Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu sự đa dạng tuyến trùng ký sinh gây sần rễ meloidogyne spp ở tây nguyên
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (9.01 MB, 198 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
LÊ THỊ MAI LINH
NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG TUYẾN TRÙNG KÝ SINH
GÂY SẦN RỄ Meloidogyne spp. Ở TÂY NGUYÊN
LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC
HÀ NỘI – 2019
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
LÊ THỊ MAI LINH
NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG TUYẾN TRÙNG KÝ SINH
GÂY SẦN RỄ Meloidogyne spp. Ở TÂY NGUYÊN
LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC
Chuyên ngành: Tuyến trùng học
Mã số: Thí điểm
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
1. TS. Trịnh Quang Pháp
2. PGS. TS. Phan Kế Long
Hà Nội – 2019
i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan :
Luận án „NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY
SẦN RỄ Meloidogyne spp. Ở TÂY NGUYÊN‟‟là công trình do bản thân tôi thực
hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Trịnh Quang Pháp và PGS.TS. Phan Kế
Long. Các trích dẫn trong luận án theo các nguồn công bố đầy đủ. Số liệu, kết quả
nêu trong Luận án là trung thực và chưa công bố hoặc công bố trong các bài báo
khoa học mà tôi là tác giả hoặc đồng tác giả.
Hà Nội, ngày tháng
năm 2019
Tác giả luận án
Lê Thị Mai Linh
ii
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận án này trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới TS.
Trịnh Quang Pháp và PGS.TS. Phan Kế Long đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi
trong suốt thời gian tôi thực hiện và hoàn thành luận án.
Tôi xin gửi lời cảm ơn TS. Vũ Thị Thanh Tâm, ThS. Nguyễn Thị Duyên,
ThS. Nguyễn Hữu Tiền, TS. Nguyễn Thị Ánh Dương đã hỗ trợ tôi trong quá trình
hoàn thiện luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn ban lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh
vật, phòng Hệ thống học phân tử và Di truyền bảo tồn, phòng Tuyến trùng học, Học
viện Khoa học và Công nghệ cùng các đồng nghiệp, Thầy Cô trong Viện Sinh thái
và Tài nguyên sinh vật đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập, nghiên cứu và
hoàn thành luận án.
Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã động viên giúp đỡ tôi
trong quá trình thực hiện luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Quỹ phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia
(NAFOTED) trong đề tài mã số:106–NN.03–2013.56; Viện sinh thái và Tài nguyên
sinh vật (IEBR) trong đề tài mã số: IEBR.ĐT/04/17-18, IEBR.ĐT/04/G2-18 đã hỗ
trợ kinh phí để tôi thực hiện các nội dung nghiên cứu.
Một lần nữa, tôi xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2019
Tác giả luận án
Lê Thị Mai Linh
iii
MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. vi
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... vii
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. ix
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................5
1.1.Tình hình nghiên cứu tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne trên thế giới...5
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu......................................................................................................... 5
1.1.2. Đặc điểm sinh học, vòng đời của tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne ............... 7
1.1.3. Khả năng gây hại trên một số cây trồng ...................................................................... 9
1.1.4. Nghiên cứu phân loại các loài tuyến trùng sần rễ thuộc giống Meloidogyne ...... 11
1.1.4.1. Phương pháp phân tích hình thái .............................................................................. 11
1.1.4.2. Phương pháp phân tích phân tử ................................................................................ 13
1.2. Tình hình nghiên cứu tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne tại Việt Nam
...................................................................................................................................16
1.2.1. Tình hình nghiên cứu chung tại Việt Nam ............................................................... 16
1.2.2. Tình hình nghiên cứu tuyến trùng sần rễ Meloidogyne tại Tây Nguyên .............. 18
1.2.2.1. Tổng quan Tây Nguyên .............................................................................................. 19
1.2.2.2. Tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne tại Tây Nguyên.......................................... 21
1.3. Biện pháp phòng trừ sinh học tuyến trùng sần rễ Meloidogyne.................................... 22
CHƢƠNG 2 NỘI DUNG, ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM
VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................27
2.1. Nội dung, đối tƣợng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu .................27
2.1.1. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................... 27
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................................. 27
2.1.3. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................................... 27
2.1.4. Thời gian, địa điểm nghiên cứu .................................................................................. 27
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................28
2.2.1. Khảo sát thực địa và phương pháp thu mẫu ............................................................. 28
2.2.2. Phương pháp tách lọc tuyến trùng từ đất .................................................................. 29
2.2.3 Phương pháp tách lọc tuyến trùng từ rễ ..................................................................... 30
2.2.4. Nhân nuôi tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp....................................................... 30
2.2.5. Phương pháp xử lý làm trong và làm tiêu bản tuyến trùng .................................... 31
2.2.6. Nghiên cứu hình thái ................................................................................................... 33
iv
2.2.7. Nghiên cứu đa dạng di truyền.................................................................................... 35
2.2.7.1. Tách chiết DNA .......................................................................................................... 35
2.2.7.2. Phản ứng PCR ............................................................................................................ 36
2.2.7.3. Điện di sản phẩm ........................................................................................................ 37
2.2.7.4. Tinh sạch sản phẩm PCR và đọc trình tự DNA........................................................ 38
2.2.7.5. Phân tích trình tự DNA .............................................................................................. 38
2.2.7.6. Thiết lập cây phát sinh chủng loại............................................................................. 38
2.2.8. Đánh giá ảnh hưởng của một số vi sinh vật đối kháng ........................................... 38
2.2.8.1. Nấm Paecylomyces javanicus.................................................................................... 38
2.2.8.2. Vi khuẩn Lysobacter antibioticus HS124.................................................................. 39
2.2.8.3. Ảnh hưởng của hợp chất 4-HydroxyphenylaceticAcid (4-HPAA) đến tuyến trùng
M. incognita.............................................................................................................................. 39
2.2.8.4. Phân tích số liệu.......................................................................................................... 40
CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ...............................41
3.1. Tần suất xuất hiện, đặc điểm phân bố, khả năng gây hại của các loài tuyến
trùng sần rễ giống Meloidogyne .............................................................................41
3.1.1. Tần suất xuất hiện của các loài tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne trên một số
cây trồng ở Tây Nguyên ......................................................................................................... 41
3.1.2. Phân bố, mật độ của các loài tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne bắt gặp trên
các vùng thu mẫu và cây chủ ................................................................................................ 43
3.2. Đặc điểm hình thái các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne ở Tây Nguyên
...................................................................................................................................49
3.2.1. Loài Meloidogyne incognita (Kofoid & White, 1919) Chitwood, 1949 ................. 49
3.2.1.1. Đặc điểm hình thái và hình thái lượng...................................................................... 49
3.2.1.2. Đa dạng hình thái và đặc điểm chẩn loại ................................................................. 50
3.2.2. Loài Meloidogyne javanica (Treub, 1885) Chitwood, 1949..................................... 61
3.2.2.1. Đặc điểm hình thái và hình thái lượng...................................................................... 61
3.2.2.2. Đa dạng hình thái và đặc điểm chẩn loại ................................................................. 68
3.2.3. Loài Meloidogyne arenaria (Neal, 1889) Chitwood, 1949...................................... 69
3.2.3.1. Đặc điểm hình thái và hình thái lượng...................................................................... 70
3.2.3.2. Đa dạng hình thái và đặc điểm chẩn loại ................................................................. 70
3.2.4. Loài Meloidogyne enterolobii Yang, Eisenback., 1983 ........................................... 80
3.2.4.1. Đặc điểm hình thái và hình thái lượng...................................................................... 80
3.2.4.2. Đa dạng hình thái và đặc điểm chẩn loại ................................................................. 87
3.2.5. Loài Meloidogyne graminicola Golden & Birchfield 1965 ..................................... 90
3.2.5.1. Đặc điểm hình thái và hình thái lượng...................................................................... 90
3.2.5.2. Đa dạng hình thái và đặc điểm chẩn loại ................................................................. 91
v
3.2.6. Loài Meloidogyne daklakensis Trinh, Le, Nguyen, Nguyen, Liebanas & Nguyen,
2018........................................................................................................................................... 97
3.2.7. Loài Meloidogyne sp................................................................................................... 106
3.3. Đa dạng hình thái, hình thái lƣợng các loài Meloidogyne ..........................113
3.3.1. Phân tích đa dạng hình thái lượng giữa các loài Meloidogyne............................ 113
3.3.2. So sánh hình thái giữa các loài Meloidogyne spp. ................................................. 118
3.4 . Phân tích đa dạng di truyền các loài Meloidogyne spp. .............................127
3.4.1. Phản ứng Multiplex-PCR.......................................................................................... 127
3.4.2. Phân tích đa dạng di truyền ...................................................................................... 128
3.4.2.1 Vùng gen ITS.............................................................................................................. 129
3.4.2.2 Vùng gen D2D3 ......................................................................................................... 133
3.4.2.3. Vùng gen COI ........................................................................................................... 137
3.4.2.4. Vùng gen COII-16S .................................................................................................. 141
3.4.2.5. Vùng gen NAD5 ........................................................................................................ 146
3.5. Đánh giá ảnh hƣởng của một số vi sinh vật đối kháng ...............................150
3.5.1. Nấm Paecylomyces javanicus .................................................................................. 150
3.5.1.1. Ảnh hưởng của dịch bào tử nấm P. javanicus đến tỷ lệ nở của trứng của tuyến
trùng M. incognita.................................................................................................................. 150
3.5.1.2. Ảnh hưởng của dịch bào tử nấm P. javanicus đến tỷ lệ chết của ấu trùng M.
incognita.................................................................................................................................. 151
3.5.2. Vi khuẩn Lysobacter antibioticus HS124 .............................................................. 154
3.5.2.1. Ảnh hưởng của dịch bào tử vi khuẩn L. antibioticus HS124 đến sự nở trứng của
tuyến trùng M. incognita........................................................................................................ 154
3.5.2.2. Ảnh hưởng của dịch bào tử vi khuẩn L. antibioticus HS124 đến ấu trùng M.
incognita.................................................................................................................................. 155
3.5.3. Ảnh hưởng của 4-HPAA tới tuyến trùng Meloidogyne incognita ..................... 158
CHƢƠNG 4............................................................................................................161
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..............................................................................161
4.1. KẾT LUẬN .....................................................................................................161
4.2. KIẾN NGHỊ ....................................................................................................162
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ...........................................163
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................164
vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt
16S-rRNA
ADF
ANOVA
CDA
COI
COII
ĐC
DMSO
DNA
EDTA
Diễn giải
16S Ribosomal Axit Ribonucleic
Actin depolymerizing factor
One-way analysis of variance (Phân tích phương sai một yếu tố)
Canonical discriminant analysis (Phân tích chỉ số khác biệt)
Cytochrome c oxidase subunit 1
Cytochrome c oxidase subunit 2
Đối chứng
Dimethyl sulphoxide
Deoxyribonucleic acid (Axit Deoxyribonucleic)
Ethylenediamine tetraacetic acid (Axit ethylenediamine tetraacetic )
ETS
GA
HPAA
IGS
ITS
MIG
E26 transformation-specific
NAD5
Nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase subunit 5
National Center for Biotechnology Information (Trung tâm thông
tin công nghệ sinh học quốc gia)
NCBI
Gallic acid (Axit galic)
Hydroxyphenylacetic acid (Axit hydroxyphenylacetic)
Intergenic spacer
Internal transcribed spacer
Meloidogyne incognita group
SEM
Polymerase Chain Reaction (Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase)
Random Amplification of Polymorphic DNA (Đa hình DNA nhân
bản ngẫu nhiên)
Sequence Characterized Amplified Region (Nhân bản chuỗi DNA
được mô tả)
Scanning Electron Microscope (Hiển vi điện tử quét)
STT
TAE
TAF
VSV
WLB
Số thứ tự
Tris-acetate-EDTA
Triethanolamine formalin
Vi sinh vật
Worm lysis buffer
PCR
RAPD
SCAR
vii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Trình tự mồi được sử dụng trong nghiên cứu ....................................................... 37
Bảng 3.1. Tần suất xuất hiện của các loài tuyến trùng Meloidogyne spp. trên một số cây
trồng ở Tây nguyên .................................................................................................................. 43
Bảng 3.2. Phân bố của các loài Meloidogyne bắt gặp trên các vùng thu mẫu, cây chủ ...... 45
Bảng 3.3. Danh sách mẫu và mật độ các loài tuyến trùng Meloidogyne ghi nhận được ... 47
Bảng 3.4. Số đo con cái các quần thể Meloidogyne incognita (số đo theo µm) và các
nghiên cứu trước ...................................................................................................................... 53
Bảng 3.5. Số đo con đực các quần thể Meloidogyne incognita (số đo theo µm) và các
nghiên cứu trước ...................................................................................................................... 54
Bảng 3.6. Số đo ấu trùng các quần thể Meloidogyne incognita (số đo theo µm) và các
nghiên cứu trước ...................................................................................................................... 57
Bảng 3.7. Số đo con cái các quần thể Meloidogyne javanica (số đo theo µm) và nghiên cứu
trước .......................................................................................................................................... 62
Bảng 3.8. Số đo ấu trùng các quần thể Meloidogyne javanica (số đo theo µm) và các
nghiên cứu trước ...................................................................................................................... 63
Bảng 3.9. Số đo con đực quần thể Meloidogyne javanica (số đo theo µm) và nghiên cứu
trước. ......................................................................................................................................... 65
Bảng 3.10. Số đo con cái các quần thể tuyến trùng loài Meloidogyne arenaria (số đo theo
µm) và nghiên cứu trước ......................................................................................................... 73
Bảng 3.11. Số đo con đực các quần thể Meloidogyne arenaria (số đo theo µm) và nghiên
cứu trước ................................................................................................................................... 74
Bảng 3.12. Số đo ấu trùng các quần thể Meloidogyne arenaria (số đo theo µm) và nghiên
cứu trước ................................................................................................................................... 76
Bảng 3.13. Số đo con cái các quần thể Meloidogyne enterolobii (số đo theo µm) và các
nghiên cứu trước ...................................................................................................................... 81
Bảng 3.14. Số đo con đực các quần thể Meloidogyne enterolobii (số đo theo µm) và các
nghiên cứu trước đó ................................................................................................................. 82
Bảng 3.15. Số đo ấu trùng các quần thể Meloidogyne enterolobii (số đo theo µm) và các
nghiên cứu trước đó ................................................................................................................. 84
Bảng 3.16. Số đo con cái các quần thể Meloidogyne graminicola (số đo theo µm) và các
nghiên cứu trước ...................................................................................................................... 92
Bảng 3.17. Số đo con đực các quần thể Meloidogyne graminicola (số đo theo µm) và các
nghiên cứu trước ...................................................................................................................... 93
Bảng 3.18. Số đo ấu trùng các quần thể Meloidogyne graminicola (số đo theo µm) và các
nghiên cứu trước ...................................................................................................................... 94
Bảng 3.19. Số đo các quần thể Meloidogyne daklakensis n. sp.......................................... 102
Bảng 3.20. Số đo các quần thể tuyến trùng sần rễ Meloidogyne sp ................................... 110
Bảng 3.21. Bảng chỉ số CDA giữa các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne.................... 114
viii
Bảng 3.22. Đặc điểm so sánh hình thái lượng của các loài tuyến trùng Meloidogyne...... 119
Bảng 3.23. Tỷ lệ % các loại nucleotide trong trình tự gen ITS........................................... 130
Bảng 3.24. Tỷ lệ % các loại nucleotide trong trình tự vùng gen D2D3 giữa các loài
Meloidogyne spp. ................................................................................................................... 134
Bảng 3.25. Tỷ lệ % các loại nucleotide trong trình tự gen COI giữa các loài Meloidogyne
spp. .......................................................................................................................................... 138
Bảng 3.26. Tỷ lệ % các loại nucleotide trong trình tự gen COII-16S giữa các loài
Meloidogyne spp. ................................................................................................................... 142
Bảng 3.27. Tỷ lệ % các loại nucleotide trong trình tự gen NAD5 giữa các loài
Meloidogyne spp. ................................................................................................................... 146
Bảng 3.28. Ảnh hưởng của dịch bào tử nấm P. javanicus đến tỷ lệ (%) trứng nở của tuyến
trùng M. incognita .................................................................................................................. 151
Bảng 3.29. Ảnh hưởng của dịch bào tử nấm P. javanicus đến tỷ lệ chết (%) của ấu trùng
Meloidogyne incognita .......................................................................................................... 152
Bảng 3.30. Ảnh hưởng của dịch bào tử vi khuẩn L. antibioticus HS124 đến tỷ lệ nở trứng
của tuyến trùng M .incognita................................................................................................. 155
Bảng 3.31. Ảnh hưởng của dịch bào tử vi khuẩn L. antibioticus HS124 đến tỷ lệ chết của
ấu trùng tuổi 2 loài M. incognita ........................................................................................... 156
Bảng 3.32. Ảnh hưởng của hợp chất 4-HPAA đến tỷ lệ nở trứng của M. incognita ........ 158
Bảng 3.33. Ảnh hưởng của hợp chất 4-HPAA đến tỷ lệ chết của ấu trùng tuổi 2 tuyến
trùng Meloidogyne incognita ................................................................................................ 159
ix
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh tuyến trùng sần rễ lần đầu tiên được công bố.......................................... 6
Hình 1.2. Hình ảnh chi tiết tuyến trùng sần rễ Meloidogyne exigua trên cà phê ................... 6
Hình 1.3. Chu kỳ vòng đời của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp., .................................. 7
Hình 1.4. Các đặc điểm chung để xác định các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne ........ 12
Hình 1.5. Hồ tiêu bị bệnh chết nhanh, chết chậm. ................................................................. 18
Hình 1.6. Vị trí 5 tỉnh Tây Nguyên trên bản đồ Việt Nam.................................................... 20
Hình 2.1. Sơ đồ khu vực nghiên cứu (Google map).............................................................. 28
Hình 2.2. Mẫu đất và rễ sau khi thu mẫu................................................................................ 29
Hình 2.3. Nhân nuôi thuần tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp.,........................................ 30
Hình 2.4. Phương pháp cắt tấm cutin vùng chậu con cái tuyến trùng Meloidogyne spp., .. 30
Hình 2.5. Hình thái giải phẫu của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp., sử dụng cho nghiên
cứu hình thái ............................................................................................................................. 30
Hình 2.6. Cấu trúc tấm cutin vùng chậu ................................................................................. 35
Hình 2.7. Cấu trúc vùng gen trong hệ gen nhân được sử dụng trong nghiên cứu ............... 36
Hình 2.8. Cấu trúc hệ gen ty thể sử dụng trong nghiên cứu.................................................. 37
Hình 3.1. Đặc điểm rễ bị nhiễm tuyến trùng Meloidogyne trên một số cây trồng .............. 42
Hình 3.2. Ảnh chụp kính hiển vi con cái loài Meloidogyne incognita ................................. 59
Hình 3.3. Ảnh chụp kính hiển vi ấu trùng và con đực loài Meloidogyne incognita........... 60
Hình 3.4. Ảnh chụp kính hiển vi con cái loài Meloidogyne javanica .................................. 66
Hình 3.5. Ảnh chụp kính hiển vi ấu trùng và con đực loài Meloidogyne javanica ............. 67
Hình 3.6. Ảnh chụp kính hiển vi con cái loài Meloidogyne arenaria .................................. 78
Hình 3.7. Ảnh chụp kính hiển vi ấu trùng và con đực loài Meloidogyne arenaria ............. 79
Hình 3.8. Ảnh chụp kính hiển vi con cái loài Meloidogyne enterolobii............................... 86
Hình 3.9. Ảnh chụp kính hiển vi ấu trùng và con đực loài Meloidogyne enterolobii ......... 87
Hình 3.10. Ảnh chụp kính hiển vi con cái loài Meloidogyne graminicola .......................... 96
Hình 3.11. Ảnh chụp kính hiển vi ấu trùng và con đực loài Meloidogyne graminicola ..... 97
Hình 3.12. Ảnh vẽ loài Meloidogyne daklakensis ................................................................. 97
Hình 3.13. Ảnh chụp kính hiển vi loài Meloidogyne daklakensis ...................................... 100
Hình 3.14. Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (SEM) loài Meloidogyne daklakensis ............ 101
Hình 3.15. Ảnh vẽ loài Meloidogyne sp ............................................................................... 107
Hình 3.16. Ảnh chụp kính hiển vi loài Meloidogyne sp...................................................... 108
Hình 3.17. Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (SEM) Meloidogyne sp ................................... 109
Hình 3.18. Hình phân tích CDA ấu trùng các quần thể Meloidogyne spp......................... 116
Hình 3.19. Hình phân tích CDA con đực các quần thể Meloidogyne spp ......................... 116
Hình 3.20. Hình phân tích CDA con cái các quần thể Meloidogyne spp........................... 117
x
Hình 3.21. Đặc điểm so sánh tấm cutin vùng chậu con cái các loài Meloidogyne spp ..... 122
Hình 3.22. Đặc điểm so sánh vùng đầu con đực giữa các loài tuyến trùng sần rễ
Meloidogyne spp., .................................................................................................................. 124
Hình 3.23. Đặc điểm so sánh phần đuôi ấu trùng tuổi 2 giữa các loài tuyến trùng sần rễ
Meloidogyne spp., .................................................................................................................. 125
Hình 3.24. Hình điện di sản phẩm Multiplex-PCR các mẫu nghiên cứu........................... 140
Hình 3.25. Cây phát sinh chủng loại các loài Meloidogyne spp., dựa trên vùng gen ITS 140
Hình 3.26. Cây phát sinh chủng loại các loài Meloidogyne spp., dựa trên vùng gen D2D3
................................................................................................................................................. 140
Hình 3.27. Cây phát sinh chủng loại các loài Meloidogyne spp., dựa trên vùng gen COI 140
Hình 3.28. Cây phát sinh chủng loại các loài Meloidogyne spp., dựa trên vùng gen COII16S .......................................................................................................................................... 140
Hình 3.29. Cây phát sinh chủng loại các loài Meloidogyne spp., dựa trên vùng gen NAD5
................................................................................................................................................. 140
Hình 3.30. Nấm Paecylomyces javanicus ký sinh trên trứng loài M. incognita................ 153
Hình 3.31. Nấm Paecylomyces javanicus ký sinh trên ấu trùng M.incognita ................... 153
Hình 3.32. Trứng và ấu trùng M. incognita chết do vi khuẩn L. antibioticus HS124 ....... 156
Hình 3.33. Hợp chất 4-HPAA gây chết trứng và ấu trùng Meloidogyne incognita .......... 160
1
MỞ ĐẦU
Tuyến trùng sần rễ thuộc giống Meloidogyne là nhóm tuyến trùng nội ký sinh
cố định gây sần rễ [1]. Sau khi xâm nhập vào rễ, ấu trùng tuổi 2 sẽ di chuyển và cư
trú tại mô phân sinh, tấn công vào đỉnh sinh trưởng của chóp rễ, làm phân hóa tế
bào đỉnh sinh trưởng, đồng thời tiết ra enzyme làm thay đổi mô rễ và hình thành các
điểm dinh dưỡng cho tuyến trùng. Rễ cây bị nhiễm tuyến trùng sần rễ sẽ bị tổn
thương, trên bề mặt có dạng sần sùi hoặc tạo thành các u cục, cây bị còi cọc, vàng lá
và gây chết. Các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne có khả năng ký sinh trên nhiều
loại cây chủ khác nhau và phân bố rộng trên toàn cầu, làm suy giảm năng suất và
sản lượng của các loại cây trồng, đặc biệt là các vùng Nam, Trung Mỹ, Châu Phi và
Châu Á trong đó có Việt Nam [1], [2], [3], [4]. Vì vậy, tuyến trùng sần rễ
Meloidogyne trở thành mối quan tâm trong sản xuất nông nghiệp. Tính đến năm
2006, có 111 loài Meloidogyne được mô tả, trong số đó có 18 loài ký sinh trên cây
cà phê, chứng tỏ rằng các loài Meloidogyne có tính đa dạng cao [5].
Ở Việt Nam, cho đến năm 2000 mới chỉ ghi nhận được 5 loài tuyến trùng sần
rễ Meloidogyne, trong đó Tây Nguyên được biết đến có mặt cả 5 loài này [6]. Các
nghiên cứu sau này cho thấy hiện nay tại khu vực Tây Nguyên, sự hiện diện và gây
hại của nhóm tuyến trùng này rất lớn đặc biệt trên cà phê và hồ tiêu. Sự gây hại của
các loài Meloidogyne spp. làm hàng trăm hecta cà phê, hồ tiêu đã phải loại bỏ để
thay thế trồng những cây trồng khác [6], [7], [8], [9].
Biến đổi hình thái của mỗi loài tuyến trùng sần rễ chịu sự ảnh hưởng của cây
chủ cũng như phân bố của các quần thể ở sinh thái khác nhau. Những tiêu chuẩn
chủ yếu trong phân loại bằng hình thái của tuyến trùng sần rễ thường sử dụng tấm
cắt cutin vùng chậu (hậu môn-sinh dục) của con cái, ngoài ra các đặc điểm hình thái
vùng đầu con đực, vùng đuôi của ấu trùng; các đặc điểm hình thái lượng của con
cái, con đực, ấu trùng cũng được sử dụng trong nghiên cứu đa dạng hình thái giữa
các loài [10], [11], [12], [2]. Tuy nhiên, sự chồng lấn các đặc điểm hình thái của các
quần thể trong cùng một loài, giữa các loài gần gũi, hay trên các cây chủ khác nhau
hoặc giữa các vùng địa lý khác nhau thường có sự dao động lớn nên gặp nhiều khó
khăn trong chẩn loại bằng các đặc điểm hình thái [13], [14]. Vì vậy, để hỗ trợ cho
phương pháp phân loại dựa trên hình thái, kỹ thuật phân tử đã được sử dụng hiệu
2
quả trong phân loại các loài Meloidogyne spp.. Nghiên cứu về di truyền trong phân
tích trình tự các vùng gen trong hệ gen nhân (18S, ITS, và 28S) [15], [16], [17],
[18], [19], [20] và các vùng gen trong hệ gen ty thể COI và COII và đoạn không mã
hóa giữa 2 vùng gen COII-16S-rRNA [21], [22], [23], [24] đã hỗ trợ rất nhiều cho
các nghiên cứu phân loại và phát sinh chủng loại của các loài tuyến trùng sần rễ
thuộc giống Meloidogyne được nhanh chóng và chính xác, góp phần phục vụ cho
biện pháp đánh giá tác hại và phòng trừ tuyến trùng sần rễ.
Với tác hại và phân bố rộng của tuyến trùng sần rễ trên cây trồng, việc ngăn
chặn và phòng trừ nhóm tuyến trùng này luôn được quan tâm và định hướng tới nền
nông nghiệp an toàn. Biện pháp phòng trừ tuyến trùng hiện nay chủ yếu sử dụng
thuốc hóa học với hàm lượng cao đã gây nên hiện tượng kháng thuốc cũng như ảnh
hưởng đến môi trường đất, làm suy giảm sự đa dạng của các sinh vật có ích, suy
thoái đất, ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe của con người và vật nuôi [25]. Do đó,
các biện pháp phòng trừ sinh học hiện được chú trọng hơn khi sử dụng các vi sinh
vật để chống lại các loài tuyến trùng ký sinh thực vật, được xem là một trong những
biện pháp rất tiềm năng [26], [27]. Nhiều loại vi sinh vật có khả năng làm tăng sinh
trưởng của cây, tạo ra các chất kháng sinh và độc tố làm ngăn cản sự sinh sản, nở
trứng và khả năng sống sót của ấu trùng tuổi 2 tuyến trùng sần rễ do vậy có thể
được đưa vào ứng dụng trong phòng trừ tuyến trùng [28], [29].
Xuất phát từ thực tiễn về đa dạng cây trồng và địa hình ở Tây Nguyên, cũng
như đa dạng của loài tuyến trùng sần rễ và khả năng gây hại, chúng tôi thực hiện đề
tài: “Nghiên cứu sự đa dạng tuyến trùng ký sinh gây sần rễ Meloidogyne spp. ở
Tây Nguyên’’
Mục tiêu nghiên cứu
Xác định được các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne gây hại trên các cây
trồng chính ở khu vực Tây Nguyên.
Đánh giá mức độ đa dạng hình thái và phân tử của các loài tuyến trùng sần rễ
Meloidogyne ở khu vực Tây Nguyên.
Đánh giá khả năng sử dụng một số vi sinh vật trong việc hạn chế sự phát
triển của tuyến trùng sần rễ M. incognita trong điều kiện phòng thí nghiệm.
3
Phạm vi nghiên cứu
Đặc điểm hình thái và phân tử của các loài tuyến trùng sần rễ
Meloidogyne ghi nhận trên một số cây trồng ở khu vực Tây Nguyên.
Đánh giá ảnh hưởng của một số vi sinh vật đối kháng lên khả năng nở
trứng và sống sót của ấu trùng Meloidogyne incognita.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Ý nghĩa khoa học
Bổ sung mới thành phần loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne ở Tây Nguyên,
trong đó ghi nhận thêm nhiều cây ký chủ bị nhiễm tuyến trùng Meloidogyne
cũng như sự phân bố của chúng. Mô tả và ghi nhận loài mới loài
Meloidogyne daklakensis ký sinh trên cà phê tại tỉnh Đắk Lắk.
Các chỉ tiêu hình thái của các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne ở các cây
chủ và địa điểm khác nhau được đánh giá, so sánh đưa ra sự biến đổi hình
thái trong loài và các loài khác nhau đã xác định được những chỉ tiêu quan
trọng ít thay đổi trong phân loại loài như các đặc điểm hình thái, hình thái
lượng của vân cutin vùng chậu con cái, vùng đầu con đực và phần đuôi ấu
trùng.
Đánh giá đa dạng di truyền giữa các quần thể trong một loài và giữa các loài
Meloidogyne ở Tây Nguyên được phân tích đưa ra các đoạn gen bảo thủ và
tiến hóa cũng như phát sinh loài. Từ đó góp phần đưa ra chọn lựa tốt nhất
trong phân loại từng nhóm loài Meloidogyne bằng sinh học phân tử. Bên
cạnh đó, lần đầu tiên đóng góp cơ sở dữ liệu các vùng gen nhân (ITS, D2D3)
và gen ty thể (COI, COII-16S, NAD5) của các loài Meloidogyne có mặt ở
Việt Nam trên Genbank.
Luận án khẳng định vai trò ký sinh và gây chết của vi sinh vật có lợi trong
điều kiện phòng thí nghiệm của nấm Paecilomyces javanicus, vi khuẩn
Lysobacter antibioticus HS124 trong phòng trừ loài Meloidogyne incognita
phổ biến trên nhiều cây trồng.
Ý nghĩa thực tiễn
4
Xác định thành phần loài, mật độ tuyến trùng sần rễ hại cây trồng là tiêu
chuẩn trong phòng trừ hiệu quả. Cung cấp số liệu về khả năng ký sinh, ký
chủ, gây hại và phân bố của các loài tuyến trùng ký sinh gây sần rễ góp phần
ngăn chặn chúng phát tán trong điều kiện tự nhiên bảo vệ cây trồng tránh bị
lây nhiễm. Từ đó lựa chọn phương thức canh tác phù hợp đối với từng cây
trồng nhất là đối với cà phê và hồ tiêu cũng như những cây trồng xen và luân
canh.
Luận án cung cấp cơ sở dữ liệu về hình thái và phân tử của các loài
Meloidogyne phục vụ cho tra cứu, tham khảo.
Đánh giá khả năng phòng trừ tuyến trùng sần rễ Meloidogyne bởi nấm
Pacylomyces javanicus, vi khuẩn Lysobacter antibioticus HS124, kháng sinh
4-HPAA làm cơ sở cho việc lựa chọn các tác nhân trong phòng trừ, qua đó
góp phần giảm lượng thuốc hóa học trong phòng trừ, giữ được cân bằng sinh
thái để phát triển bền vững các cây trồng chủ lực ở Tây Nguyên.
Những đóng góp mới của luận án
Luận án lần đầu tiên đưa ra dữ liệu đầy đủ về phân bố, cây chủ và đặc trưng
hình thái, phân tử của các loài tuyến trùng sần rễ trên cà phê, hồ tiêu và các
cây trồng xen ở Tây Nguyên. Đã xác định thêm nhiều cây chủ mới nhiễm
tuyến trùng Meloidogyne ở Tây Nguyên cũng như cho Việt Nam. Bổ sung
145 trình tự các vùng gen ITS, D2D3, COI, COII-16S, NAD5 của các loài
tuyến trùng sần rễ ở Tây Nguyên trên Genbank.
Đã ghi nhận 01 loài tuyến trùng sần rễ mới cho khoa học ký sinh trên cà phê
đã được mô tả, công bố và đặt tên Meloidogyne daklakensis n. sp. và 01 loài
còn lại đã được gửi công bố.
Lần đâu tiên tại Việt Nam đã đánh giá khả năng ký sinh và gây chết của nấm
Pacylomyces javanicus, vi khuẩn Lysobacter antibioticus HS124 và chất
kháng sinh 4-HPAA đối với tuyến trùng sần rễ M. incognita trong điều kiện
phòng thí nghiệm.
5
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.Tình hình nghiên cứu tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne trên thế giới
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu
Berkeley (1855) là nhà khoa học đầu tiên công bố sự xuất hiện của tuyến
trùng sần rễ trên rễ cây dưa chuột trồng tại khu vườn Nuneham, Vương Quốc Anh
với các mô tả triệu chứng như: các nốt sần có màu kem đục, gần như hình cầu, có
vảy mờ, có hiện tượng phình to ở rễ (hình 1.1). Jobert (1878) đã ghi nhận sự hiện
diện trong rễ cà phê các cá thể hình giun được nở ra từ trứng có trong rễ cây,và ông
đã đưa ra các mô tả cơ bản về tuyến trùng này. Sau đó, nhóm tuyến trùng này lần
lượt được đặt tên là Anguillula marioni (Cornu, 1879); Heterodera radicicola (Carl
Muller, 1884), Heterodera javanica Treub (Melchior, 1885) [30]. Năm 1887 tên
tuyến trùng sần rễ Meloidogyne (Meloidogyne theo tiếng latin có nghĩa là „con cái
có hình quả táo‟) đã được đề xuất bởi Göldi khi mô tả chi tiết loài M. exigua trên rễ
cà phê ở Braxil [1] (hình 1.2). Đến năm 1949, Chitwood thống nhất tách giống
tuyến trùng Meloidogyne Göldi, 1887 dựa trên loài chuẩn M. exigua (Goldi, 1887)
tách khỏi tuyến trùng bào nang Heterodera. Vị trí phân loại của giống Meloidogyne
hiện tại được theo hệ thống Karsen et al. (2013) [30].
Ngành: Nematoda Potts, 1932
Lớp: Chromadorea Inglis, 1983
Phân lớp: Chromadoria Pearse, 1942
Bộ: Rhabditida Chitwood, 1933
Phân bộ: Tylenchina Thorne, 1949
Họ: Meloidogynidae Skarbilovich, 1959
Phân họ: Meloidogyninae Skarbilovich, 1959
Giống: Meloidogyne Göldi, 1887
6
Hình 1.1. Hình ảnh tuyến trùng
sần rễ lần đầu tiên được công bố
A: Rễ cây bị sần, B: trứng, tuyến
trùng trong mô rễ [30].
Hình 1.2. Hình ảnh chi tiết tuyến trùng M. exigua trên cà phê Göldi (1887) [30].
7
1.1.2. Đặc điểm sinh học, vòng đời của tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne
Chu kỳ sống của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne bao gồm 5 giai đoạn phát
triển bao gồm: trứng; ấu trùng tuổi 1(J1); ấu trùng tuổi 2 (ấu trùng cảm nhiễm-J2);
ấu trùng tuổi 3, 4 (J3, J4) và giai đoạn trưởng thành với con cái và con đực (hình
1.3) [31]. Trứng sau khi thụ tinh sẽ hình thành giai đoạn đầu tiên của ấu trùng J1
nằm trong trứng. Khi đạt điều kiện thuận lợi trứng chứa J1 sẽ nở ra thành ấu trùng
tuổi 2(J2). Ấu trùng tuổi 2 khi chưa xâm nhập vào rễ cây chúng sử dụng dinh dưỡng
được dự trữ trong ruột cho đến khi tìm được ký chủ phù hợp [32], khi đó J2 sẽ bắt
đầu giai đoạn xâm nhiễm và xâm nhập vào các mô rễ, J2 thường tấn công vào các
mô phần sinh trưởng ở đỉnh rễ; nơi các rễ phụ mọc ra tạo điểm xâm nhập cho các J2
khác và làm cho bề mặt rễ bị tổn thương. Khi J2 tiếp xúc với bề mặt của rễ, chúng
dùng kim hút châm chích và xâm nhập vào bên trong rễ ở bất kỳ phía nào của rễ.
Sau khi xâm nhập vào trong rễ, tuyến trùng di chuyển giữa các tế bào vỏ rễ,
tách dọc tế bào và định vị tại vùng mô phân sinh của vỏ rễ bắt đầu quá trình dinh
dưỡng. Trong quá trình dinh dưỡng, J2 cố định phần đầu vào các tế bào mô mạch
của rễ, tiết men tiêu hóa làm thay đổi quá trình sinh lý sinh hóa của tế bào rễ và hình
thành các điểm dinh dưỡng cho tuyến trùng. Vùng này gồm 5-6 tế bào khổng lồ (tế
bào đa nhân) được tạo thành trong vùng nhu mô hoặc hoặc mô libe. Đây là sự thích
nghi chuyên hóa cao của tế bào thực vật, được tạo ra và duy trì bằng sự ký sinh của
tuyến trùng. Cùng với sự hình thành tế bào khổng lồ các mô rễ xung quanh nơi
tuyến trùng ký sinh cũng bị phình to ra và tạo thành các nốt sần rễ (gall hoặc rootknot).
Sự hình thành các tế bào khổng lồ này có liên quan đến sự thay đổi điều tiết
và biểu hiện của gen chẳng hạn như gen ADF mã hóa cho protein ADF2 trong tế
bào thực vật chịu trách nhiệm cho sự phát triển các tế bào bình thường [33]. Các tác
động từ Meloidogyne sau khi xâm nhiễm sẽ làm kích hoạt các protein ADF2 này
làm cho các tế bào thực vật phát triển mạnh hơn và bất thường hơn. Trung bình,
kích thước cuối cùng của các tế bào bị nhiễm tuyến trùng sần rễ sẽ lớn gấp 400 lần
so với các tế bào mạch bình thường trong rễ [34], [35].
Các nốt sần rễ thường được tạo thành trong vòng 1-2 ngày sau khi bị tuyến
trùng xâm nhập. J2 sẽ tăng kích thước, lột xác lên giai đoạn J3, J4 và phát triển
8
trong thời gian từ 4-6 ngày và cuối cùng là cơ thể trưởng thành đực và cái. Con đực
có kích thước dài, hình giun, tuy nhiên chúng không ăn trực tiếp dinh dưỡng từ cây.
Con cái có dạng hình quả lê và hoàn thành chu trình sống bắt đầu đẻ trứng, mỗi túi
trứng được chứa từ 300-500 trứng, có loài lên tới 2000 trứng, trứng này được chứa
trong một túi gelatin có thể ở trong hoặc phủ ra ngoài rễ, khi gặp điều kiện nhiệt độ
và độ ẩm thích hợp trứng sẽ được nở [36], [30].
Hình 1.3. Chu kỳ vòng đời của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp.,
Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp. có 2 hình thức sinh sản khác nhau,
trong đó một vài loài sinh sản hữu tính-giao phối bắt buộc (amphimixis) như M.
carolinensis, M. megatyla và M. pini [12] và phần lớn các loài còn lại là sinh sản
lưỡng tính (parthenogensis) không cần con đực như M. chitwoodi, M. exigua và M.
9
fallax. Đối với các loài có hình thức sinh sản hữu tính thì con đực cặp đôi với con
cái ngay sau lần lột xác cuối cùng [37], [30]. Chiều dài vòng đời tuyến trùng thu
được phụ thuộc nhiều yếu tố, quan trọng nhất là nhiệt độ môi trường và loại đất. Ở
nhiệt độ 27ºC, một chu kỳ của tuyến trùng Meloidogyne từ 21-25 ngày, trong khi tại
nhiệt độ 19ºC cần ít nhất là 29 ngày để hoàn thành chu kỳ sống. Các loài tuyến
trùng ở các vùng ôn đới như M. hapla sinh trưởng tốt từ 15-25ºC, trong khi đó các
loài ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới như M. incognita, M. javanica, M. arenaria
thì thích hợp ở nhiệt độ từ 18-30ºC. Chu kỳ sống này cũng sẽ kéo dài hơn nếu cây
chủ không phù hợp [38], hay còn tùy thuộc vào môi trường sống, thông thường loại
đất cát thích hợp cho tuyến trùng hơn là loại đất sét.
1.1.3. Khả năng gây hại trên một số cây trồng
Cho đến nay, tuyến trùng sần rễ Meloidogyne đã trở thành đối tượng nhận
được sự quan tâm của rất nhiều nhà tuyến trùng học do phân bố địa lý, phổ ký chủ
rất rộng và có khả năng làm suy giảm năng suất và sản lượng của nhiều loại cây
trồng. Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne có khả năng ký sinh trên hầu hết các loại cây
trồng, lên tới 5500 loại cây khác nhau, bao gồm từ cây một lá mầm đến cây hai lá
mầm [39]. Một số loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne có phạm vi ký chủ rộng như
M. incognita, M. arenaria có khả năng ký sinh trên nhiều loại cây so với các loài
tuyến trùng sần rễ Meloidogyne khác [39], [40]. Thiệt hại cho kinh tế của hàng năm
liên quan đến tuyến trùng sần rễ ước tính lên tới hàng trăm tỷ đô la [32], [39], [41],
[42], [43]. Tới năm 2006, có 111 loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne được mô tả
[44], [45]. Một số loài mới tiếp tục được ghi nhận trong những năm gần đây như:
M. lopezi trên cà phê ở Costa Rica [5], M. aberrans trên kiwi ở Trung Quốc [46].
Trên cà phê, tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp., được xem là một trong
những nguyên nhân chính gây ra các tổn thất làm giảm năng suất và sản lượng, ước
tính tổn thất lên đến 15% [3]. Đến năm 2014, có 18 loài tuyến trùng sần rễ
Meloidogyne ký sinh trên cây cà phê được ghi nhận bao gồm: M. exigua, M.
africana, M. arabicida, M. arenaria, M. coffeicola, M. decalineata, M. hapla, M.
incognita, M. inornata, M. izalcoensis, M. javanica, M. kikuyensis, M. konaensis,
M. mayaguensis, M. megadora, M. oteifae, M. paranaensis và M. lopezi [4], [5]. Ở
khu vực Trung Mỹ, phần lớn cà phê trồng tại đây bị ảnh hưởng bởi các loài tuyến trùng
10
sần rễ Meloidogyne và có 6 loài đã được ghi nhận, trong đó loài M. exigua xuất hiện
phổ biến nhất và được ghi nhận được ở Costa Rica, Nicaragua và Honduras gây thiệt
hại kinh tế khoảng 10% tổng giá trị sản phẩm [47], [48], [49], [50]. Hai loài M. exigua
và M. incognita gây hại mạnh nhất cho cà phê ở khu vực Châu Mỹ La Tinh. Tại Braxil
tuyến trùng sần rễ Meloidogyne gây thiệt hại kinh tế cho việc sản xuất cà phê lên tới
45% [50]. Ngoài ra, một số loài tuyến trùng sần rễ khác cũng được ghi nhận ở khu
vực này như: M. arenaria và M. incognita đã được ghi nhận ở Cộng hòa En-XanVa-Đo và Cộng hòa Gua-Tê-Ma-La, M. hapla ở Cộng hòa Gua-Tê-Ma-La [51],
[52], M. mayaguensis ở Cuba [53].
Trên hồ tiêu, tuyến trùng sần rễ Meloidogyne làm suy giảm sự sinh trưởng
của cây, gây ra bệnh vàng lá, chết chậm cho cây. Điều tra ở Braxil năm 1976 ghi
nhận 91% cây hồ tiêu bị nhiễm tuyến trùng trong đó M. incognita là loài được bắt
gặp nhiều nhất [54]. Tại Malaysia, M. incognita và M. javanica được báo cáo là
nguyên nhân làm giảm sinh trưởng và gây triệu chứng vàng lá trên cây tiêu, nhiều
cánh đồng trồng tiêu đã bị chết trụi do tuyến trùng sần rễ gây ra [55], [56], hai loài
này cũng đã được ghi nhận trên hồ tiêu ở Ấn Độ, Thái Lan, Campuchia, Indonesia,
Brunei, Philipin, Braxil và Việt Nam. Trong khi đó loài M. arenaria chỉ được ghi
nhận trên hồ tiêu tại Srilanka [57]. Năm 2000, loài M. piperi được mô tả là loài mới
trên hồ tiêu tại Ấn Độ [58].
Trên lúa, M. graminicola là loài đại diện được tìm thấy trên lúa ở hầu hết ở
các nước châu Á, phổ biến ở Burma, Bangladesh, Ấn Độ, Nepal, Pakistan, Sri
Lanka, Lào, Thái lan, Đài loan, Indonesia, Philippine và Việt Nam [57]. Loài này
gây thiệt hại đến năng suất lúa từ vùng núi cao, vùng đồng bằng cho đến các vườn
ươm [59] gây thiệt hại lên tới 70% năng suất lúa ở Philipine [60]. Ước tính thiệt hại
do tuyến trùng M. graminicola làm suy giảm năng suất lúa dao động từ 20-80%
[61]. Ngoài ra, trên cây lúa còn ghi nhận thêm những tuyến trùng sần rễ khác như:
M. hainamensis và M. lini ở Trung Quốc, M. triticoryzae ở Ấn Độ và 4 loài khác
được tìm thấy chủ yếu trên các loài lúa cạn (M. incognita, M. javanica, M. arenaria
và M. salasi) [57].
Trên khoai tây, có tới 7 loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne được ghi nhận.
Ở vùng nhiệt đới gây hại mạnh nhất là loài M. incognita, tiếp đến là M. javanica, M.
11
arenaria. Trong khi đó các loài M. hapla, M. chitwoodi, M. fallax và M. thamesi
gây hại chủ yếu ở các vùng ôn đới [57]. Sự gây hại của tuyến trùng sần rễ
Meloidogyne còn được ghi nhận ở nhiều nơi khác như Nam Phi, Vương Quốc Bỉ,
Mỹ, Malta, Hà Lan, Ả Rập Xê Út với sự ghi nhận loài M. javanica nhiều nhất với tỷ
lệ 7,35% sau đó đến loài M. incognita là 5% [62].
Trên các loại rau và hoa màu khác ghi nhận được 5 loài tuyến trùng sần rễ
ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản xuất các loại rau màu bao gồm M. incognita (tỷ lệ
nhiễm 53%), M. javanica (tỷ lệ nhiễm 30%), M. arenara (tỷ lệ nhiễm 8%) và M.
hapla (tỷ lệ nhiễm 8%) [57].
Tầm quan trọng của nhóm tuyến trùng sần rễ này cũng được thể hiện thông
qua một số lượng lớn các nghiên cứu được công bố và sách được xuất bản [2], [38],
[40], [63], [64]. Một trong những nghiên cứu tập trung nhất về nhóm tuyến trùng
này là dự án “The International Meloidogyne Project” năm (1975-1984) một dự án
nghiên cứu tập trung vào đặc điểm sinh học, phân loại, sinh thái, phòng trừ và
chuyển giao công nghệ trong nông nghiệp [65]. Hiện nay, các nghiên cứu về nhóm
tuyến trùng này vẫn được phát triển mạnh và ghi nhận nhiều loài mới cho khoa học
thuộc giống Meloidogyne.
1.1.4. Nghiên cứu phân loại các loài tuyến trùng sần rễ thuộc giống Meloidogyne
1.1.4.1. Phương pháp phân tích hình thái
Việc phân loại các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne là rất cần thiết chủ
yếu vẫn dựa trên hình thái, tuy nhiên vẫn còn khá nhiều khó khăn vì các đặc điểm
hình thái đa dạng giữa các loài và quần thể.
Chitwood (1949) đã sử dụng chi tiết các đặc điểm của con cái như: kim hút,
DGO, đặc điểm tấm cutin vùng chậu (perineal pattern) để mô tả các loài M. hapla,
M. incognita, M. arenaira, M. exigua, M. incognita và M. javanica [10]. Các đặc
điểm tấm cutin vùng chậu bao gồm các vị trí: điểm đuôi (tail terminus), phasmids,
đường bên, khoảng cách vulva-anus (âm hộ-hậu môn), đặc điểm vân bao quanh
vulva, anus. Tấm cutin vùng chậu này của con cái được xem là đặc điểm quan trọng
khi phân loại các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne bởi vì rất nhiều nghiên cứu
chỉ ra rằng các đặc điểm của tấm cắt này khá ổn định và đặc trưng cho từng loài,
không thay đổi sau một khoảng thời gian nhân nuôi [31], [66]. Jebson (1983) [67]
12
đã phân tích thêm các đặc điểm vùng đầu con đực, hình thái lượng của kim hút;
khoảng cách từ gốc kim hút đến lỗ đổ của tuyến thực quản lưng (DGO). Sau đó ông
phân tích thêm các chỉ số chiều dài đuôi, hình dạng đuôi và chiều dài hyaline của ấu
trùng để chia tuyến trùng sần rễ Meloidogyne ra làm 12 nhóm.
Hình 1.4. Các đặc điểm chung để xác định các loài Meloidogyne
A: Đặc điểm hình thái con cái với kiểu cổ; B: Hình thái tấm cutin vùng chậu;
C: Phần đầu con đực trưởng thành; D: Đặc điểm kim hút; E: Đặc điểm phần đuôi ấu
trùng.
Hình ảnh kính hiển vi điện tử quét (SEM) của tuyến trùng đã phân tích được
các đặc điểm hình thái chi tiết hơn và hỗ trợ rất nhiều cho các nghiên cứu hình thái
thông thường [2], [68]. Tuy nhiên, những đặc điểm sai khác của cấu trúc của tấm
cutin vùng chậu giữa các cá thể trong cùng một loài [31], [66], [69] và sự tương
đồng giữa các loài đồng hình gây ra nhiều khó khăn trong phân loại nếu chỉ sử dụng
riêng rẽ một đặc điểm vùng chậu [2]. Ví dụ như, loài M. paranaensis, M.
konaensis, M. izalcoensis và M. mayaguensis có cấu trúc vân cutin vùng chậu gần
tương tự với loài M. incognita [70]. Hơn thế nữa, phân loại các loài dựa trên các đặc
điểm hình thái, hình thái lượng yêu cầu rất nhiều về kỹ năng và thời gian làm việc
đặc biệt là nếu số lượng mẫu lớn hoặc các quần thể hiếm gặp lại rất khó căn cứ vào
các đặc điểm này [71], [72], [73]. Sự khác nhau giữa các loài gần gũi rất khó phân
biệt được qua hình thái nhất là đối với nhóm phức hợp loài (species complex) thuộc
giống Meloidogyne [2]; hay như các loài Radopholus gặp ở Việt Nam chỉ phân biệt
được sau khi phân tích biệt thức chuẩn CDA của các chỉ số hình thái lượng và phải
dùng các đặc trưng phân tử để chắc chắn loài đã gặp [74].
13
1.1.4.2. Phương pháp phân tích phân tử
Phân loại tuyến trùng bằng phân tử được bắt đầu bằng phương pháp PCR sử
dụng các chỉ thị phân tử và phân tích trình tự gen [75], [76] cho phép việc phân loại
các loài này nhanh và chính xác hơn so với phương pháp hình thái truyền thống, từ
đó đưa ra vị trí phân loại của loài và phát sinh chủng loại của các loài tuyến trùng
sần rễ Meloidogyne [77]. Phương pháp PCR có thể áp dụng với DNA được tách
chiết từ trứng, ấu trùng, con cái hoặc con đực, có thể phân tích từ 1 cá thể trong mẫu
có lẫn nhiều quần thể với nhau, thời gian bảo quản mẫu có thể lên đến vài năm [75],
[78]. Cho tới nay kỹ thuật phân tử có thể áp dụng trong định dạng và định lượng các
loài Meloidogyne spp. trong mẫu khi có hơn 2 loài bằng phương pháp PCR đa mồi
(Multiplex-PCR) [79].
Phân loại tuyến trùng bằng phân tích trình tự các vùng gen là một trong
những phương pháp đáng tin cậy nhất trong phân loại tuyến trùng sần rễ. Các
phương pháp hiện nay bao gồm phân tích các vùng gen trong hệ gen nhân (rDNA)
và các vùng gen trong hệ gen ty thể (mtDNA) [17], [80], [81], [82], [83], [84].
Hệ gen nhân
Các vùng gen trong hệ gen nhân được sử dụng trong phân loại một số loài
tuyến trùng sần rễ Meloidogyne khác nhau, do đây là vùng gen vừa có tính bảo thủ
vừa có tính đa dạng thích hợp để phân biệt các loài gần gũi. Trong hệ gen nhân này,
một tổ hợp gen quan trọng gọi là tổ hợp DNA ribosome (rDNA) bao gồm vùng giao
gen (ITS1 và ITS2) và vùng gen 18S, 26S, 28S và 5.8S. Trong đó vùng ITS1 nằm
giữa 2 vùng gen 18S và 5,8S; vùng ITS2 nằm giữa 2 vùng gen 5,8S và 28S; hai
vùng này có mức độ biến đổi ngoài loài rất cao khó có thể sử dụng để so sánh các
loài khác giống nhưng lại phù hợp để phân tích giữa các loài khác nhau trong cùng
một giống [81], [85], [86]. Vùng gen 18S, 26S, 28S và 5.8S được sắp xếp theo cặp
đối xứng tách biệt với vùng ITS và ETS và liền với vùng IGS [87]. Các vùng gen
mã hóa ribosome 18S, 28S, 5.8S thường được sử dụng trong phân tích phát sinh
chủng loại của tuyến trùng do chúng bảo thủ hơn so với các vùng không phiên mã
ribosome (ITS, ETS và IGS) và tham gia vào mã hóa gen cấu trúc [77]. Landa et al.,
2008 [14] phân loại loài M. hispanica phân lập từ Braxil, Bồ Đào Nha và Tây Ban
Nha dựa trên vùng gen 18S, 5.8S, ITS2 và D2D3. Các nghiên cứu sử dụng vùng gen
