LÊ ĐÌNH HẢI XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP TÁCH MỘT SỐ ACID AMIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ ĐÌNH HẢI

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP TÁCH
MỘT SỐ ACID AMIN BẰNG SẮC KÝ
LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ ĐÌNH HẢI
MÃ SINH VIÊN: 1401175

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP TÁCH
MỘT SỐ ACID AMIN BẰNG SẮC KÝ
LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn
1. PGS.TS. Phạm Thị Thanh Hà
2. Th.S. Vũ Ngân Bình
Nơi thực hiện
Bộ môn Hóa phân tích – độc chất

HÀ NỘI – 2019

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đề tài, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu đến từ
các thầy cô, bạn bè và gia đình. Khi khóa luận đã hoàn thiện, tôi xin phép được
bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến họ.
Đầu tiên, với tất cả lòng biết ơn và kính trọng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới
PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà, Th.S Vũ Ngân Bình – Giảng viên bộ môn Hóa
phân tích và độc chất – Trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã trực tiếp
hướng dẫn, chỉ bảo tận tình để giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, thực
hiện khóa luận.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Th.S Nguyễn Lâm Hồng, Th.S Ngô
Minh Thúy, Th.S Nguyễn Thị Thùy Linh và các thầy cô, các anh/chị kĩ thuật
viên Bộ môn Hóa phân tích và độc chất, Bộ môn Vật lý – hóa lý đã giúp đỡ, chỉ
bảo tận tình và đạo điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành khóa luận.
Tôi xin gửi lời cảm ơn Ban Giám hiệu, các phòng ban, các thầy cô và tập
thể cán bộ công nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội – những người đã đào
tạo và giúp đỡ tôi trong suốt những năm học tập và sinh hoạt tại trường.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh,
giúp đỡ, chia sẻ những khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sính viên

Lê Đình Hải


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẺ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................... 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN. .............................................................................. 3
1.1. Các acid amin. ......................................................................................... 3
1.2. Sơ lược về sắc ký lỏng tương tác thân nước. ........................................ 4
1.2.1. Cơ chế tách của sắc ký lỏng tương tác thân nước (HILIC). .............. 4
1.2.2. Pha tĩnh. ................................................................................................ 5
1.2.3. Pha động ............................................................................................... 6
1.2.4. Ưu điểm của phương pháp HILIC ...................................................... 7
1.3. Xác định pH của pha động trong HILIC. ............................................ 8
1.4. Sơ lược về các phương pháp phân tích acid amin đã có. .................. 10
CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 14
2.1. Đối tượng nghiên cứu. .......................................................................... 14
2.2. Nguyên vật liệu...................................................................................... 14
2.2.1. Hóa chất .............................................................................................. 14
2.2.2. Thiết bị dụng cụ .................................................................................. 14
2.2.4. Chuẩn bị các dung dịch làm việc ....................................................... 15
2.3. Nội dung nghiên cứu............................................................................. 17
2.3.1. Khảo sát sự thay đổi pH dung dịch theo tỉ lệ acetonitril. ................. 17
2.3.2. Khảo sát thời gian lưu của các acid amin trong một số pha động và
pha tĩnh khác nhau....................................................................................... 17


2.3.3. Xây dựng và thẩm định phương pháp tách đồng thời một số acid
amin bằng HILIC. ........................................................................................ 17
2.4. Phương pháp thực nghiệm................................................................... 17
2.4.1. Khảo sát sự thay đổi pH dung dịch theo tỉ lệ acetonitril. ................. 17
2.4.2. Khảo sát thời gian lưu của các acid amin trong một số pha tĩnh và
các pha động khác nhau. ............................................................................. 19
2.4.3. Xây dựng và thẩm định phương pháp tách đồng thời một số acid

amin bằng HILIC. ........................................................................................ 20
CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................... 23
3.1. Khảo sát sự thay đổi pH dung dịch theo tỉ lệ acetonitril. ................. 23
3.1.1. Khảo sát sự thay đổi pH của các dung dịch acid khi thay đổi tỉ lệ
acetonitril. ..................................................................................................... 23
3.1.2. Khảo sát sự thay đổi pH của các dung dịch đệm/muối cùng nồng độ
được pha loãng bằng acetonitril. ................................................................. 25
3.2. Khảo sát thời gian lưu của các acid amin trong một số pha tĩnh và
pha động khác nhau. ...................................................................................... 26
3.2.1. Lựa chọn dung môi pha mẫu ............................................................. 26
3.2.2. Kết quả khảo sát thời gian lưu các acid amin trên pha tĩnh Zorbax
NH2 (150x4,6mm, 5μm) với các pha động khác nhau................................ 27
3.2.3. Kết quả khảo sát thời gian lưu các acid amin trên pha tĩnh Zorbax
RX-Sil (150 x 4,6 mm, 5 µm) với các pha động khác nhau........................ 28
3.2.4. Kết quả khảo sát thời gian lưu các acid amin trên pha tĩnh Supelco
Ascentis Silica (250x4,6 mm, 5 μm) với các pha động khác nhau. ............ 30
3.3. Xây dựng và thẩm định phương pháp tách đồng thời một số acid
amin bằng HILIC. .......................................................................................... 31
3.3.1. Xây dựng phương pháp tách đồng thời một số acid amin. .............. 31
3.3.2. Thẩm định phương pháp tách đồng thời 5 acid amin. ..................... 34


3.4. Bàn luận ................................................................................................. 36
3.4.1. Ý nghĩa khảo sát pH các dung dịch khi thay đổi tỉ lệ acetonitril. .... 36
3.4.2. Kết quả khảo sát thời gian lưu các acid amin trong các pha tĩnh và
pha động khác nhau. .................................................................................... 37
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .............................................................................. 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết

Tiếng Anh

Tiếng Việt

ACN

Acetonitril

Acetonitril

ADN

Deoxyribonucleic acid

Acid deoxyribonucleic

AQC

6-aminoquinolyl-N-

6-aminoquinolyl-N-

hydroxysuccinimidyl carbamate

hydroxysuccinimidyl

tắt

carbamat
Điện di mao quản

CE

Capilary electrophoresis

CNBF

Chloro-3,5-dinitrobenzotrifluoride Cloro-3,5dinitrobenzotrifluorid

DABS-Cl

Dimethylamino-

Dimethylamino-

azobenzensulfonyl chlorid

azobenzensulfonyl clorid

DAD

Diod array detector

Detector mảng diod

ESI

Electrospray ionisation

Bộ ion hóa bằng tia điện tử

FOMC

9-fluorenylmethyl chloroformate

9-fluorenylmethyl
cloroformat

HILIC

HPLC

Hydrophilic interaction

Sắc ký lỏng tương tác thân

chromatography

nước

High performance liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

chromatography
LC

Liquid chromatography

Sắc ký lỏng

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of quantitation

Giới hạn định lượng

MS

Mass spectrometry

Phân tích khối phổ

NBD-F

7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-

7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-

diazol

1,3-diazol

Normal phase liquid

Sắc ký lỏng pha thuận

NP-LC

chromatography


OPA

ortho-phthalaldehyde

Aldehyd (o) – phthalic

PITC

Phenylisothiocyanate

Phenylisothiocyanat

RP-LC

Reverse phase liquid

Sắc ký lỏng pha đảo

chromatography
Rs

Resolution

Độ phân giải

RSD

Relative standard deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

UPLC

Ultra performance liquid

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

chromatography
UV

Ultra violet

Bức xạ tử ngoại


DANH MỤC CÁC BẢNG
STT

Bảng Nội dung

1

1.1

Tên gọi, tên viết tắt, pI của các acid amin cơ bản

4

2

1.2

Một số phương phát phân tích acid amin

11

3

2.1

Các điều kiện pha động khảo sát

20

4

3.1

Giá trị sspKa của acid formic và acid acetic khi thay

23

Trang

đổi tỉ lệ ACN
5

3.2

Kết quả khảo sát khả năng tách 2 acid amin thơm

33

(Phe, Tyr) khi thay đổi thành phần pha động
6

3.3

Độ phù hợp hệ thống của phương pháp tách đồng

35

thời 5 acid amin
7

3.4

Kết quả xác định giới hạn phát hiện của phương pháp 36

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
STT Hình

Nội dung

Trang

1

1.1

Công thức tổng quát của acid amin cơ bản

3

2

1.2

Tính lưỡng tính của acid amin

3

3

1.3

Các cơ chế lưu giữ chủ yếu khi triển khai HILIC

5

4

2.1

Cách xác định tỉ số tín hiệu/độ nhiễu (S/N)

22

5

3.1

Sự thay đổi sspKa theo tỉ lệ ACN(%) của acid acetic và 23
acid formic

6

3.2

Mối quan hệ giữa tỉ lệ 𝑠𝑠𝑝𝐾𝑎 / 𝑤
𝑤𝑝𝐾𝑎 theo tỉ lệ ACN(%)

24

7

3.3

Quan hệ giữa sspKa và wwpKa của acid hữu cơ mạch

25

thẳng ở các tỉ lệ ACN khác nhau.
8

3.4

Sự biến đổi swpH các dung dịch đệm acid acetic:amoni 25
acetat (2:1), đệm acid acetic:amoni acetat (1:1), muối
amoni acetat 2,5,10 mM theo tỉ lệ ACN

9

3.5

Sắc ký đồ các mẫu Prolin pha trong nước, trong amoni 27
acetat, trong dung môi pha động

10

3.6

Kết quả thời gian lưu một số acid amin trên cột amino

28

11

3.7

Thời gian lưu của các acid amin biểu thị qua hệ số

29

chọn lọc với Tryptophan αTrp của các acid amin trong
các pha động có swpH thay đổi.
12

3.8

Sắc ký đồ tách 3 acid amin thơm

33

13

3.9

Sắc ký đồ chương trình tách đồng thời 5 acid amin

34

14

3.10

Sắc ký đồ xác định độ đặc hiệu của phương pháp

36


ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, kĩ thuật sắc ký và đặc biệt là sắc ký lỏng đã trở lên phổ biến và
áp dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh vực đa dạng khác nhau như hóa sinh, vi sinh,
kiểm nghiệm, an toàn thực phẩm, môi trường,… Bên cạnh các kĩ thuật sắc ký lỏng
quen thuộc như RP-LC hay NP-LC, kĩ thuật sắc ký lỏng tương tác thân nước
(HILIC) là một kĩ thuật mới, lần đầu được giới thiệu vào năm 1990, nhưng nhanh
chóng phát triển và ngày càng được ứng dụng rộng rãi. Sắc ký lỏng tương tác thân
nước hoạt động dựa trên pha tĩnh phân cực và pha thuận phân cực (hỗn hợp nước
và acetonitril), khắc phục được các nhược điểm của các kĩ thuật sắc ký truyền
thống. Do pha tĩnh phân cực, sắc ký lỏng tương tác thân nước thích hợp hơn RPLC khi thực hiện phân tích các hợp chất phân cực tốt như peptid, các kháng sinh
(aminosid, β-lactam,…), các dẫn xuất phân cực hóa (các nucleosid, các
glycosid,…) [10], [11], [13], [22]. Tuy nhiên, dù HILIC đang ngày càng được chú
ý và phát triển mạnh mẽ trên thế giới, số lượng nghiên cứu liên quan tới HILIC ở
Việt Nam còn rất hạn chế [10].
Các acid amin có độ phân cực lớn, kích thước phân tử nhỏ, là một nhóm
chất rất phù hợp với sắc ký lỏng tương tác thân nước. Trên thế giới cũng đã có
một số nghiên cứu sử dụng HILIC trong phân tích acid amin [17], [22] nhằm khắc
phục những nhược điểm của các kĩ thuật phân tích acid amin phổ biến hiện nay.
Hiện nay, hầu hết các cách phân tích acid amin đều phải thực hiện quy trình dẫn
xuất hóa trước cột hoặc sau cột phức tạp và mất thời gian [5], [23]. Vì vậy, nghiên
cứu áp dụng kĩ thuật HILIC để phân tích trực tiếp các acid amin là khả thi và có
nhiều ý nghĩa thực tiễn.
Tuy nhiên, lý thuyết về sắc ký lỏng tương tác thân nước khá phức tạp, phụ
thuộc vào nhiều yếu tố và vẫn đang tiếp tục được nghiên cứu đầy đủ [10], [13],
[18], [22]. Nhìn chung, khác với RP-LC, yếu tố ảnh hưởng lớn nhất tới khả năng
tách trong HILIC là bản chất của pha tĩnh [18]. Bên cạnh đó, pH của pha động

cũng là một yếu tố ảnh hưởng rất lớn trong HILIC do pH không chỉ thay đổi được
trạng thái tồn tại của chất phân tích mà còn thay đổi được tính chất của pha tĩnh
[13], [14], [18]. Tương tự với các kĩ thuật sắc ký khác, các yếu tố như tỉ lệ các
1


thành phần pha động, nồng độ ion trong HILIC vẫn có ảnh hưởng lên khả năng
phân tách. Do đó, bước đầu nghiên cứu sử dụng kĩ thuật HILIC áp dụng vào phân
tích các acid amin cần thực hiện nhiều khảo sát, đánh giá ảnh hưởng của nhiều
yếu tố khác nhau trên đối tượng acid amin.
Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Xây dựng phương pháp tách một số acid amin bằng sắc ký lỏng tương tác thân
nước”
Với ba mục tiêu:
1. Khảo sát sự thay đổi của pH dung dịch theo tỉ lệ acetonitril.
2. Khảo sát thời gian lưu của các acid amin trong một số pha tĩnh và pha động
khác nhau.
3. Xây dụng và thẩm định phương pháp tách đồng thời một số acid amin bằng
HILIC.

2


CHƯƠNG I. TỔNG QUAN.
1.1.

Các acid amin.
Các acid amin là đơn vị cơ bản cấu tạo nên Protein. Có khoảng 300 acid

amin được tìm thấy trong tế bào động vật, thực vật và các loài vi sinh vật, trong

đó có khoảng 20 loại cơ bản (20 acid amin thường gặp) được mã hóa bởi ADN.
Tất cả 20 acid amin thông thường đều là các α-amino acid, nhóm -COOH
và nhóm -NH2 đều gắn vào Cα. Sự khác nhau giữa 20 loại acid amin này nằm ở
nhóm thế R gắn vào Cα. Trong tự nhiên, các acid amin đều có Cα là carbon bất đối
(trừ Glycin), ở dạng đồng phân lập thể L.

Hình 1.1. Công thức tổng quát của acid amin cơ bản
Nhóm thế R của các acid amin có tính chất quyết định đối với kích thước,
và các đặc tính hóa – lý (tính phân cực, điện tích, mức độ hòa tan trong các dung
môi,…) của phân tử acid amin. Công thức cấu tạo và các giá trị hằng số acid của
20 acid amin cơ bản được ghi trong phụ lục 1
Các acid amin đều có tính lưỡng tính acid-base, mang điện dương ở nhóm
-NH2 (dạng NH3+) và mang điện âm ở nhóm -COOH (dạng -COO-) tùy thuộc vào
pH môi trường. Với mỗi acid amin, tại một pH xác định nào đó, acid amin tồn tại
chủ yếu ở dạng ion lưỡng cực, tổng điện tích âm bằng điện tích dương (điện tích
toàn phần bằng 0). Giá trị pH đó gọi là điểm đẳng điện pI của acid amin.

Hình 1.2. Tính lưỡng tính của acid amin
Dựa vào tính chất phân cực và cấu tạo hóa học của gốc R, 20 acid amin
thường gặp có thể chia thành 5 nhóm [4]:
• Nhóm R kị nước, không phân cực: Glycin, Alanin, Methionin, Prolin,
Leucin, Isoleucin, Valin.
3


• Nhóm R phân cực, không mang điện: Threonin, Serin, Cystein,
Glutamin, Asparagin.
• Nhóm R mang nhân thơm: Tryptophan, Tyrosin, Phenylalanin.
• Nhóm R mang điện âm: Acid aspatic, Acid glutamic.
• Nhóm R mang điện dương: Lysin, Asparagin, Histidin.

Bảng 1.1: Tên gọi, tên viết tắt, pI của các acid amin cơ bản [4]
STT

Tên gọi

Tên

pI

STT

Tên gọi

viết tắt

Tên

pI

viết tắt

1

Glycin

Gly

5,97

11

Asparagin

Asp

5,41

2

Alanin

Ala

6,01

12

Cystein

Cys

5,07

3

Prolin

Pro

6,48

13

Tryptophan

Trp

5,89

4

Leucin

Leu

5,98

14

Phenylalanin Phe

5,48

5

Isoleucin

Ile

6,02

15

Tyrosin

Tyr

5,66

6

Methionin Met

5,74

16

Histidin

His

7,59

7

Valin

Val

5,97

17

Arginin

Arg

10,76

8

Serin

Ser

5,68

18

Lysin

Lys

9,74

9

Threonin

Thr

5,87

19

Acid aspatic

Asp

2,77

10

Glutamin

Gln

5,60

20

Acid

Glu

3,22

Glutamic
Dựa trên giá trị dinh dưỡng, 20 acid amin cơ bản được chia thành 2 nhóm
[4].

• Nhóm các acid amin thiết yếu (các acid amin cơ thể người không thể
tự sinh tổng hợp): Met, Val, Trp, Ile, Phe, Thr, Leu, Lys (đối với trẻ
em có thêm Arg, His).
• Nhóm acid amin không thiết yếu: Gly, Ala, Ser, Tyr, Cys, Asp, Asn,
Glu, Gln, Arg, His, Pro.
1.2.

Sơ lược về sắc ký lỏng tương tác thân nước.

1.2.1. Cơ chế tách của sắc ký lỏng tương tác thân nước (HILIC).

4


Sắc ký lỏng tương tác thân nước HILIC sử dụng một pha tĩnh thân nước kết
hợp với pha động gồm nước và 1 dung môi hữu cơ không proton hóa với tỉ lệ
dung môi hữu cơ lớn. Các nhóm chức thân nước trên bề mặt pha tĩnh giữ những
phân tử nước trong pha động, hình thành một lớp nước mỏng cố định trên bề mặt
pha tĩnh. Sự tách xảy ra do sự phân bố khác nhau của các chất phân tích giữa lớp
nước mỏng cố định trên bề mặt pha tĩnh và pha động giàu dung môi hữu cơ. Thông
thường, khi tăng tỉ lệ ACN trong thành phần pha động (giảm độ phân cực của pha
động), khả năng rửa giải của dung môi sẽ giảm, thời gian lưu của chất phân tích
sẽ tăng lên [14], [18], [22].
Ngoài cơ chế chính đã nêu trên, một số cơ chế tách khác cũng đã được đề
cập trong HILIC như hấp phụ [11], [22], liên kết Hidro, tương tác lưỡng cực –
lưỡng cực [19], [22]. Trong trường hợp pha tĩnh có bề mặt mang điện, tương tác
giữa chất phân tích và pha tĩnh có thể thêm tương tác tĩnh điện và tương tác ion
[18], [19], [22].

Hình 1.3. Các cơ chế lưu giữ chủ yếu khi triển khai HILIC [22]

Tuy nhiên, hiện nay chưa có lý thuyết tổng quát mô tả đầy đủ cơ chế tách
trong HILIC để dự đoán hiệu quả thời gian lưu của của các chất phân tích do số
lượng và mức độ ảnh hưởng khác nhau của nhiều loại tương tác [22].
1.2.2. Pha tĩnh.
Pha tĩnh dùng trong HILIC là những bề mặt ưa nước, dễ dàng hình thành
lớp nước hấp phụ trên bề mặt. Pha tĩnh được sử dụng rộng rãi trong phân tích bằng
HILIC là cột silica. Dựa vào cấu trúc có thể chia cột silica thành 2 loại: cột silica
không dẫn xuất hóa và cột silica dẫn xuất hóa bề mặt.
5


• Silica không dẫn xuất hóa: chứa các hạt nhồi bề mặt là nhóm -SiOH.
Pha tĩnh Silica không dẫn xuất hóa có thể sử dụng ở vùng pH thấp
hơn so với các pha tĩnh Silica dẫn xuất hóa bề mặt do không gặp vẫn
đề về thủy phân liên kết dẫn xuất hóa [10]. Cột silica không dẫn xuất
hầu như không mang điện trong khoảng pH từ 2 tới 3 [18], mang
điện âm rõ rệt (-SiO-) với các môi trường có pH>4 [14], [18].
• Silica dẫn xuất hóa bề mặt: Nhóm Silica trên bề mặt pha tĩnh được
tạo các liên kết với các nhóm chức hữu cơ khác. Các pha tĩnh Silca
dẫn xuất hóa thường được phân loại dựa vào đặc điểm tích điện bề
mặt của hạt nhồi [13], [18], [22]:
o Trung tính: amid, cyano, cyclodextrin, diol,…
o Mang điện dương: amino, imidazol, polyamine,..
o Mang điện âm: polysulfoethyl A, poly CAT A
o Lưỡng tính: sulfobetaine, phosphocholine,…
1.2.3. Pha động
Pha động sử dụng trong HILIC thường là hỗn hợp nước hoặc đệm trong
nước và một dung môi hữu cơ thân nước không proton hóa. Tỉ lệ nước thường
dao động từ 5-40%. Tỉ lệ nước yêu cầu tối thiểu 2% để hình thành được lớp nước
trên bề mặt pha tĩnh – tạo ra cơ chế chính trong phân tách bằng HILIC [22]. Tỉ lệ

nước cao hơn 40% có thể dẫn tới sự giảm mạnh thời gian lưu hoặc không lưu giữ
các chất phân cực [18], [22].
ACN là dung môi hữu cơ được sử dụng phổ biến nhất vì ACN không cho
nhận proton giúp làm giảm sự cạnh tranh với H2O trong tương tác với pha tĩnh.
Tuy nhiên các dung môi hữu cơ đồng tan không proton hóa khác đều có thể được
sử dụng (tetrahydrofuran, dioxan,…) [10], [18].
Đệm và các chất bổ sung trong nước khác thường được sử dụng để điều
chỉnh pH và lực ion của pha động. Yếu tố pH của pha động quyết định tới trạng
thái mang điện của cả chất phân tích, pha tĩnh và lớp nước trên bề mặt pha tĩnh
(pha tĩnh giả). Đối với chất phân tích, dạng mang điện bị lưu giữ mạnh hơn so với
dạng không mang điện. Đối với pha tĩnh, pH có thể ion hóa các nhóm chức bề
6


mặt pha tĩnh, làm tăng/giảm các tương tác tĩnh điện có thể xảy ra giữa chất phân
tích và pha tĩnh [22].
Việc thay đổi nồng độ đệm thường ảnh hưởng tới thời gian lưu của chất
phân tích do thay đổi độ phân cực của pha động, thay đổi bề dày lớp nước hấp
phụ trên bề mặt pha tĩnh [11], [18], cạnh tranh tương tác tĩnh điện giữa ion pha
động và chất phân tích dạng ion [11].
Các đệm có khả năng bay hơi (amoni acetat, amoni format,…) thường được
sử dụng vì dễ dàng kết hợp với detector khối phổ [10], [11], [22]. Đệm phosphate
cũng thường được sử dụng trong phân tích sử dụng detector DAD nhờ khoảng
đệm rộng nhưng nhược điểm là không bay hơi nên khó kết hợp với detector khổi
phổ và dễ bị tủa trong môi trường tỉ lệ cao ACN [10].
1.2.4. Ưu điểm của phương pháp HILIC
HILIC có nhiều ưu điểm rõ rệt khi so sách với các phương pháp sắc ký lỏng
truyền thống khác.
Đối với sắc ký lỏng pha đảo RP-LC, pha tĩnh có bản chất không phân cực,
pha động là chất phân cực. Do vậy RP-LC hạn chế trong khả năng lưu giữ các

chất phân cực. Ngược lại, pha tĩnh và pha động trong HILIC đều phân cực, khả
năng lưu giữ các chất phân cực tốt hơn so với RP-LC, tạo thuận lợi hơn trong việc
phân tích trực tiếp các chất phân cực mạnh thay vì phải tiến hành các phản ứng
dẫn xuất hóa khi tiến hành phân tích. Thêm vào đó, pha động trong HILIC dễ bay
hơi (tỉ lệ ACN lớn, tỉ lệ H2O thấp, đệm thường sử dụng loại dễ bay hơi) hơn khi
so sánh với pha động dùng trong RP-LC (chủ yếu là nước hoặc đệm trong nước,
tỉ lệ nhỏ dung môi đồng tan khác) nên dễ dàng kết nối với hệ thống detector khối
phổ [10], [22]. Pha động trong HILIC cho phép theo dõi và phát hiện ở bước sóng
thấp nhờ vào bước sóng tới hạn thấp của các dung môi.
Đối với sắc ký lỏng pha đảo NP-LC và sắc ký tạo cặp ion, mặc dù hay được
sử dụng để phân tích các hợp chất phân cực nhưng các phương pháp này cũng có
những hạn chế nhất định. Trong NP-LC, pha động là các dung môi hữu cơ kém
phân cực nên khả năng rửa giải chất phân tích phân cực mạnh còn hạn chế. Dung
môi hữu cơ trong NP-LC thường độc và gây hại cho môi trường. Trong sắc ký tạo
7


cặp ion, thường không thể thay đổi mục địch sử dụng cột do cặp ion tạo ra thường
liên kết mạnh với pha tĩnh, bị lưu giữ mạnh.
Tuy nhiên, HILIC cũng có một số nhược điểm cẩn lưu ý khi triển khai. Do
cơ chế tách dựa trên lớp nước hấp phụ nên thời gian ổn định cột trước khi chạy
hay trước khi thay đổi dung môi thường kéo dài (ít nhất 30 phút) [19]. Các cơ chế
tách do sự kết hợp của nhiều tương tác khác nhau nên việc dự đoán và kiểm soát
thời gian lưu giữ thường gặp khó khăn [13], [14], [18], [22]. Dung môi sự dụng
trong HILIC thường chỉ là ACN mà không có các lựa chọn thay thế khác.
1.3.

Xác định pH của pha động trong HILIC.
Trong sắc ký nói chung, sắc ký lỏng tương tác thân nước nói riêng, pha

động thường là sự pha trộn các dung dịch trong nước (acid, muối, đêm,…) với
một dung môi hữu cơ theo các tỉ lệ khác nhau.
Khi thêm một dung môi hữu cơ vào trong nước, hằng số điện môi của hỗn
hợp bị thay đổi, làm tăng năng lượng quá trình solvat hóa các ion [12], [26]. Do
đó, giá trị pKa các chất có tính acid/base, pKa của chất phân tích, dung lượng đệm
của pha động trong chương trình sắc ký đều bị thay đổi [26]. Thông thường giá
trị hằng số acid pKa của các acid mang điện dương (NH3+, (C2H5)2NH3+,…) giảm
khi tăng tỉ lệ dung môi hữu cơ trong hỗn hợp (tính acid mạnh lên); ngược lại, giá
trị pKa của các acid không mang điện (CH3COOH, HCOOH,…) tăng lên khi tăng
tỉ lê dung môi hữu cơ trong hỗn hợp (tính acid yếu đi) [12], [26].
Theo dược điển Việt Nam V, pH của một dung dịch được xác định dựa trên
pH của các dịch đối chiếu theo công thức.
𝑝𝐻 = 𝑝𝐻𝑠 −

𝐸 − 𝐸𝑠
𝑘

Trong đó:
• pHs là pH của dung dịch đối chiếu.
• E, Es lần lượt là điện thế của pin chứa dung dịch được khảo sát và
dung dịch đối chiếu.
• k là hệ số có giá trị thay đổi theo nhiệt độ.

8


Có 3 cách có thể sự dụng để xác định giá trị pH của 1 pha động chạy sắc
ký nói chung [26].
• Cách 1: Chuẩn hóa điện cực bằng các dung dịch chuẩn trong nước
thông thường. Đo giá trị pH của dung dịch acid/muối/đệm trước khi

phối hợp với dung môi hữu cơ. Giá trị pH đo theo cách này là wwpH.
Sử dụng giá trị pH này để biểu thị giá trị pH của pha động.
• Cách 2: Chuẩn hóa điện cực với các dung dịch chuẩn trong dung môi
tương ứng với thành phần pha động cần đo. Đo giá trị pH pha động
sau khi đã phối hợp các thành phần. Giá trị pH đo theo cách này là
s
spH.

Sử dụng giá trị pH này để biểu thị giá trị pH của pha động.

• Cách 3: Chuẩn hóa điện cực bằng các dung dịch chuẩn trong nước
thông thường. Đo giá trị pH pha động sau khi đã phối hợp các thành
phần. Giá trị pH đo theo cách này là swpH. Sử dụng giá trị pH này để
biểu thị giá trị pH của pha động.
Xác định giá trị wwpH đơn giản, thuận tiện nhất nhưng không thể hiện được
sự ảnh hưởng của dung môi hữu cơ lên các tính chất pha động và trạng thái tồn
tại của chất phân tích. Xác định giá trị sspH yêu cầu việc chuẩn hóa điện cực phức
tạp, không thuận tiện khi thay đổi thành phần pha động. Giá trị

s
wpH

được xác

định tương đối đơn giản, không yêu cầu phải chuẩn bị các dung dịch đệm chuẩn
mới khi thay đổi tỉ lệ thành phần pha động. Đồng thời, giá trị swpH có thể chuyển
đổi sang giá trị sspH dễ dàng dựa trên hệ số chuyển đổi δ (xem phụ lục 2) [12],
[15], [26] theo phương trình:
𝛿 = 𝑤𝑠𝑝𝐻 − 𝑠𝑠𝑝𝐻
Sử dụng giá trị wspH hay sspH giúp xác định tốt hơn mối quan hệ giữa pH

pha động và đặc điểm của chất phân tích trong từng điều kiện phân tích cụ thể
[12], [25]. Hơn nữa, các giá trị khuyến cáo pH về khoảng ổn định của các pha tĩnh
mang gốc silica (thường từ pH 2 tới 8) đều là các giá trị

w
wpH

nhưng điều kiện

hoạt động thường trong các pha động chứ dung môi hữu cơ. Thêm dung môi hữu
cơ làm mở rộng khoảng giới hạn pH sử dụng của cột sắc ký. Điều này cho phép
khảo sát được nhiều loại đệm hơn khi triển khai HILIC trên cột Silica [12].
9


1.4.

Sơ lược về các phương pháp phân tích acid amin đã có.
Các phương pháp phân tích acid amin được phát triển để xác định hàm

lượng của các acid amin, peptid, protein trong mẫu phân tích. Mẫu phân tích có
bản chất và đặc điểm rất đa dạng do sự có mặt phổ biến của các acid amin như:
mẫu dịch sinh học (máu, nước tiểu, nước bọt,…), mẫu dịch chiết dược liệu, mẫu
thực phẩm, mẫu chế phẩm thuốc,…
Một quy trình phân tích acid amin có 2 giai đoạn.
• Giai đoạn 1: Thủy phân các protein thành các acid amin tự do.
• Giai đoạn 2: Phân tích xác định đồng thời nhiều acid amin.
Trong phạm vi của đề tài, tôi chỉ trình bày các phương pháp phân tích đồng
thời nhiều acid amin đã được nghiên cứu.
Nhiều phương pháp khác nhau đã được nghiên cứu, tiến hành để phân tích

acid amin như các phương pháp sắc ký, điện di mao quản,…
Nhìn chung, các acid amin hấp thụ quang kém, không có các nhóm mang
màu, cần áp dụng biện pháp dẫn xuất hóa để phát hiện đáp ứng.
Các kĩ thuật phổ biến nhất là kỹ thuật sắc ký trao đổi ion dẫn xuất sau cột
và sắc ký lỏng pha đảo dẫn xuất trước cột [23].
Đối với sắc ký trao đổi ion, nguyên tắc chung dựa vào sự thay đổi dạng tồn
tại của các acid amin theo pH. Hỗn hợp acid amin được đưa lên cột ở pH thấp,
các acid amin ở dạng mang điện dương được lưu giữ trên cột. Quá trình rửa giải
sử dụng một chương trình gradient pH, khi pH đạt tới điểm đẳng điện, acid amin
ở dạng cân bằng về điện và sẽ bị rửa giải. Các acid amin được phát hiện bằng dẫn
xuất hóa sau cột, chủ yếu bằng phản ứng với ninhydrin hoặc OPA [23].
Đối với sắc ký lỏng pha đảo, acid amin phân cực tốt nên kém lưu giữ. Việc
dẫn xuất hóa trước cột được thực hiện để giải quyết 2 vấn đề: tăng mức độ kị nước
và tăng khả năng hấp thụ quang của các acid amin [23]. Các chất để dẫn xuất hóa
thường thấy là PITC, OPA-FMOC,…
Việc dẫn xuất sau cột không yêu cầu sản phẩm dẫn xuất phải bền, không
yêu cầu phải dẫn xuất hoàn toàn nhưng đặt ra những yêu cầu về hệ thống phân
tích và những hạn chế trong việc lựa chọn tác nhân dẫn xuất. Ngược lại, việc dẫn
10


xuất trước cột có lợi trong việc lựa chọn tác nhân và con đường dẫn xuất hóa
nhưng đặt ra yêu cầu về độ ổn định của sản phẩm dẫn xuất cũng như nguy cơ ảnh
hưởng bởi các phản ứng phụ.
Một số phương pháp phát hiện trực tiếp acid amin không qua dẫn xuất cũng
đã được nghiên cứu và đề xuất [23]: phát hiện ở bước sóng UV thấp, detector khối
phổ, detector tán xạ bay hơi,…
Bảng 1.2: Một số phương pháp phân tích acid amin.
STT Tác giả
1

Dược

Phương pháp

Nền mẫu
điển

Giới thiệu 7 kỹ thuật:
• 2 kỹ thuật sắc ký trao đổi cation tạo

Việt Nam V

dẫn xuất trước cột với Ninhydrin

[5]

hoặc OPA
• 5 kỹ thuật sắc ký lỏng pha đảo tạo
dẫn xuất trước cột với PITC, AQC,
OPA, DABS-Cl, FMOC hoặc
NBD-F
2

Tiêu
Việt

chuẩn Thức

ăn Sắc ký cột trao đôi ion.

Nam chăn nuôi

Hệ thống dẫn xuất hóa sau cột với

TCVN

Ninhydrin.

8764:2012 [1]

Phân tích 17 acid amin, LOQ trong
khoảng 0,03-0,35 g/kg

3

Weihua Ly và Măng

tây Sắc ký lỏng pha đảo:

cộng sự (2011) (Asparagus
[17]

Cột C18 (250x4,6 mm, 5 μm)

Officinalis) Dẫn xuất hóa trước cột: CNBF
Thời gian phân tích: 60 phút
Phân tích 20 acid amin, LOD trong
khoảng 1,2-6,0 μmol.L-1

11


4

Salamy

và Bột

thực Sắc ký lỏng pha đảo:

cộng sự (2018) phẩm

từ Cột C18 (250x4,6 mm, 5μm)

Gián

nhà Thời gian phân tích: 30 phút

[24]

(Periplaneta Dẫn xuất hóa trước cột: PITC
Americana) Phân tích 15 acid amin, LOD trong
khoảng 0,9-11,7 μmol.L-1
5

Muhammad

Mẫu

da Sắc ký khí

YarKhuhawar, bệnh nhân Cột HP-5 (30 m x 0,32 mm)
Subhan

Ali vảy nến

Dẫn xuất hóa trước cột 2 giai đoạn:

Majidano

trifluoroacetylacetone

(2011) [16]

chloroformate.

và

ethyl

Thời gian phân tích 10 phút
Phân tích 19 acid amin, LOD trong
khoảng 0,1-0,3 μg.mL-1
6

Bjorn
và

Thiele Mẫu

cộng

sự mạch

(2008) [27]

Lúa Sắc ký lỏng khối phổ LC-MS-MS
Cột trao đổi cation 5 μm SCX 100A,
150x2 mm
Thời gian phân tích 75 phút
Phân tích 20 acid amin, LOD trong
khoảng 0,1-0,3 μmol.L-1

7

Tomoyoshi

Điện di mao quản khối phổ CE-ESI-MS

Soga,

David

Cột mao quản 100 cm x 50 μm

N.

Heiger

Thời gian phân tích 17 phút
Phân tích 19 acid amin, LOD trong

(2000) [25]

khoảng 0,3-1,1 μmol.L-1
8

Hubertus

C. Huyết

M. T. Prinsen tương

Sắc ký lỏng tương tác thân nước HILIC
detector ESI-MS
Cột BEH Amid (100x2,1 mm, 1,7μm)

12


và

cộng

Thời gian phân tích 18 phút

sự

Phân tích 36 acid amin (định lượng 24

(2016) [21]

acid amin), LOD 0,0002-0,11 μmol.L-1
9

Lê

Duy Dịch

sinh Sắc ký lỏng siêu hiệu năng UPLC

Cường,

Trần học (huyết Cột MassTrak AAA (150x2,1 mm, 1,7

Thị Chi Mai tương, nước μm)
(2016) [6]

tiểu)

Dẫn xuất hóa trước cột: AQC
Phân tích 26 acid amin, LOQ 5 μmol.L-1

10

Nguyễn
Diệu,
Định

Thị Mẫu nhung Sắc ký lỏng pha đảo
Vĩnh hươu (khô, Cột C18 (250x4,6 mm, 5 μm)
(2014) tươi,

[7]

nang)

viên Dẫn xuất hóa trước cột: DABS-Cl
Thời gian phân tích 44 phút
Định tính được 10 acid amin, Định lượng
đồng thời được 6 acid amin.

Do kỹ thuật HILIC có khả năng lưu giữ tốt các chất phân cực nhỏ tốt hơn
RP-LC [12], [13], [14], [18]. Thành phần pha động trong HILIC (nước và ACN)
có λcut-off thấp (190nm) cho phép phát hiện được chất phân tích tại bước sóng UV
thấp. Lựa chọn HILIC với detector UV như một phương pháp để phân tích trực
tiếp không qua dẫn xuất hóa các acid amin là hợp lý.
Ngoài ra, hiện nay, các nghiên cứu phân tích acid amin hầu hết tập trung sử
dụng sắc ký lỏng pha đảo có dẫn xuất hóa trước cột. Trên thế giới, các nghiên cứu
sử dụng HILIC phân tích đồng thời nhiều acid amin được thực hiện chưa nhiều
và chủ yếu sử dụng detector MS. Ở Việt Nam, kĩ thuật HILIC còn mới và chưa
có các nghiên cứu sử dụng HILIC để phân tích đồng thời nhiều acid amin. Vì vậy,
tôi tiến hành đề tài nghiên cứu này với mục tiêu khảo sát và tìm hiểu sự thay đổi
pH của các dung môi pha động thường sử dụng trong HILIC, khảo sát và đánh
giá các đặc điểm lưu giữ của các acid amin trong các điều kiện sắc ký HILIC khác
nhau và đưa ra được phương pháp phân tích đồng thời nhiều acid amin bằng
HILIC với detector UV.
13

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

Đối tượng nghiên cứu.
Đối tượng nghiên cứu của đề tài bao gồm:
• Chất chuẩn của 16 acid amin cơ bản: Acid aspatic, Acid glutamic,
Methionin, Serin, Glycin, Alanin, Prolin, Leucin, Isoleucin,
Threonin, Valin, Phenylalanin, Tryptophan, Tyrosin, Cystein,
Glutamin.
• Chế phẩm tiêm truyền Kidmin 7,2% dùng để cung cấp acid amin cho
bệnh nhân suy thận. Chế phẩm chứa 17 acid amin cơ bản.

2.2.

Nguyên vật liệu.

2.2.1. Hóa chất
• Các chuẩn acid amin:
o Acid aspatic (99,0%), Methionin (99,7%), Serin (99,18%), Glycin
(99,1%), Alanin (100,64%), Leucin (99,14%), Isoleucin (99,93%),
Prolin (99,3%), Threonin (100,26%), Tryptophan (99,12%),
Phenylalanin (99,48%), Valin (99,86%); Viện Kiểm nghiệm thuốc
Trung Ương.
o Cystein Hydroclorid (98%), Glutamic mononatri hydrat (98%),
Glutamin (99%); Sigma
o Tyrosin (99,4%); Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh.
• Acetonitril dùng cho HPLC: sản xuất bởi Merck – Đức.
• Acid acetic băng dùng cho HPLC: sản xuất bởi Merck – Đức.
• Acid formic dùng cho MS: sản xuất bởi Merck – Đức.

• Amoni acetat dùng cho HPLC: sản xuất bởi Merck – Đức.
• Nước cất hai lần.
2.2.2. Thiết bị dụng cụ
• Hệ thống máy HPLC Agilent 1100 và 1200 series và phần mềm
chemstation.
• Cột sắc ký: Cột Supelco Ascentis Silica (250x4,6 mm, 5 µm), cột Zorbax
RX-Sil (150x4,6 mm, 5 µm), cột Zorbax NH2 (150x4,6 mm, 5 μm).
14


• Máy lắc Labinco L46 (Đài Loan).
• Máy lọc hút chân không Rocker 400.
• Màng lọc cellulose 0,45 µm.
• Cân phân tích Sartorius TE214S Thụy Sĩ (d = 0,01 mg).
• Máy siêu âm Ultrasonic LC60H (Hà Lan).
• Máy đo pH Mettler tolero.
• Micropipet 100-1000 µL, 10-100 µL. (Đức).
• Bình định mức: 5,00 ml, 20,00 ml, 25,00 ml, 100,0 ml.
• Tủ lạnh sâu PANASONIC MDF-594.
• Các dụng cụ khác: pipet Pasteur, pipet chia vạch, cốc có mỏ, ống đong, đũa
thủy tinh, vial, bình nón, …
2.2.3. Chuẩn bị mẫu
Dung dịch chuẩn đơn gốc:
• Cân chính xác khoảng 5,0 mg chuẩn từng acid amin vào bình định
mức 5,00 mL (trừ Tyrosin), thêm nước cất vừa đủ thu được dung
dịch chuẩn gốc acid amin 1mg/mL (1000 ppm).
• Cân chính xác khoảng 5,0 mg chuẩn Tyrosin vào bình định mức
25,00 mL, thêm nước cất vừa đủ thu được dung dịch chuẩn gốc
Tyrosin 0,25 mg/mL (250 ppm).
Các dung dịch chuẩn gốc acid amin (trừ Cystein) được bảo trong tủ lạnh

(2-80C), dung dịch Cystein được bảo quản trong tủ đông (-800C).
Dung dịch chuẩn chạy sắc ký ở các nồng độ được pha từ chuẩn đơn gốc
trong dung môi pha động.
• Chuẩn10 ppm: 10 μL chuẩn gốc + 990 μL dung môi pha động.
• Chuẩn 50 ppm: 50 μL chuẩn gốc + 950 μL dung môi pha động.
Mẫu thử: pha loãng 1 mL chế phẩm Kidmin 7,2% trong H2O vừa đủ thành
dung dịch 20mL. Trộn 100 μL dung dịch chế phẩm vừa pha loãng với 900 μL
dung môi pha động tạo thành mẫu thử chạy sắc ký.
2.2.4. Chuẩn bị các dung dịch làm việc
15