Tách chiết, tinh sạch và nghiên cứu tính chất một vài endonucleaza giới hạn từ các nguồn vi sinh vật của việt nam

Đ Ạ■I H Ọ■ C Q U Ố C G I A H À NỘI
■
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN

I i’ll đề tàỉ:

TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH
VẢ NGHIÊN c ú n TÍNH CHẤT MỘT VÀI _
IỈNDONUCLEAZA GIỚI HẠN TỪ CÁC NGUỔN
Ví SINH VẬT
CỦA VIỆT
NAM
■
I
Mã s ố : ọ c . 97.10

C hủ trì dề tài: P G S. T S. N gu yễn Viln Mùi

0/-- HOC £■uOC GiA h/-.
rRUN-v
THÕNG

l l à nội, lliáng 1-2000


Đ Ạ• I H Ọ■C Q U Ố C G I A H À NỘI
•
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN

Tên đề lài:

TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH
VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT MỘT VÀI
ENDONUCLEAZA GIỚI HẠN TỪ CÁC NGUỎN
VI SINH VẬT CỦA VIỆT NAM
Mã s ố : ỌG. 97,10

C hủ trì đề tài: P G S. TS. N guyễn Vãn M ùi
C ác t á n bộ tham gia:
GS. TSKH. Nguyễn Đình Quyến
TS. Phan Tuấn Nghĩa
TS. Vũ Thị Minh Đức
ThS. Ta Thị Bình
CN. Phạm Hải Yến
CN. Nguvẽn Thị Bích Liên

H à nôi, tháng 1-2000


15ÁO C Á O T Ú M T Ắ T
c ac e n ilonucleaza g iớ i hạn có khả năng phân cát các phan III A D N ờ

Iiliững trình lự (lạc hiệu. Vì vậy nó là “công c ụ ” dặc biệt cho sinh li"c phân
lư và côn g nghệ sinh học. Hiện tại đã có 400 loại c n / i m giới liíin (lã (lượclinh SỊich Irong số hàng ngần loại đirơc pliát hiện.
Các c n /im g iớ i hạn có mặt ỡ nhiều loài vi khuân, hơn nữa I1ƯOV ta r;ìl
(ỈÍI dạng về CÍÌC loài vi sinh vật, chúng là nguồn enzirn giới han tài phong
phú. Vì vậy ch ún g lỏi tiến hành (tiều tra, lách chic) và tinh sạch I11ỘI vài
cnzim giới hạn có Irong một số vi sinh vậl phân lập (lược, (V Việt nam. Cong
Irình (lược 111ực hiện (rong 2 năm từ tháng 7-1997 đôn tháng 7 - 1t?t>cí. lim
(lưực một số kél quá:
Trong 5 chúng vi khuẩn phân lập được, đã plìál hiện được I chung

có c n / i m giỏi hạn và có hoạt tính lất cao (chiếm tỷ lệ 1/5). Troll*’. I } chú 1)1!
x;i klniíin, cỏ 2 cluing có biểu hiện có enzim giới hạn (chiếm lý ]ệ l/í').
íìn /.im g iớ i hạn của clìủ n g vi k liu ẩ n Xíìc đ ịn li (lược là ỈỈ.IC III. m ol

loại Cíli pliíln lư A D N \ cho đđu bằng (đẩu tù).
Đệm chiêì enzim Mac 111 của chùng vi khuẩn lúiy có pM kliií I 5.5-8,0 và bị ức clic ở nồng (lộ muối NaCI 0,2 M.
- K h i sử (.lụng cột sắc k ý ái lực H c p a rin s e p h a ro /a C L M ỉ, c n / i m I hu­
l l ! (lược lá c h k h ỏ i CỘI lọ c gel S c p lia c ry l S.200, C117.ĨI11 Íỉíic l í l íh m v lách |;I

(|tia CỘI sắc ký giữa dính I và đỉnh II.
Tái sắc k ý (lên cột trao dổi ion D R A E -x e n lu lo z n . c n /im

ll; ic III

ciíng dược tách i íi khói cột ờ nồng (lộ muối NaCI 0,1 3 0 , 2 m .
- Qua hai birớc sắc ký: sắc ký lọc gci Scpliai(.)/;.! S.20Í) vi) I;íi >ík l \
lirn Ileparin Si'pliaroza CL-6 B c n / i m Mac III có độ sạch c;to VÌI cu lM'1111
hr<rtig klioiing (>(f kDa.
- fj>ict! kiện pliỏn ứng tliícli họp cho enzim lỉae III cùa chung vi kliu;m
nily hì 'lẹm NBB2, ion M g 3'1" và ừ nhiệt độ 37°c.
ơ mội số chủng xạ khuẩn cíing đã Ị>1lát hiện có e n / i m gioi h;m
Chúng xạ khuẩn 18 có thế là Saclỉ (cnzim cát ADN ). lạo drill s<1 le) VÌ1
chung xạ kỉinân 20 cỏ Ihố là Xho Ị (e n /im cắt ADN tạo (1rĩ LI sole).


SUMMARY
Rcslnclion endo nuc leas es can clcavc DNA molecuics ill spcc iiic scqucnccs.
|| is Ihere lore a useful tool for molecular biology and bioieclinoloiiy. /\!
picscnl, about 400 restriction enzymes have been purified from lliotisiincls of

isolated ones.
Restriction e nzym es are present in many bacteria and in our country, there
has been a variety of inicro-organisms which ihen become a plentiful source
of restriction endonucleases. Thus we investigate, isolate and purify several
icslriclion enzy m es from a small nu mber of micro-organisms isoliilctl ill
Vietnam. This project has been carried out for 2 years from 7-1997 1(1
7 1999 and following results are obtained:
- One strain containing restriction enzyme with a very high iKiivily
h;is been found within 5 isolated bacterial strains, which constitutes ;i ralio
(»1 1/5. Am ong 13 investigated Sireptomyccs strains, 2 strains arc probably
IbuntI lo contain restriction enzymes (a ratio of about 1/ 6 ).
- Hie above restriction enzyme is determined to be Hac III. ;in
c n /y in c eleaves Ằ D N A to give blunt ends.
- The extracting buffer ol this bacterial strain has a wide pH range,
from 5.5 to 8.0 and is inhibited at a NaCI concentration of 0.3M.
- When purifying through ion-exchange colum n DEAR Cellulose,
Mac III is eluted at 0.2M NaCI.
Hac Iff is purified by alTinilv column Scpharosc Cl.-OR Mcp;irin. Il
is (hen separated from this column by 0 . 15M-0.2M NaCI. This charatH'tiscs
like ion-exchange spccics.
- I iae III is eluted beÍween peak 1 and 2 a ilc r running Ihm itgh 1he
Soph aery I S.200 gel nitration column.
- Mae IÍI is also eluted at 0 . Ỉ 5 - 0 .2 M NaCl I'V a sc con (.1 infinity
Sepharose CL -6 B Heparin column,
- After two-step chr omatograp hy including Sephaiose s . 200 gel
filiration and Scpharose CL-6 B Heparin column, Mae III is highly pilliril'd
Willi a molecular weight o f about 90 ki)a.
- Reaction conditions of Hae III are NEB2 r e a d ion buffer, Mil' 4 ion
ilficl a Icmpeicitmc o f 37°c.
- Restriction en zym es are also present in sonic Sircplomyccs strains.

These n i / . y n ic s o f strains N<1.1 s c o u ld be
Sac II ( e n z y m e cuts A ! ) N A to
IM'C cohesive cik Is ) and Ilia! of strains N o.20 could lie X lie ì I ( e n / v m e
ell'llvcs X l ) N / \ l!> give colicsive ends loo).
C o - o r d ii ii U o r of Ti oje r t


MỞ ĐẦU

TÙ chìII nhũng năm 70, việc phát hiện ra các enzym giới hạn trong các
cơ thể prokaryot có khá năng phân cắl phân tử ADN lại những trình tự cIìỊc
hiệu (ỉã m ỡ (láu cho thời kỳ phái triển nhanh chóng cùa công nghệ ADN tái lổ
hợp

một kliAu then chốt trong công nghệ sinh học. Với kỹ thuật này người !h

có llic liến hành các thao lác trên các sinh vật ở mức (lộ gen nlur \;íc (lịnh IrÌTih
lự. ghép, nòi và chuyển gen...
Trong còng nghệ A UN lái tổ hợp, số loại RE tìm dược càng lơn thì cànt:
1ZiLÌp cho công việc trở nên dỗ dàng và chù dọng hơn. Mặt khác. viỌc 1irp tục
nghiên cứu và phát hiện cnzym giới hạn mới sẽ làm giảm b(Tt Iilúrim h;m chê
và cho phép đạí tói clộ chính xác cao phục vụ cho các nghiên t ill 1 ly Ihuvrt
r u n g như các ứng dụng trong lình vực sinh học phân lử và công mílii' sinh học.
Time ra. việc ÍỈ1U thâp nhiều loại enzym giới hạn khác nhau nhàm mục (.lích là
(lùng “con d a o “ này cắl ADN ở bai cứ vị trí nào nẹirời thí nghiệm mong muon.
Tuy (lên nay dã có hơn 400 loại RE được tinh sạch và trớ thành thuoiiịỉ phàm
Irong su hàng imhìn loại được phái hiện, nhung chính bới những !ý (lo 1rên mà
Iigàv nay người ta vòn tiếp tục tìm kiếm các RE từnliiéu nation khác nhau.
Theo Đ ỏ Đ ìn h H ồ, các enzvm nàv có mỄU ở bấu hốt các Idài vị klum n.

t)Ay diínli là (licu kiện lluiận lợi trong nghiên cứu vổ RE cíìng nlur Iioiìg k 11.1
năiiíi cung cap một lượng lớn sinh khối làm nguyên liệu cho CÒIUĨ HL’lic Siin
XLIAI RK đại tra. Nước la nằm trong vùng khí hậu nliiột đới, là mõi ỉmừng


-

2

-

lliuân lợi cho sự phát triển da dạng cùa vi khuẩn. Do vây, SC có nhieii hứa hẹn
(rong việc lìm kiếm các RE từ nguồn nguyên liệu phong phú này ớ Việt Nam.
M ục tiêu dề ra cúa đề tài là:
Điều tra sự có mặt của RE ớ một sô chủng vi sinh v;it phíln lAp ờ Việi
Nam.
'I hăm dò phương pháp tách chicl và mộ! sô dicu kiện |>h;tn ling cu;i
cnzym giới hạn của một chúng vi sinh vật.
Bước đầu tinh sạch enz.vin giới

hạn trong (liều kiện hiện có ctm

phòng Ilì í nghiệm góp phồn vào những nghiên cứu cơ bán về cnzym ịiiới han.
Công trình n a V được thực hiện tại Bộ môn Hoá sinh - Khoa Sinh học
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Qu ốc eia Hà nội từ 7/19^7 (lèn
7/1999.


V NỘI DUNG

1.1 N < ỈU V Ê N L I Ệ U VÀ P H Ư Ơ N G P H Á P N í ỉ H I È N C Ủ I ỉ
1.1.1 N G U Y Ê N L I Ê U
Đối lượng: Chúng vi khuẩn và xạ khuẩn dể đici! tra cn/.ym giới hạn
(lược phan )â|> lừ Bộ môn Vi Sinh học, Trung ỉílin Vi sinh vàl học ứng clụiiịi.
Khoa Sinh học- Trường đại học Khoa học lự nhiên Đại hục Quốc gia Hà nội.
Các nòi vi sinh vật để thử hoạt lirih lizozym dơ phòng sinh học philii
tử Viện Vệ sinii dịch tễ cung cấp
ÍT I 3

Nuôi cấy 1rên môi Irường dịch thể

O TBI5
IV 2
k)CD 10

Nuòi cây Irên môi trường dĩa thạch

(ÌB4
MBA ;>
n .) i

( 1 >2

I ỉoá chai:

I

p.nym a ịói hạn chuẩn: Soc lí. ỉlu n l 111, ĩ:('()/ỉ\' Hi/Iiỉỉỉ I. A/ir'l,
l i (1C ĩ ỉ I cua hãng BioLabs (Mỹ)

-!

Lizoxyin cua hãng SIGMA (Mỹ)


-

4

-

+

ÀDN chuẩn: AL)N X, (|>X174, AN D T7 của hãng Bin! ,;ihs

+

Acrylamit, Bis-acrylamit, Tris-HCI, Tris-bazcf. Eliđium Bromil.
Ỉ E M E D , EDTA, 2-Mercaptoetanol, Trixton X-IOÍ). ScpliíicIVI
S-200, Heparin Sepharo7a C L 6 B của hãng Phaim;icia ( lliụy
Điển)

+

Pcpton, cao nấm men, DHAE-Xenluiiva, BSA cùa hãng Sigma
(Mỹ).

I

l i ic l hi m a y :

+

Ly !Ain

lạnh:

Sorvall

RC

- 5B

Refrigerated

SU|H’I speed

Centrifuge (Mỹ).
\- Máy siêu âm: Soniprep 150 (Anh)
-f

Máy soi: Hoefcr - Macro Vue UVis - 20 (Mỹ)

+

M áy quang phổ: Sliimadzu Speclrophotomclcr 11V

+

Bỏ chạy diện di nằm nhỏ và lớn Bio - Ratl í Mỹ)

VIS(NI)àl)

+ Bọ chạy điện di dứng: Hocíer - Pharmacia (Tluiỵ Điên).
Cíìc lioá chít! và dụng cụ Ihí nghiệm khấc ờ phòng thí nghiệm cua Bô
mòn Hoá sinh học-Trường (.lại học Khoa học (ự nhiên - Đại học (,)||<n ò i ill'll cỉạl VCU c ẩ u d ù n g I r o n y n g h i ê n c ứ u

1. 1.2. m i l U N C , P H Á P N l ĩ H I Ê N c ứ u
1.1.2.1.

N U Ô I C Ấ Y XẠ K H U Ẩ N

Oiling ví sinh vật nghiên CỨI.I dược nuôi trên mỏi trường (lìa tliíich k | ì l
có lliíinh phíiii nhu' sau:
K J IP O ,

!g

NiiCI

\ịi

MgSO,. 711,0

\ỊỊ


-

CaC O ,

2g

(NH.,)7S 0 4

2g

Tinh bộ I

l()g

Agar

:

5

-

lOg

Khuẩn lạc sau khi mọc trcn đĩa thạch dược chuyển sang mini cày moi
trườn” tlịclr (lie LB có thành phàn như sau:
Pepton

l()g

Cao nấm men

5g

NaC!

|()g

H 20

:

I .OOOml

Các môi Irường (lược khứ trùng ở i a(ni trong 30 pluíl. Clumti

XíỊ

khu fin

clirợc 11nôi cAy ớ 37nc .

1.1.2.2. C Á C P H Ư Ơ N G P H Á P T H U N H Ậ N C H Í : P H Ẩ M KNZYINI

ỉ .Ị .2.2.ỉ. Tách chiết enzytn vỉ sinh vật từ môi trường nuôi cấy
Các lê bào vi sinh vật dược lách ra khỏi dung dịch nuôi ciív luíng cách
ly làm 5000 v/p (rong 10 pill'll ở 4 " c Loại bỏ dịch, thu l;ì_v cặn 10 liỉto. sinh
khối vi sinh vật nếu chưa SƯ dụng được cất giữ trone 111 lạnh ờ 4"c. Rửa lè bào
being đệm phá lê hào SB (K)mM Tris-HCl; 0,1 m M

EDTA.

lOmM 2-

mcrcíiploctanol; 0,2% Trixlon X-100; ImM NaN,; 5 rr glvxcrol; 5 0m M N;|(1;
|1Ỉ I 7,4 ờ 25"C).
Dimg siêu íìm đê phá vỡ tế hào ở 0°c, 8 Amp, mỏi chu kỳ cIkiy siêu Mill
là 15 giAy. [hời gian sicu Am không quá 5 phúl dể báo vè Imại lính cn/vni
Ly Ifim dịch lố hào tia vỡ của vi smli vật với tốc độ 17.000 v/p In Ml 11 .w phut r c . 'IllII dịch cliiìM rút thô.
ỉ .1 .2 .2 .2 . T ì ì ừ h o ạ t t í n h p h ú m à ỉ i g c ủ a H zozynt


-

6

-

Moi Irường nuôi cấy: Vi sinh vât được nuôi cílv Irong moi Iiirừng
Luria Brolh (LB)
Phá tổ bào vi khuản hằng siêu Am:
Sai: khi nuôi cấy lê' bào vi khuíỉn, lv lílm Iliu niuìn têChuyên
lô bào vào dung dịch đệm siêu âm. Lấy 5 111) địch tế bào, siêu Am ớ 0" c \ mui
c hu

kỳ 10 giAy. Sau 5 chu kỳ, thử độ trona trong các IÁU pluí tê bìu ì. Khi (lõ

Irong khòng lăng lên nữa hoặc lăng lên khô ne đánụ kể thì Iigứrii! lại (Thời
gian siêu íun khô ng quá 10 ph út)
1’híí lố bao vi khuẩn bằng lizozym: Li7,07,y 111 được pha với các IIOIIỊ!
(lộ 0.1, 0,2 và 0,3 mg/ml với đệm Tris - HC1 10 mM, píl 8,0. Lííy 100 ^il dịc h

nuôi cây vi khuẩn Ircn môi trường iỏng và Irên đĩa thạch, cho Ilièm S(K) |il
(lem I ris

HCI 10 mM, pH 8,0 và 200 Ị.li dung dịch li/o/yn i cu;ì lừng ln;ii. 11

ớ nhiệt độ lạnh trong 2 giờ.
Ly lâm lấy dịch tế bào vi khuẩn ớ 10.000 g (I'-1.5(H) vu ng/ph úi)
li o n g 15 phúl ớ () ’c .

-

Phương pháp xác dinh độ phá vỡ tế bào vi kliuâti bới l i /n /v m
+ Xác định độ dục trước và sau khi cỏ lizo/vm
Lfty 100 ỊLI.1 dịch tê bỉio, cho thêm 800 J_if (ỉệm I l is

11( I 10 niM.

|)lỉ 8.0 và 200 Ị.ÍĨ dung dịch lizozviii 1,5 mg/ml. Đo O D (V lurớc S(>tỉ«i Wì0 nin
Irước và sau khi t h o liz(v/ym. IJ ờ niiiệl dộ lạnh tront! LO. 1.5, 2,0. 2.X v;i í.n

I

Xác tỉịtili độ phíi vỡ tè hào truức và smi klii clu> li/(>/\ in

CliLiii’n bị ít' hào như ờ phrin xác định độ (lục-. Hti! loŨML! tc b;H> (V
ii\c nong <fộ 10 \ 10 4 và l() r>. Lay 990 Ị.IỈ nước Cíìt, cho lliêm 10 ụl (licỉi lè l'hn
(a). pha loíìng (Ill'll a bằng cách lâv 99(1 fil inrớc Cell roi cho them in Ịìl (lit h II
(h). liòp lục pha loãng, làv l>-)0 ụl mrớc cài cho thêm 10 Ịil dịch b (ci l.;ì\ ^ |||
(lịch c ( I 0 r') câ\ tlcn lên dĩa thạch, II ờ 37 (’c . Đế m sô’ lượng lẽ bìm.

-

-

7

-

Phán ứng của enzym giới hạn có sự Iham gia của lizozym
Lay 5 ông nghiệm, cho 25 ụ.1 đệm phản ứng TR (lO mM Tris -HC1;

10 m M M g C l2; lOmM 2- mercaploetanol; 50m M NaCl; pH 7,5, cho sau khi
đã khử trùng), 2 Ịil A N D (Pha loãng 500 microgani/microlit), 1 |.il enzym giới
hạn (Hindi ỉ ĩ, Bam Hỉ, Eco Rí), 3 ^1 lizozym vào các ống có nồng (lọ cuối
cùng là 0,3, 0,2, 0,15 và 0,1 mg/ml và ống đối chứng không có li/07.ym. ủ ờ
3 7 ° c (rong I giờ. Sau đó cho vào mỗi ống 10 |il dung dịch ngừng phàn ứng
(5 0% glixerin, 50 m M EDTA, pH 8,0, 0,02% bromophenol blue).
- Phản ứng với enzym giới hạn dịch chiết thồ (phá bằng siêu Am) cớ và
0,01 mg/mỉ với đệm Tris - HCI 10 mM, pH8,0.
+ Chuẩn bị dung dịch lizozirn: Dung dịch có nồng độ 0,3, 0,2,
0.15 và 0.1 m g/ml với đệm Tris-HCl lOmM, pH 8,0.
+ Phản ứng: Dùng 5 ống nghiệm đánh dấu từ I đến 5. Cho 40 Ị.IỈ
đệm NB vào ống 1, 30 ul vào ống 2,3,4 và 5. Cho 5 Ị.IỈ dịch chiết thô vỉ\o ống
1,

trộn dẻu. Lấy 15 p.] dịch từ ống 1 cho sang ống 2, trộn đều. Láy 15 Jil dịch

từ ống 2 cho sang ống 3, tiến hành tiếp tục đến ống 5. ố n g 5 bỏ đi 15 |al tlịcli.
Như vậy, mỗi ống nghiệm có 30 Ị.IÍ dung dịch có nồng độ dịch chici thô tương

ứng

1/9, 1/27, 1/81, 1/243, 1/729. Cho vào mỗi ống: 2 |il A N D Ằ hoặc A N D

T7, 3 |LiJ dung dịch lizozym từng loại mồng độ, ống đối chứng không có
lizo/.ym, ủ ớ 3 7 ° c trong 1 giờ. Cho tiếp 10 |.il dung dịch ngừng phán ứng .
-

Điện di (rên gel agaroza.

-

Gel

agaroza 0,7 % dày 3 - 4 mm. Cho vào mỗi RÌống 15 nl (lung

dịch cùa mỗi ổng nghiệm, dối chứng là mẫu A N D ). cắt bời Hind IIí, diện ííp
100V. Khi kốl thúc điện di, bán gel được nhuộm với etiđimn hiomil (10
mg/nl). Các băng A N D được phát hiện và chụp bằng anh Polaroid.


-

/

8

-

.1.2.2.3. P hư ơng p h á p xác định /làm lượng protein

Đo độ hâp thụ của mẫu ở bước sóng 260 nm và 280 nm và línli IỈ1CO

côn g tliírc:
Hàm lượng protein = 1,55 X O D 2sn - 0,77 X O D ?r,0 (mg/ml)

1.1.2.2.4. Sắc k ý lọc g e l qua cột Sephacryl S-200
Geí ớ dạng Irương sần dược nhồi lên cột có kích thước ( Ỉ , 0 x 6 0 u n )
Cân hằng và rứa chiêì CỘI bang đệm NB (10 m M N a 2HP0 4-NaH,P( ) y: 0.1 niM
EDTA; lOmM 2 - mercaptoeianol; 5% glyxerol; 50 inM NaCI; plỉ 7.4). lim
mỗi phan đoạn 2 ml với tốc độ chảy 15ml/h. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 280
lim và hoạt tính phân cắt ADN cùa enzyni ở các phân đoan.

Ị .1.2.2.5. Sốc k ý trao đổi ion quơ cột D E A E -X enluloza
D E A E - Xenluloza dạng bột khó dược ngâm trong MCI 0 , 5 M Imng 30
phút lồi được rửa bang nước cất đến pH 4,0. Tiếp đến xir lý bằng cách iigAm
(rong NaOH 0.5 M trong 30 phút và cuối cùiig rứa bàng nước CÁI (lên pll lu mu
línli. Nhựa trao dổi sau khi xử ]ý được nhồi lên cột có kích thước | v | ( ) cm.
('An bằng cột bằng đệm TB (lO mM Tris -HC1; 0,1 mM HDTA; lOuiM 2nicrcnploctanol; ‘V'r glyxerol; 50mỉVl jNaC!; pH 7,4). Chế pliắĩn c n / y m cán
líích chiết íluợc (Um lèn cột. Phẩn protein không hấp phụ (lưưc lira bằng (lộm
T R với tốc đ ỏ ch ả v 15 n i ỉ / ỉ i . Phần p rotein hấp phu dược rửa c liic ! bằTiíi các

Hổng (lộ NaCI plici trong đệm TB tíing díin t ừ O , I M - 0 / i M . Tiến hành thu phíìn
tloạn, mỗi pliíìn đoạn 2ml dể phAn tích protein và hoạt tính pliAn cắt ADN t i n
enzym. Cột dược chạy trong cticu kiện lạnh dể đám báo hoạt tính á m

en/VUI

ì . ỉ . 2.2.6. Sắc kỷ ái lực qua cột H eparin Scphaì OT.n ( I - 6ỈỈ
I lcparin Scpliaro/.a (ỉạng hột khô CÍLKrc ngArn I.rong đệm IB í iOmM I ris I K I:
0 I m M E D I A: lOmM 2- mcreaptoctanol; 5°r gỉyxcrol; 5 0 m M

I'll 7,4)


-

9

-

sau dó nhồi lên cột có kích thước (0,5x3cm). Điều chinh tốc độ chạy l.^ml/li
rứa vài làn (2()0tnl/g bột khô) để đẩy tạp chất. Chế phẩm enzvni Ciìn tíích chiết
(lược clưa lên cột. Phần protein không hấp phụ được rửa chiết bằng gradient
nồng độ NaCl pha trong đệm TB từ 0,05 M - 1 M NaCl. Tiến hành thu pliAn
đoạn, mỗi pliAn đoạn lml đổ phân tích protein và hoại lính pliíln cắt ADN cua
c n / y m . Cột (lược chạy trong điều kiện 4 - 6° c để đảm hào hoạt tính cua cn/ytn

í. 1.2.3. X Á C Đ Ị N H H O Ạ T T Í N H P H Ả N C Ắ T A D N C Ủ A E N Z V M
G K Í I H Ạ N B À N G P H Ư Ơ N G P H Á P Đ I Ệ N DI T R Ê N ( Ỉ K L
AGAROZA

Ị. 1.2.3.1. Thực hiện p h ả n ứng
Pha loãng dịch chiết rút thô với các nồng độ khác nhau trong ilimg (lịch
(lộm phản ứĩig NBB 2 ( lO m M Tris HCI; lOmM M g C l2; 5()ml NaCl; I m M D I T
pH 7.9 ở 25"C). T ừ mỗi dung dịch đó lấy 30 |il cho vào 2 f.il ADN X chuẩn
(500 ^Ig/ml). Tiến hành ú hỗn hợp phản ứng ở 3 7 ° c trong một giờ. Dừng phiin
ứng hằng cách sốc nhiột ở 6 5 ° c trong 3 phút.
Từ tiling dịch phản ứng lây ra 15 ỊLIỈ, Ihêm vào 2ị\ì thuốc nhuộm (HỈ)TA
50inM và hromoplienol xanh 0 ,0 2 % pha trong glyxerol 50%). Châm diện di
dể phái hiện các hăng A D N được cắl ra nhờ R E h o n g dịch chiCt

1.1.2.3.2. C huẩn bị g e ỉ agarotũ và chạy điện di
Đ ệm T H E 3 X dược chuẩn bị hăng cách cân M í! T r i s - lw ơ và 2 7 ,Sg a x il

boric, Ihêm 20m! BDTA 0,5 M rồi dẫn Iiước ciú clến I lít,
Từ THE 5X |>ha loãng thanh TBE 1X để dổ gcl agam /a và cỉiav diện di.

Gc! ;ig;uo7a
Iiong

dược chuẩn bị bằng cách đun sôi 0.24 ị: ngan v a

)ml I iỉtỉ IX. Để dung dịch a ẹ a r o / a nguội den khoáng 60 ‘ r ill! (lê lén

kímôn ỉicl (tã cài sắn lược. Sau khi gcỉ đỏng, cho gel VÌIO máy điện (li. (tó ỉ BI-


-

10

-

IX vào máy sao ch o gel ngập trong đệm khoảng Imm rồi rút lược ra. l.^il
(lịch trộn mâu (ìuực cho lên mỗi giếng.
Chạy diện di ở hiệu diện thế ổn định 40V. Khi vệt chất màu chạy g;in
lìôt hán gel thì ngát dòng. Nhuộm gel bằng dung dịch ctidium hromil 2 ri . LAy
ucl ra (lem soi dưới đèn tử ngoại để quan sát sự phân bó' cùa các bring ADN.

ỉ . 1.2.3.3. X ác định độ tinh sạch của c h ế p h ẩ m enz.ym bn fig phiíong

p h á p diện di trên g e l SD S

-

polyacrylam it theo ỉ.aem m ỉi

(1970).
-

Ch nàn bị du n g dich đ ể chạy điên di

A. Dung dịch gốc 30%: cân 29,2 g acrvlamit hoà lan với H : ( ) Ihìm li 100 ml và
Ihôm vào 0,8 g bis-acrylarnit.
n. Tris - HCI l,5M, pH 8 ,8 : Càn I 8 , t 7 g Tris -bazơ, 0,04g SỈ)S li(i;i ÍÍ1T1 trong
1M ) và chính về pỉ l 8,8 bằng MCI, sau đó dẫn H 3() đến lOOml
c . Tris - MCI 0,5M, pM 6 ,8 : Cân 6,06g Tris-bazơ, 0,04« SDS lioà lan Ironỵ
H 2Q và chỉnh đến pH 6,8 bằng HC1, sau đó dẫn H 2Q đến lOOml.
ỉ). Aĩiioni pcfsulphat 10%: Cân 0 , lg amoni pcrsníphat pha trong hill ỉ 1,0
í ’. Dung dịch đệm diện cực: CAn 3,0 g Tris -bazơ Víì 14,4 g glyxin. '. ho tliêm
l,()g SDS lồi dẫn H 20 đốn lOOOrnl.
ỉ;

Đệ m cô pfl 6,8: Oil) 3g Ti is -ba/,ơ lioà lan trong HiO. chính \ r

pi I 6.X

hằng MCI và cho H20 liến 50mi.
(ì. Chíìl chí thị màu: Cân 2mg biomophenol xanh hoà lan liong 0.5 ml (lem I .
0.5 ml [ M ) và ! ml glyxcml.
li.

'llniôc nhnộin: Cân 250 g

CBB Cì 25(1 hoà tan Imni! 100 ml Ill'lllitfp 'lung

(lịch C H , O il: O Ỉ , C O O Ỉ I : H:G ílico ty lệ 45:9:46 YC llìc lích.

.


-

11

-

I. Pha dung dịch tẩy: Là hỗn hợp dung dịch C H 3OH: CH ,C O OH: l ỉ 3() theo
tý lệ 4: 1:5 vé thể tích.
-

Chu ân bị mẫu
Chrtt dê pha mẫu là hỗn hợp dung dịch 2 - mercaptoctanol: SI )S Ì(Y r :

chát c hí thị màu pha theo lý lệ 1: 1 :2 vè thể tích.
Mẫu được trộn vợi chất pha mẫu theo tỷ lệ 10:1 về the lích
-

Đỏ g eỉ c h ạ y diện di
Chuẩn hi gel polyacrylainit theo tỷ lộ ghi ờ bảng sau:

Hảng 2. Thành phíỉn các dung dịch đệm
Idling dịch
1.oại gcl

A

íĩc l cò 4,5%

0,3

(ỉcl tách 12.5%

2,5

B

1.5

c

h 2o

TE M E D

D

0,5

1.2

0.003

(1,023

-

2.0

0,003

n .o n

Gel tách ! 2,5% sau khi trộn đều được cho nhanh vào khuôn kính có
kích thước 0,1 x 8 ,0 x 1 0 ,0cm. Them nước cất lên trên mặt gcl (lể mặt gcl không
bị oxy hoá và bang phẳng. Đê gel đông khoáng 30 phút thì loại bo lớp nước
phía trên, cài lược và đổ tiếp lớp gcl tách 4,5% lèn phía trên. Để gcl It ìmg hợp
2 giờ Irong nước, sau đó thay nước bằng đệm diện cực E. Dùng cylanlì liơm
30f.ll man vào mỗi ciếng.
Tiến hành chạv diện di trong đệm diện cực với hiệu diện thè io o v . cường đọ
(lònụ điện 3;nA/ giếng. Sau khi vệt chất màu chạv hết bán gcl. I;"iy gcl ra
tìhuộtìi với thing địch H. tẩy màu bằng cìuiig dịch ỉ và chụ p ánh kcl quá 1I1Í
imhiệni.


-

12

-

2. KẾT OUẢ VÀ THẢO LUẬN

2.1.

ĐIỂU TR A S ự CÓ MẶT CỦA ENZYM GIỚI HẠN Ỏ M Ộ T s ố
CH ỦNG VI SINH VẬT PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM
N hầm tìm kiếm các chủng vi sinh vật chứa enzym giới hạn, chúng tôi

tiến hành điều tra sơ bộ một số chúng vi khuấn và xạ khuẩn phân lập ở Việt
Nam.

2.1.1. Nuôi cấy vi sinh vật
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu 20 chúng vi sinh vật do Bộ mô n Vi sinh
học và Trung tám Vi sinh vật học cung cấp. Các chủng này được nuôi cấy trên
đĩa thạch trong môi trường Isp 4 để thu lấy khuẩn lạc. Một trong những hình
ánh vi khuẩn được nuôi cấy trên đĩa thạch trong môi trường Isp 4 được thế
hiện ở hình 1

' \ H ì n h 1. Khuẩn lạc cua chủng vi
khuẩn 5 nuôi cây trẽn mỏi trường
<

N. c
V,

:

thạch Isp 4

- IJ -

Sail khi các khuẩn lạc đã mọc Irên đĩa thạch (hình I ). chúng lõi lim lííy
vi sinlì vật và chuyển vào nuôi cấy trong môi trường dịch thể LB. Các lố bào vi
sinh vật nuôi Irong môi trường dịch thể LB được sử dụng làm nguồn cung Cíìp
cuzym. Với phương pháp này, cần phải tăng sinh khỏi lê hào Irong íl nliíH là
1000 tnl môi trường LB. Các bình nuôi cấy giữ ở 37" c và phải dược lắc liên
lục. Tuỳ thuộc từng chủng mà thời gian nuôi cấy trong môi trường khác nhau.
Có chủng chỉ tuiỏi trong 24 giờ. có những chủng khác phái nuôi cAy trong Mi
giờ đến 48 giờ mới thu đủ sinh khối clể thí nghiệm. Chúng lòi Ihu chung biìng
cách ly lâm và cho tan lại trong 5 ml đệm phá tế bào. Cuối cùng chí dùng 30
nl tlịcli thô đã pha loãng 1/81 lẩn để xác định enzym giới hạn. Với chúng
không tìm thay en zy m giới hạn, việc phíìri tích ngừng lại liim cluing tôi liếc
côn g sức, thời gian và nguyên liệu. Do vậy, chỉ có những chủng dương línlì
cua bước đầu nghiên cứu này đirực chọn lọc và nuôi cấy trong môi (MiiíMg (.lịch
(lie để liến hành các bước nghiỏri cứu tiếp theo. Để khắc phục vAn để Iiỉiy,
tilling lôi chỉ nuôi chủng trên mòi trường thạch và thu sinli khối Hực liếp
ỉ ỉ ước thí nghiệm này đơn giản hơn so với phương pháp trước vì f l u m e lòi
không phíú !y í;ìm nhiều lần để Ihu sinh khối. Mặt khác, lira llụicli tĩir<ÍL II
trong tủ ổn nhiệt hao đảm 37°c, vi khuẩn ílươc tăng diện lích liếp xúc với
không khí nén phát triển lốt hơn và dạc biệt trong mộl thời gian ngắn (24 giờ)
chúng lõi có the till] dược sinh khối (lể xác dịnh enzym

2.

1 . 2 .

t ) ỉ c

u

t r

a

s

ụ

c

ó

m

ặ

t

c

ủ

a

e

n

z

v

m

g

i ớ

i

h

ạ

n

Trong trường hợp có enzym eiới hạn trong chúng vi sinli VỘI nohiên CÚÌI
!;i có Ihê phAn tích (lể xác định enzym đó. Ly lâm dịcli the LR 50 00 v/p Irong
10 pill'll (V 4(’c (ỉó llui lây sinli khôi lè bào. Hoà các lế bào trong clệni siêu full
IB theo lí lè Ig tê hào: 5ml đệm. Có thê phá vỡ tế bào hằng cách null ion lò
bíio với bột bioxit nhôm hoặc hi thuỷ linh. Nhưng cách t'>l Ilk'll là (lung


- 14 -

plurơng pliỉí|> siêu Am. M ộ t vài chùng vi sinh
ly /n /v m lnr
VỘI

phíii ho

S lin g

100 fill/n il

30 phút. T ro n g nghiên C'ỨII tiny, c lu itic l<'i ^it'' 11

Am phá vỡ tc bào ớ 8 A m p trong 3 pluíl (V 0"c. Quá trình siêu Mill

tiên

liíinli không liôn lục, cứ khoảng 15 giAy lại dừng lại mộ! khoáng thời gi.m
lư ơng ứng đổ đảm bảo khổng cỏ sự tăng nhiệt độ đáng kè Irong (|II;Í trình siêu

;ìm làm ảnh hưởng đến hoạt lính của enzym. Dịch phá tê hào (luơc ly lAm
17.0(H) v/p trong .10 phút ở 4°c. Loại bỏ kết tủa thu l;ìy pliÀn nước noi di' (lieu
lia sự có mạ! Clin RE. Thông qua khá năng cắt cùa chúng (lối với AI >N } (ImiỊi
Ihời (lựa vào diện di dồ các eti/ym giới hạn chuẩn có llìê xác (lịiil) (liKíc chú Mị!
nào có RF. h uy RR tìm clirực ià dĩi biết hoặc chưa lừng phiít hiện. ĩì;n 1e ^ líi Kri
<|IKÍ cu ít quá í lình klìáo sát với các clumg vi sinh vật đã dung.
KỉÍ íiịí 1. Két cịUii kháo sá sự có mạt của enzym gii’ii hạn (1 nicl so chimi! M
xinh VAI troim lự nhiên
SI I

(ỉin n g

N g u ổ n gốc

vi siltil vật

A D N íliing

K( í (ịiiíi


|>ltAn lích

AON X

Khoni’ r ó \ ĩu h

2 v;n h tì H<

Vi kill lim J

Nước lỉiải

2

Vi khuẩn 2

T r o n 5 cống

3

Vi kliuán 3

-

4

Vi kluiẩi 1 4

-

5

Vi kliiifm 5

-

Í1

Xạ khuân ọ 3

Trong clâl

ADN l

7

X.) klmẩn Q4

-

-

Ó

X;i khuân 3

-

X;_ỉ Ivlitiáii A

-

I

V

I v;k h m<"t
( Vi \ ;tch rõ
Kliõni’ cu

v;h

h

( o 2 ' ;tcli met


-

Chủng

SIT

15

N g u ồ n gốc

vi s in h vật

-

AI)N d ù n g

KOI cpià

đ ể p h â n tích

phím lích

10

Xạ klimiín Q 8

-

11

Xạ khuẩn QIC)

-

-

CY) hai vạch

12

Xạ khuẩn Q12

-

-

-

13

Xạ khuẩn 5

-

14

Xạ khuẩn 6

-

-

15

Xạ khuẩn 9

-

-

16

Xạ khuẩn 1 1

17

Xạ khuẩn 12

-

18

Xạ khuẩn 15

-

19

Xạ khuẩn 18

20

Xa khuẩn 20

-

_____ 1

Kliòtm có vạch

Có 2 vạch mờ

-

-

-

-

-

■

Chúng lói nhận thấy rằng ở chủng vi khuẩn 5 xuấl hiên nil nhiều hăng
ADN lương (lối rõ nét. Như vậy ở chủng vi khuẩn nàv cỏ RE và (V (lịch chiết
Ihò CI1ZV111 hoạt động khá mạnh ớ độ pha loãng 1/81. Còn ó nlifinkhuẩn Q3, Ụ4, Q 8 và vi khuẩn 1, 2 ADN Ằ dã bị c;Í! nát. ('() thò (lo nuclcíi/íi
hoạt (ỉộng mạnh, tạo thành vệt sáng m ờ tiên gel diện di. Đổi với nhúng t hunt:
vi khuẩn và xạ khuẩn còn lại xuàt hiện 1 đèn 2 băng với kích llitrớc khinin” lư
700 - 800 hp. Có thể rằng các endonucleaza kh ông dặc hiệu lạo ni những hfuig
ADN

giới

han không

rõ hoặc những đoạn

ADN

X báo 1hu dm;i

bị

ciHlíi!)Uclca/a cắ! hết. Trong dịch chiết thô có rất nhiều veil tò' có t!i(' ng;ín can
\i ệ c chứng !ninlì sự cỏ mặt của RE Iihir các c n d o n LieIcaza klìótiii (l;i< liiỌn. UI ít
exoimcleaza hay tio những RE hoại dộng khnng bôn. Qua kết CỊIKÌ u;\v clHÍMị!


-

16

■

lôi nhện thấy rằng, m uô n phái hiện enzym giới hạn cần phải tìm cách loại trir
c ác ciuloiuiloaza không đặc hiệu có mặt trong mọi lố hào. Các cmlnnuclcíưa
không đặc hiệu tạo ra những băng giới hạn không rõ và làm cho việc xác (lịnh
Irử ncn khó khán hơn. Khi những ảnh hưởng này bị loại bò thì lioạl tính cua
RE sẽ được biểu hiện. Vì vậy dịch chiết thó cần phải sử lý qua các cột sắc ký
để cho phép tách R E ra khỏi các yếu tô' ảnh hưởng. Với 20 mâu clịcli chiết thô
íừ vi sinh vậl, sau khi làm phản ứng chúng lỏi chỉ tìm được mội chủng vi
khuẩn 5 có hoạt tính R E rõ ràng, chiếm tỉ lệ 1/ 2 0 . Sô' liệu nay thíìp lum so với
kết quả m à tác giả Lê Thị Kim l u y ế n dưa ra khi tiến hành điều la RE cùa

2000 vi sinh vật là I/5-1/6. Nguyễn Thị Vân Anh (1993) cũng diet! Im 17
chung vi sinh vật và đã tìm được một chủng xạ khuẩn có RE A va II và phát
liiộn sự có mặt của hai RE khác Irong hai chủng vi khuẩn. Sự khác nhau này
cõ lẽ là do sò' lượng mâu điều tra cùa ch únc tỏi còn ít. Rai có thô tí !ẹ này
không chỉ dừng ư con số 1/6. Nếu tiến hành điều tra diện rộng tròn tài cả các
nguồn vi sinh vật thì có thể còn caơ hơn nữa. Như vậy, các nghiên cứu dà
chứng tỏ ràng số lượng các vi sinh vậl phân lập ở Việt Nain có chứa RE khổng
phải là ít và sẽ là nguồn cung cấp R E phong phú cho những nghiên cứu và ứng
dụng RE sau này. Chúng tồi chọn chủng vi khuẩn 5 làm dối urợng nghiên cứu
cho các thí nghiệm tiếp theo.

2 .í.3. Níĩliièn cứu sù dụng lizozim phá màng tê bào vi khuẩn
2.13.1. Xác dịnh nồng độ Hzozim thích hợp
2 .1 .3 .1 ./. D ổ i với cóc enzint chuẩn

Đê lìm hiểu ảnh hướng của lizozim lên các enzini giới hạn chuãn. chúng
lòi dã liố trí thí nghiệm dùng H in d III cắt A D N Ằ trong sự có mạt cua l i 7.07.im

ứ các nổng độ khác nhau dùng để phá màng l ế b à o vi klutàn.


17

-

-

Q ua kêt quả cho thấy, nếu nồng độ lizozim 0,10 - 0.15 mg/ml có trong
hỗn hợp cắt của H in d III không ảnh hường đến kết quá. Nhưng ớ nồng độ
lizozim 0,2 và 0,3 mg/ml thì đã cắt nhỏ A D N A. (hình 2 )

1 2

3

4

5

*

í

jr
,

.

»

"• / v . r V -

i 1 ■ ■■■';.

V

"

...

’-***$;*{ 'y~u*'■’ f

*'^vfejSr: Hịỉ*■ry/W' '1 •
•*•ì fife?;i ■’ iệ[ V>,
.

,1

^ i r K . flty fiJif-]

ỹ n ^ ịứ : \ ’

:■

H ì n h 2. Phổ điện di A D N Ằ cất bới enzim giới hạn H in d III có lizozim
/ -

AD N À + Hind /// +lizfìzim 0,3 mg/ml

2 - ;4DiV i + /-//Hí/ /// +lizozim 0,2 míịhnl
3 - ADA' /í. + ///»£/ III +ìizozim 0,15 mg/mì
4 - AD N Ầ + Hind III +ỉizozim 0,1 mạ!ml

ĐAi Hc

c ouoc

G IA H A fsiO>

TRƯNG TÃ;/. T H Ò N G TIN Th ư V I ẻ Tv' I

P

7

/

ồ 0

A

5 - AD N À + Hind /// +không có lizozim

2.1,3.1.2. Đôi với cnzim i>iứi hạn được tách chiết thô bởi tê bào bàng siéit úm
có và không có sự tham i>ia của lizozim
Sau khi tìm hiếu ánh hướng của nồng độ lizozim lên sự cắt ADN Â.
ch ún g tôi đã thí nghiêm tiếp tuc sư ánh hưởng của 11/ 0 / im lén e n / i m giới han


- 18-

tho t u a mọt so cluing vi sinh vật clirực tách chicl biíim cácli pliií vỡ tố h:i<> bới
siêu Am.
Đối với enzim giới hạn thô của chủng T T I 3 phá vỡ tế bào hiiiig siêu Am
+ Có thêm lizozirn nồng độ 0,3 mg/ml.
Khi liỗi) hựp phản ứng có thêm lizozim nồng độ 0,3 iTig/tnl, ỉàt cá ADN
Ấ bị cắt nát kh ông có băng điện di, điều này chứng tỏ li7.07.im tin ánh hướng
đến sự cắt ADN Ằ và ADN T7 bởi

en ziiT i

giới hạn của chúng T f ! 3. có lliể dà

ức chê sự hoạt động của enzim giới hạn, có thể đã lliuý phan enzim giới lum.
+ Có them lizoziin nồng độ 0,15 mg/ml
- Với ch ủng T T 13
Sau khi thử phản ứng cát A D N bởi enzim giới hạn thò cua chúng 1TI3
có tliêin li7,07,im nồng độ 0,3 mg/m không có kết quả. Chúng tôi thứ phán ứng
với hỗn hợp có lizozim 0,15 mg/in] và kết quả cho thấy enzim giới hạn thò cua
chủng TT13 có lizozim 0,15 rng/ml trong hỗn hợp đã không ảnh lurớiig (ỈCii sự
cắt AD N X và ADN T7 bởi enzim giới hạn thô của chủng n 13 (hình 3)


-

1 2 3 4

19

-

5 6 7 8 9 10 11 12

H ì n h 3. Phổ điện di A D N được cắt bởi enzim giới hạn thô tách từ chủng
TT13 có lizozim 0,15 mg/ml tham gia.
1-5-

AD N Ã + enzim giới hạn thỏ

6,11- Đỏi chứng không có AD N
7-10- AD N T7 + enzim gi ('ri hạn thỏ
/2- AD N À + Hind III

-

Với chủng OTB.
Khi sử dụng enzim giới hạn thố của tế bào chủng OTB phá vỡ bằng siêu

âm và khi phán ứng có sự thêm lizozim nồng độ 0,15 mg/m l cho thấy ờ nồng
độ này kh ông anh hưởng đến enzim giới hạn của chủng OTB đến sự cắt ADN
Ả và ADN T7 (hình 4).


-

12

3 4 5

20

-

6 7 8

9 10 11 12

H ì n h 4. Phổ điện di AD N được cắt bới enzim giới hạn thô của chủng OTB có
lizozim 0,15 mg/ml
ì - 4: A D N Ả + enzim giới hạn thó
ỉ , I I : Đ ôi chím ẹ không có A D N
6 - 10: A D N T 7 + enzim giới hạn thô
12: M ấu chuẩn

2.1.4. Xác định độ phá vở tế bào bằng lizozim với nồng độ 0,15
m g/m l
Đế tìm hiếu phá màn g tế bào vi khuẩn bằng lizozim. ch ún g tôi dựa vào
sự thay đổi chi số O D và đếm số lượng tế bào .


-

11

-

- Chí số OD
( h ú n g u»i dùng IÌ7,07.im nồng (lộ 0,15 mg/ml cho lác (limii lên c;íc
chủng vi khuẩn T T I 3 , OTB15 và T V 2 cho thấy cluing OTB 15 sau I giờ phíin
ứng chỉ sô O D giảm rất ít, chùng TT J3 giảm khoang 1/ 3 . còn chimp TV2
giảm nhiều nhất, có nghĩa là lizozim đã phá hầu hết màng tế bao

vi kluiAii

TV2. Hiệu qua hoạt động lizozim dối với các chủng vi khuẩn có kliiíc nhau có
ihể do cấu lạo (liành tế bào vi khuẩn gram (-»-) và grain {-) khác

Iliu m

hoặc do

c á t dull nil Ày cua các vi khuẩn dó bao quanh tê bào dã cinh lurứng (lèn sự lioạl
(lộng của 117,07,im (háng 2)

Hảng 2. Sự thay dổi chỉ số O D của các chủng vi khuẩn dưới tác tiụng cua
lizozim nồng độ 0,15 mg/ini
Cluing

Lần

TTI3

O T B 15

TV2

1

0,33

0,25

0.1 1

2

0,32

0,27

o .n

3

0,32

0,29

0.11

I

0,25

0,24

0.04

2

0,25

0,25

0,03

3

0,24

0,24

0,03

J

0,24

0.24

0.01

2

0,24

0.22

0,01

3

0,25

0.22

0.01

T h ò i gian

Không có li/,ozim

Sau 1 giờ cho lizozim

Sau 2 giờ cho lizozim