Xây dựng bộ sưu tập giống vi khuẩn lên men lactic có hoạt tính probiotics

MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ
Lời mở đầu ..................................................................................................................... 1
Chương 1: GIỚI THIỆU ............................................................................................. 3
1.1 Đặt vấn đề ................................................................................................................ 3
1.2. Mục đích đề tài........................................................................................................ 4
1.3. Nội dung đề tài ........................................................................................................ 4
1.4. Ứng dụng của đề tài ............................................................................................... 5
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 6
2.1. Tổng Quan Về Probiotics ...................................................................................... 6
2.1.1. Lịch sử nghiên cứu Probiotics ............................................................................. 6
2.1.2. Định nghĩa về Probiotics ...................................................................................... 9
2.1.3. Probiotic, prebiotic và synbiotic ........................................................................ 10
2.1.4. Thành phần vi sinh của probiotics ..................................................................... 12
2.1.5. Cơ chế hoạt động và lợi ích của probiotics. ....................................................... 13
2.1.5.1. Tác động kháng khuẩn của probiotics. ........................................................... 14
2.1.5.2.Tác động của probiotics trên biểu mô ruột ...................................................... 16
2.1.5.3.Tác động lên hệ miễn dịch của probiotics. ...................................................... 17
2.1.5.4.Tác động của probiotics đến vi khuẩn đường ruột. ......................................... 19
2.1.6. Hạn chế của probiotic ....................................................................................... 22
2.2. Tổng quan về vi khuẩn lactic (LAB). ................................................................... 22
2.2.1 Khái niệm. ........................................................................................................... 22
2.2.2. Đặc tính chung ................................................................................................... 24
2.2.3. Đặc điểm hình thái một số giống LAB chủ yếu. ............................................... 26


2.2.3.1 Giống Lactobacillus ......................................................................................... 26
2.2.3.2. Giống Streptococcus ...................................................................................... 28

2.2.3.3. Giống Leuconostoc ........................................................................................ 30
2.2.3.4. Giống Pediococcus ........................................................................................ 31
2.2.4. Đặc điểm sinh lý- sinh hóa ............................................................................... 32
2.2.4.1 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic ......................................................... 32
2.2.4.2. Quá trình trao đổi chất. ................................................................................... 34
a. Lên men lactic đồng hình.
b. Lên men lactic dị hình.
2.2.5. Sản phẩm của quá trình lên men và khả năng sinh các chất kháng khuẩn ở vi
khuẩn lactic. ................................................................................................................. 38
2.3. Tổng Quan Về Phương Pháp Phân Lập Và Tuyển Chọn Vi khuẩn Lactic ........ 40
2.3.1 Nhu cầu tìm kíếm các nguồn probiotics mới. ..................................................... 40
2.3.2. Các tiêu chí để chọn các chủng probiotics ......................................................... 40
2.3.3. Phương pháp tìm kiếm các nguồn probiotics mới. ............................................ 41
2.3.4. Các phương pháp xác định, phân loại vi sinh vật vừa phân lập ........................ 42
2.3.4.1. Định danh vi sinh vật theo phương pháp cổ điển. .......................................... 42
2.3.4.2. Sự phân loại LAB đến cấp giống ................................................................... 43
2.3.4.3. Định danh vi sinh vật theo phương pháp hiện đại ........................................ . 46
2.4. Ứng Dụng Của probiotics ..................................................................................... 47
2.4.1. Các dạng chế phẩm probiotics trong thương mại. ............................................. 47
2.4.2. Những chủng vi khuẩn probiotics đã được thương mại hóa. ............................. 48
2.5.. Các nghiên cứu về probiotics trong nước. ......................................................... 54
Chương 3: VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 56
3.1. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................................ 56
3.2. Thời gian thực hiện ............................................................................................... 56
3.3. Vật liệu .................................................................................................................. 56
3.3.1. Thiết bị và dụng cụ ............................................................................................ 56
3.3.2. Hóa chất ............................................................................................................. 57


3.4. Phương pháp luận ................................................................................................. 57

3.5. Phương pháp thí nghiệm ....................................................................................... 60
3.5.1. Thu thập mẫu ..................................................................................................... 60
3.5.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic. .............................................................. 61
3.5.2.1. Tăng sinh ......................................................................................................... 61
3.5.2.2. Phân lập ........................................................................................................... 61
3.5.3. Các thí nghiệm dùng để định danh vi khuẩn lactic. ........................................... 62
3.5.3.1. Nhuộm Gram .................................................................................................. 62
3.5.3.2. Nhuộm bào tử ............................................................................................... .62
3.5.3.3. Nhuộm kháng acid .......................................................................................... 62
3.5.3.4. Thử nghiệm catalasa. ...................................................................................... 63
3.5.3.5. Thử nghiệm khả năng sinh acid. ..................................................................... 63
3.5.3.6. Thử nghiệm khả năng di động. ....................................................................... 63
3.5.3.7. Thử nghiệm khả năng lên men đường và khả năng sinh khí .......................... 63
3.6. Thử nghiệm khả năng sinh H2O2 ......................................................................... 64
3.7. Thử nghiệm khả năng kháng vi sinh vật
bằng phương pháp đo độ đục (turbidimetric method). ................................................ 65
3.8. Thử nghiệm khả năng chịu acid và muối mật ....................................................... 67
3.8.1. Khả năng chịu acid ............................................................................................ 67
3.8.2. Khả năng chịu muối mật ................................................................................... 67
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .................................................................. 69
4.1. Phân lập vi khuẩn lên men lactic .......................................................................... 69
4.2. Định danh các chủng phân lập .............................................................................. 71
4.2. 1. Nhuộm Gram .................................................................................................... 71
4.2.2. Kết quả nhuộm bào tử ........................................................................................ 80
4.2.3. Nhuộm kháng acid ............................................................................................. 81
4.2.4. Thử nghiệm catalase .......................................................................................... 82
4.2.5. Thử nghiệm tính sinh acid lactic bằng thuốc thử Uffelmann ............................ 83
4.2.6. Thử nghiệm khả năng di động bằng phương pháp thạch mềm. ........................ 84

4.2.8. Thử nghiệm kiểm tra khả năng lên men đường và khả năng sinh khí. .............. 86
4.3. Thử nghiệm khả năng sinh H2O2 .......................................................................... 91
4.4. Kiểm tra khả năng kháng E.coli và Salmonella
bằng phương pháp đo độ đục. ..................................................................................... 92
4.5. Kết quả kiểm tra khả năng chịu acid và muối mật 101
4.5.1. Kết quả kiểm tra khả năng chịu muối mật
của 3 chủng vi khuẩn phân lập ................................................................................... 103
4.5.2. Kết quả kiểm tra khả năng chịu acid
của 3 chủng vi khuẩn phân lập................................................................................... 104
Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................. 108
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤC LỤC


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC KTCN TPHCM
KHOA: MT và CNSH
BỘ MÔN: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
ĐỘC LẬP – TỰ DO – HẠNH PHÚC
----------------------

NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

HỌ VÀ TÊN: DƯƠNG THÚY VY
NGÀNH
: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MSSV : 106111042

LỚP : 06DSH

1. Đầu đề Đồ án tốt nghiệp:

XÂY DỰNG BỘ SƯU TẬP GIỐNG VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC CÓ
HOẠT TÍNH PROBIOTICS
2. Nhiệm vụ (yêu cầu về nội dung và số liệu ban đầu):

➢ Phân lập và định danh đến cấp giống các vi khuẩn lên men lactic theo
phương pháp cổ điển
➢ Kiểm tra hoạt tính probiotics của các chủng vi khuẩn đã phân lập
- Khả năng kháng vi sinh vật chỉ thị E.coli và Salmonella
- Khả năng chịu acid và muối mật của một số chủng
3. Ngày giao Đồ án tốt nghiệp: 5/4/2010
4. Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 28/6/2010
5. Họ tên người hướng dẫn:
TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

Phần hướng dẫn:
Toàn bộ

Nội dung và yêu cầu LVTN đã được thông qua Bộ môn.
Ngày
tháng
năm 2010
CHỦ NHIỆM BỘ MÔN
NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHÍNH
(Ký và ghi rõ họ tên)
(Ký và ghi rõ họ tên)

PHẦN DÀNH CHO KHOA, BỘ MÔN
Người duyệt (chấm sơ bộ): .........................
Đơn vị: ........................................................
Ngày bảo vệ: ................................................
Điểm tổng kết:..............................................
Nơi lưu trữ Đồ án tốt nghiệp: .......................


Danh sách các chữ viết tắt
ATP

:

Adenosine triphosphate

Cfu

:

Colony forming units

GOS

:

Galactooligosaccharides

GRAS

:

Generally recognized as safe

LAB

:

(Lactic acid bacteria) Vi khuẩn lên men lactic

NAD

:

Nicotinamid adenine dinucleotide dạng oxy hóa

NADH

:

Nicotinamid adenine dinucleotide dạng khử

OEI

:

Oligofructose-Enriched Inulin


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang

Bảng 2.1: Ví dụ về thành phần của prebiotic ............................................................. 12
Bảng 2.2 : Những vi sinh vật được xem như là probiotic ........................................... 13
Bảng 2.3: Sự chiếm ngụ của vi sinh trong đường tiêu hóa của người ......................... 21
Bảng 2.4 : Phân loại khoa học giống Lactobacillus .................................................... 26
Bảng 2.5: Phân loại khoa học Giống Streptococcus ................................................... 28
Bảng 2.6: Phân loại khoa học giống Leuconostoc ....................................................... 30
Bảng 2.7: Phân loại khoa học giống Pediococcus ................................................................. 31

Bảng 2.8: Sản phẩm biến dưỡng và kiểu hoạt động đối kháng ................................... 39
Bảng 2.9: Các đề tài nghiên cứu probiotics ở Việt nam từ 2008 đến nay .................. 54
Bảng 3.1: Bảng kí hiệu các nguồn phân lập ................................................................ 60
Bảng 4.1: Bảng kí hiệu các chủng vi khuẩn phân lập. ................................................. 70
Bảng 4.2: Hình thái khuẩn lạc dưới kính hiển vi x10 và hình thái vi khuẩn dưới kính
hiển vi x100…….......................................................................................................... 73
Bảng 4.3: Kết quả của các thí nghiệm dùng để định danh vi khuẩn............................ 88
Bảng 4.4: Kết quả kiểm tra khả năng kháng E.coli và Salmonella
của 23 chủng vi khuẩn phân lập................................................................................... 95
Bảng 4.5: Kết quả kiểm tra khả năng chịu muối mật của 3 chủng vi khuẩn ........................ 103

Bảng 4.6: Kết quả kiểm tra chịu acid của 3 chủng vi khuẩn.... ................................. 105


DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ
Trang
Hình 2.1: Cơ chế kháng vi sinh vật của bacteriocin ................................................... 16
Hình 2.2 : Cơ chế tác động của probiotics đến vi khuẩn đường ruột ......................... 19
Hình 2.3 : Cây phát sinh loài của vi khuẩn lactic. ....................................................... 24
Hình 2.4 : Lactobacillus species ................................................................................. 26
Hình 2.5: Streptococcus .............................................................................................. 28
Hình 2.6: Leuconostoc ................................................................................................ 30

Hình 2.7: Pediococcus sp. ...................................................................................................... 32

Hình 2.8: Con đường lên men glucose ....................................................................... 37
Hình 2.9: Các hướng an toàn của probiotics ............................................................... 41
Hình 3.1: Sơ đồ phân lọai vi khuẩn theo kết quả nhuộm Gram và hình thái (theo khóa
phân lọai của Bergey) .................................................................................................. 58
Hình 3.2: Sơ đồ các bước phân lập và định danh vi khuẩn lactic ................................ 59
Hình 4.1: Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn lactic ............................................................. 70
Hình 4.2: Vi khuẩn Bacillus subtilis Gram dương bắt màu tím. ................................. 71
Hình 4.3: Vi khuẩn E. coli Gram âm bắt màu đỏ ....................................................... 71
Hình 4.4: Vi khuẩn Bacillus subtilis sinh bào tử ......................................................... 80
Hình 4.5: vi khuẩn E.coli không sinh bào tử ............................................................... 81
Hình 4.6: mẫu vi khuẩn phân lập không sinh bào tử ................................................... 81
Hình 4.7: Vi khuẩn Mycobacterium smegmatis có tính kháng acid ............................ 82
Hình 4.8: Mẫu vi khuẩn không có tính kháng acid ...................................................... 82
Hình 4.9: Mẫu vi khuẩn có catalase âm tính............................................................... 83
Hình 4.10: Chủng Bacillus sb. có catalase dương tính ............................................... .83
Hình 4.11: vi khuẩn Bacillus không sinh acid lactic ................................................... 84
Hình 4.12: mẫu vi khuẩn sinh acid lactic..................................................................... 84


Hình 4.13: Kiểm tra tính di động của vi khuẩn ........................................................... 85
Hình 4.14: Thử nghiệm kiểm tra khả năng lên men đường ......................................... 87
Hình 4.15: Kiểm tra khả năng sinh H2O2 .................................................................... 92
Hình 4.16: Thí nghiệm ủ E. coli và Salmonella với dịch nuôi cấy LAB ly tâm...................... 95

Hình 4.17: Thử nghiệm khả năng chịu acid .............................................................. 104
Đồ thi 4.1: Khả năng ức chế vi khuẩn E.coli
của dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic không trung hòa và sau khi trung hòa .................... 97
Đồ thi 4.2: khả năng ức chế vi khuẩn Salmonella

của dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic không trung hòa và sau khi trung hòa .................... 99
Đồ thị 4.3. Biểu điễn khả năng chịu muối mật của 3 chủng vi khuẩn... .................... 103
Đồ thị 4.4. Biểu điễn khả năng chịu acid của chủng Na8...... .................................... 105
Đồ thị 4.5. Biểu điễn khả năng chịu acid của chủng E2......... ................................. ..106
Đồ thị 4.6. Biểu điễn khả năng chịu acid của chủng Y1...... .................................... .106


GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Địa điểm nghiên cứu
Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm khoa Môi Trường và Công
Nghệ Sinh Hoc trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TPHCM.
3.2. Thời gian thực hiện
Đề tài được thực hiện từ ngày 5/04/2009 đến ngày 28/06/2010
3.3. Vật liệu
3.3.1. Thiết bị và dụng cụ
- Máy đo quang phổ (UV – Vis) specific 20 genesis (USA)
- Máy đo pH Horiba (Nhật Bản)
- Autoclave (Memmert – Đức),
- Kính hiển vi quang học Olympus – (Nhật Bản)
- Cân phân tích, cân kỹ thuật.
- Tủ cấy vô trùng, tủ ấm (Memmert – Đức), tủ sấy (Memmert – Đức)
- Pipetman 100 – 1000 l
- Bếp điện
- Bông thấm nước, bong không thấm nước
- Giấy lọc, lame, lamell…

- Cá dụng cụ thí nghiệm: becher, erlen, que cấy, đền cồn, bình định mức, ống đông,
becher, pipette, crucible, giấy lọc.

SVTH: Dương Thúy Vy

56


GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.3.2. Hóa chất
+ Các hóa chất dùng để pha các loại thuốc nhuộm : Tím kết tinh (Crystal violet),
ethanol 95%, ammonoxalat, iod, KI, thuốc nhuộm fushin, lục malachite, xanh metylen,
etanol, KOH, dung dịch acid carbolic, dung dịch acid tannic, FeCL3, formalin, NaOH,
AgNO3,NH4OH, H2O2, dung dịch Tetramethy-p-phenylene diamine dihydrochloride,
+ Các hóa chất dùng để pha môi trường MRS (phụ lục 5). Đây là môi trường
tổng hợp đặc hiệu cho việc nuôi cấy vi khuẩn lactic, tên đầy đủ là: de Man, Rogosa and
Sharpe (Robinson. 2007)
+ Thuốc thử Uffelmann: Cho 2% dung dịch phenol tinh chất vào trong nước.
thêm dung dịch FeCl3 cho tới khi dung dịch phenol chuyển thành màu tím.
+ Thuốc thử xanh bromophenol (BPB): 2 g BPB, bổ sung dần 5 ml NaOH 0,1M,
nghiền trong cối sứ, hòa với nước cất cho đủ 100 ml.
3.4. Phương pháp luận
Theo tiêu chí an tòan sinh học là trên hết, cho nên đề tài chủ yếu tiến hành phân
lập các vi khuẩn lên men lactic (LAB) vì chúng được xếp vào lọai GRAS (generally
recognized as safe).
Để phân lập trước hết cần chọn các nguồn vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men
truyền thống như nem, các loại sữa chua và các nguồn đã được nghiên cứu là có chứa hệ

vi sinh vật đường ruột để phân lập ra các chủng vi khuẩn lactic và phân lập bằng
phương pháp phân lập giống thuần khiết phổ biến trong phòng thí nghiệm vi sinh.
Như đã đề cập ở mục 2.3.4.1, việc định danh LAB chủ yếu dựa vào các phương
pháp cổ điển (như dựa vào hình thái, cấu trúc, sinh lý, sinh hóa) theo Bergey’s Manual
(Benson Lab Manual, 2001) cùng với việc kiểm tra khả năng lên men các loại đường
khác nhau và so sánh với khóa phân loại của Bergey để phân loại, định danh chúng đến
cấp giống (hình 3.1 và 3.2).
Chọn môi trường sử dụng trong suốt quá trình phân lập là môi trường MRS trong
đó có bổ sung thêm 0.02% natri azide (NaN3) do chất này gây ức chế quá trình hô hấp

SVTH: Dương Thúy Vy

57


GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

cho nên loại bỏ được các vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, làm tăng tính chọn lọc của môi
trường đối với LAB và giúp lọai bỏ phần lớn các vi khuẩn gây bệnh.
Mục tiêu của đề tài tài là phân lập vi khuẩn lactic mang hoạt tính probiotic. Vì
vậy để xác định những chủng đã phân lập có mang hoạt tính của một probiotics hay
không ta tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn của chúng bằng cách cho chúng đối
kháng trực tiếp với sinh vật chỉ thị là E. coli và Salmonella bằng phương pháp đo độ đục
(Turbidometric assay method).
Nếu xác định được các chủng phân lập được có tính kháng khuẩn cao thì đã đạt
được mục tiêu của đề tài.

Hình 3.1: Sơ đồ phân lọai vi khuẩn theo kết quả nhuộm Gram và hình thái

(theo khóa phân lọai của Bergey)

SVTH: Dương Thúy Vy

58


GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Hình 3.2: Sơ đồ các bước phân lập và định danh vi khuẩn lactic
Sữa chua

Sữa men sống

Môi trường thuận
lợi cho LAB

Nem chua

Tăng sinh trong MRS broth
Cấy truyền sang MRS agar

Loại bỏ vi khuẩn
kị khí bắt buộc

Phân lập giống thuần khiết

Cứt xu em bé

MRS bổ sung 0,02%
NaN3 loại vi khuẩn
hiếu khí bắt buộc
Quan sát hình thái
khuẩn lạc

Nhuộm Gram
Quan sát hình thái tế bào

Loại bỏ vi khuẩn Gram –
(E.coli, Salmonella…)

+
Loại VK sinh bào tử
hình que(Bacillus
spp.Clostrididium)

Hình cầu

Hình que
Nhuộm bào tử
_

Loại VK kháng acid
gây bệnh như
Mycobacterium…
Loại Arthrobacter
Corynebacterium
Propionibacterium

Loại VK sinh bào tử
hình cầu Sporosarcina

_

Nhuộm
kháng acid
Quan sát đều,
không đều
Đều
Catalase
Định_tính acid lactic
+
Kiểm tra khả năng di động

Vi khuẩn lên
men lactic

SVTH: Dương Thúy Vy

Lên men đường

59

Lên men đồng hình

Lên men dị hình

GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.5. Phương pháp thí nghiệm
3.5.1. Thu thập mẫu
Mẫu là những sản phẩm lên men có chứa vi sinh vật sống được dùng làm nguồn
phân lập vi khuẩn lactic gồm: sữa chua, sữa chua men sống, nem và từ cứt xu của em
bé. Mẫu được kí hiệu theo bảng sau:
Bảng 3.1: Bảng kí hiệu các nguồn phân lập
Nguồn phân lập
Sữa chua
Nem
Sữa chua men sống

Kí hiệu các nguồn

Tên sản phẩm

phân lập

Long Thành

L

Nem Đồng Tháp

Na

Nem Tiền Giang

Nb

Yakult

Y

Beta gen

B

Cứt xu em bé

E

Trong đó :
• Nem Đồng Tháp được mua tại Lai Vung, Đồng Tháp
• Nem Tiền Giang được mua tại Tiền Giang.
• Sữa chua men sống Yakult được công bố là có chứa vi khuẩn Lactobacillus casei
Shirota ở dạng sống.
• Cứt xu em bé được lấy từ em bé sau khi vừa sinh tại bệnh viện Từ Dũ, thành phố
Hồ Chí Minh.

SVTH: Dương Thúy Vy

60


GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.5.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic.
3.5.2.1. Tăng sinh
Mục đích: kích hoạt các vi khuẩn có trong mẫu phát triển lại bình thường vì
chúng có thể bị suy yếu trong quá trình bảo quản của các mẫu. Trong đó các vi khuẩn
lactic có khả năng phát triển nhiều hơn vì ta đã sử dụng môi trường chọn lọc đối với vi
khuẩn lactic (mục 3.4). Đồng thời đây cũng là bước đầu giúp thu lượng sinh khối vi
khuẩn phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
Môi trường sử dụng MRS broth có bổ sung 0,02% NaN3, đã khử trùng ở 1210C,
trong 15 phút.
Với các mẫu là dạng dịch như: sữa chua, sữa chua men sống, hút 1ml cho vào
ống nghiệm chứa khoảng 10ml MRS broth, còn lại đối với các với các mẫu là dạng rắn
lấy khoảng 2g, đánh tơi cho vào ống nghiệm chứa MRS broth.
Quấn màng PVC (màng bọc thực phẩm) quanh nấp ống nghiệm cho kín đem ủ ở
370C, 24 giờ.
.
3.5.2.2. Phân lập
Mục đích: tách các khuẩn lạc riêng lẻ khác nhau, giúp chọn lựa ra các chủng vi
khuẩn đồng nhất.
Các mẫu sau khi tăng sinh đem pha loãng tới độ pha loãng là 10-9
Gieo cấy mẫu để tách khuẩn lạc vi khuẩn riêng rẽ: sử dụng môi trường phân lập
là môi trường MRS agar. Tiến hành cấy trang ở các độ pha loãng từ 10-5 ÷ 10-9 kết hợp
với phương pháp cấy ria để tách các khuẩn khác nhau, sau đó cấy truyền các khuẩn lạc
đã đồng nhất vào các ống thạch nghiêng ủ ở 370C, 24 giờ, bảo quản ống giống ở nhiệt
độ 40C

SVTH: Dương Thúy Vy

61

GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.5.3. Các thí nghiệm dùng để định danh vi khuẩn lactic.
3.5.3.1. Nhuộm Gram
Mục đích: giúp ta phân biệt vi khuẩn thành 2 nhóm lớn: vi khuẩn G+ (Grampositive) bắt màu tím và vi khuẩn G- (Gram-negative) bắt màu hồng. Ngoài ra nhuộm
Gram cho phép ta quan sát rõ hình thái tế bào hơn so với soi vi khuẩn sống.
Sau khi thu được các chủng vi khuẩn đồng nhất, ta tiến hành nhuộm Gram và loại
bỏ các vi khuẩn Gram âm, giúp sàng lọc ra các vi khuẩn Gram dương có khả năng là vi
khuẩn lactic.
3.5.3.2. Nhuộm bào tử .
Mục đích: Dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử : dày, chắc, khó bắt màu,
chứa nhiều lipit. Trước hết xử lý để tế bào chất bào tử dễ bắt màu bằng nhiệt và axit.
Nhuộm màu cả tế bào chất của bào tử và tế bào bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh.
Tẩy màu tế bào chất của tế bào và nhuộm nó bằng thuốc nhuộm khác bổ sung. Nhờ đó
tế bào chất của bào tử và tế bào chất tế bào bắt màu phân biệt. Trong đó bào tử sẽ có
màu xanh và tế bào có màu đỏ.
Các vi khuẩn Gram dương thu được từ bước trên được tiếp tục kiểm tra khả năng
sinh bào tử. Sử dụng sinh khối vi khuẩn khi đã già để nhuộm bào tử. Từ kết quả thu
được ta loại bỏ các chủng có bào tử, do LAB là vi khuẩn Gram dương nhưng không sinh
bào tử.
3.5.3.3. Nhuộm kháng acid
Vi khuẩn kháng acid có vỏ bên ngoài chống được cồn và acid nên nó vẫn giữ
màu nhuộm sau khi bị xử lý với dung dịch cồn và acid, vì vậy nó được phân loại là vi
khuẩn kháng acid. Còn những vi khuẩn không mang đặc tính kháng acid màu nhuộm
ban đầu sẽ bị rửa trôi và bắt màu thuốc nhuộm bổ xung. Trong đó vi khuẩn kháng acid
sẽ bắt màu đỏ. Vi khuẩn không kháng acid bắt màu xanh

Mục đích: nhuộm kháng acid để loại bỏ những vi khuẩn kháng acid như
Mycobacterium. Chúng không phải là vi khuẩn lactic mà ta mong muốn vì chúng là
những chủng có khả năng gây bệnh cho người. Các chủng phân lập là Gram dương
SVTH: Dương Thúy Vy

62


GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

không sinh bào tử được tiếp tục tiến hành nhuộm kháng acid. Từ kết quả thí nghiệm, ta
chỉ giữ lại những vi khuẩn không có khả năng kháng acid.
3.5.3.4. Thử nghiệm catalasa.
Mục đích: kiểm tra khả năng phân huỷ H2O2 tạo ra O2 của vi sinh vật nhờ sản
sinh ra enzyme catalasa.
Các chủng vi khuẩn thu được sau bước nhuộm kháng acid được tiến hành thử
nghiệm catalase. Nếu thấy sủi bọt là dương tính, không sủi bọt là âm tính. Có thể nhỏ
trực tiếp dung dịch H2O2 lên khuẩn lạc trên thạch đĩa để ghi nhận kết quả. Trong thí
nghiệm này, chỉ có những chủng vi khuẩn cho catalase âm tính là có khả năng là vi
khuẩn lactic.
3.5.3.5. Thử nghiệm khả năng sinh acid.
Mục đích: kiểm tra khả năng sinh acid của vi khuẩn trong quá trình trao đổi chất
của chúng.
Trong thí nghiệm này các chủng cho catalase âm tính thu được từ bước trên sẽ
được kiểm tra với thuốc thử Uffelmann. Các chủng phân lập là vi khuẩn lactic khi
chúng tạo acid lactic và làm đổi màu tím của thuốc thử thành màu vàng nhạt.
3.5.3.6. Thử nghiệm khả năng di động.
Mục đích: Xác định khả năng di động của vi sinh vật trong môi trường thạch

mềm 0.5-0.7% agar.
Vì vi khuẩn lactic không có khả năng di động, chỉ mọc theo đường cấy thẳng
đứng trong ống chứa môi trường thạch mềm và không làm đục môi trường xung quanh
nên trong thí nghiệm này ta sẽ loại bỏ được các vi khuẩn di động không phải là vi khuẩn
lactic, chúng sẽ mọc lan ra khỏi đường cấy và làm đục môi trường xung quanh.
3.5.3.7. Thử nghiệm khả năng lên men đường và khả năng sinh khí
* Mục đích: kiểm tra vi sinh vật có khả năng lên men các loại đường nào. Các loại
đường được sử dụng là: glucose, lactose, saccharose, maltose và mannitol. Kết quả từ

SVTH: Dương Thúy Vy

63


GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

thí nghiệm này giúp ta định danh đến cấp giống các chủng vi khuẩn lactic phân lập được
dựa theo khóa phân loại của Bergey
* Tiến hành:
- Môi trường MRS broth với lượng đường glucose lần lựơc thay thế bằng các loại
đường cần kiểm tra.
- Đặt vào mỗi ống nghiệm 1 ống nhỏ (ống Durham) lộn ngược đầu để hứng khí
CO2 sinh ra nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường. Khử trùng trong 15 phút ở
1210C..
- Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá vào các ống nghiệm, đặt ở 37 0C, theo dõi hiện
tượng sinh axit sau 1-3 ngày. Trường hợp dùng nút bông cần quấn bằng màng PVC
(màng bọc thực phẩm) để bịt kín miệng ống nghiệm
* Kết quả:

- Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường (sinh axit) chất chỉ thị xanh
bromophenol (BPB) sẽ chuyển màu đỏ.
- Nếu có bọt khí bên trong ống durham thì chủng vi khuẩn đó lên men có sinh khí
- Đối với những ống nghiệm không có bọt khí trong ống durham thì ta cần kiểm
tra lại bằng cách đốt đỏ que cấy và đặt sát bề mặt môi trường, nếu thấy có bọt khí nổi
lên thì chủng vi khuẩn đó cũng lên men có sinh khí
3.6. Thử nghiệm khả năng sinh H2O2
* Mục đích : kiểm tra khả năng sinh , là một chất tham gia vào hoạt động kháng khuẩn
của của vi sinh vật.
* Nguyên tắc : H2O2 là một chất vưa có tính khử vừa có tính oxy hóa
Trong môi trường acid, H2O2 có tính oxy hóa mạnh, khi tác dụng với chất khử KI
tạo ra I2 , nhận biết phản ứng bằng cho thêm hồ tinh bột
H2O2 + 2KI

I2 + 2KOH

* Tiến hành :
- Nuôi ủ các chủng vi khuẩn trong môi trường lỏng 24 giờ

SVTH: Dương Thúy Vy

64


GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

- Lấy mỗi mẫu 5ml dịch nuôi cấy, thêm 1ml H2SO4 1M và 1ml KI, sau đó thêm 3
giọt hồ tinh bột . Quan sát sự chuyển màu và ghi kết quả.

* Kết quả:
- Dung dịch chuyển thành màu xanh tím : có H2O2
- Dung dịch không đổi màu : không có H2O2.
3.7. Thử nghiệm khả năng kháng vi sinh vật bằng phương pháp đo độ đục
(turbidimetric method).
* Mục đích:
Những vi sinh vật mang đặc tính probiotic phải là những sinh vật có khả năng ức
chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh nên trong thí nghiệm này cần phải kiểm tra khả
năng ức chế sự phát triển vi khuẩn gây bệnh của những chủng vi khuẩn LAB phân lập
được nhằm tuyển chọn những chủng mang đặc tính probiotic trong đó vi khuẩn E. coli
và Salmonella được chọn làm vi sinh vật chỉ thị.
* Nguyên tắc:
Khi một pha lỏng có chứa nhiều phân tử không tan sẽ tạo thành một hệ huyền
phù và có độ đục bởi các phân tử hiện diện trong môi trưởng lỏng cản ánh sáng, làm
phân tán chùm ánh sáng tới. Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong
môi trường cũng làm cho môi trường trở nên đục. Độ đục của huyền phù tỉ lệ thuận với
mật độ tế bào. Do đó, thông qua việc đo độ đục bằng máy quang phổ kể ở bước sóng
610nm của dịch huyền phù tế bào ta có thể định tính được mật độ vi sinh vật ở điều kiện
cần khảo sát
Dựa trên khả năng kháng khuẩn của các sản phẩm trao đổi chất của LAB đối với
vi sinh vật chỉ thị trong môi trường lỏng. Vi sinh vật chỉ thị bị ức chế tăng trưởng dẫn
đến nồng độ tế bào giảm so với đối chứng
Ống đối chứng là sự phát triển bình thường của VK chỉ chị E. coli. Ống kiểm tra
là ống có chứa dịch nuôi LAB đã ly tâm, nếu vi khuẩn LAB có tính kháng khuẩn thì
ống kiểm tra sẽ có mật độ tế bào thấp hơn ống đối chứng.
SVTH: Dương Thúy Vy

65

GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Thí nghiệm được tiến hành với 2 nghiệm thức :
+ Nghiệm thức 1: xác định hoạt tính dựa trên sự ức chế vi khuẩn chỉ thị E.coli và
Salmonella bằng các chất được sinh ra trong quá trình trao đổi chất của các chủng LAB.
+ Nghiệm thức 2 : xác định hoạt tính dựa trên sự ức chế vi khuẩn chỉ thị E.coli và
Salmonella bằng các chất sinh ra trong quá trình trao đổi chất của các chủng LAB
nhưng đã được loại bỏ yếu tố acid lactic bằng cách trung hòa bằng dung dịch NaOH 1N.
* Chuẩn bị :
Dịch nuôi cấy E.coli và Salmonella (ủ 21h, 370C) pha loãng 10-2 tương ứng nồng
độ tế bào 105 tế bào/ml.
Dịch nuôi cấy LAB trong MRS broth ủ kị khí 18- 24h, ở 37oC , mang 1 nửa đi
trung hòa về pH 6 bằng NaOH 1N, thanh trùng ở 80oC trong 10 phút, sau đó ly tâm
4000 vòng/ phút trong 15 phút, loại bỏ sinh khối.
*Cách thực hiện:
Ống thí nghiệm : gồm 1 ml dịch nuôi cấy E.coli hoặc Salmonella nồng độ 105 tế
bào/ml với 1 ml dịch ly tâm LAB (trung hòa hoặc không trung hòa), bổ sung 8 ml môi
trường cao thịt-peptone. Ủ hiếu khí 37oC, 24 giờ .
Ống đối chứng : giống ống thí nghiệm, nhưng 1 ml dịch ly tâm LAB được thay
bằng 1ml MRS broth đã tiệt trùng.
Ống trắng : gồm 9ml môi trường cao thịt-peptone và 1ml MRS broth đã tiệt
trùng.
Tiến hành đo độ đục của tất cả các ống bằng máy quang phổ kế ở bước sóng
610nm.
* Công thức tính toán:
Tỉ lệ sống sót của VSV chỉ thị (%) = ODTN/ODĐC*100
% OD = ODĐC / ODTN * 100%
Như vậy với %OD càng nhỏ thì khả năng kháng vi sinh vật của chủng đó càng

cao.
Trong đó : ODĐC : giá trị OD của ống đối chứng
SVTH: Dương Thúy Vy

66


GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

ODTN : giá trị OD của ống thí nghiệm.
% vi sinh vật chỉ thị bị ức chế được tính như sau:
D% = 100% - %OD , thể hiện khả năng kháng vi sinh vật của chủng đó, D% càng
lớn, khả năng kháng vi sinh vật càng cao.
Chú ý: kết quả thu được là số liệu trung bình của 3 lần lặp lại với mức ý nghĩa thống kê
95%.
3.8. Thử nghiệm khả năng chịu acid và muối mật
3.8.1. Khả năng chịu acid :
Bên trong hệ tiêu hóa của chúng ta dạ dày là nơi có pH rất thấp do và ruột thường
rất thấp (pH<3) do sự có mặt của acid như acid hydrochloric nhằm tạo điều kiện acid
cho các protease hoạt đông tiêu hóa thức ăn. Chính vì vậy các vi khuẩn probiotics cần
phải chịu được điều kiện pH thấp trong 1 thời gian nhất định để có thể đi qua dạ dày tới
ruột và phát huy được tác dụng probiotics của mình.
Để kiểm tra khả năng này, người ta nuôi cấy các vi khuẩn probiotics trên môi
trường MRS với điều kiện pH là 2, 3, 4, 5 và đối chứng trên môi trường MRS thông
thường có pH = 6.5 - 7. Do môt trường MRS có màu nâu tương đối đậm nên muốn thu
kết quả chính xác ta cần phải tiến hành ly tâm và thu sinh khối vi khuẩn vào trong nước
muối sinh lý với thể tích tương ứng để đo quang xác định mật độ của tế bào ở bước sóng
là 610 nm.

3.8.2. Khả năng chịu muối mật
Có 2 loại muối mật là glycochalat natri và taruocholat natri. Muối mật có chức
năng quan trọng trong việc tiêu hóa và hấp thu lipid ở ruột non kéo theo sự hấp thu các
vitamin tan trong lipid như A, D, E, K. Vì thế muối mật có ảnh hưởng đến vi sinh vật do
tác động lên màng phospholipid của chúng. Khi xuống đến hồi tràng, 95% muối mật
được tái hấp thu rồi theo tĩnh mạch chủ trở về gan và được tái bài tiết, gọi là chu trình
ruột gan. Còn 5% muối mật được đào thải theo phân có tác dụng giữ nước trong phân và
duy trì nhu động ruột già. Chính vì thế mà khả năng chịu được muối mật cũng là một
SVTH: Dương Thúy Vy

67


GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

điều kiện để đánh giá hoạt tính của probiotics. Nó cũng phản ánh khả năng sống sót của
các chủng probiotic bên trong đường ruột
Để kiểm tra khả năng này, ta sử dụng mật bò (oxbile, Merck) và tương tự như
kiểm tra khả năng chịu pH thấp, cũng nuôi cấy vi khuẩn probiotic trong môi trường
MRS có bổ sung 0,3% muối mật và đối chứng trên môi trường MRS thông thường. Tiến
hành ủ 24 giờ trong tủ ấm 370C, sau đó ly tâm thu sinh khối và đem đo quang ở bước
sóng 610 nm để khảo sát mật độ tế bào.

SVTH: Dương Thúy Vy

68

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KẾT LUẬN

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
4.1. Phân lập vi khuẩn lên men lactic:
Việc phân lập vi khuẩn lactic được tiến hành trên nhiều nguồn khác nhau. Các
nguồn phân lập chủ yếu là các loại thực phẩm lên men truyền thống như sữa chua và
nem chua. Đây là những nguồn phổ biến đã được sử dụng trong rất nhiều đề tài phân
lập hay nghiên cứu về vi khuẩn lactic, và cụ thể hơn là các nguồn được chọn lựa để phân
lập trong đề tài này hoàn toàn khác với các nguồn đã được chọn trong đề tài tốt nghiệp
“PHÂN LẬP CÁC VI KHUẨN LACTIC CÓ NGUỒN GỐC THỰC PHẨM VÀ DƯỢC
PHẨM MANG HOẠT TÍNH PROBIOTIC” của khóa 2005, khoa Môi Trường và Công
Nghệ Sinh Học, Hutech. Nguồn phân lập được chọn ở đây là các sản phẩm mới, có
nguồn gốc, xuất xứ và mang tính địa phương khác nhau với mong muốn thu thập được
những chủng vi khuẩn lactic mới, đóng góp thêm vào bộ sưu tập giống.
Cùng với việc chọn lựa từ những nguồn mới, việc phân lập cũng tiến hành trên
các sản phẩm lên men đã được công nhận và tận dụng những kết quả nghiên cứu có sẵn
với ý nghĩa chắc chắn có sự hiện diện của vi khuẩn lactic với sự đảm bảo của nhà sản
xuất như các sản phẩm sữa chua uống men sống yakult được công bố là có chứa lợi
khuẩn Lactobacillus casei Shirota ở dạng sống do tiến sĩ Nhật Bản Minoru Shirota
(1899-1982) nuôi cấy được vào năm 1930. Một nguồn phân lập khác nữa là từ phân của
trẻ sơ sinh đã được nghiên cứu là có chứa hệ vi khuẩn đường ruột sống do cơ thể trẻ
nhận được trong lúc quá trình bào thai và sau khi bú sữa mẹ (Rocío Martín et al, 2003),
(E. Vlková et al, 2003), (J. Agric, 2002).
Môi trường sử dụng để phân lập là MRS agar là môi trường chọn lọc chứa nhiều
thành phần thích hợp với sự tăng trưởng của vi khuẩn lactic (DeMan et al., 1960).
Ở vi khuẩn khi ta nuôi cấy ở điều kiện kỵ khí ta sẽ loại bỏ được vi khuẩn hiếu khí
và ngược lại. Vi khuẩn lactic là vi khuẩn kỵ khí chịu oxy (aerotolerant organisms) và
không hô hấp nên để tăng khả năng chọn lọc, nên em đã bổ sung natri azide (NaN3) vào

môi trường MRS với nồng độ 0.02% nhằm ức chế vi khuẩn hiếu khí và tăng điều kiện
SVTH: Dương Thúy Vy

69


GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KẾT LUẬN

kỵ khí bằng cách dán kín các đĩa pettri bằng màng nhựa PVC. Vi khuẩn xuất hiện trên
đĩa thạch với các khuẩn lạc màu trắng, nhỏ (Sharpe, 1979) sẽ được chọn (hình 4.1). Từ
đó em đã chọn lựa và nuôi cấy được 38 chủng có hình thái khuẩn lạc đồng nhất có khả
năng là vi khuẩn lactic.
Các chủng tuyển chọn được kí hiệu theo bảng 4.1 .

Hình 4.1: Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn lactic
Bảng 4.1: Bảng kí hiệu các chủng vi khuẩn phân lập.
Sản phẩm
Nem

Tên sản phẩm

Kí hiệu các chủng phân lập

Nem Đồng Tháp

Na1, Na2, Na3, Na4, Na5,
Na6, Na7, Na8

Nem Tiền Giang

Nb1, Nb2, Nb3, Nb5, Nb8,
Nb9, Nb10, Nb11

Sữa

chua Yakult

men sống
Sữa chua

Y1

Beta gen

B1, B2, B3

Probi (Vinamilk)

P1, P2

Long Thành

L1, L2, L3

Cứt xu em bé

E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7,
E8, E9, E10

SVTH: Dương Thúy Vy

70


GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KẾT LUẬN

4.2. Định danh các chủng phân lập
Sau khi đã có được các chủng vi khuẩn đồng nhất, em tiến hành định danh các
chủng phân lập bằng phương pháp cổ điển: khảo sát hình thái, sinh lý và sinh hóa như
đã nêu ở mục 2.3.4
4.2.1. Nhuộm Gram
Vi khuẩn lactic là vi khuẩn Gram dương nên bước đầu tiên tiến hành định danh
chúng ta tiến hành nhuộm Gram đối với các tế bào còn non (trong khoảng 24 giờ nuôi
cấy) vì khi già vi khuẩn lactic đều trở thành Gram âm.
Khi tiến hành nhuộm Gram, trước tiên tiến hành nhuộm hai chủng biết trước là
vi khuẩn Bacillus subtilis Gram dương (hình 4.2) và vi khuẩn E. coli Gram âm (hình
4.3) có ở phòng thí nghiệm để làm đối chứng. Sau đó tiến hành nhuộm Gram 38 chủng
đã phân lập và dựa vào mẫu đối chứng để kết luận.
Trong số 38 chủng phân lập, 5 chủng thể hiện Gram âm (Na7, Nb9, L3, E5, E7).
10/30 chủng Gram dương còn lại có hình thái, kích thước tế bào trùng với các chủng
khác có cùng nguồn, nên số chủng Gram dương rút xuống còn 23.
Ở bước nhuộm Gram này ta đã tăng tính an toàn cho các chủng vi khuẩn được
chọn vì đã loại bỏ một số chủng vi khuẩn gây bệnh là Gram âm ví dụ như vi khuẩn E.
coli.

Hình 4.3: Vi khuẩn E. coli

Gram âm bắt màu đỏ

Hình 4.2: Vi khuẩn Bacillus subtilis
Gram dương bắt màu tím.

SVTH: Dương Thúy Vy

71