Phân lập nấm mốc chịu nhiệt, chịu ph thấp

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
-----------

----------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:

Phân lập nấm mốc chịu nhiệt, chịu pH thấp

Người hướng dẫn: PGS.TS.Vũ Nguyên Thành
Sinh viên: Hoàng Văn Năm
Niên khóa: K20 – Lớp 1301-CNSH

Hà Nội-2017


Viện đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học
LỜI CẢM ƠN

Tôi xin trân thành cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Vũ Nguyên Thành Giám đốc Trung tâm vi sinh vật công nghiệp – Viện Công nghiệp thực
phẩm đã dành thời gian tâm huyết và tạo điều kiên hướng dẫntôi hoàn
thành khóa luậnnày.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Th.S Nguyễn Thị Thanh Thủy, Cử nhân
Bùi Ngọc Anh và các anh,chị ở Trung tâm Vi Sinh Vật Công nghiệp, Viện
Công nghiệp Thực phẩm đã hướng dẫn, giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong suốt
thời gian làm thí nghiệm tại trung tâm.
Tôi xin trân thành cảm ơn các thầy, cô, giáokhoa côngnghệ sinh học

Viện Đại học Mở Hà Nội đã giảng dạy và truyền đạt cho tôi những kiến
thức chuyên nghành bổ ích trongsuốt quá trình học tập.
Cuối cùng tôi xin trân thành gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân
và bạn bè tôi đã luôn quan tâm, ủng hộ động viên và tạo điều kiện giúp tôi
hoàn thành khóa luận này.

Hoàng Văn Năm

Pagei


Viện đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc và thành phần của lignoecllulose ở lá cây ngô. ........... Error!
Bookmark not defined.

Hình 1.2. Cấu trúc phân tử cellulose [3]........................ Error! Bookmark not defined.
Hình 1.3. Arabino-4-O-methylglucuronoxylan từ hạt trần (theo Dekker
1985) ............................................................................................. Error! Bookmark not defined.
Hình 1.4.Hoạt động xúc tác của các cellulase trên cơ chất cellulose [1].Error!
Bookmark not defined.

Hình 3.1. Đĩa phân lập mẫutrên 2 môi trường giấy-glucose và rơm ở pH
2.0, nuôi ở 50 ....................................................................... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.2. Đĩa phân lập mẫutrên 2 môi trường giấy-glucose và rơm ở pH
2.0, nuôi ở 50 sau 8 ngày. ................................................ Error! Bookmark not defined.
Hình 3.3. Khuẩn lạc Talaromyces atroroseusLPH 263-1 mặt trước và mặt

sau trên đĩa thạch PDAtrong 9 ngàyở 30 . ................ Error! Bookmark not defined.
Hình 3.4. Hình thái tế bào chủng Talaromyces atroroseus LPH 263-1, kích
thước vật kính 40xnuôi trong 4 ngày trên môi trường PDA....... Error! Bookmark
not defined.

Hình 3.5.Khuẩn lạc Rhizomucor pusillusLPH 239 mặt trước và mặt sau,
sau 4 ngày nuôi trên môi trường PDA. ........................... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.6. Hình thái tế bào chủng Rhizomucor pusillus LPH 239 nuôi trong
4 ngày trên PDAsoi dưới vật kính 40x,kích thước thanh trèn tương ứng
10um. ............................................................................................ Error! Bookmark not defined.
Hình 3.7. Khuẩn lạc Penicillium simplicissimum LPH 260 mặt trước và
mặt sau, sau 6 ngày nuôi trên môi trường PDA.......... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.8. Hình tháitế bào Penicillium simplicissimum LPH 260 nuôi trong
6 ngày trên môi trên môi trường PDA, soi dưới vật kính 40x, kích thước
thanh chèn tương ứng 10µm ............................................... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.9. Biểu đồ hoạt tính CMCase của các chủng chịu nhiệt (50 °C) ở
các pH khác nhau .................................................................... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.10. Biểu đồ hoạt tính CMCase của các chủngnấm mốc (30 °C) tại
các pH khác nhau .................................................................... Error! Bookmark not defined.

Hoàng Văn Năm

Pageii


Viện đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

Hình 3.11. Hoạt tính xylanase của nấm mốc chịu nhiêt (pH 2.0,50 ) phân

tích ở pH 3.0, pH 5.0, pH 7.0. ........................................ Error! Bookmark not defined.
Hình 3.12. Hoạt tính xylanase của chủng nấm mốc chịu pH thấp (pH 1.0,
30 °C) phân tích ở pH 3.0, pH 5.0, pH 7.0................. Error! Bookmark not defined.
Hình 3.13. Khả năng bền nhiệt CMCase của các chủng nấm mốc chịu nhiệt
chịu nhiệt (pH 2.0, 50 °C).................................................... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.14. Biểu đồ khả năng bền nhiệt CMCase của các chủng chịu pH
thấp ( pH 1.0.0, 30 °C) .......................................................... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.15. Biểu đồkhả năng bền nhiệt xylanase chủng nấm mốc chịu nhiệt
(pH 2.0, 50°C) .......................................................................... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.16.Biểu đồ khả năng bền nhiệt xylannase chủng nấm mốc chịu pH
thấp (30 °C, pH 1.0) .............................................................. Error! Bookmark not defined.
Hình 3.17. Điện di SDS-PAGE của 40 chủng nấm mốc chịu nhiệt .......... Error!
Bookmark not defined.

Hình 3.18. Phổ fingerprinting các chủng nấm mốc phân lập được............ Error!
Bookmark not defined.

Hoàng Văn Năm

Pageiii


Viện đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần lignocellulose trong một số nguồn có trong tự nhiên
[8]. ................................................................................................. Error! Bookmark not defined.
Bảng 1.2. Phân nhóm dựa vào phổ fingerprinting của 52 chủng nấm mốc.

......................................................................................................... Error! Bookmark not defined.

Bảng 1.3. Danh sách tên các chủng đã được đọc trình tự ..... Error! Bookmark not
defined.

Hoàng Văn Năm

Pageiv


Viện đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

DANH MỤC BẢNG PHỤ LỤC
Bảng phụ lục 1.1. Bảngnguồn gốc phân lập chủng nấm mốc .... Error! Bookmark
not defined.

Bảng phụ lục 1.2. Ký hiệu và nguồn gốc mẫu............. Error! Bookmark not defined.
Bảng phụ lục 1.3. Hoạt tính CMCasecủa các chủng chịu nhiệt (pH 2.0,
50°Cở pH 3.0, pH 5.0, pH 7.0 ........................................ Error! Bookmark not defined.
Bảng phụ lục 1.4. hoạt tính CMC của các chủng nấm mốc chịu pH thấp
(pH 1.0, 30°C) .......................................................................... Error! Bookmark not defined.
Bảng phụ lục 1.5. hoạt tính xylannase của chủng nấm mốc chịu nhiệt(pH
2.0, 50°C)ở các ở pH 3.0, pH 5.0, pH 1.0. ............... Error! Bookmark not defined.
Bảng phụ lục 1.7. Khả năng bền nhiệt CMCase của các chủng nấm mốc
chịu nhiệt (pH 2.0, 50℃). .................................................... Error! Bookmark not defined.
Bảng phụ lục 1.8. khả năng bền nhiệt CMCase của các chủng nấm mốc
chịu pH thấp ( pH 1.0, 30℃) ............................................ Error! Bookmark not defined.
Bảng phụ lục 1.9. Khả năng bền nhiệt xylannase của các chủng chịu

nhiệt(pH 2.0, 50℃), ở pH 5.0. ......................................... Error! Bookmark not defined.
Bảng phụ lục 1.10. Khả năng bền nhiệtxylannase của các chủng chịu pH
thấp ( pH 1.0, 30℃) ở pH 5.0 .......................................... Error! Bookmark not defined.
Mã trình tự gen của các chủng nấm mốc phân lập được....... Error! Bookmark not
defined.

Hoàng Văn Năm

Pagev


Viện đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
APS
CMC
DNA
DNS
dNTPs
GH
ITS
IU
kDa
OD
PCR
PDA
rDNA
SDS-PAGE

Hoàng Văn Năm

Ammonium persulfate
Carboxylmethyl cellulose
Deoxyribonucleic Acid
3,5 Dinitrosalicylic acid
Deoxyribonucleotide triphosphates
Glycoside hydrolase
Internal transcribed spacer
International unit
KiloDalton
Opical Density
Polymerase Chain Reaction
Potato dextrose agar
Ribosomal Deoxyribonucleic Acid
Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel
Electrophorosis

Pagevi


Viện đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học
MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN........................................................................... Error! Bookmark not defined.
DANH MỤC HÌNH ............................................................... Error! Bookmark not defined.
DANH MỤC BẢNG ............................................................. Error! Bookmark not defined.

DANH MỤC BẢNG PHỤ LỤC....................................... Error! Bookmark not defined.
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ......................................... Error! Bookmark not defined.
MỤC LỤC.................................................................................. Error! Bookmark not defined.
MỞ ĐẦU .................................................................................... Error! Bookmark not defined.
PHẦN 1. TỔNG QUAN ...................................................... Error! Bookmark not defined.
1.1.Giới thiệu lignocellulose....................... Error! Bookmark not defined.
1.1.1.Cellulose............................................ Error! Bookmark not defined.
1.1.2.Hemicellulose .................................... Error! Bookmark not defined.
1.2.Enzyme thủy phân Lignocellulose ........ Error! Bookmark not defined.
1.2.1.Enzyme thủy phân cellulose .............. Error! Bookmark not defined.
1.2.2.Enzyme thủy phân hemicellulose ...... Error! Bookmark not defined.
1.3.Ứng dụng của enzyme thủy phân lignocellulose . Error! Bookmark not
defined.
1.4.Những nghiên cứu về enzyme thủy phân lignocenlulose ............. Error!
Bookmark not defined.
PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ Error! Bookmark not defined.
2.1.Đối tượng nghiên cứu ........................... Error! Bookmark not defined.
2.2.Hóa chất và thiết bị. .............................. Error! Bookmark not defined.
2.2.1. Hóa chất ........................................... Error! Bookmark not defined.
2.2.2. Thiết bị. ............................................ Error! Bookmark not defined.
2.3. Môi trường nghiên cứu ........................ Error! Bookmark not defined.
2.4.Phương pháp nghiên cứu: ..................... Error! Bookmark not defined.
2.4.1. Phương pháp lấy mẫu ....................... Error! Bookmark not defined.
2.4.2. Phương pháp phân lập, nuôi cấy, làm sạch và bảo quản chủng giống
................................................................... Error! Bookmark not defined.
Hoàng Văn Năm

Pagevii

Viện đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

2.4.3. Quan sát hình thái khuẩn lạc và chụp ảnh ....... Error! Bookmark not
defined.
2.4.4. Nuôi cấy tách chiết enzyme .............. Error! Bookmark not defined.
2.4.5. Xác định hoạt độ enzyme bằng phương pháp DNS: ................. Error!
Bookmark not defined.
2.4.6. Phương pháp điện di protein SDS-PAGE ....... Error! Bookmark not
defined.
2.4.7. Tách chiết ADN tổng số ................... Error! Bookmark not defined.
2.4.8. Phương pháp PCR fingerprinting...... Error! Bookmark not defined.
2.4.9. Định tên các chủng nấm mốc dựa vào giải trình tự DNA ......... Error!
Bookmark not defined.
PHẦN 3: KẾT QUẢ .............................................................. Error! Bookmark not defined.
3.1.Kết quả phân lập các chủng nấm mốc ở pH thấp Error! Bookmark not
defined.
3.2.Hình ảnh khuẩn lạc và tế bào ................ Error! Bookmark not defined.
3.3.Phân tích hoạt tính emzyme bằng phương pháp DNS ở các pHkhác
nhau. ....................................................... Error! Bookmark not defined.
3.3.1. Hoạt tính CMCase ............................ Error! Bookmark not defined.
3.3.2. Hoạt tính xylanase ............................ Error! Bookmark not defined.
3.3.3. Xác định khả năng bền nhiệt............. Error! Bookmark not defined.
3.3.4.Khả năng bền nhiệt xylanase ............. Error! Bookmark not defined.
3.3.5. Điện di protein SDS-PAGE .............. Error! Bookmark not defined.
3.4.Phân nhóm định tên các chủng ............. Error! Bookmark not defined.
3.5.Định tên các chủng nấm mốc dựa vào việc đọc trình tự rDNA: ... Error!
Bookmark not defined.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................... Error! Bookmark not defined.

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................... Error! Bookmark not defined.
PHẦN PHỤ LỤC .................................................................... Error! Bookmark not defined.

Hoàng Văn Năm

Pageviii


Viện đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học
MỞ ĐẦU

Thế giới vi sinh vật xung quanh chúng ta rất đa dạng và phong phú,
chúng luôn tồn tại và phát triển một cách mạnh mẽ, trong đó có một số rất
hữu ích đối với môi trường và con người. Vì vậy, việc nghiên cứu và tìm
chúng có ích sẽ đem lại những lợi ích to lớn cho con người và xã hội.
Thực trạng hiện nay đặc biệt ở nước nông nghiệp trong đó có Việt
Nam, tình trạng ô nhiễm môi trường do việc xả thải phụ phẩmtrong sản
phẩm nông nghiệp ngày càng nghiêm trọng. Sau mỗi đợt thu hoạch nông
sản, cách phụ phẩm như rơm,rạ,… sẽ được bỏ lại hoặc đốt tại chỗ. Việc này
sẽ gây ảnh hưởng rất lớn tới môi trường như làm tăng lượng khí CO2 gây
hiệu ứng nhà kính, gây ra hiện tượng sương mù, khói bụi ảnh hưởng tới sức
khỏe con người. Không chỉ có vậy, các xí nghiệp nhà máy chế biến lâm sản
mọc lên ngày càng nhiềuđồng nghĩa với việc các sản phẩm phụ như vỏ,
mùn cưa thải ra không được tận dụng và xử lý gây lãng phí và ô nhiễm môi
trường. Thành phần của các phụ phẩm trên chứa hàm lượng lignocellulose
rất lớn trong khi cấu trúc này lại rất bền và khó bị phân hủy bởi vi sinh vật.
Vì những lý do trên mà việc sử dụng enzyme thủy phân lignocellulose để
xử lý các phụ phẩm nông nghiệp sẽ làm giảm ô nhiễm môi trường đồng

thời có thể tận dụng chúng ủ làm thức ăn cho gia xúc (rơm rạ) hay làm
phân bón cho cây trồng (gỗ). Đặc biệt để nâng cao quá trình chuyển hóa
thức ăn cho vật nuôi giúp vật nuôi sinh trưởng và pháttriển mạnhta cần bổ
xung enzyme thủy phân lignocellulose vào thức ăn song do quá trình sản
xuất công đoạn ép viên cần nhiệt độ cao từ 70°C- 80 °Cvà trong dạ dày của
động vật có độpH thấp do đó enzyme sử dụng phải có thể hoạt động ở nhiệt
độ cao và pH thấp.

Hoàng Văn Năm

Page1


Viện đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

Nhận thấy lợi ích và tầm quan trọng đó, chúng tôi đã tiến hành tìm
kiếm, nghiên cứu các chủng nấm mốc mới có khả năng sinh enzyme thuỷ
phân mạnh các nguồn giàu lignocellulose từ các môi trường khác nhau
nhằm đáp ứng những nhu cầu thực tiễn của đời sống với đề tài: “Phân lập
nấm mốc chịu nhiệt, chịu pH thấp’’
Mục tiêu: Tìm kiếm, phân lập các chủng nấm mốc chịu nhiệt, chịu
pH có khả năng sinh enzyme thủy phân lignocellulose.

Hoàng Văn Năm

Page2

Viện đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

PHẦN 1. TỔNG QUAN
1.1.

Giới thiệu lignocellulose
Lignocelluloselà thành phần cấu trúc chính của thực vật thân gỗ và

các thực vật khác như cỏ, lúa, ngô. Thành phần chủ yếu của lignocellulose
là cellulose, hemicellulose và lignin.

Hình 1.1.. Cấu trúc và thành phần của lignocellulose ở lá cây ngô.
Trong lignocellulose, cellulose tạo thành khung chính và được bao
bọc bởi những chất có chức năng tạo mạng lưới như hemicellulose và kết
dính như lignin. Celluose, hemicellulose và lignin sắp xếp gần nhau và liên
kết cộng hóa trị với nhau. Các đường nằm ở mạch nhánh như
arabinose,galactose, và acid 4-O-metylglucuronic là các nhóm thường liên
kết với lignin [4].
Bảng 1.1..Thành phần lignocellulose trong một số nguồn tự nhiên [8].
Nguồn
Thân gỗ cứng
Thân gỗ mềm
Hoàng Văn Năm

Cellulose (%)
40-55
45-50

Hemicellulose (%)
24-40
25-35

Lignin (%)
18-25
25-35
Page3


Viện đại học Mở Hà Nội
Vỏ trấu
Giấy
Rác đã phân loại
Các loại cỏ

32.1
85-99
60
25-40

Khoa Công nghệ sinh học
24
0
20
25-50

18
0-15
20

30-50

Lignocellulose có ở hầu hết mọi nơi: trong rác thải, nước thải và phế
thải nông nghiệp. Việc nghiên cứu để tận dụng nguồn lignocellulose này
không những góp phần bảo vệ môi trường mà còn đem lại lợi ích to lớn cho
con người.
1.1.1. Cellulose
Cellulose là thành phần chủ yếu của vách tế bào thực vật và chiếm
50% tổng lượng hydrocacbon trên trái đất.Hàng năm lượng cellulose trong
sinh quyển được sản xuất là 40 tỷ tấn và tổng khối lượng cellulose trên trái
đất ước tính khoảng 700 tỷ tấn. Thành phần cellulose chiếm đến 90% trong
sợi bông, 50% trong gỗ, 40-50% trong bã mía, 35-40% trong rơm lúa mỳ
và lúa gạo [1].
Cellulose là polysaccharide liên kết với nhau bằng liên kết 1,4glucoside, mức độ polymer hóa của cellulose rất cao tới 10.000–15.000 đơn
vị glucose/phân tử. Số lượng lớn liên kết hydro nội và ngoại phân tử làm
cho phân tử cellulose có độ cứng và vững chắc [3].

Hoàng Văn Năm

Page4


Viện đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

Hình 1.2. Cấu trúc phân tử cellulose[3].
Trong tự nhiên các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên
kết hydro và liên kết Vander Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là
vùng kết tinh và vùng vô định hình.

+Vùng kết tinh: các mạch cellulose liên kết với nhau theo một trật tự
đều đặn nhờ liên kết hydrogen giữa nhóm -OH thứ nhất của mạch này với
nhóm -OH thứ ba của mạch khác. Do cấu trúc có trật tự cao này, enzyme
cũng như nhiều phần tử khác khó có thể xâm nhập được vào bên trong
phân tử cellulose để phân hủy. Hơn thế, chỉ một số ít nhóm hydroxyl trong
vùng kết tinh có tương tác với nước, do đó ở điều kiện bình thường
cellulose chỉ có thể tác động lên bề mặt sợi cellulose.
+Vùng vô định hình: cấu trúc không chặt chẽ, các mạch tập hợp với
nhau nhờ lực Van der Waals, dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài. Khi
gặp nước chúng có thể hấp thu nước và trương phồng lên.
Liên kết glucoside trong phân tử cellulose không bền với acid vì vậy
mà cellulose dễ bị phân hủy bởi acid và tạo thành sản phẩm phân hủy
không hoàn toàn là hydro-cellulose có độ bền cơ học kém hơn cellulose
Hoàng Văn Năm

Page5


Viện đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

nguyên thủy[2], còn khi thủy phân hoàn toàn thì sản phẩm tạo thành là Dglucose.
Cellulose cũng bị oxy hóa bởi một số tác nhân tạo thành sản phẩm
oxy hóa một phần là oxy-cellulose. Tác nhân oxy hóa chọn lọc nhất là acid
iodic (HIO4), và muối của nó. Cellulose không tan trong nước, dung dịch
kiềm làm trương phồng mạch cellulose và hòa tan một phần cellulose phân
tử nhỏ. Đặc biệt cellulose dễ hòa tan trong dung dịch cupri amin hydrat
[Cu(NH3)4(OH)2], và hàng loạt các dung dịch là các phức chất của đồng,
niken, cadmi, kẽm,...[3].

Trong tế bào thực vật, cellulose liên kết chặt chẽ với hemicellulose,
pectin, và với lignin điều này làm cho cellulose khá bền vững với tác động
của enzyme cũng như hóa chất. Việc thủy phân cellulose chỉ có thể diễn ra
khi cellulose đã tách khỏi các thành phần cùng cấu tạo nên thành tế bào
thực vật. Chính vì vậy, để có thể phân giải được cellulose tự nhiên cần phải
có sự kết hợp giữa các enzyme.
1.1.2. Hemicellulose
Hemicellulose cũng là một phần polysaccharide thường gặp trong
vách tế bào thực vật với hàm lượng lớn sau cellulose. Người ta gọi tên cụ
thể 1 loại hemicellulose là dựa theo tên loại đường chủ yếu tạo nên
nó.Khác với cellulose, phân tử hemicellulose nhỏ hơn nhiều (thường không
quá 150 gốc đường), được nối với nhau không chỉ bằng liên kết -1,4 mà
còn bằng liên kết -1,3 và -1,6 glucozit tạo ra mạch ngắn và phân nhánh[2].
Chính vì vậy nên hemicellulose không có cấu trúc chặt chẽ như ở cellulose
và độ bền hóa lí cũng thấp hơn.
Trong gỗ,thành phần chính của hemicellulose là glucuronoxylan và
trong gỗ mềm là Glucomannan. Glucuronoxylan trong gỗ cứng và thực vật
Hoàng Văn Năm

Page6


Viện đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

thân thảo gồm mạch chính là 1,4 β–D-xylan với nhóm thế1,2 α-4–Omethyl-D-glucuronic acid(hoặc 1,2 α-D-glucuronic acid), chiếm khoảng
10% dư lượng xylose(Hình 1.4). Xylan trong trong gỗ mềm và thực vật
thân thảo khác với xylan trong gỗ cứng ở chỗ chúng có arabinofuranose
liên kết với mạch chính xylan bằng liên kết 1,3 α[11].

Hình 1.3.Arabino-4-O-methylglucuronoxylan t hạethylgl(Dekker 1985).
Glucomannoxylan

(thườngđược

gọi

là

glucomannan

và

galactomannan) được cấu thành từ 1,4 β-D-glucose và β-D-mannose dư
lượng trong mạch thẳng.
Trong tự nhiên xylan là một hemicellulose phổ biến nhấtchiếm 30%
khối lượng rơm, 20-25% cây gổ lá rộng, 7-17% cây gỗ lá kim [3], xylan là
một polymer chính của thành tế bào thực vật trong đó các gốc Dxylopyranose kết hợp với nhau qua liên kết β-1,4-D-xylopyranoside. Đa số
phân tử xylan chứa nhiều nhóm ở trục chính và chuỗi bên. Các gốc thay thế
chủ yếu trên khung chính của xylan là các gốc acetyl, arabinosyl và
glucoronosyl. Các nhóm này có đặc tính liên kết tương tác cộng hóa trị và
không cộng hóa trị với lignin, cellulose và các polymer khác. Xylan đa
dạng về cấu trúc và khối lượng phân tử tùy thuộc vào loại thực vật, vị trí
của nó ở các mô, tế bào[20].

Hoàng Văn Năm

Page7

Viện đại học Mở Hà Nội

1.2.

Khoa Công nghệ sinh học

Enzyme thủy phân Lignocellulose
Lignocellulosecó ởkhắp mọi nơi và không dễ dàng phân hủy được

bởi cấu trúc của chúng và sự liên kết của chúng trong thành tế bào thực vật.
Đối vớimột số vi sinh vật thì việc phá vỡ cấu trúc này thì lại khá đơn
giảnnhờ hệ thống enzyme ngoại bào mà chúng tiết ra.Trong số đó, nấm
mốc đang là mối quan tâm rất lớn với các nhà khoa học với hệ enzyme thủy
phân lignocellulose đầy đủ hơn cả.
Vi khuẩn được xem là một trong những đối tượng có khả năng sinh
tổng hợp cellulase khá phong phú với chu kỳ sinh trưởng ngắn. Thông
thường mỗi loài vi khuẩn chỉ có khả năng sinh tổng hợp một loại enzyme
cellulase nhất định. Chính vì thế để có thể phân huỷ hoàn toàn cơ chất
cellulose trong tự nhiên bắt buộc chúng phải kết hợp với các vi khuẩn khác
trong mối quan hệ hỗ sinh [1]. Nhiều vi khuẩn hiếu khí đã được nghiên cứu
như Acidothemus cellulobuticus, Bacillus pumilus, các giống Cytophaga,
Sporocytophaga, Soragium. Ngoài ra còn thấy các loại thuộc giống
Cellvibrio cũng có khả năng phân giải cellulose. Trong điều kiện yếm khí,
các loại vi khuẩn ưa ấm và ưa nhiệt cũng có khả năng phân giải cellulose.
Bên cạnh vi khuẩn, nhiều chủng xạ khuẩn cũng được các nhà nghiên
cứu chú ý đến. Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật đặc biệt, tế bào của chúng rất
đặc trưng bởi sự phân nhánh, đa số sống trong đất và phát triển trong điều
kiện hiếu khí. Có một số ít loài thuộc vi hiếu khí hoặc có thể sống trong
điều kiện kỵ khí. Cellulase của xạ khuẩn là enzyme ngoại bào. Một số xạ

khuẩn có hoạt tính phân giải cellulose là: Streptomyces reticuli,
Actinomyces

griseus,

các

chủng

thuộc

chi

Streptosproagium,

Micromonospora,...

Hoàng Văn Năm

Page8


Viện đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

Nấm mốc là nhóm có khả năng tiết ra ngoài môi trường một lượng
lớn enzyme cellulase hoàn chỉnh, đầy đủ các thành phần nên có thể phân
giải cellulose rất mạnh mẽ và triệt để ví dụ như nấm mốc T. reesei có khả
năng sinh một loạt các enzyme phân hủy lignocellulose thành đường và các

cấu thành khác. Một số loài nấm khác thuộc các chi Aspergillus,
Trichoderma, Penicillium, Phanerochaete,…đã được nghiên cứu cho thấy
cũng có hoạt tính phân giải cellulose khá cao như A. niger, A. wenttii, A.
flavus, A. oryzae, Mucor pusilus, F. solani, F. lini, T. viride, P.
fumiculosum, P. inophinum, Sporotrichum pulverulentum và Sclevotium
rolfsii,...Một số nghiên cứu cho thấy, các loại nấm ưa nhiệt như
Chaetormium thermophile có khả năng tổng hợp được cả exo-glucanase,
endo-glucanase và β-glucosidase, chúng là những enzyme bền nhiệt, có thể
giữ được hoạt tính ở 77°C trong 30 phút và ở 58°C trong 10 giờ, sinh
trưởng ở nhiệt độ tối ưu là 45-50°C, nhiệt độ tối thiểu là 27°C, pH=5.
Ngoài ra, xylanase của nấm chịu nhiệt đang nhận được sự chú ý đáng kể vì
nó có thể ứng dụng trong quá trình tẩy tắng bột giấy trong ngành công
nghiệp giấy, bổ sung vào thức ăn chăn nuôi để cải thiện khả năng tiêu hóa
của động vật. Một số loài nấm mốc được sử dụng để sản xuất xylanase:
Thermomyces

lanuginosus,

Malbranchea

pulchella

var.

sulfureao,

Thermoascus aurantiacus và Paecilomyces varioti, H. grisea var.
thermoidea [21] và Talaromyces emersonii [22].
1.2.1. Enzyme thủy phân cellulose
Cellulase là hệ enzyme xúc tác cho quá trình thủy phân

cellulosethành các sản phẩm hòa tan bằng việc phân cắt liên kết β-1,4glycoside giữa các đơn vị glucose.Theo hệ thống phân loại EC dựa vào vị
trí xúc tác có thể chia làm 3 loại chính sau[1].

Hoàng Văn Năm

Page9


Viện đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

Endoglucanase (EG) (EC 3.2.1.4, endocellulase): Endo-1,4glucanase hay còn được gọi là carboxymethylcellulase (CMCase) tham gia
xúc tác phản ứng thủy phân liên kết β-1,4-glucanase bên trong phân tử
cellulose và một số cơ chất tương tự khác giải phóng ra cellodextrin,
cellobiose và glucose. Sản phẩm phân cắt sau đó sẽ được β-glucosidase tiếp
tục thủy phân thành các phân tử glucose. Enzyme này thể hiện hoạt tính
mạnh mẽ trên vùng cellulose vô định hình và hoạt động tốt trong dải pH
4,0-5,0, tối ưu ở nhiệt độ 50-70°C.
Cellobiohydrolase(CHB) (EC 3.3.1.91, exocellulase): exo-β-1,4glucanase gồm có CHB I và CHB II, xúc tác phân cắt liên tiếp các đơn vị
đường từ đầu chuỗi. Sản phẩm thủy phân chính là cellobiose, ngoài ra còn
giải phóng các saccharide nhỏ như cellotriose và cellotetraose từ chuỗi
cellulose. Các cellobiohydrolase có khả năng cắt phân tử cellulose ở cả
vùng kết tinh và vùng vô định hình, tuy nhiên tác dụng lên vùng kết tinh
không rõ ràng [14]. Nhóm enzyme này cũng hoạt động tốt trong khoảng pH
4,0-5,0 và phổ nhiệt tối ưu rộng từ 37-60°C.
β-glucosidase hay cellobiase (EC.3.2.1.21): Thủy phân cellobiose
thành glucose. Là nhóm enzym khá phức tạp, có khả năng hoạt động ở pH
rất rộng từ 4,4 đến 8,4. Trọng lượng phân tử 50-95 kDa, có thể hoạt động ở
nhiệt độ cao. tuy nhiên nhiệt độ tối ưu dao động khoảng 45-75°C. Chức

năng của enzyme này có lẽ là điều chỉnh sự tích lũy các chất cảm ứng của
cellulose.
Theo hệ thống phân loại GH, enzyme được phân loại dựa vào đặc
điểm trình tự Glycoside hydrolase. Đây là nhóm chứa nhiều các enzyme
thủy phân liên kết glycosidic giữa hai hay nhiều carbohydrate hoặc giữa
một carbohydrate với một không phải là carbohydrate. Cellulase của nấm
Hoàng Văn Năm

Page10


Viện đại học Mở
ở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh hhọc

mốc chủ yếu đượcc tìm thấy
th ở một vài họ trong GH bao gồm
m GH5, 6, 7, 8,
9, 12, 44, 48, 61 và 74 [2].
[2
Cơ chế hoạt động.
Sự thủyy phân cellulose là ssự kết hợp của cả 3 enzyme trên.Trước
trên
tiên
enzyme EG tấnn công vào gi
giữa mạch cellulose và giảii phóng các đầu cuối
của chuỗi polysaccharide.
polysaccharide Sau đó enzyme CBH tiếp tục phân cắắt để tạo sản
phẩm cuối cùng là cellobiose.Cuối

cellobiose.Cu cùng enzyme β-D-glucosidase
glucosidase ssẽ phân
cắtt cellobiose thành glucose [12].

Hình 1. 4.Hoạt động
ng xúc tác ccủa các cellulase trên cơ chấtt cellulose[1].
cellulose[
1.2.2. Enzyme thủyy phân hemi
hemicellulose
Hemicellulase là m
một nhóm enzyme thủy
y phân hemicellulose chúng
đượcc module carbohydrate để thúc đẩy hoạt động củaa enzym trên cơ
c chất
[11]. Trong tự nhiên hemicellulase được tổng hợp từ vi sinh vvật, và là
enzyme ngoạii bào chúng ti
tiết ra nhằm phá vỡ cấu trúc phức
ph
tạp của
hemicellulose để tạoo thành các ssản phẩn đơn giản dễ chuyển
n hóa. N
Nấm mốc
là vi sinh vật có khả nă
năng tổng hợp
p enzyme hemicellulase. Cho đến nay,
Hoàng Văn Năm

Page11

Viện đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

hemicellulase nấm mốc đã được xác định trong 19 họ GH: 1, 2, 3, 5, 10,
11, 26, 27, 36, 39, 43, 51, 53, 54, 62, 67, 74, 115 và 116 và 9 họ CE
(carbohydrate esterase): 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 15 và 16 [18].
Hemicellulase bao gồm:
• Xylanase/Xylosidase
Xylanase (EC 3.2.1.8) thủy phân liên kết β-1,4 xylan mạch chính, tạo
ra các xylooligomer ngắn. Hầu hết các xylanase được biết đến thuộc họ GH
10 và 11, và khoảng 20 gen xylanase được phân bố giữa các họ GH 5, 8 và
43. Liên quan đến cơ chất đặc trưng của xylanase, thông thường sự hiện
diện 4-O-methyl-glucuronic acid và arabinofuranose chuỗi bên cản trở sự
liên kết và thủy phân của xylanase
β-Xylosidase(EC 3.2.1.37) là exo-glycosidase thủy phân các xylooligosaccharide và xylobiose hòa tan thành xylose được tìm thấy trong các
họ GH 3, 39, 43, 52 và 54. Hầu hết các β-xylosidase được nghiên cứu cho
đến nay đều bị ức chế bởi xylose, sản phẩm thủy phân của chúng. Các
enzyme này đóng một vai trò quan trọng trong sư thủy phân xylan bằng
cách giảm bớt sự ức chế sản phẩm cuối cùng của endoxylanase.
• β-Mannanase
β-Mannanase (EC 3.2.1.78) thủy phân mannan trên hemicellulose và
giải phóng chuỗi ngắn β-1,4-mannooligomer, hợp chất này có thể được tiếp
tục thủy phân thành mannose bởi β-mannosidase (EC 3.2.1.25).
• α-L-Arabinofuranosidase
L-Arabinose được tìm thấy trong các thành phần sinh khối
hemicellulosic khác nhau, chủ yếu là arabinoxylan, trong đó trục chính βHoàng Văn Năm

Page12

Viện đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

1,4-D-xylopyranosyl được liên kết chuỗi bên với arabinose. α-LArabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) và α-L-arabinanase (EC 3.2.1.99) thủy
phân liên kết arabinofuranosyl trên hemicellulosese.
• α-D-Glucuronidase
α-D-Glucuronidase phân cắt liên kết α-1,2-glycoside trong chuỗi bên
4-O-methyl-D-glucuronic acid của xylan và chỉ được phân loại vào họ GH
67. Tính đặc hiệu của α-D-glucuronidase khác nhau phụ thuộc vào nguồn
gốc enzyme.
• Hemicellulolytic esterase
Hemicellulolytic esterasesbao gồm acetyl xylan esterases (EC
3.1.1.72) thủy phân nhóm thế acetyl trên nửa phân tử xylose, và feruloyl
esterases (EC 3.1.1.73) thủy phân liên kết este giữa nhóm thế arabinose và
ferulic acid.
1.3.

Ứng dụng của enzyme thủy phân lignocellulose
Ngày nay enzyme thủy phân lignocellulose được ứng dụng phổ biến

trongnhiều lĩnh vực của đời sống và đã đem lại hiệu quả cao trong quá trình
sản xuất và bảo vệ môi trường.
-Trong công nghiệp sản xuất bột giấy,Trong công đoạn nghiền bột
giấy, bổ sung cellulase làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose làm tăng
khả năng nghiền và tiết kiệm 20-40% năng lượng. Để tẩy trắng giấy người
ta sử dụng cellulase trong quá trình tái chế giấy. Phương pháp này giữ cho
sợi giấy không bị ăn mòn nhiều và không ảnh hưởng đến môi trường so với
phương pháp tẩy trắng giấy bằng acid HCl [15].

Hoàng Văn Năm

Page13


Viện đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

-Trong xử lý môi trường: phức hệ cellulase được sử dụng để xử lý
nguồn nước thải do các nhà máy giấy thải ra. Cellulase góp phần làm rút
ngắn thời gian phân hủy rác hữu cơ có bản chất cellulose. Điều này có ý
nghĩa trong việc bảo vệ môi trường (hạn chế sự ô nhiễm đất, nước) đồng
thời thúc đẩy quá trình chuyển hóa vật chất trong tự nhiên.
-Trong sản xuất cồn nhiên liệu: cellulase có vai trò quan trọng trong
việc sản xuất ethanol thế hệ hai từ nguồn nguyên liệu có bản chất
lignocellulose. Việc sử dụng các enzyme thủy phân lignocellulse trong giai
đoạn tiền xử lý góp phần đáng kể vào hiệu quả quá trình lên men, giảm chi
phí tiêu tốn năng lượng và thân thiện hơn so với các phương pháp tiền xử
lý bằng vật lý hay hóa học khác.
-Trong sản xuất bột giặt và chất tẩy rửa, bổ sung cellulase chủ yếu
nhằm mục đích làm mềm sợi vải cotton.
-Trong sản xuất thức ăn chăn nuôi, enzymecellulase và hemicellulase
được sử dụng rộng rãitrong nghành sản xuất thức ăn chăn nuôi, việc bổ
xung vào nguồn thức ăn sẽ làm tăng khả giá trị nguyên liệu cũng như làm
cho vật nuôi hấp thụ nguồn thức ăn tốt hơn. Các chất xơ được enzyme thủy
phân một các nhanhchóng khi làm thức ăn cho động vật đồng thời tăng khả
năng tiêu hóa giúp động vật hấp thụ tốt các chất dinh dưỡng. Bên cạnh đó
enzym đượcbổ xung vào giúp hỗ trợ một số các enzyme khác nhằm nâng

cao hiệu suất trong quá trình chuyển hóa thức ăn, giúp vật nuôi hay ăn
chóng lớn.
β-glucanase và xylanase đã được sử dụng trong thức ăn của động vật
dạ dày đơn để thủy phân polysaccharide không phải tinh bột như β-glucan
và arabinoxylan.Cellulase được sử dụng như phụ gia thức ăn đơn lẻ hoặc
bổ sung cùng với protease có thể cải thiện đáng kể chất lượng thịt lợn.
Hoàng Văn Năm

Page14


Viện đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

Glucanase và xylanase làm giảm độ nhớt của chất xơ trong lúa mạch đen
và đại mạch trong nguyên liệu thức ăn của gia cầm và lợn [5,13 ].
Cellulase được sử dụng để cải thiện sản xuất thức ăn ủ cho gia súc,
trong đó liên quan đên việc nâng cao khả năng tiêu hóa các loại cỏ có chứa
một lượng lớn các chất dinh dưỡng có khả năng tiêu hóa và các giá trị năng
lượng cùng với một lượng nhỏ carbohydrate hòa tan trong nước. Thành
phần thức ăn của động vật nhai lại chứa cellulose, hemicellulose, pectin và
lignin phức tạp hơn so với thức ăn ngũ cốc của gia cầm và lợn. Chế phẩm
enzyme có chứa hàm lượng cao cellulase, hemicellulose và pectinase đã và
đang được sử dụng để nâng cao giá trị dinh dưỡng của thức ăn. Quy trình
sản xuất thức ăn chăn nuôi nói chung bao gồm phương pháp gia nhiệt nhằm
bất hoạt virus, vi sinh vật gây bệnh, loại bỏ tạp chất. Ứng dụng cellulase
bền nhiệt trong sản xuất thức ăn có khả năng làm giảm tác nhân gây bệnh
cũng như để tăng cường khả năng tiêu hóa và giá trị dinh dưỡng của thức
ăn, do đó có một sự kết hợp giữa việc xử lý nhiệt, tuy nhiên khi bổ xung

enzyme vào quá trình da nhiệt này sẽ làm giảm hoạt tính do đó cần phải lựa
chọn enzyme có khả năng chịu nhiệt cao để có thể giữ được hoạt tính cao
khi đem ra ngoài thị trường tiêu thụ. Các cellulase và hemicellulase chịu
trách nhiệm cho quá trình thủy phân một phần nguyên liệu lignocellulose,
loại bỏ vỏ của hạt ngũ cốc, thủy phân β-glucan và nhũ tương hóa và tính
linh hoạt của nguyên liệu thức ăn tốt hơn mà kết quả là nhằm cải thiện chất
lượng dinh dưỡng trong thức ăn chăn nuôi.
1.4.

Những nghiên cứu về enzyme thủy phân lignocenlulose
Tiềm năng ứng dụng enzym thủy phân lignocellulosebền nhiệt và

hoạt động ở pH thấp là rất to lớn. Ngoài ứng dụng trong việc bổ sung vào
thức ăn gia súc, những cellulase còn được sử dụng vào rất nhiều ngành
công nghiệp khác mà đòi hỏi những điều kiện đặc biệt về nhiệt độ cao hay
Hoàng Văn Năm

Page15


Viện đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

môi trường acid. Trên thế giới, trong gần hai chục năm trở lại đây đã có
nhiều công bố về việc tìm ra cellulase bền nhiệt, bền pH.
Tại Brazil, Marli Camassola và cộng sự (2004) đã tinh sạch một hỗn
hợp cellulase từ P.echinulatum. Hỗn hợp enzyme này hoạt động mạnh nhất
ở pH 4 và 5, có khả năng bền nhiệt ở 55°C [16]. Tại Ấn Độ, năm 2007 các
nhà nghiên cứu đã tìm ra một endoglucanase mới từ A. aculeatus. Enzyme

mới này có kích thước 45 kDa, pH tối ưu của enzyme là 5, nhiệt độ tối ưu
là 40°C, pI=4,3. Enzyme có khả năng giữ được 50% hoạt tính khi gia nhiệt
ở 90°C trong 5 giờ [17]. Các enzyme tìm thấy đều là những enzyme vừa có
khả năng hoạt động ở pH thấp, vừa là những enzyme bền nhiệt.
Tại Nga năm 2010, các nhà khoa học đã tinh chế được 9 cellulase từ
Penicillium verruculosum. Các enzyme có pH tối ưu 3,5-5. Nghiên cứu bền
nhiệt chỉ ra rằng hầu hết các enzyme đều có thể chịu được nhiệt độ 50°C
trong ít nhất 3 giờ. Ở 60°C, các enzyme tinh sạch vẫn giữ được hoạt tính từ
31-80% hoạt tính sau 3 giờ. Ở 65°C, enzyme EGIIb vẫn giữ được 46% hoạt
tính sau 3 giờ [22].
A. nidulans được khai thác như một nguồn cung cấp enzyme thủy
phân lignocellulose cho những tiềm năng công nghệ sinh học, Tavares và
cộng sự (2013) đã tách dòng gen mã hóa endoglucanse (rEGA) và biểu
hiện thành công trong P. pastoris. Đây là một enzyme có khối lượng phân
tử 35 kDa. Hoạt tính enzyme cao nhất ở 50°C và pH 4. Enzyme giữ được
100% hoạt tính khi ủ ở 45°C và 50°C trong 72 giờ. Những thông số hiện có
gợi ý rằng rEGA thích hợp cho những quá trình biến đổi sinh học các hợp
chất hữu cơ, cho các ngành công nghiệp qua trọng như sản xuất thức ăn
chăn nuôi và sản xuất ethanol thế hệ 2 [9].

Hoàng Văn Năm

Page16