Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men để ứng dụng trong sản xuất whisky từ malt đại mạch và ngô

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

NGUYỄN VĂN QUYÊN

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN
CHỦNG NẤM MEN ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG
SẢN XUẤT WHISKY TỪ MALT ĐẠI MẠCH VÀ NGÔ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2020


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

NGUYỄN VĂN QUYÊN

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN
CHỦNG NẤM MEN ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG
SẢN XUẤT WHISKY TỪ MALT ĐẠI MẠCH VÀ NGÔ

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 9.42.01.07

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1. TS. Nguyễn Quang Thảo

2. GS.TS. Nguyễn Thành Đạt

HÀ NỘI - 2020


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan Luận án tiến sĩ “Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm
men để ứng dụng trong sản xuất whisky từ malt đại mạch và ngô” là công
trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và tài liệu trong luận án là trung
thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào. Số liệu
công bố có sự cộng tác nghiên cứu, đã được đồng ý của các cộng sự. Tất cả
những tham khảo và kế thừa đều được trích dẫn và tham chiếu đầy đủ.
Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2020
Nghiên cứu sinh

Nguyễn Văn Quyên


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành Luận án tiến sĩ, Tôi đã nhận được sự hướng dẫn về chuyên
môn, sự giúp đỡ rất tận tình của các đơn vị, các thầy, cô và bạn bè cùng gia đình.
Nhân dịp này Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và trân trọng cảm ơn: GS.TS.
Nguyễn Thành Đạt, TS. Nguyễn Quang Thảo, đã tận tâm hướng dẫn tôi trong suốt
quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án khoa học này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn: Bộ môn Công nghệ sinh học và Công nghệ
vi sinh; Trường đại học Sư phạm Hà Nội; Trường Cao đẳng Hải Dương; Bộ môn Vi
sinh, Bộ môn Đồ uống, Trung tâm bảo tồn Vi sinh vật công nghiệp (Viện Công
nghiệp Thực phẩm); Công ty cổ phần Bia-Rượu ERESSON Việt Nam đã tạo mọi
điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất, trang thiết bị, nhân lực giúp Tôi thực hiện tốt
nhất các nghiên cứu khoa học, triển khai thực nghiệm và các công việc có liên quan

tới nội dung của luận án.
Tôi xin được cảm ơn sự giúp đỡ của: TS. Nguyễn Quang Hào; PGS.TS.
Dương Minh Lam -Trưởng phòng Khoa học công nghệ, TS. Trần Thị Thúy -Trưởng
Bộ môn CNSH và CNVS (Trường Đại học Sư phạm Hà Nội); PGS.TS. Nguyễn Thị
Minh Tú, Viện Công nghệ sinh học và Công nghiệp thực phẩm (Trường Đại học
Bách khoa Hà Nội) đã chia sẻ kinh nghiệm, kiến thức học thuật, hỗ trợ tôi trong quá
trình nghiên cứu.
Cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn đồng hành, chia sẻ và tạo mọi điều kiện
tốt nhất để Tôi hoàn thành luận án này.
Xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2020
Nghiên cứu sinh

Nguyễn Văn Quyên


MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU..................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU.........................................5
1.1. Nấm men...........................................................................................................5
1.1.1. Đại cương về nấm men............................................................................5
1.1.2. Đặc điểm sinh học cơ bản của nấm men.................................................6
1.1.3. Nhu cầu dinh dưỡng cơ bản của nấm men..............................................9
1.1.4. Lên men rượu etylic...............................................................................12
1.1.5. Nấm men trong công nghệ sản xuất rượu..............................................15
1.1.6. Những yếu tố cơ bản ảnh hưởng tới quá trình lên men rượu của
nấm men.........................................................................................................17
1.2. Rượu whisky...................................................................................................22
1.2.1. Khái niệm và phân loại whisky..............................................................22

1.2.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ rượu whisky trên thế giới......................23
1.2.3. Tình hình sản xuất và tiêu thụ rượu whisky tại Việt Nam......................26
1.3. Công nghệ sản xuất rượu whisky..................................................................27
1.3.1. Nguyên liệu chính trong sản xuất rượu whisky......................................27
1.3.2. Enzyme bổ sung trong sản xuất whisky.................................................33
1.3.3. Enzyme Protease...................................................................................35
1.3.4. Công nghệ sản xuất rượu whisky..........................................................35
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
................................................................................................................................. 43
2.1. Nguyên liệu, hoá chất, thiết bị........................................................................43
2.1.1. Nguyên liệu...........................................................................................43
2.1.2. Hoá chất................................................................................................44
2.1.3. Thiết bị..................................................................................................44
2.2. Môi trường......................................................................................................44
2.3. Phương pháp nghiên cứu...............................................................................44
2.3.1. Phương pháp vi sinh vật và sinh học phân tử........................................44
2.3.2. Phương pháp hoá - lý............................................................................46
2.3.3. Phương pháp hóa sinh..........................................................................57
2.3.4. Một số kỹ thuật sử dụng trong quá trình nghiên cứu.............................60
2.3.5. Phương pháp cảm quan........................................................................62
2.3.6. Phương pháp toán học..........................................................................64
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN..............................65
3.1. Tuyển chọn nấm men......................................................................................65


3.1.1. Mục đích tuyển chọn nấm men..............................................................65
3.1.2. Tiêu chuẩn tuyển chọn nấm men...........................................................65
3.1.3. Tuyển chọn chủng nấm men..................................................................65
3.1.4. Đánh giá khả năng lên men rượu của chủng MS42..............................71
3.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và định danh chủng MS42..............72

3.2.1. Đặc điểm hình thái của chủng nấm men MS42.....................................72
3.2.2. Khả năng đồng hóa đường của chủng nấm men MS42.........................73
3.2.3. Định danh khoa học chủng MS42.........................................................74
3.3. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng của Saccharomyces
cerevisiae MS42 trong nuôi cấy mẻ.......................................................................75
3.3.1. Ảnh hưởng của độ pH...........................................................................75
3.3.2. Ảnh hưởng của hàm lượng ôxi hoà tan ban đầu....................................76
3.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ........................................................................78
3.3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng đường tổng số............................................79
3.3.5. Sử dụng giá đỗ thay thế pepton trong môi trường nhân giống nấm men
........................................................................................................................ 81
3.3.6. Đánh giá chất lượng chủng MS42 trong quá trình bảo quản................82
3.4. Nghiên cứu động học quá trình lên men rượu của Saccharomyces
cerevisiae MS42......................................................................................................83
3.4.1. Nghiên cứu động học quá trình lên men rượu từ malt đại mạch...........83
3.4.2. Nguyên cứu động học quá trình lên men rượu từ ngô...........................95
3.5. Nghiên cứu công nghệ sản xuất rượu whisky từ ngô và malt đại mạch
(quy mô PTN).......................................................................................................104
3.5.1. Nghiên cứu công nghệ sản xuất rượu whisky từ malt đại mạch..........104
3.5.2. Nghiên cứu công nghệ sản xuất rượu whisky từ ngô...........................108
3.5.3. Nghiên cứu tỷ lệ phối trộn rượu malt và ngô để tạo loại rượu Blend
...................................................................................................................... 112
3.5.4. Nghiên cứu qúa trình ủ chín và tạo hương rượu whisky......................113
3.5.5. Bước đầu nghiên cứu sự biến đổi một số chất thơm trong quá trình
tàng trữ rươu whisky.....................................................................................117
3.5.6. Quy trình công nghệ sản xuất rượu whisky từ malt đại mạch.............135
3.5.7. Quy trình công nghệ sản xuất rượu whisky từ ngô..............................138
3.6. Nghiên cứu ứng dụng sản xuất thử nghiệm sản phẩm tại Công ty Eresson
............................................................................................................................... 140
3.6.1. Chế biến dịch lên men.........................................................................140

3.6.2. Lên men rượu......................................................................................141
3.6.3. Chưng cất............................................................................................141
3.6.4. Tàng trữ, tạo hương và hoàn thiện sản phẩm......................................142
3.6.5. Đánh giá chất lượng sản phẩm...........................................................142


KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................................143
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BÔ....................145
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................146
PHỤ LỤC............................................................................................................1PL

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Nội dung

AOAC

Association of Official Analytical Chemists
(Hội các nhà hóa học phân tích chuẩn quốc tế)

BH

Bắc Hà

EDTA

Ethylenediamine tetraacetic acid

FAN

free amino nitrogen (amino acid tự do)

GC-FID

Gas chromatography - Flame ionization detection
(nhận biết qua sắc ký khí – sác ký ion hóa ngọn lửa)

GS-MS

Gas Chromatography - Mass Spectrometry
(Sắc ký khí và sắc ký khối phổ)

KL

Khối lượng

KPH

Không phát hiện

LV

Làng Vân

MS

Mẫu Sơn

MUFA

Monounsaturated fatty acid
(acid béo không no có một nối đôi)

NCYC

National Collection of Yeast Culture
(Trung tâm sưu tập giống nấm men quốc gia)

OD

Optical Density (Mật độ quang)

PCR

Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi Polymerase)

PUFA

Polyunsaturated fatty acid
(Acid béo không no có nhiều nối đôi)

QCVN

Quy chuẩn Việt Nam

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

To

Nhiệt độ

YM

Yeast extract, malt extract aga (Môi trường thạch cùng nước


chiết malt và chiết xuất nấm men)
w/v

Đơn vị khối lượng trên tích (tính theo khối lượng chất tan (g)
nhân với 100 và chia cho thể tích dung dịch (ml))

'

phút

DANH MỤC CÁC BẢNG
Tr

Y
Bảng 1.1:
Bảng 1.2:
Bảng 1.3:
Bảng 1.4:
Bảng 1.5:
Bảng 1.6:
Bảng 2.1:

Bảng 2.2:
Bảng 2.3:
Bảng 2.4:
Bảng 3.1:
Bảng 3.2:
Bảng 3.3:
Bảng 3.4:
Bảng 3.5:
Bảng 3.6.
Bảng 3.7:
Bảng 3.8:
Bảng 3.9:
Bảng 3.10:
Bảng 3.11:
Bảng 3.12:
Bảng 3.13:

Một số axit amin ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng Saccharomyces
cerevisiae (xếp theo thứ tự từ cao xuống thấp)........................................10
Thành phần tro của sinh khối Saccharomyces cerevisiae.....................11
Đặc điểm của quá trình thủy phân đường ở Candida tropicalis và
Saccharomyces cerevisiae....................................................................15
Các chi nấm men rượu điển hình..........................................................17
Bảng thành phần dinh dưỡng chính có trong ngô vàng hạt khô.................31
Các hợp chất Polyphenolic chính có trong một số loại gỗ sồi..............33
Một số mẫu rượu whisky thương mại.....................................................43
Điểm tiêu chuẩn cho từng chỉ tiêu cảm quan........................................63
Hệ số quan trọng của các chỉ tiêu.........................................................64
Xếp hạng chất lượng sản phẩm............................................................64
Kết quả phân tích và đánh giá cảm quan của 15 dòng nấm men

(trên môi trường malt - M)...................................................................66
Kết quả phân tích và đánh giá cảm quan của 15 dòng nấm men
(trên môi trường ngô - N).....................................................................67
Kết quả phân tích sắc ký khí rượu từ dịch malt sau chưng cất..............68
Kết quả phân tích sắc ký khí rượu từ dịch ngô sau chưng cất...............68
Kết quả cảm quan rượu malt chưng cất lần 2.......................................69
Kết quả cảm quan rượu ngô chưng cất lần 2........................................70
Khả năng lên men tạo độ cồn cao.........................................................70
Khả năng lên men của chủng MS42 với các chủng TN2, EC1118,
BDX, R2226.........................................................................................71
Khả năng sử dụng một số loại đường của chủng MS42.......................74
Ảnh hưởng của pH tới sự sinh trưởng của S. cerevisiae MS42............75
Ảnh hưởng của oxy hoà tan ban đầu đến sinh trưởng nấm men MS42
.............................................................................................................77
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng nấm men MS42...................78
Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến sinh trưởng nấm men MS42.........80


Bảng 3.14:
Bảng 3.15:
Bảng 3.16:
Bảng 3.17:
Bảng 3.18:
Bảng 3.19:
Bảng 3.20:
Bảng 3.21:
Bảng 3.22.
Bảng 3.23:
Bảng 3.24:
Bảng 3.25:

Bảng 3.26:
Bảng 3.27:
Bảng 3.28:
Bảng 3.29:
Bảng 3.30:
Bảng 3.31:
Bảng 3.32:
Bảng 3.33:
Bảng 3.34:
Bảng 3.35:
Bảng 3.36:
Bảng 3.37.
Bảng 3.38:

Ảnh hưởng của giá đỗ đến sinh trưởng nấm men.................................82
Ảnh hưởng của thời gian lưu giữ giống MS42 đến lên men rượu........83
Khả năng lên men đối với các loại malt khác nhau..............................84
Ảnh hưởng của kích thước malt nguyên liệu tới dịch đường hóa.........84
Ảnh hưởng của tỉ lệ phối trộn malt với nước đối với dịch malt............85
Ảnh hưởng của tỉ lệ Termamyl® SC bổ sung đến đường hóa dịch malt
.............................................................................................................86
Ảnh hưởng của tỉ lệ Dextrozyme® GA bổ sung trong đường hóa
dịch malt...............................................................................................87
Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình lên men dịch malt
.............................................................................................................88
Ảnh hưởng của pH đến quá trình lên men dịch malt............................89
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men dịch malt....................90
Ảnh hưởng của SO2 đến quá trình lên men rượu từ dịch malt..............91
Ảnh hưởng của số lượng tế bào nấm men đến quá trình lên men rượu
.............................................................................................................92

Sự biến đổi đường, cồn, axit và số lượng tế bào nấm men trong
quá trình lên men rượu.........................................................................93
Bảng thành phần dinh dưỡng chính có trong ngô vàng hạt khô.................95
Ảnh hưởng tỉ lệ phối trộn với nước của dịch ngô.................................96
Ảnh hưởng của tỉ lệ Termamyl® SC và thời gian thủy phân đến độ
nhớt của khối dịch thu được.................................................................96
Ảnh hưởng của nồng độ Dextrozyme® GA và thời gian thủy phân
đến hàm lượng đường thu được (g/l)....................................................97
Ảnh hưởng của hàm hượng Neutrase và thời gian thủy phân đến
hàm axit amin (mg/l)............................................................................98
Ảnh hưởng của hàm lượng đường trong lên men dịch ngô..................99
Ảnh hưởng của pH đến quá trình lên men rượu từ dịch ngô...............100
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men rượu ở dịch ngô
...........................................................................................................101
Ảnh hưởng của số lượng nấm men đến quá trình lên men rượu ngô
...........................................................................................................102
Sự biến đổi đường, cồn, axit và số lượng tế bào nấm men trong
quá trình lên men rượu từ dịch ngô....................................................103
Thành phần dịch malt sau khi đường hóa...........................................105
Sự biến đổi trong quá trình lên men rượu từ dịch malt (M)................105


Bảng 3.39:
Bảng 3.40.
Bảng 3.41:
Bảng 3.42.
Bảng 3.43:
Bảng 3.44:
Bảng 3.45.
Bảng 3.46:

Bảng 3.47.
Bảng 3.48:
Bảng 3.49:
Bảng 3.50:
Bảng 3.51:
Bảng 3.52:
Bảng 3.53:
Bảng 3.54:
Bảng 3.55:
Bảng 3.56:
Bảng 3.57:
Bảng 3.58:
Bảng 3.59:
Bảng 3.60:

Kết quả phân tích rượu chưng cất lần 1..............................................107
Tỷ lệ tách rượu đầu và cuối trong giai đoạn chưng cất lần 2..............107
Kết quả phân tích các mẫu rượu malt chưng cất lần 2........................107
Thành phần dịch ngô trong lên men rượu sản xuất whisky................108
Sự biến đổi trong quá trình lên men rượu từ dịch ngô (N)..................109
Kết quả phân tích rượu ngô chưng cất lần 1.......................................110
Tách mẫu rượu phân tích trong chưng cất lần 2..................................111
Kết quả phân tích các mẫu rượu ngô chưng cất lần 2.........................111
Đánh giá cảm quan tỉ lệ rượu phối trộn giữa malt và ngô...................112
Đánh giá cảm quan 24 mẫu gỗ sồi ngâm rượu (Thời gian ngâm 03 tháng)
............................................................................................................114
Kết quả cảm quan lần 2 của 04 mẫu gỗ sồi sau 180 ngày ủ với rượu........115
Giá trị OD các mẫu ngâm sồi với lượng gỗ sồi khác nhau theo
thời gian.............................................................................................116
Giá trị OD420nm các mẫu ngâm sồi ở hàm lượng cồn khác nhau..........117

Thành phần một số chất tạo hương của whisky Jack Danies (Mỹ)
sản xuất từ 100% ngô.........................................................................118
Thành phần một số chất tạo hương của whisky Singleton
(Scotchland) sản xuất từ 100% malt...................................................120
Thành phần một số chất tạo hương của KNOB CREEK (Mỹ) whisky phối trộn (80% ngô; 20% malt)..............................................121
Thành phần cơ bản một số chất tạo hương trong rượu trước khi
ngâm sồi.............................................................................................123
Thành phần cơ bản một số chất tạo hương rượu whisky sau 06
tháng tàng trữ.....................................................................................125
Thành phần cơ bản một số chất tạo hương rượu whisky sau 12
tháng tàng trữ.....................................................................................127
Thành phần cơ bản một số chất tạo hương rượu whisky sau 18
tháng tàng trữ.....................................................................................129
Thành phần cơ bản một số chất tạo hương rượu whisky sau 24
tháng tàng trữ.....................................................................................131
Kết quả cảm quan sau 24 tháng tàng trữ.............................................134


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1:
Hình 1.2:
Hình 1.3:
Hình 1.4:
Hình 1.5:
Hình 1.6:
Hình 1.7:
Hình 1.8:
Hình 1.9:
Hình 1.10:

Hình 1.11:
Hình 1.12:
Hình 2.1:
Hình 2.2:
Hình 2.3:
Hình 2.4.
Hình 2.5:
Hình 2.6:
Hình 3.1:
Hình 3.2:
Hình 3.3:
Hình 3.4:
Hình 3.5:
Hình 3.6:
Hình 3.7.
Hình 3.8:
Hình 3.9:
Hình 3.10.
Hình 3.11.
Hình 3.12:
Hình 3.13:
Hình 3.14:
Hình 3.15:

YY
Bào tử và túi bảo tử của nấm men..........................................................7
Chu kì sinh sản của nấm men S. cerevisiae............................................7
Các pha nguyên phân của nấm men S. cerevisiae...................................7
Sơ đồ tóm tắt sự kiểm soát dị hóa glucose............................................14
Sản lượng rượu whisky tiêu thụ ở một số nước năm 2014...................25

Doanh số và lợi nhuận năm 2016 và dự đoán thị trường rượu
whisky đến năm 2025...........................................................................25
Một số sản phẩm thủy phân của tannin................................................32
Sơ đồ đường hoá dịch malt...................................................................35
Thiết bị chưng cất gián đoạn................................................................38
Quy trình chưng cất rượu whisky của Scotland....................................39
Quy trình chưng cất rượu whisky của Ireland......................................39
Thiết bị chưng cất liên tục theo thiết kế của Coffey.............................40
Một số loại rượu mẫu thương mại sử dụng phân tích đối chứng..........44
Đường chuẩn maltose...........................................................................48
Đường chuẩn D-glucose.......................................................................49
Đồ thị đường chuẩn Albumintheo phương pháp Lowry.......................52
Sơ đồ đường hoá dịch malt...................................................................61
Sơ đồ đường hóa dịch ngô....................................................................62
Sắc kí đồ sản phẩm rượu của dòng MS42 trên môi trường malt (M)
.............................................................................................................68
Sắc kí đồ sản phẩm rượu của dòng MS42 trên môi trường ngô (N)
.............................................................................................................68
Khuẩn lạc chủng MS42 trên môi trường Hansen..................................73
Hình dạng tế bào chủng MS42 dưới kính hiển vi điện tử.....................73
Túi bào tử của chủng MS42.................................................................73
Cây chủng loại phát sinh xây dựng bằng phần mềm Mega 6...............74
Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng nấm men S. cerevisiae MS42.......76
Ảnh hưởng của ôxi hòa tan ban đầu đến sinh trưởng nấm men S.
cerevisiae MS42....................................................................................78
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng S. cerevisiae MS42..............79
Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến sinh trưởng của S. cerevisiae
MS42....................................................................................................81
Đồ thị động thái lên men rượu trong dịch malt.....................................94
Đồ thị động thái lên men rượu từ dịch ngô.........................................104

Phổ sắc ký một số chất tạo hương của whisky Jack Danies (Mỹ) sản
xuất từ 100% ngô................................................................................118
Phổ sắc ký một số chất tạo hương của whisky Singleton
(Scotchland) sản xuất từ 100% malt...................................................119
Phổ sắc ký chất tạo hương của KNOB CREEK (Mỹ) - whisky phối


trộn (80% ngô; 20% malt)..................................................................121
Hình 3.16. Sơ đồ sản xuất rượu whisky từ malt đại mạch....................................135
Hình 3.17. Sơ đồ sản xuất rượu whisky từ ngô....................................................138


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Whisky thuộc loại rượu mạnh (độ rượu từ 40 – 50%Vol) được sản xuất bằng
cách chưng cất dịch lên men một số loại ngũ cốc (đại mạch, lúa mì, ngô, lúa gạo,...),
rượu sau chưng cất được tàng trữ với gỗ sồi trong thời gian dài để hoàn thiện sản
phẩm [30], [108]. Mỗi một loại whisky có hương vị đặc trưng và khác biệt riêng do
sự khác nhau về: loại nguyên liệu sản xuất, chủng nấm men sử dụng, khí hậu đặc
trưng từng vùng, quy trình sản xuất, thời gian và điều kiện tàng trữ [115].
Trước đây, rượu whisky là sản phẩm nổi tiếng được sản xuất tại Scotchland, hiện
nay whisky đã được sản xuất tại nhiều quốc gia khác như: Anh, Pháp, Hoa Kỳ, CHLB
Đức, Italia, Tây Ban Nha, Nhật Bản, Trung Quốc,...[75], [108].
Đối với dòng rượu mạnh, theo MarketLine [143]: Giá trị thị trường này sẽ vượt
mức 306 tỷ USD vào năm 2015, tốc độ tăng trưởng trong năm năm gần nhất đạt 17%,
sản lượng tiêu thụ tăng từ 19 tỷ lít (2010) lên 22 tỷ lít (2015), tăng 10%. Dẫn đầu thị
trường là whisky (27% thị phần),… Châu Âu, Ấn Độ, Mỹ vẫn là thị trường tiêu thụ
chính số một của mặt hàng này, chiếm 48% thị trường thế giới [76]. Quy mô thị
trường rượu mạnh toàn cầu được định giá 336 tỷ USD vào năm 2016 và dự kiến sẽ
chứng kiến mức tăng trưởng hàng năm (CAGR) là 33,4% từ năm 2017 đến năm

2025 tại thị trường Mỹ (Theo phân tích thị trường Grand View Research - 2017).
Nhu cầu sử dụng rượu cao độ nói chung và whisky nói riêng ở Việt Nam khoảng
từ 500 - 520 triệu lít/năm. Rượu cao độ (chủ yếu là các loại rượu Whisky, Cognac
và Vodka,…) hàng năm được nhập khẩu và tiêu thụ tại Việt Nam chiếm khoảng
20% tổng sản lượng rượu trên thị trường (trong đó dòng rượu whisky chiếm thị
phần lớn nhất trên 30%) [5], [25]. Việt Nam lại chưa sản xuất được loại rượu này nên
vẫn phải nhập khẩu với số lượng rất lớn bằng ngoại tệ, ảnh hưởng không nhỏ đến sự phát
triển bền vững về kinh tế của Việt Nam.
Là quốc gia đã có nghề sản xuất rượu thủ công từ lâu đời, trong những năm giữa
của thế kỷ 20, nhiều thương hiệu rượu làng nghề của Việt Nam như Làng Vân, Kiên
Lao, Bầu Đá, Mẫu Sơn,… và nhiều sản phẩm rượu được sản xuất từ ngũ cốc đã xuất
khẩu sang các thị trường châu Âu, châu Á và được đánh giá rất cao. Việt Nam cũng là
quốc gia hàng đầu thế giới về đa dạng sinh học, trong đó có nguồn gen vi sinh vật có


chất lượng rất tốt và vô cùng phong phú nhất là các vi sinh vật để sản xuất các loại rượu
có chất lượng cao và an toàn, đây là những tiềm năng rất quý để Việt nam có thể tự sản
xuất được nhiều loại rượu mạnh, trong đó có rượu Whisky phục vụ và đáp ứng nhu cầu
thị trường trong nước, từng bước giảm nhập khẩu và góp phần ổn định kinh tế.
Cho đến nay, ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu bước đầu về sản xuất rượu
whisky nhưng chủ yếu ở quy mô thí nghiệm, những công trình nghiên cứu mang
tính học thuật khoa học, có khả năng ứng dụng sản xuất ở quy mô lớn còn rất hạn
chế và chưa đầy đủ.
Xuất phát từ nhu cầu thị trường, từ tiềm năng về nguyên liệu, để hoàn thiện
quy trình công nghệ và chủ động sản xuất rượu whisky tại Việt Nam, chúng tôi chọn
đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men để ứng dụng trong sản xuất
whisky từ malt đại mạch và ngô” với mong muốn được đóng góp một phần về kiến
thức khoa học, công nghệ, từng bước hoàn thiện và nâng cao quy mô sản xuất rượu
whisky tại Việt Nam, tạo được sản phẩm có chất lượng tốt, an toàn, có giá trị kinh tế
cao, từng bước hạn chế nhập khẩu, góp phần ổn định kinh tế quốc gia.

2. Mục tiêu nghiên cứu
Tuyển chọn được 1 – 2 chủng nấm men có chất lượng tốt, đáp ứng các yêu
cầu công nghệ và chất lượng sản phẩm
Xác định được một số đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa, di truyền và định
tên khoa học chủng nấm men đã tuyển chọn.
Ứng dụng chủng nấm men đã tuyển chọn để nghiên cứu sản xuất rượu
whisky từ malt đại mạch và ngô
Xây dựng được quy trình công nghệ và sản xuất được rượu whisky từ ngô và
malt đại mạch sản phẩm đạt tiêu chuẩn chất lượng và an toàn thực phẩm theo quy định.
3. Nội dung nghiên cứu chính
3.1. Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men đáp ứng yêu cầu công nghệ sản
xuất và chất lượng sản phẩm rượu whisky;
3.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học cơ bản (đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh
trưởng) và định danh tên khoa học của chủng nấm men đã tuyển chọn
3.3. Nghiên cứu động học quá trình lên men rượu
3.4. Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất rượu whisky từ ngô
và malt đại mạch


3.5. Ứng dụng quy trình công nghệ sản xuất thử nghiệm sản phẩm tại cơ sở
sản xuất rượu
4. Kết quả đã đạt được
4.1. Tuyển chọn được 01 chủng nấm men đáp ứng yêu cầu công nghệ và chất
lượng sản phẩm rượu whisky
4.2. Xác định được đặc điểm sinh học, di truyền và định tên khoa học đến
loài cho chủng nấm men đã tuyển chọn là Saccharomyces cerevisiae MS42
4.3. Xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất rượu whisky từ ngô và malt
đại mạch.
4.4. Sản xuất được 10.000 lít rượu whisky từ ngô và malt đại mạch tại Công ty cổ
phần TNHH MTV Bia- Rượu Eresson Việt Nam tại Công ty cổ phần TNHH MTV BiaRượu Eresson Việt Nam (gồm 3 sản phẩm: Whisky 100% malt; Whisky 100% ngô;

Whisky 20% matl và 80% ngô), các sản phẩm đều đạt quy chuẩn kỹ thuật quốc gia và
An toàn thực phẩm đối với sản phẩm đồ uống có cồn theo quy định.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
- Về mặt khoa học
Đề tài đã tuyển chọn được chủng nấm men tại Việt Nam và gỗ sồi S8 phù
hợp để sản xuất whisky từ ngô và malt đại mạch. Chủng nấm men có khả năng sinh
trưởng mạnh trên môi trường malt, ngô, hiệu suất lên men đạt từ 89,51 – 91,40%, ở
25oC, pH 5,0 – 5,5, có khả năng lên men rượu đạt 12,3 %Vol, sản phẩm có hương,
vị đặc trưng của rượu whisky.
Cung cấp cơ sở khoa học về quy trình công nghệ sản xuất whisky từ ngô và
malt đại mạch (đặc biệt là quá trình hình thành và biến đổi một số chất tạo hương
đặc trưng của rượu whisky trong quá trình tàng trữ) phù hợp với điều kiện thực tiễn
tại Việt Nam.
- Về mặt thực tiễn
Đề tài ứng dụng vào thực tiễn sản xuất tại doanh nghiệp và đã tạo ra sản
phẩm có chất lượng tốt, đạt Tiêu chuẩn chất lượng và an toàn thực phẩm theo quy
định, được khách hàng Trung Quốc và Singapore đánh giá cao.
Việc sản xuất whisky tại Việt Nam sẽ góp phần khai thác có hiệu quả nguồn
nguyên liệu (ngô, chủng nấm men,…) hiện có tại Việt Nam để chủ động sản xuất


được loại sản phẩm cao cấp Việt Nam từng bước hạn chế nhập khẩu bằng ngoại tệ
tiến tới xuất khẩu sản phẩm đặc trưng của Việt Nam.
6. Những đóng góp mới của luận án
6.1. Tuyển chọn và định danh khoa học được 01 chủng nấm men phân lập từ
nguồn bánh men rượu truyền thống xã Mẫu Sơn, huyện Bình Lộc, tỉnh Lạng Sơn
(Saccharomyces cerevisiae MS42) đạt được các tiêu chí để sản xuất rượu whisky từ
ngô và malt đại mạch như: Có khả năng lên men dịch đường hóa từ malt đại mạch
và ngô tạo độ rượu đạt 12,3%Vol ở 25 oC, tạo được hương, vị tốt, đặc trưng cho sản
phẩm. Chủng M42 có khả năng sinh trưởng tốt trên môi trường malt (M), ngô (N)

sau 36 – 48 giờ nuôi cấy đạt số lượng tế bào tối đa từ 213 x 10 6 – 215 x 106 tế
bào/ml. Lên men rượu tối ưu từ dịch lên men có hàm lượng đường:160 – 180g/l;
pHopt: 5,0 – 5,5; Topt = 20 – 30oC đạt độ cồn: 9,00 – 9,91%Vol. Hiệu suất lên men từ
89,52 – 91,13%, tạo ít độc tố methanol, acetaldehyde, fufurol.
6.2. Xác định được loại nguyên liệu phù hợp để sản xuất rượu whisky gồm:
Malt, ngô hiện có tại Việt Nam và gỗ sồi (kí hiệu S8) nhập khẩu từ Mỹ. Xây dựng
được quy trình công nghệ sản xuất whisky từ ngô và malt đại mạch phù hợp với
điều kiện thực tiễn tại Việt Nam.
6.3. Bước đầu nghiên cứu sự hình thành và biến đổi của một số chất tạo
hương rượu whisky trong quá trình tàng trữ rượu với gỗ sồi.
6.4. Cung cấp cơ sở khoa học về chủng nấm men và quy trình công nghệ
sản xuất rượu whisky từ malt đại mạch, ngô và áp dụng sản xuất quy mô thực
nghiệm tại Việt Nam đã tạo được 3 loại sản phẩm whisky: 100% malt ; 100% ngô
và 20% malt + 80% ngô. Sản phẩm đạt tiêu chuẩn chất lượng và an toàn thực
phẩm theo quy định.
7. Cấu trúc luận án
Luận án được cấu trúc làm 6 phần: mở đầu, nội dung, kết luận, danh mục các
công trình khoa học đã công bố, tài liệu tham khảo và phụ lục. Phần nội dung của
luận án được triển khai thành ba chương như sau:
Chương 1: Tổng quan vấn đề nghiên cứu (38 trang)
Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (20 trang)
Chương 3: Kết quả và thảo luận (80 trang)


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Nấm men
1.1.1. Đại cương về nấm men
Nấm men là nhóm nấm đơn bào hoặc tập hợp đơn bào, có kích thước, đường
kính tế bào từ 3 – 10 μm. Tuỳ loài nấm men tế bào có hình cầu, hình trứng, hình
ovan, hình chanh, hình elíp, hình mũ phớt, hình sao thổ, hình cái liềm, hình thoi, hình

cung nhọn, hình tam giác, hình chai, hình thấu kính, hình quả lê, hình bán cầu có rìa
hẹp,....[26], [44].
Thành tế bào nấm men Saccharomyces có cấu tạo chủ yếu từ mannan và
glucan, ở một số chi có thêm kitin. Màng tế bào chất gồm 2 lớp phân tử phospholipid
với mối liên kết este đặc trưng cho màng các vi sinh vật nhân thực. Trong tế bào chất
có các bào quan như: nhân, ti thể, riboxôm, không bào, thể Golgi,… Nhân tế bào của
Saccharomyces cerevisiae có 16 nhiễm sắc thể (đơn bội – 1n) hoặc 16 cặp nhiễm
sắc thể (lưỡng bội – 2n). Ngoài nhân còn có nhiều yếu tố di truyền khác như
plasmid, yếu tố di truyền vận động (Transposon).
Khối lượng riêng của tế bào nấm men là 1,055 - 1,060 KDa, không khác biệt
nhiều so với tế bào vi khuẩn (1,050 - 1,112 KDa). Nấm men đóng vai trò quan trọng
đối với đời sống con người, chúng được sử dụng rộng rãi trong các ngành công
nghiệp, điển hình là công nghiệp sản xuất rượu, cồn, rượu vang, bia, thực phẩm và
các hoạt chất sinh học,...[8], [132].
Việc phân loại đối với nấm men nói chung rất phức tạp và thường dựa trên
các chỉ tiêu chủ yếu sau:
- Đặc điểm tế bào sinh dưỡng (hình dạng, cấu tạo, kích thước..)
- Đặc điểm sinh sản hữu tính và đặc điểm sinh lý, nuôi cấy (khả năng đồng
hoá carbon, đồng hoá nitrat, phản ứng DBB (phản ứng với Diazonium Blue B).
Cho đến nay đã có nhiều khoá phân loại nấm men của các tác giả: Lodder.J.
1970), Kudriavtsev (1954), Tâm Tâm Phương (1954), Barnett.J.A, Payne.R.W và
Yarrow.D. (1983), Kreger-Van Rij. N.J.W. (1984)...
Một số kỹ thuật điển hình hiện nay trong phân loại học phân tử: Phân tích
trình tự DNA, Kỹ thuật PCR, Lai phân tử, Điện di izozym.
Cách phân loại nấm men dựa vào các tiêu chí [8], [47], [76]:


1- Các đặc điểm hình thái tế bào và khuẩn lạc
2- Các đặc điểm sinh sản vô tính (nảy chồi, phân đôi), hữu tính (hình thành
túi, nang bào tử hữu tính).

3- Các đặc điểm sinh hóa (thành tế bào, coenzyme Q10,...), đặc điểm sinh lí
(nguồn dinh dưỡng C, N,..., pH, To tối ưu,...)
4- Các đặc điểm sinh học phân tử (trình tự D1, D2 của gen 28S; ITS1, ITS2
ở 2 bên của gen 5,8S và trình tự RNA – ribôxôm 18S,...)
Hiện nay, nấm men đã xác định được: 1110 loài/ 58 chi/ 17 họ / Bộ Saccharomycetales/
Lớp Saccharomycetes/ Ngành Ascomycota [139].
1.1.2. Đặc điểm sinh học cơ bản của nấm men
1.1.2.1. Sinh sản của nấm men
Nấm men duy trì nòi giống bằng hai hình thức sinh sản vô tính và sinh sản hữu
tính. Tuy nhiên, có sự luân phiên sinh sản vô tính và hữu tính với các giai đoạn đơn bội,
lưỡng bội khác nhau trong vòng đời của nấm men hoặc tùy theo môi trường.
- Sinh sản vô tính: Nấm men sinh sản vô tính chủ yếu bằng hình thức nảy
chồi. Đây là hình thức sinh sản vô tính phổ biến nhất ở nấm men thể hiện qua sự
xuất hiện của chồi từ vị trí sẹo chồi [76].
Ngoài ra ở nấm men còn có hình thức sinh sản vô tính bằng bào tử như: bào
tử đốt (ở chi Geotrichum), bào tử bắn (ở chi Sporobolomyces), bào tử áo (ở nấm
Candida albicans) [56], [100].
Sinh sản vô tính có ưu điểm: tốc độ sinh sản nhanh, chiếm lĩnh môi trường, ít
đột biến, ổn định di truyền.
- Sinh sản hữu tính: Sinh sản hữu tính ở nấm men xuất hiện ở các chi
Saccharomyces, Zygosaccharomyces và nhiều chi nấm men khác thuộc bộ
Endomycetales. Quá trình sinh sản liên quan tới sự tạo thành bào tử túi từ tế bào sinh
dưỡng kèm theo quá trình giảm phân gồm giảm phân 1 và giảm phân 2, trong đó chỉ có 1
lần nhân đôi nhiễm sắc thể ở giảm phân 1, vì vậy từ tế bào lưỡng bội (2n) tạo thành 4 bào
tử đơn bội (n). Khi gặp điều kiện thuận lợi cho sinh sản vô tính ở môi trường mới, các bào
tử nảy mầm thành tế bào mới và nảy chồi tiếp theo trở về sinh sản vô tính [8], [44].
Các nấm men lớp Ascomycetes có dạng sinh sản hữu tính hình thành túi bảo
tử chứa các bào tử túi (Ascospores) do kết quả của quá trình giảm phân. Ví dụ túi
bào tử và bào tử túi của 3 loài nấm men phổ biến như sau [100]:

S. cerevisiae

Pichia farinosa
Schizosaccharomyces octosporus
Hình 1.1: Bào tử và túi bảo tử của nấm men [84]
Sinh sản hữu tính: thường xảy ra khi ở điều kiện môi trường khắc nghiệt. Thế

hệ con có đặc điểm khác biệt về vật chất di truyền, tạo nguồn nguyên liệu cho chọn
lọc tự nhiên, có ý nghĩa sinh tồn, tiến hóa.
- Chu kì sống của nấm men
Sau quá trình giảm phân, các bào tử túi sẽ được sinh ra (thường là 4 bào tử
túi). Khi không có sinh sản hữu tính chúng vẫn liên tục nẩy chồi để sinh sản. Chu kì
này thấy ở nấm men rượu S. cerevisiae [56], [8].

Hình 1.2: Chu kì sinh sản của nấm men S. cerevisiae [56]
Yếu tố quyết định và quan trọng nhất là các đặc tính di truyền của tế bào qua
sinh sản vô tính nảy chồi truyền lại cho thế hệ sau. Đặc tính này được thể hiện rõ ở
nấm men S. cerevisiae.

Hình 1.3: Các pha nguyên phân của nấm men S. cerevisiae [56]
Chu kỳ sinh sản vô tính của tế bào được chia làm 4 pha: G1, S (giai đoạn tổng


hợp DNA), G2 và M (các kì nguyên phân), trong đó pha G2 ngắn hơn do có sẹo chồi.
1.1.2.2. Đặc điểm sinh lí – sinh hóa nấm men
a/ Đồng hóa các hợp chất carbon
Chuyển hóa carbon là nền tảng cho sản xuất các thành phần tế bào và cung
cấp chuyển hóa năng lượng. Để thử nghiệm khả năng đồng hóa các hợp chất
carbon của chủng nấm men S. cerevisiae, 20 loại hợp chất có thể sử dụng trong

giai đoạn đầu [8], [44], [81]:
- Các hexose: glucose, galactose, sorbose, methuyl-D-glucoside salicine,
arbutine
- Các pentose: D - xylose, L - arabinose, D và L – ribose, L – rhamnose.
- Các disaccharide: saccharose, lactose, maltose, melibiose, trehalose, cellobiose.
- Trisaccharide: rafinose, melezitose
- Polysaccharide: tinh bột, inuline
Sau đó, nhóm các hợp chất tiếp theo gồm [81]:
- Rượu: methanol, ethanol, glyxerol, ribitol, galactiol, erythritol, mannitol, sorbitol,
inositol.
- Các axit hữu cơ: lactic, succinic, citric, pyruvic, malic, glucuronic, 2xetogluconic
Phương pháp để thử các loại đường tương đối đơn giản đó là cho nguồn
đường là hợp chất cần nghiên cứu vào môi trường thạch Difco 2% và có nitơ nấm
men. Phương pháp này có thuận lợi là nhanh chóng có kết quả. Khi nấm men có sinh
trưởng thì xác định được chủng nấm men nghiên cứu có thể sử dụng được nguồn
đường bổ sung. Thử nghiệm sự thủy phân arbutine được thực hiện trên môi trường
có arbutine (5%), thạch 2 % trong ống nghiệm đặt nghiêng. Nếu arbutine được thủy
phân thì màu nâu sẽ xuất hiện trong môi trường sau 2 – 7 ngày ở 25oC [6], [84].
Hiện nay, phương pháp phổ biến được sử dụng để xác định khả năng đồng
hóa các hợp chất carbon là dùng bộ kit thử. Nguyên tắc chung là dựa trên sự phát hiện các
enzyme, nhóm enzyme tham gia chuyển hóa các hợp chất carbon có trong vi sinh vật. Ví dụ:
sử dụng kit ID 32C, có khả năng phát hiện 32 loại hợp chất carbon có thể được dùng cho
chuyển hóa vật chất và năng lượng trong tế bào.
b/ Đồng hóa các hợp chất nitơ
Nguồn nitơ rất cần thiết cho sự sống và quá trình trao đổi chất của chúng được


điều hòa chính xác. Hiện nay, nghiên cứu khả năng đồng hóa các hợp chất nitơ chủ yếu
sử dụng 2 nguồn là: nitrat kali và chlorhydrat ethylamin, thí nghiệm thực hiện theo
phương pháp auxanographic (khuyết dưỡng tự ghi) trong môi trường cơ bản nước chiết

nấm men (Difco) hay trên môi trường tổng hợp không có nitơ [44] [56].
Ở S. cerevisiae vật liệu nitơ cho sinh tổng hợp axit amin chủ yếu được chuyển
đổi từ glutamate và glutamine. Nitơ amin từ glutamate và nhóm amin từ glutamine
chiếm lần lượt 85% và 15% trong tổng số nitơ của tế bào [86]. Trong khi đó, glutamate
và glutamine hoạt động với α-ketoglutarate để kết nối chu trình TCA và chuyển hóa
nitơ thông qua glutamate dehydrogenase, phụ thuộc NADPH (GDH1), glutamine
synthetase (GLN1), glutamate synthase phụ thuộc NADH (GLT1) và glutamate
dehydrogenase liên kết với NAD (GDH2) [138]. Chuyển hóa nitơ đã được chứng minh
là rất quan trọng trong quá trình dị hóa và đồng hóa protein, axit amin và các hợp chất
nitơ khác. Do đó, nitơ đóng một vai trò chi phối nói chung sự trao đổi chất. Điều hòa
chuyển hóa nitơ bao gồm một tập hợp các quá trình liên kết với nhau, chẳng hạn như
hệ thống cảm biến báo hiệu Ssy1-Ptr3-Ssy5 (hệ thống cảm biến SPS) [58].
1.1.3. Nhu cầu dinh dưỡng cơ bản của nấm men
Nấm men có khả năng sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí và kị khí. Các
quá trình trao đổi chất là khác nhau, do vậy nhu cầu dinh dưỡng cũng khác nhau.
Trong môi trường nuôi cấy cung cấp đầy đủ các nhân tố cần thiết để tế bào nấm men
sinh trưởng. Tỉ lệ các nguyên tố trong sinh khối tế bào nấm men Saccharomyces
cerevisiae là C: 1,72; O: 0,44; N: 0,15 khi nuôi nấm men này trong điều kiện hiếu khí
và trên môi trường chứa glucose và khoảng 10% chất tro [100]. Môi trường cần cung
cấp đầy đủ và đúng tỉ lệ các nguyên tố trên cho nấm men sinh trưởng. Các hợp chất
carbon (đường, rượu, axit hữu cơ,...) cung cấp nguồn năng lượng cho nấm men, đồng
thời cung cấp hydro cần thiết để tổng hợp sinh khối tế bào.
- Nhu cầu nitơ:
Nitơ đứng thứ 2 về số lượng cho cấu trúc tế bào cần phải bổ sung vào môi
trường nuôi cấy. Nitơ cần dùng cho tế bào tổng hợp các axit amin, các nucleotid và một
số vitamin. Rất nhiều nguồn nitơ có thể được sử dụng. Tất cả các nấm men có khả
năng sử dụng nitơ dưới dạng anion. Các anion có thể đưa vào môi trường dưới dạng
clorua amon, nitrat amon, phosphat amon và sulfat amon. Trong đó, sulfat amon có ưu
điểm hơn vì nó đồng thời cung cấp lưu huỳnh cần thiết để tổng hợp một vài loại axit
amin có lưu huỳnh [6], [44]. Vài loại nấm men có khả năng sử dụng nitrit và nitrat như:

Hansenula, Pachysolen, Citeromyces và Candida và Trichosporon. Khả năng này còn
được sử dụng trong khóa phân loại học nấm men [84].
Trong môi trường nuôi cấy, các nitrit tạo ra pH dưới 6, axit nitrit là chất độc
đối với tế bào. Phần lớn các axit amin có thể được nấm men sử dụng như là nguồn
nitơ. Tuy nhiên, tùy theo loại axit amin trong môi trường tốc độ sinh trưởng của
nấm men là khác nhau. Dưới đây liệt kê các axit amin theo tốc độ sinh trưởng từ
cao xuống thấp theo thứ tự (Bảng 1.1):
Bảng 1.1: Một số axit amin ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng Saccharomyces
cerevisiae (xếp theo thứ tự từ cao xuống thấp) [40]
STT

Tên chất

STT

Tên chất

STT

Tên chất

1

Glutamine

9

Phenylalanine

17

Iso leucine

2

Ammonium

10

Ornithine

18

Threonine

3

Asparagine

11

Citrulline

19

Tryptophane

4

Axit glutamic

12

Allantoine

20

Axit allantoic

5

Serine

13

Vanilin

21

Methionine

6

Arginine

14

Leucine

22

Histidine

7

Urea

15

Proline

23

Glycine

8

Alanine

16

Tyrosine

Các axit amin kiềm cung cấp khung carbon sau khi chuyển amin. Khung
carbon được sử dụng trong hình thành sinh khối. Trong khi đó, khung carbon của axit
amin có tính kị nước như valine sẽ được tiết ra ngoài sau khi chuyển amin. Hỗn hợp
các axit amin tạo thành môi trường sinh trưởng tốt hơn đối với nấm men khi môi
trường chỉ có một loại axit amin. Vì thế thủy phân caseine hay nước chiết trái cây lên

men tạo ra nguồn nitơ rất tốt. Các dipeptid và tripeptid cũng được nấm men sử dụng.
Việc sử dụng polypepetid bị giới hạn ở ngoài môi trường tế bào chất, do kích thước
phân tử lớn. Chúng được thủy phân nhờ các peptidase nội bào, cuối cùng urea tổ hợp
với biotine và các bazơ purine và pyrimidine có thể được sử dụng. Việc sử dụng các
axit amin có tốc độ khác nhau, các nấm men sẽ sử dụng nguồn axit amin ưa thích,
theo 3 tiêu chí [40], [44]:
+ Xâm nhập vào tế bào nhanh;
+ Biến đổi nhanh trong tế bào với số giai đoạn tối thiểu để hình thành amoniac
hoặc axit glutamic hoặc cả hai;
+ Không tạo hiệu ứng độc thứ cấp.


Đối với Saccharomyces cerevisiae trong điều kiện không bị giới hạn năng lượng,
theoYaya Liu và cộng sự, khi môi trường thiếu hụt trầm trọng N và P, để tránh bị chết đói
một số tế bào phân giải, giải phóng hợp chất chứa N và P bù lại nhu cầu tối thiểu giúp
duy trì với tốc độ tăng trưởng gần như bằng không. Từ các phép đo này, tỷ lệ giải phóng
N, P cụ thể là 8,1 μmol N / [g sinh khối] / h và 5,2 μmol P / [g sinh khối] / h đã được tính
toán [136].
- Nhu cầu photpho (P):
Phospho có mặt trong các axit nucleic và các nucleosides, diphosphats,
triphosphats. Người ta tìm thấy phospho dưới dạng polyme mạch thẳng polyphosphate
đóng vai trò quan trọng trong điều hòa chuyển hóa vật chất nội bào. Nồng độ ion
phosphate (PO4)3- điều hòa sự tổng hợp các lipid và các gluxit.
Phospho được tế bào đồng hóa dưới dạng ion (H2PO4)-. Các nguồn phospho
trong môi trường nuôi cấy được cung cấp dưới dạng KH 2PO4 hay Na2HPO4. Nếu môi
trường có ít phospho, tế bào tổng hợp phosphomonoesterase khu trú ở thành tế bào sẽ
giải phóng phospho từ các este phosphoric [40], [76].
- Các nhân tố vi lượng:
Nầm men cần sử dụng các nguyên tố kim loại ở mức vi lượng để sinh
trưởng: K, Na, Mg, Zn, Fe,….Các ion khác có mặt trong thành phần tế bào của nấm

men nhưng với hàm lượng rất nhỏ. Một vài loại nguyên tố như Arsenic (thạch tím
Asen), Chì (Pb), Aluminium (Nhôm, Al), Chrome (Cr) và vannadium (vanadi, V) là
những nguyên tố ức chế [40], [100].
Một số nguyên tố khác như đồng (Cu), Nickel (Ni) hay Iod (I) có thể có bổ
sung với hàm lượng rất ít (dạng vết) vào môi trường nuôi cấy. Nói chung các
nguyên tố vết này có trong thành phần của tế bào lắng cặn của môi trường khi dư
thừa các ion thêm vào này. Thành phần cơ sở của sinh khối Saccharomyces cerevisiae
Bảng 1.2: Thành phần tro của sinh khối Saccharomyces cerevisiae [40]
Các nguyên tố

Số lượng (g/100g
chất khô tế bào

Các nguyên tố

Số lượng (g/100g
chất khô tế bào

Potassium (K)

2,2

Cobalt (Co)

0,5. 10-3

Phosphorus (P)

1,6

Nickel (Ni)

250. 10-3

Sulfur (S)

300. 10-3

Arsenic (As)

180. 10-6

Magnesium (Mg)

270. 10-3

Lead (Pb)

150. 10-6

Sodium (Na)

60. 10-3

Iode (I)

125. 10-6


Các nguyên tố

Số lượng (g/100g
chất khô tế bào
-3

Các nguyên tố

Số lượng (g/100g
chất khô tế bào

Calcium (Ca)

50. 10

Molybdenum (Mo)

7. 10-6

Barium (Ba)

15. 10-3

Bore (Bo)

5. 10-6

Zinc (Zn)

12. 10-3

Aluminium (Al)

1. 10-6

Iron (Fe)

10. 10-3

Chrome (Cr)

10. 10-26

Copper (Cu)

5. 10-3

Vanadium (V)

5. 10-26

Manganese (Mn)

3. 10-3

Dựa trên các giá trị này có thể tính số lượng các muối bổ sung vào môi trường
nuôi cấy. Trong khi tạo môi trường nuôi cấy hay trong môi trường hỗn hợp công
nghiệp, cần phải tính toán cả mối tương tác giữa các thành phần môi trường khác nhau.
Ví dụ: hiệu ứng tương tác giữa nồng độ (NH4)2SO4 và KH2PO4 đến tốc độ sinh trưởng.
Ngoài ra, với một vài nguyên tố xác định khi nồng độ quá nhiều có thể biến
thành yếu tố gây độc, ví dụ Đồng (Cu) với nồng độ 1,5 μmol.l -1 kích thích sự sinh

trưởng của Saccharomyces cerevisiae nhưng ở 10 μmol.l -1 thì lại làm ức chế. Tính
độc của Cu sẽ làm giảm bớt sự hấp thụ của Zn [76].
1.1.4. Lên men rượu etylic
Quá trình chuyển hóa glucose thành ethanol gồm hai giai đoạn chính:
Glucose

Pyruvat

Ethanol

Trong điều kiện kị khí axit pyruvic sinh ra do quá trình đường phân được
decarboxyl nhờ pyruvat decarboxylase thành axetaldehyde, sau đó chất này được khử
thành ethanol nhờ alcol dehydrogenase và tạo ra NAD+ tham gia vào quá trình đường
phân, nó oxy hóa 3-phosphoglyxeraldehyde thành axit 3-phosphoglyceric [47], [84].
Có 3 iso enzyme đối với alcol dehydrogenase. Những nghiên cứu trên các chủng
đột biến đối với các enzyme này cho phép phát hiện vai trò đặc biệt nhờ những bằng
chứng: Một đột biến khuyết gen alcol dehydrogenase I (enzyme cấu trúc) sẽ không thể
sinh trưởng trên môi trường glucose trừ khi có một đột biến thứ 2 có alcol
dehydrogenase II khi có mặt của glucose. Alcol dehydrogenase II và alcol
dehydrogenase ti thể (isoenzyme III) được ức chế bởi glucose và tham gia sử dụng
ethanol [56], [68].
Nếu như lên men rượu do Saccharomyces cerevisiae quá trình đường phân
diễn ra theo con đường EMP thì lên men rượu do vi khuẩn Zymomonas mobilis sự

chuyển
đường
hóaphân
rượu

đường phân glucose lại đi theo con đường Entner – Doudoroff.
Một sự khác biệt nữa là ở nấm men rượu biến pyruvat thành axetaldehyde rồi
hợp chất này nhận hydro từ NADH để biến thành ethanol, còn ở vi khuẩn thường
không có pyruvat decarboxylase mà thường có axetaldehyde dehydrogenase nên
pyruvat được biến thành acetyl –CoA nhờ pyruvat dehydrogenase (PDH), và axetylCoA nhờ enzyme axetal dehydrogenase để biến thành axetaldehyde, rồi nhận hydro
từ NADH để biến thành ethanol [8], [41], [96].
Bằng nguyên tử đánh dấu C14 cho biết nguồn gốc của nguyên tử carborn
trong phân tử rượu ở nấm men là 1; 2 và 5; 6 còn 3; 4 được thoát ra dưới dạng CO 2,
trong khi đó ở vi khuẩn là 2; 3 và 5; 6 còn nguyên tử carborn 1; 4 được thoát ra dưới
dạng CO2 [56].
Các vi khuẩn Zymomonas mobilis cũng như các vi khuẩn lactic, Enterobacteria,
Clostridium, không có pyruvat decarboxylase mà thường có axetal dehydrogenase
nên sự hình thành ethanol theo con đường sau:
Pyruvat

Axetyl CoA

Axetaldehyde

Ethanol

Nói chung, sự chuyển hóa từ 1 glucose qua lên men ethanol sẽ tạo ra:
2 Ethanol, 2 CO2, 2 ATP. Phương trình tổng quát:
C6H12O6 + 2ADP + 2H3PO4 → 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP + 3H2O
Trong qúa trình lên men ethanol có sự hình thành glyxerol để tạo ra NADH +
+

H và để khử phosphodihydrogenase, sau đó phosphoglycerol được thủy phân thành
glyxerol nhờ một enzyme đặc trưng là phosphatase.
Một đặc điểm rất quan trọng của glyxerol được phát hiện khi có mặt của

bisulfit là glyxerol tổ hợp với acetaldehyde và ức chế glycerol bị khử thành ethanol.
Cùng với glyxerol một hợp chất khác là axit succinic được sinh ra trong quá trình lên men
ethanol. Axit succinic có lẽ sẽ tham gia vào oxy hóa axit α-xetoglutaric trong chu trình Krebs.
- Hiệu ứng Pasteur:
Đa số các loài nấm men có thể chuyển hóa gluxit trong điều kiện hiếu khí và kị khí.
Hiện tượng ức chế quá trình lên men do quá trình hô hấp được gọi là hiệu ứng Pasteur.
Hiện tượng ức chế này là do sự canh tranh giữa pyruvat decarboxylase (lên men)
có ái lực yếu hơn đối với pyruvat (Km = 3 – 4mM) và pyruvatedehydrogenase (hô hấp)
lại có ái lực mạnh (Km = 0,1 – 0,2 mM) đối với pyruvat. Do đó, chỉ khi số lượng pyruvat
vượt trội quá khả năng của pyruvatedehydrogenase mà tế bào tích lũy thì pyruvat
decarboxylase hoạt động để tiến hành lên men. Sự điều hòa một số giai đoạn của quá