lý ngô bằng khí NH3 được đặc biệt quan tâm
ứng dụng hơn cả. Người ta nhận thấy, nếu hàm lượng NH3 là 0,5 - 1,5% và nhiệt độ
bên ngoài là 25 °C, trong 14 ngày tiếp xúc, lượng aflatoxin từ 200 ppb có thể giảm
xuống còn 10 ppb (theo Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003).
1.2.3. Phương pháp sinh học:

Mặc dù các biện pháp phòng chống nấm mốc sinh độc tố đã được khuyến cáo áp
dụng, nhưng sự nhiễm aflatoxin trên nông sản ở mức độ cao quá giới hạn là không thể
tránh được trong những điều kiện bảo quản bất lợi. Vấn đề khử nhiễm aflatoxin bằng
con đường sinh học nhằm thay thế cho biện pháp khử nhiễm aflatoxin bằng các hóa
chất có giá thành cao và làm biến đổi phẩm chất lượng lương thực nên khó áp dụng vào
thực tiễn bảo quản được chứng minh là các phương pháp hứa hẹn nhất.
Khử nhiễm độc tố aflatoxin bằng phương pháp sinh học có thể được định nghĩa như
sự phân giải bằng enzyme hay chuyển hóa sinh học của các độc tố nấm mốc trực tiếp

9


Đồ án tốt nghiệp

nhờ vi sinh vật. Một số vi khuẩn có khả năng khử nhiễm độc tố aflatoxin được trình
bày trong bảng 1.1.
Bảng 1.1: Các cơ chế khử nhiễm sinh học bằng một số chủng vi khuẩn

Tên vi khuẩn

Đối tượng

Cơ chế khử nhiễm

Tác giả

Sử dụng các sản phẩm trao
đổi chất ngoại bào, sinh ra

Bacillus pumilus

Aspergillus
parasiticus

trong quá trình nuôi cấy B.
pumilus, ức chế sự phát triển
và quá trình tổng hợp độc chất

C. Munimbazi và
LB.Bullerman, 1997

aflatoxin của nấm Asp.
parasiticus
Streptomyces sp. tổng hợp
được aflastatin A, là hợp chất

Streptomyces sp.

Aspergillus
parasiticus

có bản chất là protein, ức chế
1 số enzyme esterase tham gia
quá trình tổng hợp độc chất

Ono. M và cộng sự,
1997

aflatoxin của nấm Asp.
parasiticus

A. xylosoxidan tổng hợp
Cyclo (L-leucyl-L-prolyl), là
Achromobacter

Aspergillus

xylosoxidans

parasiticus

1 cyclodipeptide, ức chế sự PS. Yan và cộng sự,
phát triển và sự tổng hợp

2004

aflatoxin của nấm Asp.
parasiticus.
Lactobacillus

Aspergillus

Sử dụng các sản phẩm trao

10

I. Chang và JD.


Đồ án tốt nghiệp

casei

flavus

đổi chất ngoại bào, sinh ra

Kim, 2007.

trong quá trình nuôi cấy L.
casei, ức chế sự phát triển và
quá trình tổnghợp độc chất
aflatoxin của nấm Asp.
flavus.
Bacillus subtilis Aspergillus
B-FS06

flavus

Hợp chất thứ cấp

Ting Zang và cộng
sự, 2007.

B. subtilis tổng hợp các

Bacillus subtilis

Aspergillus
flavus

enzyme ngoại bào như
protease, chitinase, β-1,3glucanase làm ức chế sự phát

R. Thakaew và cộng
sự, 2013

triển của nấm Asp. flavus.

Các loại nông sản Việt Nam được thế giới biết đến càng nhiều như lúa gạo, cà
phê, tiêu, điều, thanh long, vú sữa... xuất khẩu đậu phộng của Việt Nam, bao gồm
nguyên vỏ, bóc vỏ và hạt cao (số liệu này không bao gồm thương mại biên giới với
Trung Quốc). Các thị trường xuất khẩu chính của Việt Nam là Đài Loan, Hồng Kông,
Thái Lan, Nga, Malaysia và một số nước khác. Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ (USDA) điều
chỉnh ước tính cho xuất khẩu đậu phộng của Việt Nam trong vụ 2016/17 lên 10 nghìn
tấn, bao gồm xuất khẩu đậu phộng thông qua thương mại biên giới và xuất khẩu đậu đã
qua chế biến. Để đạt được năng suất ấy, người nông dân sử dụng rất nhiều phân bón
hóa chất khác và không ít các loại thuốc bảo vệ thực vật. Hệ quả không chỉ nông dân
phải mất nhiều tiền vào hóa chất mà hệ sinh vật đất và chất lượng đất bị tàn phá
nghiêm trọng. Phương pháp sinh học sử dụng cho cây trồng đang được các nhà khoa
học khuyến khích sử dụng vì chúng có những ưu điểm sau:
11