Phân lập vi khuẩn bacillus subtilis từ thức ăn thừa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS
TỪ CƠM THỪA
Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN THỊ HAI
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1211100027

: NGUYỄN TRƯỜNG AN
Lớp: 12DSH02

TP. Hồ Chí Minh, 2016


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự
hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Hai, khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi
trường, Trường Đại học Công Nghệ TP Hồ Chí Minh.
Những số liệu và kết quả có được trong đồ án này là trung thực, hoàn toàn
không sao chép từ đồ án tốt nghiệp của người khác dưới bất kỳ hình thức nào. Các

thông tin trích dẫn sử dụng trong đề tài đều được chỉ rõ nguồn gốc và có độ chính
xác trong phạm vi hiểu biết của tôi. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đồ án của
mình.
TP. HCM, ngày 18 tháng 08 năm 2016
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Trường An

i


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài tốt nghiệp tại
Trường ĐH Công Nghệ TP, HCM, em đã nhận được nhiều sự quan tâm giúp đỡ tử
quý Thầy Cô, gia dình và bạn bè.
Để hoàn thành được đồ án tốt nghiệp này, lời đầu tiên em xin được chân
thành gửi lời cảm ơn đến Trường Đại học Công Nghệ TP. HCM đã tạo điều kiện
cho em được thực hiện đề tài tại Phòng thí nghiệm của trường.
Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời tri ân chân thành đến Cô Nguyễn Thị
Hai, Cô đã động viên, tận tình hướng dẫn và chỉ bảo em trong suốt thời gian thực
hiện đồ án tốt nghiệp.
Đồng thời, em cũng xin được gửi lời cảm ơn đến quý Thầy, Cô khoa Công
nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt
thời gian dài học tập, giúp em xây dựng nền tảng kiến thức cho công việc và học tập
sau này.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình đã luôn chăm sóc,tạo điều kiện
cho em đến trường theo đuổi ước mơ và thường xuyên khích lệ, động viên em trong
suốt quá trình học tập và thực hiện đồ án tốt nghiệp.

Em xin cảm ơn các bạn cùng thực hiện đề tài trong phòng thí nghiệm –
những người bạn luôn sát cánh và giúp đỡ hết mình trong suốt thời gian thực hiện
đề tài này.
Cuối cùng, em xin cảm ơn các Thầy, Cô trong Hội đồng phản biện đã dành
thời gian đọc và nhận xét đồ án này. Em xin gửi đến quý Thầy, Cô lời chúc sức
khỏe.
Em xin chân thành cảm ơn!
TP. HCM, ngày 18 tháng 08 năm 2016
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Trường An

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN...............................................................................................i
LỜI CẢM ƠN................................................................................................... ii
MỤC LỤC ....................................................................................................... iii
MỞ ĐẦU ...........................................................................................................1
1.1.1. Mục tiêu nghiên cứu .....................................................................3
1.1.2. Mục đích nghiên cứu ....................................................................3
1.2.

Phương pháp nghiên cứu ..................................................................3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................4
1.1.

Tổng quan về vi khuẩn Bacillus subtilis...........................................4

1.1.1. Lịch sử phát hiện...........................................................................4
1.1.2. Phân loại........................................................................................5
1.1.3. Đặc điểm .......................................................................................6
1.1.4. Bộ gen của Bacillus subtilis .......................................................13
1.1.5. Hệ enzyme của Bacillus subtilis.................................................13
1.1.6. Tính chất đối kháng ....................................................................14
1.1.7. Tính an toàn và ứng dụng của Bacillus subtilis .........................15
CHƯƠNG 2.
...............18
2.1.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ...........................................18

2.1.1. Địa điểm nghiên cứu...................................................................18
2.1.2. Thời gian nghiên cứu ..................................................................18
2.2.

Vật liệu nghiên cứu .........................................................................18

2.2.1. Nguồn mẫu..................................................................................18
2.2.2. Hóa chất ......................................................................................18
3


2.3.

Phương pháp nghiên cứu ................................................................18

2.3.1. Phương pháp phân lập và làm thuần ..........................................18
2.3.2. Phương pháp định danh vi sinh vật ............................................21
2.3.3. Xác định cấu trúc vi sinh vật ......................................................21
2.3.4. Kỹ thuật nhuộm bào tử ...............................................................22
2.3.5. Định danh bằng các thử nghiệm sinh hóa ..................................23
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...............................................27
3.1.

Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn ........................................27

3.1.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc .....................................................27
3.1.2. Đặc điểm hình thái tế bào ...........................................................27
3.1.3. Hình dạng bào tử.........................................................................27
3.1.4. Tổng hợp kết quả xác định hình thái và cấu trúc của các chủng
phân lập
3.2.

28
Các thử nghiệm sinh hóa để xác định vi khuẩn Bacillus subtilis ..46

3.2.1. Thử nghiệm khả năng di động....................................................46
3.2.2. Thử nghiệm catalase: ..................................................................48
3.2.3. Thử nghiệm methyl red ..............................................................49
3.2.4. Thử nghiệm Voges Proskauer: ...................................................50
3.2.5. Thử nghiệm khả năng sử dụng citrate ........................................53
3.2.6. Thử nghiệm khả năng sống trên môi trường chứa 6.5% NaCl ..56
3.2.7. Thử nghiệm khả năng thủy phân tinh bột ..................................58
3.2.8. Thử nghiệm thủy phân casein.....................................................59
3.2.9. Thử nghiệm khả năng lên men các loại đường ..........................59

4


3.3.
phân lập

Khảo sát khả năng sinh enzyme amylase ngọai bào của các chủng
65

3.4.

Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ pH đến khả năng sinh enzyme

của các chủng phân lập...........................................................................................67
3.4.1. Khảo sát khả năng đồng nuôi cấy giữa Bacillus subtilis với
Lactobacillus 70
3.4.2. Khảo sát sự tương thích giữa các chủng Bacillus subtilis với
nhau

72
3.4.3. Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn phân lập

đối với nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh trên cây thanh long ..........73
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.........................................................................76
1. Kết luận ...................................................................................................76
2. Kiến nghị .................................................................................................76
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................77

5

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.2. Khả năng lên men các loại đường của các chủng phân lập................72
Bảng 3.3. Kết quả thử nghiệm sinh hóa các chủng vi khuẩn phân lập được ....72
Bảng 3.4. Khả năng phân giải tinh bột của các chủng .........................................74
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ pH đến khả năng sinh enzyme của chủng
phân lập .....................................................................................................................75
Bảng 3.6. Hiệu lực đối kháng giữa các chủng với nấm Neoscytalidium
dimidiatum .................................................................................................................82
Hình 3.28. Hiệu lực đối kháng giữa các chủng phân lập với nấm
Neoscytalidium dimidiatum
.................................................................................................................83

6


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis.......................................................16
Hình 1.2 . Bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis ...........................................................16
Hình 2.1. Sơ đồ phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis .............................................27
Hình 3. 1. Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng BM1 .............................41
Hình 3. 2. Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng BM2 .............................42
Hình 3. 3. Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng BM3 .............................43
Hình 3. 4. Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng BM4 .............................44
Hình 3. 5. Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng BM5 .............................45
Hình 3. 6. Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng BM6 .............................46
Hình 3. 7. Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng BM7 .............................47
Hình 3. 8. Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng BM8 .............................48
Hình 3. 9. Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng BM9 .............................49

Hình 3. 10. Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng BM10 .........................50
Hình 3. 11. Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng BM11 .........................51
Hình 3. 12. Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng BM12 .........................52
Hình 3. 13. Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng BM13 .........................53
Hình 3.14. Khả năng di động của các chủng phân lập .........................................56
Hình 3.15. Thử nghiệm catalase..............................................................................57
Hình 3.16. Thử nghiệm Methyl Red .......................................................................58
Hình 3.17. Thử nghiệm Voges Proskauer ..............................................................61
Hình 3.18. Thử nghiệm citrate ................................................................................64
Hình 3.19. Khả năng chịu mặn của vi khuẩn phân lập........................................65
Hình 3.20. Khả năng phân giải tinh bột của các chủng .......................................66
Hình 3.21. Khả năng thủy phân casein của các chủng.........................................67
Hình 3.22. Khả năng lên men các loại đường........................................................71
Hình 3.23. Khả năng phân giải tinh bột của các chủng phân lập .......................74
Hình 3.24. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh enzyme amylase ..................78

vii


Hình 3.25. Khả năng tương thích giữa các chủng BM1, BM2, BM5, BM 8 với
Lactobacillus ..............................................................................................................80
Hình 3.26. Khả năng tương thích giữa các chủng BM1, BM2, BM5, BM8 với
nhau............................................................................................................................81
Hình 3.27. Khả năng đối kháng giữa các chủng phân lập với nấm
Neoscytalidium dimidiatum ......................................................................................82

viii


MỞ ĐẦU

1.
đề

Đ ặt vấ n
Dân số thế giới theo số liệu thống kê vào năm 2011 đạt trên 7 tỷ người, và

được dự đoán là sẽ đạt đến 9. 4 tỷ vào năm 2050, kéo theo đó là nhu cầu về lương
thực tăng lên 50 – 70% . Sự tăng lên này đã thúc đẩy sự phát triển về sản xuất và
chế biến lương thực thực phẩm, từ phạm vi nhỏ lẻ ở các hộ gia đình, đến quy mô
lớn hơn là ở các nhà hàng, quán ăn – với sự xuất hiện của hàng loạt thương hiệu
thức ăn nhanh, các chuỗi nhà hàng,... Ở quy mô công nghiệp, sự phát triển này được
đánh dấu bằng sự ra đời của nhiều nhà máy chế biến và sản xuất thực phẩm; bằng
sự đa dạng, phong phú về các thương hiệu có mặt trên thị trường. Sự phát triển này
góp phần thúc đẩy dự tăng trưởng kinh tế, tạo cơ hội việc làm, tăng thu nhập cho
hàng triệu người, cũng như tạo nên một thị trường thực phẩm đa dạng, phong phú,
đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng. Tuy vậy, bên cạnh những lợi ích mà sự phát
triển này mang lại, còn tồn đọng nhiều vấn đề tiêu cực, mà rác thải thực phẩm là
một trong những vấn đề quan trọng nhất. Theo thống kê của Tổ chức Nông Lương
Liên hiệp quốc (FAO), mỗi năm, khoảng 1/3 tổng số thực phẩm được sản xuất phục
vụ cho như cầu của người dân toàn thế giới – xấp xỉ 1.3 tỷ tấn –bị lãng phí hoặc mất
mát. Chất thải thực phẩm là một nguồn thải khổng lồ đối với tài nguyên thiên nhiên
và gây ra các tác động tiêu cực về môi trường. Hơn 97% chất thải thực phẩm sẽ
được đưa vào các bãi rác, gây ô nhiễm môi trường đất, nước, không khí; gây ảnh
hưởng xấu đến sức khỏe của con người. Đặc biệt là ở nước ta với tính chất khí hậu
nhiệt đới nóng ẩm và mưa nhiều, là điều kiện thuận lợi cho các thành phần hữu cơ
phân huỷ, thúc đẩy nhanh quá trình lên men, thối rữa và tạo nên mùi khó chịu cho
con người. Các chất thải khí phát ra từ các quá trình này thường là H2S, NH3, CH4,
SO2, CO2, đây đều là những loại khí độc, gây hưởng đến sức khỏe con người.
Ngoài ra, các bãi rác công cộng là những nguồn mang dịch bệnh. Các kết quả
nghiên cứu cho thấy rằng: trong các bãi rác, vi khuẩn thương hàn có thể tồn tại

trong 15 ngày, vi khuẩn lỵ là 40 ngày, trứng giun đũa là 300 ngày. Các loại vi trùng
gây bệnh thực sự phát huy tác dụng khi có các vật chủ trung gian gây bệnh tồn tại
1


trong các bãi rác như những ổ chứa chuột, ruồi, muỗi,...và nhiều loại ký sinh trùng
gây bệnh cho người và gia súc, một số bệnh điển hình do các trung gian truyền bệnh
như: chuột truyền bệnh dịch hạch, bệnh sốt vàng da do xoắn trùng, ruồi, gián truyền
bệnh đường tiêu hoá, muỗi truyền bệnh sốt rét, sốt xuất huyết. Hàng năm, theo tổ
chức Y tế thế giới, trên thế giới có 5 triệu người chết và có gần 40 triệu trẻ em mắc
các bệnh có liên quan tới rác thải.
Trong chất thải thực phẩm,việc xử lý thức ăn thừa từ các hộ gia đình, các
quán ăn, nhà hàng, là một trong những vấn đề khó giải quyết nhất. Hơn 50% số rác
thải thực phẩm ở nước Anh đến từ các hộ gia đình. Các chất thải từ các nhà máy sản
xuất công nghiệp, thường sẽ được xử lý trước khi thải ra môi trường bằng các công
nghệ xử lý chất thải. Còn các chất thải thực phẩm từ các hộ gia đình, nhà hàng,
quán ăn, thường được đưa thẳng vào các bãi rác mà không qua bất kỳ một công
đoạn xử lý nào, điều này không chỉ gây ảnh hưởng đến môi trường và sức khỏe con
người, mà còn gây ra các tổn thất và lãng phí về kinh tế. Vì thế, việc tìm ra các tác
nhân có thể phân hủy các rác thải thực phẩm - đặc biệt là phân hủy các lượng cơm
thừa canh cặn được thải ra từ các hộ gia đình cũng như các nhà hàng, quán ăn – mà
không làm ảnh hưởng đến môi trường đang được các nhà khoa học quan tâm.
Theo Zhi-Long Ye et al (2008) và Jialing Tang et al (2016), trong thức ăn
thừa chưa một lượng lớn tinh bột và cũng khá giàu protein và lipid. Theo Syeda
Azeem Unnisa (2015), Thức ăn thừa là nguồn vật liệu tốt để sản xuất phân bón dạng
lỏng. Theo tác giả, phân bón lên men từ thức ăn thừa tương đối dễ làm, không chứa
độc tố gây hại và cho hiệu quả tốt đối cây trồng,. Vậy các vi sinh vật có ích nào có
trong cơm thừa để có thể tăng cường quá trình lên men, tạo phân bón dạng lỏng từ
thức ăn thừa?
Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng Bacillus subtilis là một trong

những nguyên nhân gây hư hỏng thực phẩm. Thức ăn thừa là một nguồn giàu các
chất dinh dưỡng như tinh bột, các chất béo, protein, và Bacillus subtilis có khả năng
tiết các hệ enzyme amylase, protease, lipase …. phân hủy các đại phân tử thành
những đơn phân dễ hấp thu.


Dựa trên cơ sở đó, đề tài “ Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ thức ăn
thừa” được thực hiện nhằm mục đích thu được chủng vi khuẩn Bacillus subtilis để
làm nguồn vật liệu bổ sung cho quá trình lên men tạo phân bón lỏng từ thức ăn thừa
1.1.1. Mục tiêu nghiên cứu
-

Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ cơm thừa

-

Đánh giá khả năng phân hủy tinh bột dựa trên khả năng sinh enzyme

amylase của vi khuẩn
1.1.2. Mục đích nghiên cứu
-

Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng phân hủy cơm

thừa
1.2. Phương pháp nghiên cứu
-

Sử dụng phương pháp phân lập vi sinh vật để phân lập Bacillus

subtilis
-

Sử dụng phương pháp tuyển chọn vi sinh vật có khả năng phân giải

amylase để tuyển chọn chủng Bacillus subtilis có khả năng phân hủy tinh bột tốt
-

Sử dụng các phương pháp thống kê phân tích để đánh giá hiệu lực của

chế phấm sản xuất được


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về vi khuẩn Bacillus subtilis
Bacillus subtilis thuộc chi Bacillus - một trong những vi sinh vật đầu tiên
được phát hiện và mô tả trong giai đoạn đầu của tiến trình phát triển ngành vi sinh
vật học ở cuối thế kỷ XIX. Đây là một chi lớn với gần 200 loài vi khuẩn hiếu khí,
hình que, có khả năng sinh nội bào tử để chống chịu các điều kiện bất thường của
môi trường sống. Bacillus phân bố rộng rãi trong các hệ sinh thái tự nhiên: từ trên
cạn đến dưới nước, từ nước ngọt đến nước mặn và từ vùng ven bờ đến đáy các Đại
Dương (Trịnh Thành Trung, 2013)
Một số loài thuộc chi này đã được ghi nhận là tác nhân gây bệnh ở người,
trong đó hai loài được xem là quan trọng về mặt y học là B. anthracis – gây bệnh
than, một bệnh truyền nhiễm cấp tính, và B. cereus – có thể gây ra một dạng bệnh từ
thực phẩm tương tự Staphylococcus.( Public Health England, 2015)
Bên cạnh đó, nhiều loài vi khuẩn Bacillus, đặc biệt là nhóm B. subtilis, có
tiềm năng sản xuất các sản phẩm thương mại ứng dụng trong y học, trong nông
nghiệp và trong công nghiệp thực phẩm. (Trịnh Thành Trung, 2013)
Theo phân loại truyền thống, chi Bacillus được chia thành 3 nhóm dựa vào

đặc điểm hình thái của bào tử và nang bào tử, trong đó Bacillus subtilis thuộc nhóm
II – gồm những loài Gram biến đổi ( Gram variable), sinh bào tử hình ellip( Public
Health England, 2015)
Những năm gần đây, hệ thống phân loại chi Bacillus đã phát triển thêm hai
nhóm, được gọi là nhóm B. subtilis và nhóm B. cereus. Trong đó, nhóm Bacillus
subtilis là một nhóm gồm ít nhất 9 loài vi khuẩn có chung các đặc điểm kiểu hình và
có tính tương đồng đoạn gen 16S rRNA cao. Định danh các loài trong nhóm này đòi
hỏi phải sử dụng tổ hợp nhiều kỹ thuật phân loại hiện đại (Trịnh Thành Trung,
2013)
1.1.1. Lịch sử phát hiện
Bacillus subtilis được Christion Ehrenberg phát hiện lần đầu tiên vào năm
1835, tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis”, là một trong số


những vi khuẩn được mô tả sớm nhất.

Năm 1872, nhà sinh học người Đức

Ferdinand Cohn, đã mô tả quá trình hình thành bào tử và đặt lại tên cho loài vi
khuẩn này là Bacillus subtilis (Ines Verbaendert and Paul De Vos, 2011)
Năm 1941, Bacillus subtilis được phát hiện trong phân ngựa bởi tổ chức y
học Nazi (Đức). Ban đầu, chúng chủ yếu được dùng để phòng bệnh lị cho các binh
lính Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Môi trường nuôi cấy chứa Bacillus subtilis hoạt động
được bán trên toàn thế giới như một sản phẩm thuốc và nhanh chóng trở thành
phương pháp điều trị hàng đầu thế giới đối với bệnh lỵ và các vấn đề đường ruột
khác trong nhiều năm cho đến khi các loại thuốc kháng sinh tổng hợp ra đời vào
cuối những năm 1950. Tuy nhiên, vi khuẩn Bacillus subtilis vẫn là một trong số
những vi khuẩn mạnh nhất và có lợi nhất trong tất cả các loại vi khuẩn tăng cường
sức khỏe và kích thích hệ miễn dịch (Stapelberg, Monica-Maria, 2016)
1.1.2. Phân loại

1.1.2.1. Phân loại
Theo phân loại của Bergey (1974), Bacillus subtilis thuộc:
− Giới (Kingdom) : Bacteria
− Ngành (Division): Firmicutes
− Lớp (Class) : Bacilli
− Bộ (Order) : Bacillales
− Họ (Family) : Bacillaceae
− Chi (Genus) : Bacillus
− Loài (Species) : Bacillus subtilis
Danh pháp hai phần: Bacillus subtilis (Ehrenberg 1835) Cohn 1872
1.1.2.2. Nhóm Bacillus subtilis
Hơn 20 năm qua, nhiều loài vi khuẩn có quan hệ gần gũi với Bacillus subtilis
đã được phân lập và mô tả. Chúng gồm ít nhất 9 loài vi khuẩn là B.
amyloliquefaciens, B. atrophaeus, B. axarquiensis, B. malacitensis, B. mojavensis,
B. sonorensis, B. tequilensis, B. vallismortis và B. velezensis. Phương pháp phân
loại truyền thống dựa trên hình thái tế bào, bào tử cũng như các đặc tính sinh hóa


không có khả năng phân tách các loài này. Hơn nữa, kết quả phân tích trình tự đoạn
gen 16S rRNA cho thấy mức độ tương đồng giữa chúng rất cao (> 99%). Vì vậy, 9
loài vi khuẩn trên thường được gọi theo một thuật ngữ chung là nhóm vi khuẩn B.
subtilis
Bên cạnh việc phân loại dựa trên trình tự gen 16S rRNA, một số gen khác
như DNA gyrase subunit A (gyrA), DNA gyrase subunit B (gyrB) và twocomponent sensor histidine kinase (CheA) đã được sử dụng phân loại các loài trong
nhóm B. Subtilis. Gần đây, xây dựng cây phát sinh chủng loại trên trình tự đa gen
(gyrA, rpoB, purH, polC, groEL và 16S rRNA) đã được ứng dụng trong phân loại
các loài hoặc dưới loài B. Subtilis. Nhiều loài trong nhóm này đã được phân tách
thành các loài phụ như B. subtilis được phân thành B. subtilis subsp. subtilis, B.
subtilis subsp. spizizenii và B. subtilis subsp. inaquosorum (Trịnh Thành Trung,
2013)

Phân loại các loài trong nhóm B. subtilis đòi hỏi phải có sự tổ hợp của nhiều
phương pháp phân loại hiện đại. Hiện nay ở Việt Nam hầu như chưa có bất cứ một
nghiên cứu nào công bố chính xác một loài vi khuẩn phân lập trong hệ sinh thái tự
nhiên đến cấp độ dưới loài dựa trên việc phân tích trình tự đa gen.gen (Phan Lạc
Dũng, 2013)
1.1.3. Đặc điểm
1.1.3.1. Đặc điểm sinh thái và sự phân bố trong tự nhiên
Vi khuẩn B. subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi.
Chúng phân bố hầu hết trong các môi trường giàu dinh dưỡng trong tự nhiên như
vùng rễ, đất, nước, phần lớn cư trú trong đất và rơm rạ, cỏ khô nên được gọi là “
trực khuẩn cỏ khô”. Theo nhiều nghiên cứu về sự phân lập nhau Bacillus subtilis từ
rễ cây của các loài thực vật khác nhau thì mật độ vi khuẩn này trong rễ cây là khá
cao, vào khoảng 107 CFU / g đất vùng rễ. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, đất
hoang thì sự hiện diện của chúng rất hiếm. (Anil Wipat and Colin R. Harwood,
1999). Nước và bùn cửa sông cũng như ở nước biển cũng có mặt bào tử và tế bào
Bacillus subtilis. (Bùi Thị Phi, 2007)


Ngoài ra, chúng còn có mặt trong các nguyên liệu sản xuất như bột mì ( trong
bột mì vì khuẩn Bacillus subtilis chiếm 75 – 79% vi khuẩn tạo bào tử), bột gạo,
trong các thực phẩm như mắm, tương, chao...
Bacillus subtilis đóng vai trò đáng kể về mặt có lợi, tuy nhiên cũng gây nhiều
tác hại trong quá trình biến đổi sinh học. Chúng phân hủy pectin và polysaccharide
ở mô thực vật và góp phần gây nên các nốt trên củ khoai tây bị u. Chúng sinh
trưởng trên môi trường nguyên thủy xác định mà không cần bổ sung thêm yếu tố
kích thích sinh trưởng. Bacillus subtilis có khả năng dùng các hợp chất vô cơ làm
nguồn carbon trong khi một số loài khác như Bacillus sphaericus, Bacillus cereus
cần các hợp chất hữu cơ là vitamin và amino acid cho sự sinh trưởng.( Nguyễn
Thùy Dương, 2012). Sự sinh trưởng phát triển của chúng góp phần làm hỏng các
nguyên liệu có nguồn gốc động thực vật, là nguyên nhân gây hư hỏng bánh mì.

(Nguyễn Thị Phương Như, 2008)
1.1.3.2. Đặc điểm hình thái
Bacillus subtilis là những vi khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu
tím Gram (+), tế bào đứng riêng rẽ hoặc nối lại với nhau thành các chuỗi có độ dài
ngắn khác nhau, kích thước: chiều dài 4 -10 µm x đường kính 0.25 – 1.0 µm, với
khối lượng khoảng 4.6 fL khi tế bào ở pha cân bằng (stationary phase) Vi khuẩn có
khả năng di động, có từ 8 – 12 tiên mao.( ( Yu, Allen Chi-Shing et al, 2013 ).
Như các thành viên khác của chi Bacillus, Bacillus subtilis có khả năng sinh
bào tử để tồn tại trong các điều kiện môi trường khắc nghiệt về nhiệt độ và dinh
dưỡng (Michael T. Madigan et al, 2005). . Bào tử hình bầu dục, nhỏ hơn tế bào,
kích thước từ 0.8 – 1.8 µm, vị trí của bào tử phân bố trong tế bào sinh dưỡng
không theo nguyên tắc chặt chẽ nào, nằm chính tâm, gần tâm, hoặc nằm gần tận
cùng; bào tử không làm biến dạng tế bào. (Paul Vos et al, 2011 )


Hình 1.1. Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis
( )

Hình 1.2 . Bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis
(Paul Vos et al, 2011)
1.1.3.3. Đặc điểm nuôi cấy
Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí, tuy nhiên, hiện nay đã có nhiều bằng
chứng cho thấy chúng có khả năng phát triển trong điều kiện thiếu oxy (Paul Vos et
al, 2011)
Bacillus subtilis có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ khá rộng, với
nhiệt độ tối thiểu là 18oC, nhiệt độ tối đa là 43oC và nhiệt độ tối ưu cho sự tăng
trưởng của Bacillus subtilis là ở 30 -37oC (L. Korsten et al., 1996)


Bacillus subtilis sinh trưởng trong phổ pH rộng, từ 2 – 11, sinh trưởng tốt ở

pH = 7.0 – 7.2
Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển trên hầu hết các môi trường dinh dưỡng
cơ bản.
Hình thái khuẩn lạc của Bacillus subtilis biến đổi đa dạng trên các môi
trường khác nhau, thường xuất hiện với các đặc điểm trộn lẫn sau: khuẩn lạc có
hình dạng bất định, đường kính trung bình khoảng 2 – 4 mm, độ sệt dao động từ
dạng ẩm ướt đến dạng bơ, hoặc dạng nhầy đến dạng màng, khi khô trở nên xù xì và
cứng, rìa biến đổi từ dạng lượn sóng đến dạng sợi
o Trên môi trường thạch đĩa Trypticase Soy Agar (TSA): khuẩn lạc
dạng tròn, rìa răng cưa không đều, màu vàng xám, đường kính 3 - 5 mm, sau 1 - 4
ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu
o Trên môi trường giá đậu – peptone : khuẩn lạc dạng tròn lồi, nhẵn
bóng, đôi khi lan rộng, rìa răng cưa không đều, đường kính 3 – 4 cm sau 72 giờ
nuôi cấy
Trên môi trường lỏng, vi khuẩn phát triển làm đục môi trường, tạo màng
nhăn trên bề mặt, lắng cặn, kết lại như vẩn mây ở đáy, khó tan khi lắc đều, ít hoặc
không tạo nhớt
Nhu cầu dinh dưỡng: chủ yếu cần các nguyên tố C, H, O, N và một số
nguyên tố vi lượng khác. Bacillus subtilis có thể sử dụng ammonium, nitrate, amino
acid, các purine, urea, uric acid, allantoin, và các peptide như một nguồn nitơ.
Glutamine, tiếp đó là arginine, là nguồn tốt nhất cho sự phát triển nhanh chóng.
Bacillus subtilis phát triển tốt trong môi trường cung cấp đủ nguồn carbon
(như glucose) và nitơ (như peptone). Bên cạnh đó, Bacillus subtilis cũng có thể sinh
trưởng và phát triển trong các nguồn carbon và nitơ thấp, rẻ tiền, vì hệ enzyme của
chúng có thể thủy phân các protein, carbohydrate và lipid có nguồn gốc động, thực
vật thành những đơn vị cấu thành cơ bản dễ hấp thu (Jorge Olmos et ali, 2014)


1.1.3.4. Đặc điểm sinh hóa
Lên men không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose, mannitol,

saccharose, xylose, arabinose.
Indol (-), VP (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase (+), casein (+),
citrate (+), di động (+), hiếu khí (+).
Bảng 1.2. Các thử nghiệm sinh hóa của Bacillus subtilis
P
h
D
i
P
h
C
a
O
x
I
n
M
R
V
P
C
i
N
i
U
r
G
e
A
r

G
l
L
a
S
u
M
a
M
a
M
a
R
a
G
a
H
2

K
ế
+
+
+
−
−
+
+
[
+

+
−
+
+
+
[
−
+
+
+
+
+
−
−
(Paul Vos et al, 2011)


Các ký hiệu có ý nghĩa như sau:
+ : 90% hoặc trên 90% dương tính
− : 90% hoặc trên 90% âm tính
[+] : 76 – 89 % dương tính
[−] : 76 – 89 % âm tính
1.1.3.5. Bào tử và khả năng tạo bào tử của Bacillus subtilis
a. Cấu tạo bào tử
Bào tử là một khối nguyên sinh chất đặc, có chứa các thành phần hóa học cơ
bản như ở tế bào sinh dưỡng nhưng có một vài điểm khác về tỉ lệ giữa các thành
phần và có thêm một số thành phần mới.
Ngoài cùng của bào tử là một lớp màng , dưới lớp màng là lớp vỏ. Vỏ bào tử
có nhiều lớp. Áo bào tử và vỏ bào tử có tác dụng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước
và chất hòa tan trong nước, đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ lõi bào tử .

Áo bào tử có cấu tạo protein sừng, không thấm nước, có khả năng chống chịu
cao với các tác nhân như lyzozyme, protease, chất hóa học, tia bức xạ… Vỏ bào tử
chủ yếu được cấu tạo từ peptidoglycan, ít liên kết chéo, đặc biệt bên trong vỏ chứa
nhiều phân tử calcium dipicolinate (DPA-Ca) và cũng chính nhờ có Ca2+ mà lớp vỏ
trở nên chắc cứng.
Trái ngược với lớp áo bào tử, vỏ bào tử có tính thẩm thấu rất cao và điều đó
làm cho nước trong lõi bị rút ra bên ngoài vỏ, lượng nước của nó có thể lên đến
70% (trong khi đó tế bào dinh dưỡng chỉ chứa 80%), sự loại nước như là yếu tố
quan trọng cho tính kháng nhiệt, kháng bức xạ và cao hơn hết là để ức chế hoạt
động của enzyme ở bên trong lõi. Măc dù sự hiện diện của Ca2+ ở vỏ không có chức
năng kháng nhiệt nhưng sự có mặt của nó ở trong lõi rất quan trọng. Nó sẽ liên kết
với ADN làm cho cấu trúc ADN trở nên bền hơn trước những tác động bất lợi từ
bên ngoài (Biền Văn Minh, 2011)
b. Khả năng tạo bào tử của Bacillus subtilis
Không phải mọi vi khuẩn đều có bào tử. Nội bào tử thường gặp ở các vi
khuẩn thuộc họ Bacillaceae được tạo ra để giúp vi khuẩn chống chịu tốt hơn trước


những tác nhân bất lợi của môi trường ngoài như tia tử ngoại, tia gama, chất sát
trùng, nhiệt độ môi trường quá cao, môi trường thiếu dinh dưỡng hay sự khô cạn…
Bào tử được hình thành ngay trong tế bào dinh dưỡng, mỗi tế bào dinh dưỡng chỉ
tạo ra một bào tử và không có chức năng sinh sản như bào tử nấm. Khi vi khuẩn đã
hình thành bào tử thì cũng là lúc nó chuyển sang trạng thái sống ẩn, đây là trạng thái
gần như không hoạt động của tế bào
Thời gian tồn tại của bào tử kéo dài: có thể là vài năm, vài chục năm và thậm
chí vài trăm năm. Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ hút nước và bị trương ra.
Sau đó, vỏ của chúng bị phá hủy và bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào mới.
Còn nếu bào tử bị vỡ cấu trúc thì lúc đó vi khuẩn sẽ chết. (Biền Văn Minh, 2011)
Khả năng hình thành bào tử trong những điều kiện nhất định là một trong
những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis. Chúng hình thành bào tử theo chu

trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi (dinh dưỡng trong
môi trường bị kiệt quệ[tô minh châu]. Bào tử Bacillus subtilis có dạng elip đến hình
cầu, có kích thước 0,6 - 0,9 µm x 1,0 - 1,5 µm, có khả năng chịu được pH thấp của
dạ dày, tiến đến ruột và nảy mầm tại phần đầu của ruột non – đây là đặc điểm quan
trọng trong ứng dụng sản xuất probiotic từ Bacillus subtilis
Sự tạo bào tử diễn ra qua nhiều giai đoạn, tổng cộng gần 8 giờ để hoàn tất.
Đầu tiên, nucleotid kéo dài trở thành một sợi trục. Sau đó, tế bào hình thành một
vách ngăn và bắt đầu phân chia thành hai phần. Phần nhỏ hơn của tế bào được gọi là
các tiền bào tử (forespore) và phần lớn hơn được gọi là tế bào mẹ. Tế bào mẹ nuôi
dưỡng tiền bào tử. Khi hình thành vách ngăn, 30% số nhiễm sắc thể đã nằm bên
trong tế bào mẹ, 70% nhiễm sắc thể còn lại chuyển vào tiền bào tử thông qua một
loại protein vận chuyển được gọi là SpoIIIE . Khi bào tử trưởng thành, tế bào dinh
dưỡng tự phân giải và bào tử được giải phóng khỏi tế bào mẹ. (Nguyễn Thị Thúy,
2012)
1.1.4.

Bộ gen của Bacillus subtilis
Toàn bộ bộ gen của B. subtilis đã được giải trình tự vào năm 1997 . Tế bào vi

khuẩn B. subtilis chỉ có một phân tử DNA nằm trong một nhiễm sắc thể tròn. Kích


thước tổng thể của DNA là 4 214 814 cặp bp (4,2 Mbp). Khoảng 87% bộ gen (bao
gồm 4.100 gen) mã hóa cho protein. Trong 4.100 gen thì có 192 gen được cho là
không thể thiếu và 79 gen được cho là cần thiết cho các quá trình sống của B.
subtilis. Hầu hết các gen cần thiết tham gia vào quá trình trao đổi chất (Nguyễn Thị
Thúy, 2012)
1.1.5. Hệ enzyme của Bacillus subtilis
1.1.5.1. Các enzyme nội bào Bacillus subtilis
Trong tế bào Bacillus subtilis nói riêng và vi sinh vật nói chung đều có

những enzyme xúc tác các phản ứng sinh hóa. Các enzyme này được sinh tổng hợp
và nằm trong sinh khối tế bào, chúng thường không có khả năng di chuyển qua
màng tế bào. Đó là những enzyme nội bào.
Enzyme nội bào (intracellular enzyme – endoenzyme ) là những enzyme
được vi sinh vật tổng hợp trong tế bào, nằm trong tế bào và chỉ tham gia vào quá
trình phân giải (dị hóa) các hợp chất hữu cơ có phân tử lượng thấp hay sinh tổng
hợp các vật chất trong tế bào của chúng.
Các enzyme nội bào của Bacillus subtilis: các enzyme thủy phân như
protease nội bào (thường là peptidase và một số protease), pennicillin amidase,
catalase, amylase nội bào…; các enzyme tổng hợp như aspagagin-syntetase; các
enzyme tham gia các quá trình oxy hóa – khử như dehydrogenase, oxydase,
cytochrom, peroxydase và các enzyme tham gia chuyển hóa vật chất có trong tế
bào.
1.1.5.2. Các enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis
Bacillus subtilis có thể sinh tổng hợp nhiều loại enzyme cần thiết cho quá
trình sống để thích ứng với hoàn cảnh và điều kiện môi trường: amylase (αamylase), β-glucanase, xylanase, protease…


Bảng 1.2 . Một số loại enzyme do Bacillus subtilis sinh tổng hợp, đặc tính
và phản ứng thủy phân
N
E hi p P
n ệt H h
zy
tố ảT
αa
m
yl
βgl
uc

an
X
yl
an
Pr
ot
ea
se

h
70 5
80 . ủ
6y
pT
h
35
6.
55
0- ủ
7. y
0
pT
5
h
ủT
6h
7. u
4
y
r

1.1.6. Tính chất đối kháng
Với vi sinh vật gây bệnh, mỗi loài sinh vật khác nhau sẽ thích hợp ở điều
kiện môi trường khác nhau, sinh khuẩn lạc khác nhau. Thay đổi môi trường hoặc
các yếu tố môi trường bất lợi là làm thay đổi điều kiện sống, làm hạn chế hoặc ức
chế sự phát triển của vi sinh vật. Thực tế khi môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự
hiện diện của Bacillus subtilis với một số lượng lớn sẽ xảy ra sự cạnh tranh dinh
dưỡng. cạnh tranh không gian sống giữa vi khuẩn và nấm. do vi khuẩn phát triển
nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môi
trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm bị ức
chế ( Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Thuận, 1976)


1.1.7. Tính an toàn và ứng dụng của Bacillus subtilis
1.1.7.1. Tính an toàn đối với người và động vật
Ở châu Âu và ở Mỹ, B. subtilis được chỉ định là đủ điều kiện về an toàn và
không hề có tác dụng phụ (GRAS, Genrally Regarded As Safe) bởi FDA, nghĩa là
loài vi khuẩn này không gây hại cho người hoặc động vật (Jorge Olmos et al ,
2014). Một số chủng B. subtilis và họ hàng gần của nó là B. licheniformis, B.
pumulis, B. megaterium có khả năng sản xuất lecithinase, một enzyme có khả năng
phá vỡ màng động vật có vú. Tuy nhiên, vẫn chưa có bằng chứng nào cho thấy
lecithinase gây bệnh trên người .
Trong một số các trường hợp người ta vẫn phát hiện ra B. subtilis ở những
bệnh nhân bị ung thư phổi, hoại thư bạch cầu, áp xe khi lắp bộ phận giả…, nhưng tỉ
lệ các trường hợp này là rất hiếm (chỉ có 2 trong 1034 ca phát hiện có B. subtilis) .
Bacillus anthracis là một loài của Bacillus gây bệnh than nguy hiểm cho người
(Nguyễn Thị Thúy, 2007)
1.1.7.2. Một số ứng dụng quan trọng của Bacillus subtilis
Bacillus được ứng dụng nhiều trong sản xuất enzyme công nghiệp vì nó có
khả năng sinh các loại enzyme như protease, amylase, cellulase, lipase, urease…

Ngoài ra, Bacillus còn có khả năng sinh các chất chuyển hóa sơ cấp như nucleotide
acid, inosinic acid, guanilic acid, kháng sinh. Dưới điều kiện sống thiếu dinh dưỡng
Bacillus còn có khả năng sinh các loại kháng sinh peptid như surfactin hay subtilin
có hoạt tính kháng khuẩn
Sự hình thành bào tử của Bacillus thường xảy ra đồng thời với quá trình sinh
hóa khác như tổng hợp một số chất kháng khuẩn bản chất polypeptide (baxitraxin,
tyroxidin, gramixidin, polymidin). Nhiều kháng sinh polypeptide được mô tả chi tiết
về tính chất hóa học và chức năng.
Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp baxitraxin, một nhóm kháng sinh
polypeptide quan trọng, có tác dụng ức chế sinh tổng hợp màng tế bào. Baxitraxin
có

hoạt

tính

sinh

học

đa

dạng:

kích

thích

phân

giải

TB,

tạo

TB trần, ngăn cản sự đồng hóa các acid amin tổng hợp mucopeptide thành TB.


Baxitraxin có hiệu lực chống các VK Gram dương như: Actinomyces, Clostridium,
Staphylococcus, Haemophilus, Diplococcus, Corynebacterium… Baxitraxin được
ứng

dụng

trong

công

nghiệp

chế

biến

thực

phẩm

để

bảo

quả

thịt cá, trong y học điều chế thuốc chữa bệnh, đặc biệt Zn-baxitraxin là một trong
bảy loại kháng sinh được ứng dụng rộng rãi trong chăn nuôi để kích thích tăng trọng
và phòng chống bệnh (Nguyễn Thùy Dương , 2012).
Trong công nghệ thực phẩm, người ta ứng dụng VK B. subtilis, để sản xuất
các enzyme quan trọng. Chế phẩm amylase từ B. subtilis, chịu nhiệt độ
cao được dùng trong giai đoạn dịch hóa tinh bột trước khi đường hóa rất tốt, ở nhiệt
độ 80 – 900C/ 10 – 15 phút α-amylase của VK bị vô hoạt một phần rất nhỏ (Nguyễn
Thùy Dương , 2012).
Bacillus subtilis tạo protease kiềm (gọi tên là subtilisin) với số lượng lớn, có
đặc tính bền vững, hoạt động tốt ở nhiệt độ và pH cao nên chúng được ứng dụng ở
nhiều ngành công nghiệp khác nhau. Ngoài ra subtilisin còn sử dụng trong sản xuất
nước mắm cá, làm thức ăn gia súc, xử lý chất thải từ động vật giáp xác, xử lý rác
thải trong lò mổ gia cầm
Hệ enzyme của Bacillus subtilis được ứng dụng nhiều trong sản xuất chất tẩy
rửa. chúng có thể biến đổi các dạng chất thải độc hại thành những dạng hợp chất vô
hại của nitrogen, carbon dioxide, và nước
Trong công nghiệp sản xuất amino acid, thức ăn gia súc, Bacillus subtilis là
một trong những chủng vi sinh vật tổng hợp lysine có hàm lượng khá lớn (15-20%)
từ tinh bột
Trong y dược, Bacillus subtilis được đóng thành thuốc Subtilis 10ml trị bệnh
tiêu chảy cho trẻ em do vi khuẩn Coliform gây ra, bệnh đường ruột lị do trục trùng,
đắp các vết thương lở loét ngoài da ( Trẫn Đỗ Quyên, 2004)
Sản xuất các kháng sinh thực vật, ứng dụng trong phòng trừ vi sinh vật gây
bệnh nhu nấm Rhizoctonia solani, Fusarium sp, Pylicularia oryzae, … Người ta
thấy rằng sự phát triển của Bacillus subtilis trongcaay làm tăng khả năng tổng hợp