Nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất từ một số loài cây thuộc họ asteraceae và họ zingiberaceae
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (5.7 MB, 230 trang )
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------------------------------
TRẦN THỊ THANH NHÀN
NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC
VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC HỢP CHẤT
TỪ MỘT SỐ LOÀI CÂY THUỘC HỌ ASTERACEAE
VÀ HỌ ZINGIBERACEAE
LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
Hà Nội – 2014
1
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------------------------------
TRẦN THỊ THANH NHÀN
NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC
VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC HỢP CHẤT
TỪ MỘT SỐ LOÀI CÂY THUỘC HỌ ASTERACEAE
VÀ HỌ ZINGIBERACEAE
Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ
Mã số: 62 44 27 01
LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
1. PGS. TS. PHAN MINH GIANG
2. GS. TSKH. PHAN TỐNG SƠN
Hà Nội – 2014
2
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chƣa đƣợc công bố
trong bất kì công trình nào khác.
Tác giả luận án
Trần Thị Thanh Nhàn
3
LỜI CẢM ƠN
Luận án này đƣợc hoàn thành tại Phòng thí nghiệm Hóa học các Hợp chất
thiên nhiên, Bộ môn Hóa học Hữu cơ, Khoa Hóa học, Trƣờng Đại học Khoa học
Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Phan Minh Giang,
ngƣời đã giao đề tài, tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi
trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận án.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS. TSKH. Phan Tống Sơn,
ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành
luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn nhà thực vật học TS. Nguyễn Quốc Bình, Viện
sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
đã giúp giám định và thu thập các mẫu thực vật.
Tôi xin cảm ơn ThS. Đặng Vũ Lƣơng, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam đã giúp ghi các phổ NMR, và PGS. TS. Lê Mai
Hƣơng, Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam đã giúp thử nghiệm các hoạt tính sinh học.
Tôi xin cảm ơn GS. TS. Hideaki Otsuka và GS. TS. Katsuyoshi
Matsunami, Viện Sau Đại học các Khoa học Y Sinh và Sức khỏe, Đại học tổng
hợp Hiroshima (Nhật Bản) đã giúp ghi các phổ khối lƣợng phân giải cao.
Tôi xin cảm ơn các thầy giáo, cô giáo, các cán bộ nhân viên cùng toàn thể
các bạn đồng nghiệp trong Bộ môn Hóa học Hữu cơ và Khoa Hóa học về sự giúp
đỡ nhiệt tình trong thời gian tôi thực hiện luận án.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến những ngƣời thân trong
gia đình đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt giai
đoạn học tập và nghiên cứu này.
Tác giả
Trần Thị Thanh Nhàn
4
MỤC LỤC
Trang
LỜI MỞ ĐẦU
1
Chƣơng 1 TỔNG QUAN
4
1.1 THỰC VẬT HỌC, NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH
SINH HỌC CÁC LOÀI ARTEMISIA (ASTERACEAE)
4
1.1.1 Vài nét về thực vật học chi Artemisia
4
1.1.2 Nghiên cứu hóa học chi Artemisia
4
1.1.2.1 Các hợp chất tecpenoit
1.2
4
1.1.2.1.1 Các monotecpen từ tinh dầu
4
1.1.2.1.2 Các sesquitecpen và sesquitecpen lacton
7
1.1.2.2 Các flavonoit và các chất khác
14
1.1.2.3 Các hợp chất acetylenic
18
1.1.3 Nghiên cứu hoạt tính sinh học các loài Artemisia
20
1.1.4 Công dụng của các loài Artemisia trong y dƣợc học
24
THỰC VẬT HỌC, NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH
SINH HỌC CÁC LOÀI CURCUMA (ZINGIBERACEAE)
25
1.2.1 Vài nét về thực vật học chi Curcuma
25
1.2.2 Nghiên cứu hóa học chi Curcuma
26
1.2.2.1 Các hợp chất tecpenoit
26
1.2.2.2 Các điarylheptanoit và các chất khác
30
1.2.3 Nghiên cứu hoạt tính sinh học các loài Curcuma
35
1.2.4 Công dụng của các loài Curcuma trong y dƣợc học
39
1.3 TỔNG QUAN VỀ CÁC CÂY NGHIÊN CỨU TRONG LUẬN ÁN
40
1.3.1 Cây Ngải rừng (Artemisia roxburghiana Bess., họ Cúc Asteraceae)
40
1.3.2 Cây Thanh cao Bắc Bộ (Artemisia dubia Wall. ex. Bess. var.
longeracemosa Pamp. forma tonkinensis Pamp., họ Cúc Asteraceae)
40
1.3.3 Cây Nghệ Quảng Tây (Curcuma kwangsiensis S. G. Lee et C.
5
F. Liang, họ Gừng - Zingiberaceae)
41
Chƣơng 2 PHƢƠNG PHÁP VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
43
2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
43
2.2 CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH, PHÂN TÁCH CÁC HỖN HỢP
VÀ PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT
43
2.2.1 Phƣơng pháp chiết hai pha lỏng
43
2.2.2 Sắc ký lớp mỏng (TLC)
43
2.2.3 Sắc ký cột
44
2.2.4 Sắc ký rây phân tử
44
2.2.5 Chiết pha rắn trên pha đảo
44
2.2.6 Phƣơng pháp kết tinh lại
45
2.3 CÁC PHƢƠNG PHÁP KHẢO SÁT CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT
45
2.3.1 Điểm nóng chảy
45
2.3.2 Độ quay cực
45
2.3.3 Các phƣơng pháp phổ
45
2.4 PHƢƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC
46
Chƣơng 3 PHẦN THỰC NGHIỆM
47
3.1 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY NGẢI RỪNG
(ARTEMISIA ROXBURGHIANA BESS.)
47
3.1.1 Nguyên liệu thực vật
47
3.1.2 Điều chế các phần chiết từ lá cây Ngải rừng
47
3.1.3 Phân tích các phần chiết lá cây Ngải rừng bằng sắc ký lớp
mỏng
49
3.1.4 Phân tách các phần chiết lá cây Ngải rừng
49
3.1.4.1 Phân tách phần chiết n-hexan (ARH)
49
3.1.4.2 Phân tách phần chiết điclometan (ARD)
52
3.1.4.3 Phân tách phần chiết etyl axetat (ARE)
56
3.1.5 Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập
đƣợc từ lá cây Ngải rừng
57
3.2 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY THANH CAO
6
BẮC
BỘ
(ARTEMISIA
DUBIA
WALL.
EX
BESS.
VAR.
LONGERACEMOSA PAMP. FORMA TONKINENIS PAMP.)
64
3.2.1 Nguyên liệu thực vật
64
3.2.2 Điều chế các phần chiết từ lá cây Thanh cao Bắc Bộ
64
3.2.3 Phân tích các phần chiết lá cây Thanh cao Bắc Bộ bằng sắc
ký lớp mỏng
66
3.2.4 Phân tách các phần chiết lá cây Thanh cao Bắc Bộ
66
3.2.4.1 Phân tách phần chiết n-hexan (ADH)
66
3.2.4.2 Phân tách phần chiết điclometan (ADD)
69
3.2.5 Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập
đƣợc từ lá cây Thanh cao Bắc Bộ
71
3.3 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY NGHỆ QUẢNG
TÂY (CURCUMA KWANGSIENSIS S. G. LEE et C. F. LIANG)
75
3.3.1 Nguyên liệu thực vật
75
3.3.2 Điều chế các phần chiết từ thân rễ cây Nghệ Quảng Tây
76
3.3.3 Phân tích các phần chiết thân rễ cây Nghệ Quảng Tây bằng
sắc ký lớp mỏng
78
3.3.4 Phân tách các phần chiết thân rễ cây Nghệ Quảng Tây
78
3.3.4.1 Phân tách phần chiết điclometan (CKD)
78
3.3.4.2 Phân tách phần chiết etyl axetat (CKE)
80
3.3.5 Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập
đƣợc từ thân rễ cây Nghệ Quảng Tây
83
3.4 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH
85
Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
88
4.1 NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CÂY NGẢI RỪNG (ARTEMISIA
ROXBURGHIANA BESS.)
88
4.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu
88
4.1.2 Chiết và phân tách các phần chiết từ lá cây Ngải rừng
88
4.1.3 Xác định cấu trúc các hợp chất đƣợc phân lập từ lá cây Ngải
rừng
88
7
4.2 NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CÂY THANH CAO BẮC BỘ
(ARTEMISIA DUBIA WALL. EX BESS. VAR. LONGERACEMOSA
PAMP. FORMA TONKINENSIS PAMP.)
110
4.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu
110
4.2.2 Chiết và phân tách các phần chiết từ lá cây Thanh cao Bắc Bộ
110
4.2.3 Xác định cấu trúc các hợp chất đƣợc phân lập từ lá cây Thanh
cao Bắc Bộ
111
4.3 NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CÂY NGHỆ QUẢNG TÂY (CURCUMA
KWANGSIENSIS S. G. LEE et C. F. LIANG)
4.3.1 Đối tƣợng nghiên cứu
122
123
4.3.2 Chiết và phân tách các phần chiết từ thân rễ cây Nghệ Quảng
Tây
123
4.3.3 Xác định cấu trúc các hợp chất đƣợc phân lập từ thân rễ cây
Nghệ Quảng Tây
123
4.4 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC
133
KẾT LUẬN
134
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ ĐƢỢC CÔNG
BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
136
TÀI LIỆU THAM KHẢO
137
PHỤ LỤC
150
8
DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ BẢNG
Trang
Sơ đồ 1
Qui trình điều chế các phần chiết từ lá cây Ngải rừng
48
Sơ đồ 2
Phân tách phần chiết n-hexan (ARH)
50
Sơ đồ 3
Phân tách phần chiết điclometan (ARD)
54
Sơ đồ 4
Phân tách phần chiết etyl axetat (ARE)
57
Sơ đồ 5
Qui trình điều chế các phần chiết từ lá cây Thanh cao Bắc
Bộ
65
Sơ đồ 6
Phân tách phần chiết n-hexan (ADH)
67
Sơ đồ 7
Phân tách phần chiết điclometan (ADD)
70
Sơ đồ 8
Qui trình điều chế các phần chiết từ thân rễ cây Nghệ Quảng
Tây
77
Sơ đồ 9
Phân tách phần chiết điclometan (CKD)
79
Sơ đồ 10
Phân tách phần chiết etyl axetat (CKE)
81
Bảng 4.1
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
133
9
DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1
Cây Ngải rừng
40
Hình 1.2
Cây Thanh cao Bắc Bộ
41
Hình 1.3
Cây Nghệ Quảng Tây
42
Hình 4.1
Các tƣơng tác HMBC () và NOESY () quan trọng của
92
AR3
Hình 4.2
Các tƣơng tác HMBC () và NOESY () quan trọng của
AR15
104
Hình 4.3
Các tƣơng tác HMBC () và NOESY () của AR17
107
Hình 4.4
Các hợp chất đƣợc phân lập từ cây Ngải rừng
109
Hình 4.5
Các tƣơng tác NOESY () và HMBC () của AD12
120
Hình 4.6
Các hợp chất đƣợc phân lập từ cây Thanh cao Bắc Bộ
122
Hình 4.7
Các tƣơng tác 1H-1H COSY () và HMBC () của CK3
126
Hình 4.8
Các tƣơng tác NOESY () quan trọng của CK3
126
Hình 4.9
Các tƣơng tác 1H-1H COSY () và HMBC () của CK4
128
Hình 4.10
Các tƣơng tác NOESY () quan trọng của CK4
129
Hình 4.11
Các tƣơng tác NOESY () và HMBC () của CK5
131
Hình 4.12
Các hợp chất đƣợc phân lập từ cây Nghệ Quảng Tây
132
10
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
DÙNG TRONG LUẬN ÁN
Các phƣơng pháp sắc ký
CC
: Sắc ký cột (Column Chromatography)
FC
: Sắc ký cột nhanh (Flash Chromatography)
Mini-C
: Sắc ký cột tinh chế (Mini-Column Chromatography)
GC-MS
:
Sắc
ký
khí-Khối
phổ
(Gas
Chromatography-Mass
Chromatography)
TLC
: Sắc ký lớp mỏng (Thin-Layer Chromatography)
RP-18
: Sắc ký cột pha đảo C-18 (C-18 Reversed Phase Column
Chromatography)
RP-SPE
: Chiết pha rắn trên pha đảo (Reversed Phase-Solid Phase
Extraction)
: Sắc ký rây phân tử (Size Exclusion Chromatography)
SEC
Các phƣơng pháp phổ
UV
: Phổ tử ngoại (Ultra Violet spectroscopy)
IR
: Phổ hồng ngoại (InfraRed spectroscopy)
CD
: Phổ nhị sắc tròn (Circular Dichroism Spectrometry)
MS
: Phổ khối lƣợng (Mass Spectrometry)
ESI-MS
: Phổ khối lƣợng ion hóa phun bụi điện tử (ElectroSpray
Ionization Mass Spectrometry)
APCI-MS
: Phổ khối lƣợng ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển
(Atmospheric-Pressure
Chemical
Ionization
Mass
Spectrometry)
HR-MS
: Phổ khối lƣợng phân giải cao (High-Resolution Mass
Spectrometry)
NMR
: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy)
1
H-NMR
: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear Magnetic
Resonance Spectroscopy)
11
13
C-NMR
: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân cacbon-13 (Carbon-13 Nuclear
Magnetic Resonance Spectroscopy)
: Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation
DEPT
Tranfer)
2D NMR
: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân hai chiều (Two-dimensional
Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)
COSY
: Phổ COSY (COrrelation SpectroscopY)
HSQC
: Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence)
HMBC
: Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Coherence)
NOESY
: Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Exchange SpectroscopY)
δ (ppm)
: Độ dịch chuyển hóa học (parts per million)
J (Hz)
: Hằng số tƣơng tác (Hertz)
s
: singlet
d
: doublet
t
: triplet
br
: pic tù
q
: quartet
m
: multiplet
Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học
IC50
: Nồng độ ức chế 50% (50% Inhibitory Concentration)
MIC
: Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration)
VSVKĐ : Vi sinh vật kiểm định
Các dung môi
EtOAc
: Etyl axetat
MeOH
: Metanol
Các ký hiệu khác
đ.n.c.
: điểm nóng chảy
12
DANH SÁCH CÁC PHỤ LỤC PHỔ
Phụ lục 1.
Phụ lục 2.
Phụ lục 3.
Phụ lục 4.
Phụ lục 5.
Phụ lục 6.
Phụ lục 7.
Phụ lục 8.
Phụ lục 9.
Phụ lục 10.
Phụ lục 11.
Phụ lục 12.
Phụ lục 13.
Phụ lục 14.
Phụ lục 15.
Phụ lục 16.
Phụ lục 17.
Phụ lục 18.
Phụ lục 19.
Phụ lục 20.
Phụ lục 21.
Phụ lục 22.
Phụ lục 23.
Phụ lục 24.
Phụ lục 25.
Phụ lục 26.
Phụ lục 27.
Phụ lục 28.
Phụ lục 29.
Phụ lục 30.
Phụ lục 31.
Phụ lục 32.
Phụ lục 33.
Phụ lục 34.
Phụ lục 35.
Phụ lục 36.
Phụ lục 37.
Phổ 1H-NMR của AR1
Phổ 1H-NMR của AR2
Phổ IR của AR3
Phổ (+)-HR-ESI-MS của AR3
Phổ 1H-NMR của AR3
Phổ 13C-NMR của AR3
Phổ DEPT của AR3
Phổ NOESY của AR3
Phổ HMBC của AR3
Phổ HSQC của AR3
Phổ 1H-NMR của AR4
Phổ IR của AR5
Phổ (+)-ESI-MS của AR6/AR7
Phổ 1H-NMR của AR6/AR7
Phổ 13C-NMR của AR6/AR7
Phổ DEPT của AR6/AR7
Phổ 1H-NMR của AR8
Phổ 13C-NMR của AR8
Phổ DEPT của AR8
Phổ 1H-NMR của AR9
Phổ IR của AR10/AR11
Phổ (−)-ESI-MS của AR10/AR11
Phổ 1H-NMR của AR10/AR11
Phổ 13C-NMR của AR10/AR11
Phổ DEPT của AR10/AR11
Phổ 1H-NMR của AR12
Phổ 1H-NMR của AR13
Phổ 13C-NMR của AR13
Phổ DEPT của AR13
Phổ 1H-NMR của AR14
Phổ IR của AR15
Phổ (+)-HR-ESI-MS của AR15
Phổ 1H-NMR của AR15
Phổ 13C-NMR của AR15
Phổ DEPT của AR15
Phổ NOESY của AR15
Phổ HMBC của AR15
13
Phụ lục 38.
Phụ lục 39.
Phụ lục 40.
Phụ lục 41.
Phụ lục 42.
Phụ lục 43.
Phụ lục 44.
Phụ lục 45.
Phụ lục 46.
Phụ lục 47.
Phụ lục 48.
Phụ lục 49.
Phụ lục 50.
Phụ lục 51.
Phụ lục 52.
Phụ lục 53.
Phụ lục 54.
Phụ lục 55.
Phụ lục 56.
Phụ lục 57.
Phụ lục 58.
Phụ lục 59.
Phụ lục 60.
Phụ lục 61.
Phụ lục 62.
Phụ lục 63.
Phụ lục 64.
Phụ lục 65.
Phụ lục 66.
Phụ lục 67.
Phụ lục 68.
Phụ lục 69.
Phụ lục 70.
Phụ lục 71.
Phụ lục 72.
Phụ lục 73.
Phụ lục 74.
Phụ lục 75.
Phụ lục 76.
Phổ 1H-NMR của AR16
Phổ IR của AR17
Phổ (+)-HR-ESI-MS của AR17
Phổ 1H-NMR của AR17
Phổ 13C-NMR của AR17
Phổ DEPT của AR17
Phổ HMBC của AR17
Phổ HSQC của AR17
Phổ NOESY của AR17
Phổ 1H-NMR của AR18/AR19
Phổ 13C-NMR của AR18/AR19
Phổ DEPT của AR18/AR19
Phổ 1H-NMR của AD1
Phổ 13C-NMR của AD1
Phổ DEPT của AD1
Phổ 1H-NMR của AD2
Phổ 1H-NMR của AD3
Phổ 1H-NMR của AD4
Phổ 13C-NMR của AD4
Phổ DEPT của AD4
Phổ 1H-NMR của AD5
Phổ 1H-NMR của AD6
Phổ 13C-NMR của AD6
Phổ 1H-NMR của AD7/AD8
Phổ (−)-ESI-MS của AD9/AD10
Phổ 1H-NMR của AD9/AD10
Phổ 13C-NMR của AD9/AD10
Phổ DEPT của AD9/AD10
Phổ 1H-NMR của AD11
Phổ IR của AD12
Phổ (+)-ESI-MS của AD12
Phổ 1H-NMR của AD12
Phổ 13C-NMR của AD12
Phổ DEPT của AD12
Phổ NOESY của AD12
Phổ HMBC của AD12
Phổ HSQC của AD12
Phổ 1H-NMR của AD13
Phổ IR của CK1
14
Phụ lục 77. Phổ 1H-NMR của CK2
Phụ lục 78. Phổ UV của CK3
Phụ lục 79. Phổ IR của CK3
Phụ lục 80. Phổ CD của CK3
Phụ lục 81. Phổ (+)-HR-ESI-MS của CK3
Phụ lục 82. Phổ 1H-NMR của CK3
Phụ lục 83. Phổ 13C-NMR của CK3
Phụ lục 84. Phổ DEPT của CK3
Phụ lục 85. Phổ NOESY của CK3
Phụ lục 86. Phổ HMBC của CK3
Phụ lục 87. Phổ HSQC của CK3
Phụ lục 88. Phổ UV của CK4
Phụ lục 89. Phổ IR của CK4
Phụ lục 90. Phổ CD của CK4
Phụ lục 91. Phổ (+)-ESI-MS của CK4
Phụ lục 92. Phổ (+)-HR-ESI-MS của CK4
Phụ lục 93. Phổ 1H-NMR của CK4
Phụ lục 94. Phổ 13C-NMR của CK4
Phụ lục 95. Phổ DEPT của CK4
Phụ lục 96. Phổ HMBC của CK4
Phụ lục 97. Phổ HSQC của CK4
Phụ lục 98. Phổ NOESY của CK4
Phụ lục 99. Phổ (+)-ESI-MS của CK5
Phụ lục 100. Phổ 1H-NMR của CK5
Phụ lục 101. Phổ 13C-NMR của CK5
Phụ lục 102. Phổ DEPT của CK5
Phụ lục 103. Phổ NOESY của CK5
Phụ lục 104. Phổ 1H-1H COSY của CK5
Phụ lục 105. Phổ HMBC của CK5
Phụ lục 106. Phổ HSQC của CK5
15
LỜI MỞ ĐẦU
Thực vật là nguồn phong phú các hợp chất hữu cơ thiên nhiên với sự đa
dạng về cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học. Các khung phân tử của các hợp
chất thiên nhiên đƣợc sinh tổng hợp theo nhiều con đƣờng khác nhau, và sự sắp
xếp của các nhóm chức và hóa lập thể của nhiều hợp chất này đƣợc cho là đã
đƣợc thiên nhiên phát triển để tạo ra nhiều hoạt tính sinh học tối ƣu; tất cả đã tạo
nên sự lý thú về hóa học của các hợp chất thiên nhiên từ thực vật và tầm quan
trọng của các hợp chất này trong nghiên cứu hoạt chất sinh học nhằm ứng dụng
vào thực tiễn. Phân tích, phân tách các hỗn hợp đƣợc chiết ra từ thực vật, phân lập
và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ thiên nhiên tiếp tục đặt ra
những nhiệm vụ mới cho các nhà nghiên cứu.
Trên con đƣờng phát triển các dƣợc phẩm mới, các tác nhân có thể đƣợc
phân lập từ nguồn nguyên liệu thiên nhiên, bán tổng hợp hoặc tổng hợp toàn
phần. Theo thống kê gần 70% các thuốc đƣợc phép sử dụng hiện nay có nguồn
gốc từ thiên nhiên, trong số đó một phần khá lớn từ thực vật và ít nhất có 119 hợp
chất bắt nguồn từ 90 loài cây có thể đƣợc xem là thuốc quan trọng hiện nay đang
đƣợc sử dụng ở một hay nhiều nƣớc [88]. Các tài liệu gần đây cho thấy 21 thuốc
trên cơ sở các hợp chất thiên nhiên đã đƣợc đƣa ra thị trƣờng dƣợc phẩm thế giới
trong khoảng thời gian từ năm 1998 đến năm 2004 [50]. Do đã đƣợc sử dụng
trong y học dân gian để điều trị các bệnh nhiễm trùng từ lâu đời, các thực vật bậc
cao đã cung cấp nhiều cấu trúc hóa học làm chất dẫn đƣờng để phát triển các thế
hệ thuốc chống nhiễm trùng mới (chống sốt rét, kháng lao, kháng khuẩn, kháng
nấm,…) [24, 29]. Hệ thực vật phong phú của Việt Nam với gần 11.000 loài thực
vật bậc cao (theo dự đoán, con số này có thể lên tới 12.000 loài), trong số đó cây
làm thuốc chiếm khoảng 26-30% [1, 3] tiếp tục là nguồn cung cấp các hợp chất
thiên nhiên cho các nghiên cứu về hóa học, sinh học và dƣợc lý học. Cùng với
việc phát hiện các tác nhân chống nhiễm trùng gây ra bởi các vi khuẩn, vi rút, vi
nấm gây bệnh và ký sinh trùng, các nghiên cứu định hƣớng nhằm phát hiện các
hợp chất thiên nhiên có tác dụng chống oxi hóa cũng đang đƣợc giới khoa học
quốc tế và trong nƣớc quan tâm.
16
Trong giới thực vật của Việt Nam, họ Cúc (Asteraceae, syn. Compositae)
và họ Gừng (Zingiberaceae) thể hiện sự đa dạng sinh học cao; nhiều loài mới
thuộc các chi của hai họ này tiếp tục đƣợc các nhà thực vật học phát hiện [3]. Sự
phong phú về cấu trúc hóa học, đặc biệt là cấu trúc lập thể, đã đƣợc thể hiện trong
các nghiên cứu hóa học về các hợp chất đƣợc phân lập từ các họ này, trong số đó
nhiều chất thuộc về các lớp có cấu trúc tiềm năng cho các hoạt tính chống nhiễm
trùng (kháng khuẩn, kháng nấm, chống sốt rét,…) và chống oxi hóa nhƣ các
điarylheptanoit và flavonoit. Các loài cây này cũng rất giàu các tecpenoit có hoạt
tính sinh học, đặc biệt là các sesquitecpenoit. Do đó chúng là các đối tƣợng
nghiên cứu phù hợp nhằm phát hiện các hợp chất sesquitecpenoit mới từ thực vật.
Việc phát hiện ra các tác nhân điều trị quí giá nhƣ thuốc chống sốt rét artemisinin
từ chi Artemisia và thuốc dự phòng ung thƣ curcumin từ chi Curcuma là động lực
bắt đầu của nhiều nghiên cứu hóa học các cây của hai chi này. Trong một chƣơng
trình nghiên cứu xây dựng thƣ viện mẫu các sesquitecpenoit và điarylheptanoit
cho các thử nghiệm sinh học, hai chi Artemisia và Curcuma đã đƣợc chúng tôi lựa
chọn cho các nghiên cứu hóa học.
Trong luận án này, chúng tôi lựa chọn ba loài cây thuộc họ Cúc
(Asteraceae, syn. Compositae) và họ Gừng (Zingiberaceae), là những cây thuộc
loại hiếm hoặc mới chỉ đƣợc phát hiện gần đây ở nƣớc ta và chƣa đƣợc nghiên
cứu về thành phần hóa học làm đối tƣợng nghiên cứu: Artemisia dubia Wall. ex
Bess. var. longeracemosa Pamp. forma tonkinensis Pamp. (Asteraceae), Artemisia
roxburghiana Bess. (Asteraceae), và Curcuma kwangsiensis S. G. Lee et C. F.
Ling (Zingiberaceae). Mục tiêu của nghiên cứu này là phân lập các hợp chất
thành phần của ba loài cây đƣợc nghiên cứu, xác định cấu trúc của các hợp chất
phân lập đƣợc và đánh giá hoạt tính sinh học của một số hợp chất chọn lọc.
Các nội dung nghiên cứu chính của luận án là:
1.
Xây dựng qui trình chiết và điều chế các phần chiết.
2.
Phân tích sắc kí các phần chiết, xây dựng các qui trình phân tách các phần
chiết và phân lập các hợp chất thành phần.
3.
Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập đƣợc.
17
4.
Đánh giá hoạt tính sinh học của một số hợp chất nhận đƣợc trong khuôn
khổ luận án.
18
Chƣơng 1
TỔNG QUAN
1.2 THỰC VẬT HỌC, NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH
HỌC CÁC LOÀI ARTEMISIA (ASTERACEAE)
1.1.1 Vài nét về thực vật học chi Artemisia
Họ Cúc (Asteraceae, syn. Compositae) là một họ thực vật có hoa hai lá
mầm. Asteraceae là họ lớn thứ hai trong ngành Magnoliophyta, với khoảng 9001.100 chi và 13.000-20.000 loài đã đƣợc thống kê.
Chi Artemisia (chi Ngải) là một chi lớn thuộc họ Cúc (Asteraceae) với
khoảng 200-400 loài. Chi này bao gồm các loại cây thân thảo hay thân bụi đƣợc
biết đến nhờ tinh dầu đặc trƣng của chúng. Các thực vật này sinh trƣởng trong các
khu vực nhiệt đới và ôn đới của Bắc bán cầu. Các loài Artemisia thƣờng ƣa sinh
sống ở môi trƣờng khô hay bán khô. Lá của chúng tƣơng tự lá cây dƣơng xỉ và
hầu hết có lông trắng nhỏ bao phủ.
Có khoảng 15 loài Ngải đã đƣợc biết đến tại Việt Nam nhƣ Ngải cứu
(Artemisia vulgaris L.), Ngải giấm (Artemisia tridentata Nutt.), Ngải đắng
(Artemisia absinthium L.), Thanh hao hoa vàng (Artemisia annua L.), Ngải lá
kim hay Nhân trần hao (Artemisia capillaris Thunb.), Ngải Nhật (Artemisia
japonica Thunb.), Ngải giun hay Thanh cao biển (Artemisia maritima L.), Ngải
thơm hay Thanh hao lá hẹp (Artemisia dracunculus L.), Thanh cao Bắc Bộ hay
Ngải đen (Artemisia dubia Wall var. longeracemosa forma tonkinensis Pamp.),
Ngải cứu chổi (Artemisia scoparia Waldst. et. Kil.), Ngải chân vịt (Artemisia
lactiflora Wall. ex Bess.), Thanh cao ngò (Artemisia apiacea Hance.), v.v…[1, 3].
1.1.2 Nghiên cứu hóa học chi Artemisia
1.1.2.1 Các hợp chất tecpenoit
1.1.2.1.1 Các monotecpen từ tinh dầu
Các tecpen hiđrocacbon và dẫn xuất của chúng (các tecpenoit) có chứa
trong tinh dầu của nhiều loài Artemisia.
Nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu Artemisia incana từ Thổ Nhĩ Kỳ,
Cetin B. và cộng sự bằng các phƣơng pháp GC và GC-MS đã xác định đƣợc 73
19
hợp chất đặc trƣng chiếm 97,2% hàm lƣợng tinh dầu. Các thành phần chủ yếu là
camphor (1) (19%), borneol (2) (18,9%), 1,8-cineole (3) (14,5%), bornyl acetate
(4) (7,8%), camphene (5) (4,9%), và -thujone (6) (4,8%) [20].
Weber D. J. và cộng sự [109] đã nghiên cứu các hợp chất dễ bay hơi của
các loài phụ (subspecies) tridentata và vaseyana của Artemisia tridentata. Các
hợp chất đặc trƣng cho loài subsp. tridentata là methacrolein (7) và thujone;
camphene, camphor, 1,8-cineole, và thujone đặc trƣng cho subsp. vaseyana.
Juteau F. và cộng sự [44] đã nghiên cứu thành phần tinh dầu đƣợc thu nhận
bằng cách chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc phần trên mặt đất của Artemisia
campestris var. glutinosa bằng GC và GC-MS và xác định đƣợc 51 thành phần.
Các thành phần chính là γ-terpinene (8), capillene (9), 1-phenyl-2,4-pentadiyn-1one (10), spathulenol (11), methyleugenol (12), p-cymene (13), và β-pinene (14).
Thành phần hóa học của tinh dầu của 18 mẫu Artemisia herba-alba đƣợc
thu thập tại vùng Nam Tunisia đã đƣợc xác định bằng GC và GC-MS; các thành
phần chính là cineole, thujone, chrysanthenone (15), camphor, borneol,
chrysanthenyl acetate (16), và sabinyl acetate (17) [76].
Tinh dầu của Artemisia capillaris cũng chứa một số thành phần chính
tƣơng tự nhƣ các loài Artemisia khác là 1,8-cineole (13,75%), camphor (8,57%),
và germacrene D (18) (10,41%); và các thành phần chính của tinh dầu Artemisia
mongolica là α-pinene (19) (12,68%), germacrene D (8,36%), và γ-terpinene
(8,17%) [63].
Gunawardena K. và cộng sự [31] đã phân lập đƣợc các monotecpen từ
ba loài Artemisia là Artemisia tridentata ssp. spiciformis, Artemisia tridentata
ssp. vaseyana và Artemisia cana ssp. viscidula và xác định cấu trúc của chúng
bằng các phƣơng pháp phổ. Tổng cộng có 26 monotecpen có cấu trúc không theo
và theo qui tắc isopren đã đƣợc xác định. 2,2-Dimethyl-6-isopropenyl-2H-pyran
(20), 2,3-dimethyl-6-isopropyl-4H-pyran (21), và 2-isopropenyl-5-methylhexatrans-3,5-dien-1-ol (22) đã đƣợc phân lập từ cả A. tridentata ssp. vaseyana lẫn A.
cana ssp. viscidula. Chất monotecpen không theo qui tắc 2,2-dimethyl-6isopropenyl-2H-pyran có mạch cacbon tƣơng tự nhƣ chất tritecpen squalen. Hai
20
monotecpen không theo qui tắc nữa, artemisiatrien (23) và trans-chrysanthemal
(24) đã đƣợc phân lập từ A. cana ssp. viscidula; và lavandulol (25) đã đƣợc phân
lập từ A. tridentata ssp. spiciformis.
O
O
O
O
OH
1
2
O
3
4
5
O
H
O
6
7
8
9
10
H
O
H
OH
O
11
12
13
14
O
O
O
O
15
O
16
17
18
OH
H3C
19
O
O
20
21
CH3
CH2
CH2
22
O
HO
OH
H3C
OH
CH3
H
OH
CH2
CHO
23
24
CH3
25
H
O
OH
26
Artemisia ordosica Krasch. phân bố rộng rãi ở các khu vực khô của Đông
Á. Phần trên mặt đất của cây này thƣờng đƣợc sử dụng trong y học dân gian của
21
Mông Cổ để điều trị viêm thanh quản, viêm họng, xuất huyết, và viêm đa khớp
dạng thấp. Khurelbat D. và cộng sự [49] đã phân lập đƣợc artemisioside (26), một
monotecpen glucosit mới, từ phần trên mặt đất của Artemisia ordosica.
1.1.2.1.2 Các sesquitecpen và sesquitecpen lacton
Nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Artemisia anomala Wen J. và
cộng sự [110] đã phân lập đƣợc một guaianolid dimeric mới đƣợc đặt tên là
artanomalide D (27) và một glaucolid mới đƣợc đặt tên là artanomalide A (28),
một axit
seco-guaiaretic mới acid artanomalic (29), hai guainolid mới
artanomalide B (30) và artanomalide C (31), và năm sesquitecpen lacton đã biết là
armexifolin (32), eudesmaafraglaucolide (33), seco-tanapartholide (34), 8-Oacetylarteminolide (35), và artanomaloide (36).
R1
R2
R3
O
H
HO
O
O
H O
OH
H
O
O
O
O
O
O
O
O
27 R1=OH R2=OAc R3=Me
35 R1=OAc R2=Me R3=OH
O
O
O
28
29
OH
HO
HO
O
O
H
O
Cl
H O
O
OH O
O
HO
30
O
O
31
32
O
O
OH
O
OH
O
O
O
O
O
HO
H
O
O O
33
O
O
O
34
O
O
O
36
Trong một công trình nghiên cứu về các cây thuốc Trung Quốc [36], tám
guaianolid mới (các artemdubolide A-H) và mƣời chín sesquitecpen lacton đã biết
đã đƣợc phân lập từ Artemisia dubia. Cấu trúc của các hợp chất mới này đã đƣợc
xác định là artemdubolide A (37), artemdubolide B (38), artemdubolide C (39),
22
artemdubolide
D (40), artemdubolide
E (41), artemdubolide
F (42),
artemdubolide G (43), và artemdubolide H (44).
O
HO
O
HO
OR
OR
H
O
H
O
37 R=Sen
OH
OR
O
O
O
H
O
O
O
O
39 R=2-MeBu
40 R=Sen
41
38 R=2-MeBu
HO
OH
HO
OH
OH
Cl
OR
OR
HO
O
OH
H
HO
H
H
O
O
O
O
O
O
42
43 R=Ac
O
O
1'
2'
1'
2'
3'
44 R=2-MeBu
4'
O
5'
Ac
2-MeBu
Sen
Noori S. và cộng sự [78] đã phân lập đƣợc tehranolide (45), một
sesquitecpen lacton mới với một nhóm endoperoxide từ Artemisia diffusa.
Tehranolide có cấu trúc giống nhƣ artemisinin và đƣợc xem là có các tác dụng
giống với artemisinin, một chất có tác dụng kháng các tế bào ung thƣ.
Shafizadeh F. và Bhadane N. R. trong một nghiên cứu hóa học về cây
Artemisia arbuscula và Artemisia tridentata [92] đã phân lập và xác định cấu trúc
hai hợp chất germacranolid đã biết tatridin-A (46) và tatridin-B (47), và hai
germacranolid mới deacetyllaurenobiolid (48) và spiciformin (49).
HO
OH
H
OH
O
O
O
H
OH
O
O
HO
O
O
O
O
45
O
O
HO
46
O
47
OH
48
H
H
O
OH
49
Kelsey R. G. và Shafizadeh F. [48] đã điểm lại các sesquitecpen lacton
đƣợc phân lập từ các loài trong chi Artemisia nhằm hiểu rõ hơn về sự phát sinh
23
giống loài và sự phân loại của bốn giống phụ Abrotanum, Absinthium,
Dracunculus, và Seriphidium đƣợc đề xuất bởi Besser vào năm 1829. Kết quả
nghiên cứu này đã tỏ ra rất hữu ích. Chẳng hạn sự không có lông ở đế hoa chỉ là
đặc trƣng về hình thái để phân chia các loài của Abrotanum với các loài của
Absinthium. Đã không tìm thấy các đặc trƣng hóa học phân biệt các loài của hai
giống phụ này vì chúng đều sản sinh ra các eudesmanolid và guaianolid giống hệt
nhau hoặc tƣơng tự nhau về mặt sinh tổng hợp. Do đó các tác giả đề nghị hợp
nhất hai giống phụ này làm một (chi Artemisia).
Từ loài Artemisia rutifolia, nhóm nghiên cứu của Tan R. X. [100] đã phân
lập đƣợc một germacranolid (50), một dẫn xuất của acid costic (51), hai
eudesmanolid (52, 53) và hai guaianolid (54, 55). Trong số đó 51, 53, 54 là các
chất mới. Cấu trúc của các hợp chất mới này đƣợc xác định là 1β,3β-dihydroxy6α-(2′-hydroxymethylacryloyloxy)costic acid methyl este (51), 1β-acetoxy-11βHeudesma-3-ene-12,6α-olide
(53),
và
1α,4β-dihydroxyguaia-2,10(14),11(13)-
triene-12,6α-olide (54).
RO
OH
HO
O
HO
HO
H
OMe
O
H
O
O
OH
O
50
X
O
O
51
52 R=H X=CH2
53 R=Ac X=H, α-Me
OH
HO
X
O
H
H
HO O
O
O
O
54 X=CH3, β-OH
55
Các nghiên cứu gần đây trên thế giới ngày càng mở rộng hơn về số lƣợng
loài đƣợc nghiên cứu và số lƣợng hợp chất phân lập đƣợc.
Theo kết quả nghiên cứu của Sy L. -K. và Brown G. D. [98] các amorphan
sesquitecpen deoxyarteannuin B (56), dihydro-deoxyarteannuin B (57), epideoxyarteannuin B (58), dihydro-epi-deoxyarteannuin B (59), isoannulide (60),
24
annulide (61), và một monotecpen trans-5-hydroxy-2-isopropenyl-5-methylhex3-en-1-ol (62) đã đƣợc phân lập từ cây Artemisia annua; trong số đó 56, 57, và 62
là các thành phần mới.
H
H
H
H
H
H
HO
O
O
R
R
O
56
57
O
R= =CH2
R= −CH3
58 R= =CH2
59 R= −CH3
O
O
OH
O
O
60
61
62
Cây thanh hao (Artemisia annua L.) là nguồn cung cấp thuốc chống sốt rét
mạnh artemisinin (63) và đã là đối tƣợng của nhiều công trình nghiên cứu rộng
lớn kể từ năm 1982 lại đây [18]. Khoảng 38 sesquitecpen thuộc kiểu khung
amorphan và cadinan đã đƣợc biết đến từ loài cây này, trong số đó acid arteannuic
(64), arteannuin B (65) và artemisinin thƣờng có hàm lƣợng cao trong cây. Acid
dihydroartemisinic (66) và dihydroarteannuin B (67) cũng có mặt trong A. annua
với hàm lƣợng đáng kể. A. annua cũng là một nguồn phong phú của nhiều loại
hợp chất thiên nhiên khác, bao gồm các monotecpen, các đitecpen và các
flavonoit. Tất cả các nghiên cứu hóa thực vật này của A. annua đều đã đƣợc thực
hiện với phần trên mặt đất của cây (lá, thân và hoa).
H
H
H
O
O
H
O
R
O
63
O
H
O
HO
O
R
R
O
64 R= =CH2
66 R= −CH3
O
65 R= =CH2
67 R= −CH3
Brown G. D. và cộng sự [18] đã nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên có
mặt trong hạt cây A. annua và đã phát hiện ra hạt này là một nguồn tập trung hầu
hết các chất chuyển hóa thứ cấp đã đƣợc tìm thấy trong các công trình nghiên cứu
trƣớc đó về cây này, và còn thêm nhiều tecpen mới. Phân tách phần chiết
điclometan của hạt cây A. annua bằng sắc kí cột (CC) và sắc kí lỏng hiệu năng
25
