NGHIÊN CỨU LOẠI CAFEIN TỪ DỊCH CHIẾT LÁ CHÈ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HẤP PHỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THU HÀ

NGHIÊN CỨU LOẠI CAFEIN TỪ DỊCH CHIẾT
LÁ CHÈ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HẤP PHỤ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THU HÀ

1401169

NGHIÊN CỨU LOẠI CAFEIN TỪ DỊCH CHIẾT
LÁ CHÈ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HẤP PHỤ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
DS. Trần Trọng Biên
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công Nghiệp Dược

HÀ NỘI – 2019

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn trân trọng và sâu sắc tới DS. Trần Trọng
Biên, tổ Chiết xuất - bộ môn Công nghiệp Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội
đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ và tạo điệu kiện tốt nhất để em có thể hoàn
thành tốt khóa luận tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Nguyễn Văn Hân, TS. Bùi Thị Thúy
Luyện đã nhiệt tình chỉ bảo, giúp đỡ em hoàn thành khóa luận.
Em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, các thầy cô giáo Trường đại học
Dược Hà Nội, các thầy cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên của bộ môn Công
Nghiệp Dược đã tạo điều kiện cho em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè luôn bên cạnh ủng
hộ, động viên, giúp đỡ em những lúc khó khăn để em có thể đạt được kết quả ngày
hôm nay.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 05 năm 2019
Sinh viên
Nguyễn Thu Hà


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC HÌNH VẼ
ĐẶT VẤN ĐỀ
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .............................................................................. 2
1.1. Giới thiệu về cây Chè ................................................................................. 2
1.1.1. Đặc điểm thực vật, phân bố................................................................. 2
1.1.2. Tình hình sản xuất Chè tại Việt Nam.................................................. 2
1.1.3. Thành phần hóa học ............................................................................ 2

1.2. Một số nghiên cứu về loại cafein từ Chè xanh .......................................... 6
1.2.1. Loại cafein từ lá Chè ........................................................................... 6
1.2.2. Loại cafein từ dịch chiết lá Chè .......................................................... 8
1.3. Một số chất hấp phụ sử dụng trong nghiên cứu ......................................... 9
1.3.1. Montmorillonit .................................................................................... 9
1.3.2. Nhựa macroporous ............................................................................ 13
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU .................................................................................................... 15
2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị.............................................................. 15
2.1.1. Nguyên liệu ....................................................................................... 15
2.1.2. Chất chuẩn và hóa chất ..................................................................... 15
2.1.3. Thiết bị thí nghiệm ............................................................................ 17
2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 17
2.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 17
2.3.1. Chiết xuất và điều chế cao thô .......................................................... 17
2.3.2. Quá trình hấp phụ .............................................................................. 18
2.3.3. Phương pháp định lượng cafein và EGCG ....................................... 19
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................ 21
3.1. Thẩm định phương pháp định lượng cafein và EGCG trong lá Chè xanh
......................................................................................................................... 21


3.1.1. Độ đặc hiệu........................................................................................ 21
3.1.2. Độ thích hợp hệ thống ....................................................................... 22
3.1.3. Khoảng tuyến tính ............................................................................. 22
3.1.4. Độ lặp lại ........................................................................................... 23
3.1.5. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ....................................... 24
3.2. Nghiên cứu sàng lọc các chất hấp phụ ..................................................... 24
3.2.1. Tính chọn lọc của các chất hấp phụ .................................................. 25
3.3.2. So sánh các chất hấp phụ .................................................................. 26

3.3. Nghiên cứu loại cafein bằng MMT .......................................................... 26
3.3.1. Động học hấp phụ cafein trên MMT ................................................. 26
3.3.2. Đường hấp phụ đẳng nhiệt ................................................................ 29
3.3.3. Ảnh hưởng của pH dịch chiết ........................................................... 32
3.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ .................................................................... 32
3.3.5. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol ....................................................... 33
3.4. Quy trình loại cafein................................................................................. 34
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ............................................................................... 38
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................... 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

EGCG

Epigallocatechin gallat

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High Performance Liquid Chromatography)

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ

Giới hạn định lượng (Litmit of Quantifitation)

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

tt/tt

Thể tích/thể tích

kl/tt

Khối lượng/thể tích


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Kết quả thời gian lưu và diện tích píc của dung dịch chuẩn hỗn hợp 22
Bảng 3.2. Mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ cafein và EGCG ....... 23
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng .................. 24
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thời gian đến dung lượng hấp phụ của cafein trên
MMT ................................................................................................................... 27
Bảng 3.5. Dữ liệu thực nghiệm mô hình giả bậc 1 ............................................. 28
Bảng 3.6. Dữ liệu thực nghiệm mô hình giả bậc 2 ............................................. 28
Bảng 3.7. Các thông số mô hình động học hấp phụ cafein trên MMT 4 ............ 29
Bảng 3.8. Kết quả thực nghiệm hấp phụ đẳng nhiệt của cafein trên MMT ở 25oC
............................................................................................................................. 30
Bảng 3.9. Các thông số mô hình hấp phụ đẳng nhiệt của cafein trên MMT ở

25°C ..................................................................................................................... 31
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của pH dịch chiết đến quá trình loại cafein ................... 32
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình loại cafein ........................... 33
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến quá trình loại cafein............... 34


DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của một số loại catechin .......................................... 3
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của cafein ................................................................ 5
Hình 1.3. Cấu trúc phân tử của montmorillonit .................................................. 10
Hình 1.4. Các vị trí tương tác của montmorillonit .............................................. 11
Hình 3.1. Sắc ký đồ HPLC thẩm định độ đặc hiệu ............................................. 21
Hình 3.2. Đường chuẩn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ ............. 23
Hình 3.3. Ảnh hưởng của các loại chất hấp phụ đến dung lượng hấp phụ cafein,
EGCG và hệ số chọn lọc ..................................................................................... 25
Hình 3.4. Ảnh hưởng của các loại chất hấp phụ đến tỷ lệ cafein loại đi và tỷ lệ
EGCG còn lại trong dịch chiết ............................................................................ 26
Hình 3.5. Động học hấp phụ cafein trên MMT 4 ................................................ 27
Hình 3.6. Đồ thị động học hấp phụ cafein từ dung dịch cafein (a) và dịch chiết
(b) trên MMT theo mô hình giả bậc 1. ................................................................ 28
Hình 3.7. Đồ thị động học hấp phụ cafein từ dung dịch cafein (c) và dịch chiết
(d) trên MMT theo mô hình giả bậc 2. ................................................................ 28
Hình 3.8. Đường đẳng nhiệt hấp phụ cafein trên MMT ở 25°C ......................... 30
Hình 3.9. Đồ thị hấp phụ đẳng nhiệt của cafein trên MMT ở 25°C ................... 31
Hình 3.10. Đồ thị ảnh hưởng của pH dịch chiết đến quá trình loại cafein ......... 32
Hình 3.11. Đồ thị ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình loại cafein .................. 33
Hình 3.12. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến quá trình loại cafein ..... 34
Hình 3.13. Sơ đồ tóm tắt quy trình loại cafein từ dịch chiết Chè ....................... 35
Hình 3.14. Cao loại cafein................................................................................... 35
Hình 3.15. Sắc ký đồ cao thô (a) và cao loại cafein lần 1,2,3 (b1, b2, b3) ......... 37

Hình 4.1. Minh họa cơ chế hấp phụ cafein trên montmorillonit ......................... 39
Hình 4.2. Dịch chiết Chè tự nhiên (1), dịch chiết có MMT và acid citric (2) và
dịch chiết có MMT không có acid citric (3) sau khi lắc 1 giờ ............................ 40


ĐẶT VẤN ĐỀ
Chè xanh (Camellia sinensis (L.) Kuntze), thuộc họ Chè - Theaceae, là loài
cây được phát triển mạnh trên nhiều nước trên thế giới [2]. Trong Chè xanh,
Catechin - nhóm các hợp chất polyphenol đã được biết đến với hoạt tính chống
oxy hóa nổi bật giúp giảm thiểu nguy cơ nhiều bệnh như ung thư, tiểu đường, béo
phì, lão hóa. Trong đó, epigallocatechin gallat (EGCG) là catechin chính trong
Chè xanh với hàm lượng lớn nhất (khoảng 50% tổng lượng catechin) [16].
Tuy nhiên, trong lá Chè còn chứa một lượng lớn cafein (khoảng 2 %) với các
tác động tiêu cực gồm rối loạn giấc ngủ, tăng huyết áp, rối loạn tiêu hóa, sẩy thai
[6]. Do đó, nhu cầu sử dụng các sản phẩm chứa hàm lượng cafein thấp từ Chè
xanh của người tiêu dùng hiện nay ngày càng gia tăng. Đến nay đã có nhiều
phương pháp loại cafein dựa trên hai hướng tiếp cận là loại bỏ cafein từ lá Chè
trong quá trình xử lý nguyên liệu và loại bỏ cafein trong dịch chiết Chè. Nhưng
chưa có phương pháp nào thực sự hiệu quả vì hàm lượng cafein bị loại đi còn thấp
hoặc ngoài cafein còn làm giảm đáng kể các chất khác như catechin trong Chè
[32].
Trên thế giới hiện nay, các chất hấp phụ (như montmorillonit) đang ngày
càng được phát triển và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực do khả năng hấp phụ chọn
lọc, an toàn, kinh tế [25]. Nhằm ứng dụng phương pháp hấp phụ vào việc tạo ra
sản phẩm cao Chè ít cafein, đề tài “Nghiên cứu loại cafein từ dịch chiết lá Chè
bằng phương pháp hấp phụ” được thực hiện với mục tiêu:
Khảo sát và lựa chọn được các thông số kỹ thuật thích hợp cho quá trình loại
cafein từ dịch chiết lá Chè xanh bằng montmorillonit.

1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về cây Chè
1.1.1. Đặc điểm thực vật, phân bố
Chè hay còn gọi là trà, có tên khoa học là Camellia sinensis (L.) O.Kuntze,
thuộc họ Chè - Theaceae [2].
Chè là cây thân gỗ, mọc hoang, khi không cắt xén có thể cao tới 10 mét,
đường kính thân lớn, có thể một người ôm không xuể. Đôi khi mọc thành rừng gỗ
trên núi đá cao. Nhưng khi trồng, để phù hợp với việc thu hái, người ta thường cắt
tỉa để cây chỉ cao ít nhất là 2 mét. Nhiều cành đâm ngay từ gốc. Lá mọc so le,
không rụng. Hoa to trắng, mọc ở kẽ lá, mùi thơm, nhiều nhị. Quả nang, thường có
3 ngăn nhưng chỉ có một hạt do các hạt khác teo đi [5].
Cây Chè được trồng phổ biến ở nhiều nước trên thế giới, tiêu biểu là Trung
Quốc, Ấn Độ, Việt Nam, Nhật Bản và một số nước châu Á. Ở nước ta, Chè được
trồng khắp nơi, nhất là những vùng đồi, núi thấp, tương đối bằng phẳng. Cây thích
nghi với khí hậu nhiệt đới, ưa ánh sáng, chịu hạn. Chè không kén đất, nhưng chất
đất, nhất là các yếu tố vi lượng có ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng, hương vị của
Chè. Đây là nguyên nhân Chè được trồng chủ yếu ở Thái Nguyên, Tuyên Quang,
Hà Giang, Phú Thọ, Lâm Đồng, Đắc Lắc… [4], [5].
1.1.2. Tình hình sản xuất Chè tại Việt Nam
Việt Nam là một nước có sản lượng Chè lớn. Năm 2018, tổng diện tích trồng
Chè cả nước khoảng 134,7 nghìn hecta, sản lượng Chè búp đạt 1 triệu tấn, với rất
nhiều loại Chè thương phẩm khác nhau, trong đó chủ yếu là Chè đen, còn lại là
Chè xanh và các loại khác. Chè cũng là một trong những mặt hàng xuất khẩu quan
trọng của Việt Nam [1], [4].
1.1.3. Thành phần hóa học
Thành phần hóa học của Chè biến đổi phụ thuộc vào giống, tuổi Chè, điều
kiện đất đai, địa hình, kỹ thuật canh tác và mùa thu hoạch [2]. Trong búp Chè có
polyphenol (30 - 36%), cafein (3 - 5%), protein, carbohydrat, theanin, acid amin,

acid hữa cơ, chlorophyll, enzym, chất khoáng,… Trong đó, polyphenol (chủ yếu

2


là các catechin) và cafein là những thành phần quan trọng quyết định hương vị
của sản phẩm [1].
1.1.3.1. Catechin
Cấu trúc:
Catechin là tên gọi chung chỉ các flavonoid mang khung flavan-3-ol thường
gặp trong lá Chè và còn được gọi là catechin Chè xanh, polyphenol Chè xanh.
Trong cấu trúc của catechin có 2 C bất đối (C2 và C3), mỗi dẫn chất có 4 đồng
phân nên có thể có 24 catechin khác nhau, tuy nhiên hiện nay mới có 12 catechin
đã được được phân lập và xác định cấu trúc từ lá Chè xanh [1].

1

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của một số loại catechin

Về cấu tạo, các catechin có thể chia thành 2 nhóm: epicatechin (đồng phân
2R và 3R) và nonepicatechin (catechin), cũng có thể phân thành catechin tự do và
catechin ester hóa [1].

3


Catechin Chè xanh chủ yếu là các epicatechin, trong đó EGCG chiếm 10 50% tổng lượng catechin. Nonepicatechin chỉ chiếm một lượng nhỏ. Hàm lượng
mỗi catechin trong các giống Chè và các bộ phận của Chè khác nhau, giảm dần
theo thứ tự EGCG > EGC > ECG >EC [1].
Tính chất:

Catechin là các hợp chất không màu, kết tinh hình kim hoặc hình lăng trụ,
có vị chát. Tan trong nước và một số dung môi hữu cơ [1].
Catechin có tính khử mạnh, dễ bị oxy hóa, nhạy cảm với enzym oxy hóa
trong lá Chè. Catechin kém bền với môi trường acid mạnh, phân hủy nhanh trong
khoảng pH từ 4 đến 8, đặc biệt kém bền trong môi trường pH > 8. Catechin bền
vững nhất trong môi trường acid nhẹ (pH ~ 4). Ngoài ra, catechin còn kém bền
với nhiệt độ (> 80oC) [1].
Do vậy để tăng độ ổn định của catechin trong quá trình chiết xuất, cần kiểm
soát chất lượng nước, nhiệt độ chiết xuất ,bổ sung các chất chống oxy hóa, ổn định
và điều chỉnh pH (EDTA, acid ascorbic, acid citric…) [1].
Tác dụng dược lý:
Tác dụng nổi bật nhất của các catechin là khả năng chống oxy hóa. Trong đó
EGCG là chất có hoạt tính cao nhất, hoạt tính chống oxy hóa của EGCG cao gấp
100 lần vitamin C và cao hơn 25 lần so với vitamin E [13]. Ngoài ra, catechin còn
có tác dụng chống ung thư, diệt khuẩn, kháng viêm, kháng virus, giảm cholesterol,
chống lão hóa, tiểu đường [16]. Do vậy, catechin Chè xanh được sử dụng rộng rãi
trong các ngành công nghệ thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm và dinh dưỡng.
1.1.3.2. Cafein
Trong lá Chè, cafein là alkaloid chính (2,5 - 4,5%), ngoài ra còn có lượng rất
nhỏ theophyllin, theobromin, adenin và xanthin [2]. Thông thường, một cốc trà
250 ml chứa 10 - 45 mg cafein, và hàm lượng này thay đổi tùy theo lượng trà, thể
tích nước, nhiệt độ pha và thời gian hãm trà [35].

4


2

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của cafein

Công thức phân tử: C8H10N4O2. Trọng lượng phân tử: 194,2 [3].
Tính chất:
Cafein ở dưới dạng tinh thể trắng, mịn hay bột kết tinh trắng, không mùi, vị
hơi đắng, nóng chảy ở 234oC - 238°C. Khi đun nóng ở 100oC cafein sẽ mất nước
và thăng hoa ở khoảng 200oC [3].
Cafein hơi tan trong nước, dễ tan trong nước sôi, cloroform, khó tan trong
ethanol và ether, tan trong các dung dịch acid và trong các dung dịch đậm đặc của
benzoat hay salicylat kiềm. Dung dịch cafein trong nước có phản ứng trung tính
với giấy quỳ [3].
Cafein là một chất có hoạt tính base yếu, chỉ tạo muối với các acid mạnh và
các muối này không bền, dễ bị phân ly. Trong môi trường kiềm, cafein dễ bị phân
hủy thành chất có độc tính là cafeidin [3].
Tác dụng dược lý:
Cafein được biết đến là hoạt chất có tác dụng kích thích thần kinh trung ương,
do vậy khi cơ thể tiêu thụ hàm lượng thấp, cafein mang lại nhiều tác dụng có lợi
như làm tăng sự tỉnh táo và giảm mệt mỏi [3], [33]. Tuy nhiên, nếu tiêu thụ cafein
thường xuyên dù ở hàm lượng thấp cũng sẽ gây ra các tác dụng không mong muốn
như tăng cảm giác hồi hộp, lo âu, mất ngủ, mệt mỏi, kích ứng đường tiêu hóa,
tăng huyết áp, nhịp tim nhanh, đẻ non và sẩy thai [6], [11].
Giới hạn về liều:
EFSA tuyên bố rằng tiêu thụ 5 mg/kg trọng lượng cơ thể có thể tạo ra những
thay đổi hành vi nhất thời như tăng hưng phấn, khó chịu, hồi hộp hoặc lo lắng ở
trẻ em. Bộ Y tế Canada đã có khuyến nghị hạn chế lượng cafein của trẻ em (45mg

5


đối với trẻ em từ 4 - 6 tuổi; 62,5 mg: 7 - 9 tuổi; và 85 mg: 10 - 12 tuổi), đối với
thanh thiếu niên (> 13 tuổi) không quá 2,5 mg/kg trọng lượng cơ thể [8].
Phụ nữ có thai cũng là một đối tượng nhạy cảm với cafein, có một số khuyến

nghị của các cơ quan quản lý về hạn chế lượng cafein trong thai kỳ từ 200 đến
300 mg/ngày. Khuyến cáo giới hạn lượng cafein tiêu thụ cũng được đưa ra cho
những đối tượng có tình trạng sức khỏe đặc biệt như tăng huyết áp, tiểu đường
type II hoặc rối loạn nhịp tim [8].
Việc tranh luận về rủi ro tiền ẩn của cafein ngày càng tăng trong cộng đồng
khoa học [8]. Mặc dù có một số tác dụng dược lý nhất định, nhưng sử dụng thường
xuyên và quá mức cafein gây ra nhiều tác dụng bất lợi như trên. Cùng với sự phát
triển của đời sống xã hội, hiện nay nhu cầu về các loại sản phẩm chứa hàm lượng
cafein thấp từ Chè (lá Chè loại cafein, cao Chè loại cafein) là rất lớn. Do vậy, việc
sản xuất ra sản phẩm cao khô Chè có hàm lượng cafein thấp đã thu hút được nhiều
sự quan tâm của các nhà khoa học.
1.2. Một số nghiên cứu về loại cafein từ Chè xanh
Các nghiên cứu về loại cafein trên Chè xanh chủ yếu dựa trên hai hướng tiếp
cận: một là loại bỏ cafein từ lá Chè trong quá trình xử lý nguyên vật liệu và hai là
loại bỏ cafein trong dịch chiết Chè [32]. Sau đây là các phương pháp phổ biến
nhất được sử dụng để loại cafein.
1.2.1. Loại cafein từ lá Chè
1.2.1.1. Loại cafein bằng dung môi hữu cơ
Phương pháp này dựa trên khả năng hòa tan chọn lọc của các dung môi hữu
cơ đối với cafein so với catechin để chiết loại bỏ cafein. Độ tan của cafein trong
dung môi hữu cơ gấp khoảng 10 lần so với trong nước ở nhiệt độ phòng [30]. Một
số dung môi được sử dụng trong khoảng những năm 1970 là cloroform, methylen
chlorid, dichloromethane, ethyl acetat [35]. Ưu điểm của phương pháp này là chi
phí vận hành tương đối thấp. Tuy nhiên, một số thành phần khác có lợi cho sức
khỏe đặc biệt là EGCG cũng bị loại bỏ cùng với cafein [7], kèm theo việc sử dụng
một lượng lớn các dung môi hữu cơ độc hại và tồn dư dung môi trong sản phẩm

6

có thể gây nên các vấn đề liên quan đến môi trường và sức khỏe người tiêu dùng
[21].
Gần đây, một dung môi hữu cơ khác thân thiện hơn với môi trường đã được
nghiên cứu khả năng loại bỏ cafein là ethyl lactat cho thấy tính chọn lọc với cafein
khá cao. Hơn nữa, ethyl lactate đã được phê duyệt bởi Cục Quản lý Thực phẩm
và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) là dược phẩm và phụ gia thực phẩm [34]. Tuy
nhiên, đây là dung môi phân hủy sinh học nên đắt tiền và chưa được ứng dụng
nhiều.
1.2.1.2. Loại cafein bằng nước nóng
Phương pháp dựa vào tính tan tốt của cafein trong nước nóng để chiết loại
bỏ cafein trong lá Chè xanh. Nước là một dung môi an toàn, thân thiện với môi
trường, tương đối rẻ tiền và dễ tiếp cận hơn so với các dung môi hữu cơ. Chè sau
khi khử cafein bằng nước cũng giảm thiểu bị mất đi hương vị so với khử cafein
bằng dung môi hữu cơ [35].
Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất loại cafein là nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ
dung môi/nguyên liệu. Kết quả cho thấy điều kiện tối ưu để loại cafein trong lá
Chè tươi là nhiệt độ 100°C, trong 3 phút và tỷ lệ lá Chè với nước là 1:20 (kl/tt).
Tuy nhiên phương pháp này chỉ áp dụng với mẫu lá Chè tươi, vì một phần lớn
catechin cũng bị mất đi khi thử nghiệm trên các mẫu lá Chè khô. Quá trình sấy
khô và rây có thể phá hủy các tế bào lá dẫn đến một số thành phần hóa học trong
lá Chè bao gồm catechin và cafein được ép ra trên bề mặt của lá. Trong trường
hợp này, catechin và cafein dễ dàng hòa tan trong nước khi lá Chè khô được xử
lý nước nóng [19].
1.2.1.3. Loại cafein bằng vi sinh vật và enzym
Cơ chế của phương pháp này là vi sinh vật dùng cafein làm nguồn carbon và
nitơ cho quá trình sinh trường và phát triển, từ đó giúp giảm hàm lượng cafein
trong lá Chè. Các chủng cho tác dụng tốt là Bacillus sp. Mặc dù có ưu điểm là
thân thiện môi trường, không tồn dư hóa chất, không gây độc hại nhưng phương
pháp này rất khó để nâng cấp quy mô và đòi hỏi kiểm soát nghiêm ngặt các điều

7


kiện như chủng vi sinh vật, hàm lượng cafein ban đầu, nhiệt độ tiến hành, thời
gian ủ [12], [28].
1.2.1.4. Loại cafein bằng công nghệ biến đổi gen
Con đường sinh tổng hợp cafein trong Chè được đề xuất liên quan đến 3
enzym N-methyltransferase gồm xanthosin methyltransferase, 7-N methylxanthin
methyltransferase và 3, 7-dimethylxanthin methyltransferase. Hai bước cuối trong
quá trình này được xúc tác bởi enzym có tên gọi cafein synthase. Do đó, một
phương pháp loại cafein được để xuất là tiến hành bất hoạt mRNA sau quá trình
dịch mã của cafein synthase mRNA. Các giống Chè biến đổi gen cho thấy mức
độ giảm biểu hiện gen cafein synthase và làm giảm 44 - 61% lượng cafein và 46
- 67% lượng theobromin so với nhóm chứng [22]. Tuy nhiên, đây là công nghệ
mới cần được tiếp tục nghiên cứu thử nghiệm, kiểm chứng về mức độ hiệu quả và
các ảnh hưởng của thực vật biến đổi gen đến sức khỏe con người.
1.2.1.5. Loại cafein bằng dung môi siêu tới hạn
Sử dụng dung môi siêu tới hạn là phương pháp hiện đại để loại cafein từ lá
Chè xanh. Quá trình được tiến hành như sau: lá Chè được nghiền thành các tiểu
phân có kích thước nhỏ (< 1 mm), sau đó trộn với đồng dung môi (ví dụ ethanol
95%) để tăng hiệu suất chiết cafein và nạp vào bình chiết. CO2 lỏng được bơm
theo áp suất định trước, qua hệ thống gia nhiệt và chảy vào bình chiết. Cafein hòa
tan trong CO2 siêu tới hạn và được chảy qua bình tách, tại đây, cafein được tách
khỏi khí CO2 bằng cách giảm áp suất. Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất loại
cafein như kích thước nguyên liệu, hàm lượng cafein trong nguyên liệu ban đầu,
loại và lượng đồng dung môi sử dụng, áp suất, nhiệt độ và tốc độ dòng CO2 [26].
Ưu điểm của phương pháp này là không tồn dư dung môi do CO2 dễ dàng được
loại bỏ, ít làm phân hủy các catechin và giữ lại được mùi vị đặc trưng của lá Chè
[14]. Tuy nhiên phương pháp xử lý này phức tạp và tốn kém hơn so với dung môi
lỏng nên chưa được áp dụng nhiều trong thực tế.

1.2.2. Loại cafein từ dịch chiết lá Chè
1.2.2.1. Loại cafein bằng kỹ thuật chiết phân bố lỏng lỏng

8


Phương pháp này sử dụng độ tan và sự phân bố chọn lọc của các hợp chất
catechin và cafein trong các dung môi. Dịch chiết nước từ lá Chè được chiết phân
bố với dung môi hữu cơ (ethyl acetat), sau đó pha ethyl acetat tiếp tục được chiết
phân bố với dung dịch acid citric. Trong đó catechin sẽ thu được ở pha ethyl
acetat, cafein bị giữ lại ở pha dung dịch acid citric với 78,8% lượng cafein được
loại bỏ [9], [29]. Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là sử dụng lượng
lớn các dung môi hữu cơ độc hại, quy trình gồm nhiều bước, khó nâng quy mô,
hiệu suất thu hồi và hàm lượng catechin thu được không cao.
1.2.2.2. Loại cafein bằng các chất hấp phụ chọn lọc
Đây là phương pháp được nghiên cứu nhiều nhất trong những năm gần đây
nhằm loại bỏ chọn lọc cafein khỏi dịch chiết lá Chè. Đã có nhiều nhóm chất hấp
phụ từ tự nhiên đến tổng hợp đã được nghiên cứu như than hoạt [37], cyclodextrin
[10], nhựa hấp phụ macroporous [31], vật liệu trao đổi ion [32]. Ưu điểm lớn nhất
của nhóm phương pháp này là việc không sử dụng các dung môi hữu cơ độc hại.
Một số chất hấp phụ có dung lượng hấp phụ cao, chọn lọc với cafein, có thể tái sử
dụng tốt và dễ dàng nâng quy mô.
Tuy nhiên cafein có các tính chất lý hóa kích thước phân tử và độ tan tương
tự như các catechin trong lá Chè, do đó việc loại bỏ triệt để thành phần này rất
khó khăn. Trong nhiều trường hợp cần kết hợp các phương pháp khác nhau như
khử cafein một phần từ nguyên liệu ban đầu và kỹ thuật hấp phụ [37], chiết phân
bố lỏng lỏng và kỹ thuật hấp phụ [20]. Các kỹ thuật này có thể tiến hành lần lượt
hoặc kết hợp trong cùng một bước tinh chế với trung tâm là phương pháp hấp phụ
trên chất mang.
1.3. Một số chất hấp phụ sử dụng trong nghiên cứu

1.3.1. Montmorillonit
Montmorillonit (MMT) là một khoáng sét đa chức năng, thành phần chính
của bentonit, thuộc họ smectit, được hình thành do sự phong hóa tro núi lửa [23].
MMT với các tính chất độc đáo như trương nở và hấp phụ đã được ứng dụng rộng
rãi trong y tế và nhiều lĩnh vực trong công nghiệp [27].

9


1.3.1.1. Cấu trúc
Tinh thể MMT có cấu trúc lớp 2:1, mỗi một lớp gồm 3 tầng xếp chồng lên
nhau với 2 tấm silica tứ diện (tetrahedral silicate - Si4O6(OH)4) kẹp 1 tấm nhôm
oxyd bát diện (octahedral alumina - Al(OH)6), bề dày và bề rộng của mỗi lớp
tương ứng khoảng 1 và 100 -1000 nm [25].
Công thức hóa học được đề xuất là Si8Al3.5Mg0.5O20(OH)4. Nếu thay thế đồng
hình phân tử trung tâm Si4+ bởi Al3+ và phân tử trung tâm Al3+ bởi Mg2+ hoặc Fe2+
sẽ tạo ra những lớp có bề mặt tích điện âm. Bề mặt mang điện tích được cân bằng
qua việc hấp phụ các cation như Li+, Na+, Ca2+. Những cation này có thể dễ dàng
thay thế bằng khác cation hữu cơ hoặc vô cơ khác, liên quan đến tính chất ưa
nước, trương nở, hấp phụ của montmorillonit. MMT cũng mang các nhóm
hydroxyl trên bề mặt giúp tăng cường khả năng hấp phụ các phân tử mục tiêu
bằng các liên kết yếu như liên kết hydro [27].

3

Hình 1.3. Cấu trúc phân tử của montmorillonit

1.3.1.2. Tính chất
Tính ưa nước và trương nở
Một trong những tính chất vật lý độc đáo của MMT là tính ưa nước và trương

nở trong nước. Do bề mặt lớp MMT tích điện âm nên H3O+ sinh ra từ sự tự ion

10


hóa của nước có thể dễ dàng xâm nhập vào lớp xen kẽ. Trạng thái vật lý của MMT
có thể thay đổi từ chất rắn khan thành dạng ngậm nước, bán rắn, gel và huyền phù
tùy thuộc vào sự gia tăng hàm lượng nước. Trong đó sự thay đổi trạng thái vật lý
từ chất rắn khan sang dạng gel được gọi là sự trương nở. Sự trương nở này phụ
thuộc vào khoáng vật học, kích thước, điện tích âm và năng lượng hydrat hóa của
các cation trao đổi. Vd: Natri montmorillonit có khả năng tăng thể tích lên tới 20
lần sau khi hấp phụ nước [25], [27].
Tính hấp phụ
Một đặc tính khác của MMT là sự hấp phụ. Bởi vì giữa các lớp 2:1 của MMT
có chứa cation trao đổi, một số phân tử xen kẽ vào giữa các lớp bằng cách trao
đổi ion. Các phân tử với độ phân cự khác nhau chẳng hạn như alcol mạch ngắn,
glycerol, carbohydrat, ethylen glycol, aliphatic amin, aromatic amin và các chất
màu hữu cơ, được hấp phụ mạnh trên bề mặt của các lớp của MMT. Mặt khác,
các phân tử không phân cực, như nitơ, argon và ethan không kết hợp được với
MMT. Cụ thể, các phân tử này có thể được hấp phụ trên bề mặt nhưng không thể
xâm nhập vào các lớp kẽ [27].

4

Hình 1.4. Các vị trí tương tác của montmorillonit

Các cơ chế hấp phụ MMT với các phân tử được đề xuất như tạo liên kết
hydro, tương tác lưỡng cực - lưỡng cực, tương tác ion - lưỡng cực, liên kết cộng

11

hóa trị, tạo cặp ion, tương tác ion - pi và trao đổi ion với các vị trí liên kết như bề
mặt, cạnh, khoảng cách giữa các lớp [15].
1.3.1.3. Ứng dụng của montmorillonit
MMT là một khoáng sét đa chức năng và được ứng dụng trong nhiều lĩnh
vực. Trong đó, tùy nhu cầu sử dụng mà có các yêu cầu khác nhau về cách khai
thác, hoạt hóa, biến tính và chất lượng MMT.
Trong y học
MMT là dạng khoáng sét đã được tinh chế để có thể sử dụng trong ngành
công nghiệp thực phẩm và dược phẩm. MMT hấp phụ tốt các độc tố như các ion
kim loại nặng (As, Cd, Pb, Mn, Ni và Cr), các anion độc, aflatoxin, các hợp chất
nitro thơm gây ung thư, virus (ví dụ: rotavirus, coronavirus), làm lành vết thương
(các vết loét ở đường tiêu hóa, hội chứng viêm da tiếp xúc). Từ đó MMT có thể
dùng như một phương pháp chữa bệnh, giải độc. Một trong số các sản phẩm
thương mại chứa khoáng sét cấu trúc MMT đã được phát triển và có sẵn trên thị
trường dùng trong điều trị tiêu chảy nhiễm trùng cấp tính là SMECTA® [27].
Trong công nghiệp dược phẩm
Ứng dụng nổi bật nhất của MMT là làm tá dược và chất mang trong các hệ
đưa thuốc. Phức hợp MMT - dược chất có thể được tạo thành bằng kỹ thuật hấp
phụ từ dung dịch, đun chảy hoặc nghiền [27]. Trong một báo cáo, tỷ lệ sống sót
của Lactobacillus casei trong đường tiêu hóa tăng lên khi được cố định vào natri
montmorillonit [18].
Ngoài ra MMT còn có thể kết hợp với nhiều polyme tự nhiên và tổng hợp
tạo thành các vật liệu composit với các đặc tính mới làm thay đổi tính chất và
động học giải phóng, hấp thu của nhiều dược chất [27].
Trong các ngành công nghiệp khác
MMT được sử dụng để hấp phụ các chất gây ô nhiễm (các cation kim loại
nặng, các chất màu,…) trong môi trường nước, không khí, dung môi hữu cơ.
MMT còn được sử dụng làm tác nhân hấp phụ protein, làm trong rượu, nước ép

hoa quả và dầu ăn. Ngoài ra nó còn là tác nhân hấp phụ các độc tố, bổ sung vi

12


lượng và ứng dụng trong sản xuất thức ăn cho động vật. MMT cũng được sử dụng
trong công nghiệp khoan dầu, nông nghiệp, xây dựng [23], [27].
1.3.2. Nhựa macroporous
Nhựa macroporous là các polyme liên kết chéo, không ion hóa, đặc trưng bởi
số lượng lớn các lỗ xốp (đường kính > 50 Å) và có khả năng hấp phụ các phân tử
nhỏ. Nhựa được sản xuất bằng cách polyme hóa các monome (thường sử dụng
styren divinylbenzen) với sự có mặt của các chất độn (porogens) không polyme
hóa như toluen, n-heptan, isooctan và isobutanol. Các chất độn có thể trộn lẫn với
hỗn hợp monome, không hoà tan polyme, có khả năng bay hơi ở những điều kiện
nhất định sau khi kết thúc quá trình polyme hoá để lại những lỗ hổng trong cấu
trúc polyme.
Khả năng hấp phụ chọn lọc của nhựa macroporous phụ thuộc vào nhiều yếu
tố như: bản chất polyme, đường kính lỗ xốp, diện tích bề mặt riêng, độ phân cực,
các nhóm chức đặc trưng của nhựa; khối lượng phân tử, kích thước và độ phân
cực của chất tan và các điều kiện tiến hành (nồng độ, pH dịch chiết, nhiệt độ hấp
phụ, dung môi,…). Xét theo độ phân cực, nhựa macroporous được chia làm 4 loại:
không phân cực (D101, H103,…); phân cực yếu (AB-8, HPD722,…); phân cực
trung bình (ADS-17, XAD-8,…); phân cực mạnh (NKA-2, DA201,…) [17], [24].
Nhựa macroporous được phát triển và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh
vực, trong lĩnh vực chiết xuất nhựa macroporous được ứng dụng để tinh chế, phân
lập các hoạt chất tinh khiết, làm giàu hoạt chất trong các cao dược liệu. Trong đó
có nhiều ưu điểm như: cấu trúc đa dạng, khả năng lặp lại và ổn định tốt, phần lớn
đều sử dụng các dung môi “xanh” như nước và ethanol, có thể tái sử dụng, phù
hợp với nhiều nhóm hoạt chất, chi phí vận hành rẻ, phù hợp khi triển khai ở quy
mô lớn [17].

Cho đến nay, phương pháp hấp phụ đang ngày càng trở nên phổ biến đặc biệt
trong lĩnh vực dược phẩm cùng với sự khám phá ngày càng đa dạng các chất hấp
phụ trong tự nhiên và tổng hợp nhân tạo. Việt Nam hiện nay là quốc gia có ưu thế
về sản xuất và phát triển Chè, tuy nhiên các sản phẩm từ Chè vẫn dừng lại ở mức
độ đơn giản như Chè xanh, Chè đen, Chè Oolong. Để ứng dụng trong dược phẩm,
13


yêu cầu cao Chè cần được kiểm soát, chuẩn hóa về nhiều yếu tố như nguyên liệu
đầu vào, quy trình sản xuất, các chỉ tiêu chất lượng,…. Với mong muốn đa dạng
hóa và nâng cao chất lượng các sản phẩm từ Chè, tạo tiền đề ứng dụng các sản
phẩm đó trong dược phẩm, nghiên cứu này bước đầu xây dựng quy trình loại
cafein từ dịch chiết lá Chè xanh quy mô phòng thí nghiệm bằng công nghệ đơn
giản và mang tính ứng dụng cao, sản phẩm được đánh giá hàm lượng các hoạt
chất bằng phương pháp phân tích hiện đại như HPLC.

14


CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
Lá Chè xanh tươi được thu mua tại Đại Từ, Thái Nguyên tháng năm 2018 và
được giám định tên khoa học tại bộ môn Thực Vật, trường Đại học Dược Hà Nội.
Mẫu lá Chè được rửa sạch bằng nước, sấy khô trong tủ sấy tĩnh ở 50oC đến
hàm ẩm dưới 5% (khoảng 2 ngày) xay nhỏ (1 - 2 mm) và bảo quản trong túi PE
kín ở điều kiện phòng thí nghiệm.
2.1.2. Chất chuẩn và hóa chất
Chất chuẩn

- Cafein chuẩn: hàm lượng 98,73%, lô MUST-17060110 (Chengdu Must
Biological Technology Co., Ltd.).
- EGCG chuẩn: hàm lượng 99,78%, lô MUST-17060113 (Chengdu Must
Biological Technology Co., Ltd.).
- Cafein nguyên liệu: hàm lượng 99,20% (Ấn Độ).
Các chất hấp phụ
- Nhựa macroporous: D101, HPD826, H103, X5 từ Anhui Sanxing Resin
Technology Co., Ltd. (Trung Quốc).
- Montmorillonit: Các mẫu MMT được cung cấp bởi Clariant Company (Ấn Độ).
- Than hoạt (kích thước 0,5 - 1 mm) từ Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.
(Trung Quốc).
Nhựa macroporous được xử lý bằng cách ngâm rửa với ethanol 96% nhiều
lần, sau đó rửa sạch lại bằng nước cất. MMT và than hoạt được sử dụng trực tiếp
không qua tinh chế thêm.
5

6

15


Bảng 2.1. Các đặc tính lý hóa của nhựa macroporous

7

Diện tích

Kích

Kích

bề mặt

thước lỗ

thước hạt

(m2/g)

xốp (nm)

(mm)

400-450

10-11

0,3-1,3

Acrylat Dimethylmethacrylat

500-600

9-10

0,3-1,3

H103

Styren

Divinylbenzen

900-1100

8,4-9,4

0,3-1,25

X5

Styren

Divinylbenzen

500-600

9-10

0,3-1,25

Nhựa

Chất

macroporous

nền

D101

Styren

HPD826

Liên kết chéo

Divinylbenzen

Độ phân
cực
Không
phân cực
Phân cực
Không
phân cực
Không
phân cực

Bảng 2.2. Các đặc tính lý hóa của các khoáng sét tự nhiên
Tỷ lệ các thành phần chính

Thể

Kích

Diện tích bề

chất

thước

mặt (m2/g)

SiO2

Fe2O3

Al2O3

MgO

CaO

1

Bột

50-63 µm

300

68,25

3,43

11,60

1,90

1,55

2

Bột

40-54 µm

250

61,94

7,12

16,14

1,25

2,24

3

Bột

51-68 µm

320

65,35

5,05

15,03

1,56

2,44

4

Bột

55-60 µm

500

55-65

1-2

4-8

-

-

5

Bột

55-68 µm

400

52-60

1-2

3-8

-

-

6

Bột

70-75 µm

270

55,42

5,73

7,94

5,85

5,47

7

Hạt

0,5-5 mm

-

62,23

4,25

10,54

-

-

8

Hạt

0,5-5 mm

-

58,34

5,23

15,34

-

-

MMT

16


Hóa chất
8

Bảng 2.3. Danh mục hóa chất sử dụng

STT

Tên hóa chất

Nguồn gốc

Tiêu chuẩn

1

Methanol

Fisher (Hàn Quốc)

HPLC

2

Acid phosphoric

Merck (Đức)

Tinh khiết hóa học

3

Nước cất

Việt Nam

-

4

Ethanol 96%

Việt Nam

Tinh khiết hóa học

5

Acid citric khan

Trung Quốc

Tinh khiết hóa học

2.1.3. Thiết bị thí nghiệm
- Bình chiết dược liệu bằng inox dung tích 10 Lít (Việt Nam).
- Máy cô quay chân không IKA® RV8 (Đức).
- Máy phun sấy Buchi B290 (Thụy Sỹ).
- Máy đông khô Christ® Alpha 1-LD (Đức).
- Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao Shimadzu (Nhật Bản).
- Máy ly tâm lạnh HERMLE Larbotechnik GmbH-Z326k (Đức).
- Máy lắc điều nhiệt Shaker Incubator, LSI-100B (Nhật Bản).
- Máy khuấy cơ WiseStir HS-120A (Trung Quốc).
- Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S d = 0,1 mg (Thụy Sỹ).
- Các dụng cụ kiểm nghiệm khác.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu thẩm định phương pháp định lượng cafein và EGCG bằng HPLC.
- Nghiên cứu sàng lọc chất hấp phụ cho quá trình loại cafein từ dịch chiết Chè.
- Khảo sát và lựa chọn được các thông số cho quá trình loại cafein bằng kỹ thuật
hấp phụ trên MMT.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Chiết xuất và điều chế cao thô
Cân 1,0 kg lá Chè khô, chiết 3 lần × 10,0 L dung môi ethanol 50%, 25°C
trong 12 giờ. Gộp các dịch chiết và cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm (500
mbar, 70°C) đến khi còn 1/3 thể tích và phun sấy tạo cao khô với các điều kiện:
nhiệt độ đầu vào 140°C, nhiệt độ đầu ra 67 - 70°C, tốc độ bơm 30 - 35%, áp suất
17