Thiết kế bộ chỉ thị STR phục vụ chẩn đoán hemophilia a trước chuyển phôi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Nguyễn Kim Ngân

THIẾT KẾ BỘ CHỈ THỊ STR PHỤC VỤ CHẨN ĐOÁN HEMOPHILIA A
TRƯỚC CHUYỂN PHÔI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Nguyễn Kim Ngân

THIẾT KẾ BỘ CHỈ THỊ STR PHỤC VỤ CHẨN ĐOÁN HEMOPHILIA A
TRƯỚC CHUYỂN PHÔI

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 8420101.21.
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.BS. Đặng Tiến Trường
TS. Trần Đức Long

Hà Nội – 10/2019

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập, nghiên cứu và thực nghiệm để hoàn thành luận văn,
tôi đã may mắn nhận được sự hỗ trợ cả về vật chất và tinh thần từ các thầy cô, cộng
sự và bạn bè. Tôi luôn trân trọng những sự giúp đỡ quý báu đó.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS.BS. Đặng Tiến Trường – Phó
Chủ nhiệm Bộ môn Giải Phẫu, Học viện Quân Y, người đã trực tiếp hướng dẫn,
truyền đạt cho tôi những kiến thức, kĩ năng chuyên ngành và tạo mọi điều kiện tốt
nhất để tôi được học tập và nghiên cứu cho đến ngày hoàn thành luận văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Trần Đức Long – Khoa Sinh học,
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, người đã luôn hỗ trợ, động viên, chỉ
bảo tôi khắc phục những thiếu sót và truyền cho tôi những kinh nghiệm quý báu trong
suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy, cô Khoa Sinh học,
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN và đặc biệt là các thầy cô Bộ môn
Di truyền học - những người đã giảng dạy cho tôi trong quá trình học tập; các cán
bộ của Bộ môn Giải phẫu, Học viện Quân Y, đặc biệt là ThS.BS. Nguyễn Minh
Tâm, các cán bộ tại Trung tâm Hemophilia, Viện Huyết học – Truyền máu TW và
Bệnh viện Nam Học và Hiếm muộn Hà Nội đã tận tình hỗ trợ tôi trong suốt quá trình
thu mẫu.
Cuối cùng tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc tới những người bạn, người anh chị em
tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN – chỗ dựa tinh thần vững chắc đã
luôn ở bên cạnh động viên, chia sẻ, giúp đỡ, cổ vũ và giúp tôi vượt qua mọi giai đoạn
khó khăn trong cuộc sống nói chung và trong quá trình hoàn thiện luận văn nói riêng.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn và ghi nhớ.
Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2019
Học viên

Nguyễn Kim Ngân


Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3
1.1. Bệnh hemophilia A ...................................................................................................... 3
1.1.1. Tổng quan hemophilia A ................................................................................... 3
1.1.2. Cơ sở phân tử của bệnh ..................................................................................... 5
1.1.3. Chẩn đoán trước sinh bệnh hemophilia A....................................................... 11
1.2. Chẩn đoán trước chuyển phôi Hemophilia A ......................................................... 15
1.2.1. Kỹ thuật chẩn đoán trước chuyển phôi ........................................................... 15
1.2.2. Chẩn đoán trước chuyển phôi Hemophilia A ................................................. 16
1.3. Phân tích di truyền liên kết ....................................................................................... 19
1.3.1. Ứng dụng của phân tích di truyền liên kết ...................................................... 19
1.3.2. Chỉ thị phân tử STR ........................................................................................ 21
1.3.3. Các chỉ số đa hình di truyền ............................................................................ 22
1.4. Kỹ thuật PCR đa mồi ............................................................................................... 22
1.5. Kỹ thuật điện di mao quản ........................................................................................ 24
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 26
2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................................ 26
2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................... 26
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu ......................................................................................... 26
2.2.2. Công thức tính cỡ mẫu trong nghiên cứu đa hình gen .................................... 27
2.2.3. Sơ đồ nghiên cứu............................................................................................. 28
2.3. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu................................................................................ 29
2.4. Các kỹ thuật được sử dụng ....................................................................................... 29
2.4.1. Giai đoạn tối ưu và xác định tính đa hình ....................................................... 29

2.4.2. Giai đoạn áp dụng và phân tích di truyền trước chuyển phôi ......................... 38
2.4.3. Giai đoạn xác nhận kết quả bằng chẩn đoán trước sinh .................................. 39
2.5. Các chỉ tiêu nghiên cứu ............................................................................................. 40


Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

2.6. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................................ 40
2.7. Vấn đề y đức và đạo đức trong nghiên cứu ............................................................ 40
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 41
3.1. Bộ STR đa hình liên kết với gen F8 phục vụ PGT-M hemophilia A tại Việt
Nam ..................................................................................................................................... 41
3.1.1. Các STR nằm cách gen F8 1Mb ..................................................................... 41
3.1.2. Kết quả tối ưu hóa quy trình PCR đa mồi khuếch đại các STR ...................... 42
3.1.3. Chỉ số đa hình và chỉ số dị hợp tử của các STR ............................................. 48
3.1.4. Chuẩn hóa quy trình PGT-M trên mẫu tế bào phôi ............................................ 52
3.2. Áp dụng bộ chỉ thị STR thiết kế cho gia đình bệnh nhân hemophilia A ........... 56
3.2.1. Áp dụng quy trình PGT-M trên gia đình bệnh nhân ....................................... 56
3.2.2. Kết quả mang thai và chẩn đoán trước sinh cho gia đình bệnh nhân.............. 63
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 68
Kết luận ............................................................................................................................... 68
Kiến nghị ............................................................................................................................ 68
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 69


Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng 1. Phân loại thể bệnh Hemophilia theo biểu hiện lâm sàng ..............................4
Bảng 2. Các phương pháp phát hiện đột biến gây bệnh hemophilia ........................10

Bảng 3. Một số STR được sử dụng trong chẩn đoán Hemophilia A .......................18
Bảng 4. Thành phần D2 ............................................................................................32
Bảng 5. Thành phần Mastermix ................................................................................33
Bảng 6. Thành phần phản ứng PCR đơn mồi ...........................................................34
Bảng 7. Chu trình nhiệt tiến hành phản ứng PCR đơn mồi ......................................34
Bảng 8. Thành phần phản ứng PCR đa mồi gắn màu huỳnh quang .........................35
Bảng 9. Chu trình nhiệt phản ứng PCR đa mồi gắn màu huỳnh quang ....................35
Bảng 10. Thông tin mồi huỳnh quang.......................................................................36
Bảng 11. Thành phần phản ứng biến tính DNA cho điện di mao quản ....................36
Bảng 12. Chu trình nhiệt biến tính DNA ..................................................................36
Bảng 13. Thông tin các STR được sử dụng trong nghiên cứu ..................................42
Bảng 14. Trình tự mồi khuếch đại các chỉ thị STR ..................................................43
Bảng 15. Kết quả nồng độ và độ tinh sạch DNA tách từ mẫu máu ..........................44
Bảng 16. Nồng độ mồi trong phản ứng PCR đa mồi ................................................47
Bảng 17. Kết quả tính toán chỉ số Ho, He, PIC ..........................................................49
Bảng 18. Kết quả nồng độ sản phẩm WGA 05 mẫu phôi bào phục vụ tối ưu hóa ...52
Bảng 19. Kết quả phân tích đột biến gen F8 ở phôi IVF ..........................................63


Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. Bệnh nhân hemophilia bị chảy máu trong cơ và biến dạng khớp ..................3
Hình 2. Vị trí của gen tổng hợp FVIII ........................................................................5
Hình 3. Bản đồ vị trí đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A ở Việt Nam ...............6
Hình 4. Cơ chế đột biến đảo đoạn intron 22 ..............................................................7
Hình 5. Cơ chế đột biến đảo đoạn intron 1 .................................................................8
Hình 6. Cơ chế di truyền bệnh Hemophilia A ..........................................................11
Hình 7. Vị trí 4 mồi A, B, P, Q trong Long-range PCR phát hiện đảo đoạn int22 trong
gen F8 ........................................................................................................................12

Hình 8. Kết quả LD-PCR phát hiện đảo đoạn int22 gen F8 .....................................13
Hình 9. Vị trí cắt giới hạn của enzyme BclI ..............................................................14
Hình 10. Sơ đồ nguyên lý 3 kỹ thuật khuếch đại toàn hệ gen ..................................16
Hình 11. Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của hệ điện di mao quản ...................................24
Hình 12. Sơ đồ nghiên cứu........................................................................................28
Hình 13. Phần mềm Tandem Repeat Finder và các chỉ số thiết đặt để sàng lọc ......30
Hình 14. Giao diện phân tích kết quả phần mềm Genemapper 4.0. .........................37
Hình 15. Sơ đồ vị trí các STR sử dụng trong nghiên cứu trên NST X .....................41
Hình 16. Kết quả tối ưu hóa các mồi X1 đến X5 ở dải nhiệt độ 55, 60, 65 ..............44
Hình 17. Kết quả tối ưu hóa các mồi X6 đến X10 ở dải nhiệt độ 55, 60, 65oC ........44
Hình 18. Kết quả tối ưu hóa các mồi X11 đến X15 ở dải nhiệt độ 55, 60, 65oC ......45
Hình 19. Kết quả điện di mao quản phản ứng PCR đa mồi cho 14 cặp mồi có .......46
Hình 20. Kết quả điện di mao quản phản ứng PCR đa mồi cho 14 cặp mồi có nồng
độ phản ứng đã hiệu chỉnh ........................................................................................48
Hình 21. Biểu đồ tần số dị hợp tử quan sát Ho trong các quần thể nghiên cứu ........50
Hình 22. Biểu đồ tần số dị hợp tử lý thuyết He trong các quần thể nghiên cứu........50
Hình 23. Biểu đồ chỉ số đa hình PIC trong các quần thể nghiên cứu .......................51
Hình 24. Biểu đồ tỉ lệ cá thể dị hợp tử các chỉ thị STR ở 2 bên gen F8 ...................52
Hình 25. Kết quả tối ưu hóa trên phôi bào 1 .............................................................53
Hình 26. Kết quả tối ưu hóa trên phôi bào 2 .............................................................54


Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Hình 27. Kết quả tối ưu hóa trên phôi bào 3 .............................................................54
Hình 28. Kết quả tối ưu hóa trên phôi bào 4 .............................................................55
Hình 29. Kết quả tối ưu hóa trên phôi bào 5 .............................................................55
Hình 30. Kết quả điện di mao quản phân tích STR trên các mẫu máu bố, mẹ, con và
phôi Q1 ......................................................................................................................57
Hình 31. Kết quả điện di mao quản phân tích STR trên các mẫu máu bố, mẹ, con và

phôi Q2 ......................................................................................................................58
Hình 32. Kết quả điện di mao quản phân tích STR trên các mẫu máu bố, mẹ, con và
phôi Q3 ......................................................................................................................59
Hình 33. Kết quả điện di mao quản phân tích STR trên các mẫu máu bố, mẹ, con và
phôi Q4 ......................................................................................................................60
Hình 34. Kết quả phân tích di truyền liên kết phục vụ PGT-M hemophilia A của gia
đình bệnh nhân tham gia nghiên cứu ........................................................................62
Hình 35. Kết quả chẩn đoán trước sinh bằng Longrange PCR do Viện Huyết học –
Truyền máu Trung ương thực hiện ...........................................................................64
Hình 36. Kết quả điện di mao quản phân tích STR trên các mẫu máu bố, mẹ, con và
dịch ối ........................................................................................................................65
Hình 37. Kết quả chẩn đoán trước sinh bằng phân tích di truyền liên kết sử dụng bộ
STR thiết kế được......................................................................................................66


Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
ADO
Bp
CGH

CSGE

DHPLC
DNA
DOP
F8

Nghĩa tiếng Anh
Allele drop out

Mất allele

base pair

Cặp bazơ nitơ

Comparative genomic
hybridization

Lai so sánh hệ gen

Conformation sensitive gel

Điện di phân biệt cấu hình phân

electrophoresis

tử

Denaturing high pressure

Sắc ký lỏng biến tính hiệu năng

liquid chromatography

cao

Deoxyribonucleic acid

Axit deoxyribonucleic

Degenerate oligonucleotide
primed
F8 gene

Khuếch đại bằng mồi thoái hóa
Gen quy định yếu tố VIII
Yếu tố VIII

FVIII
FISH

Nghĩa tiếng Việt

Fluorescence in situ
hybridization

Lai huỳnh quang tại chỗ

Ho

Observed Heterozygosity

Chỉ số dị hợp tử quan sát

He

Expected Heterozygosity

Chỉ số dị hợp tử lý thuyết

Int1

Intron 1

Intron 1

Int22

Intron 22

Intron 22

I-PCR

Inversion PCR

PCR phát hiện đảo đoạn

In vitro fertilization

Thụ tinh trong ống nghiệm

Intra-cytoplasmic sperm

Tiêm tinh trùng vào bào tương

injection

trứng

IVF
ICSI

MDA
Mbp

Multiple displacement
amplification
Mega base pair

Khuếch đại đa điểm thay thế
Triệu cặp bazơ nitơ


Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Chữ viết tắt

Nghĩa tiếng Anh

Nghĩa tiếng Việt

Multiplex ligation dependent

Nhân bản các đoạn đầu dò phụ

probe amplification

thuộc vào phản ứng nối

NST

Chromosome

Nhiễm sắc thể

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi polymerase

Preimplantation genetic

Chẩn đoán di truyền trước chuyển

diagnosis

phôi

Preimplantation genetic

Xét nghiệm di truyền trước

testing

chuyển phôi

Preimplantation genetic

Xét nghiệm di truyền trước

testing for Aneuploidies

chuyển phôi phát hiện dị bội

MLPA

PGD

PGT
PGT – A

PIC

Polymorphism Information
Content

Hàm lượng thông tin tính đa hình

Preimplantation genetic

Xét nghiệm di truyền trước

testing for monogenic/single

chuyển phôi phát hiện bệnh đơn

gene disorders

gen

Preimplantation genetic

Xét nghiệm di truyền trước

testing for chromosome

chuyển phôi phát hiện rối loạn cấu

structural rearrangements

trúc nhiễm sắc thể

STR

Short tandem repeat

Trình tự lặp kế tiếp

WGA

Whole genome amplification

Khuếch đại toàn bộ hệ gen

µl

Microliter

Micro lít

µM

Micromole

Micro mol

PGT – M

PGT – SR


Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hemophilia A là bệnh rối loạn đông máu di truyền liên kết nhiễm sắc thể
(NST) X, do đột biến gen F8, giảm yếu tố VIII, gây chảy máu không cầm, có thể dẫn
tới tử vong. Trên thế giới, tỷ lệ mắc bệnh khoảng 1/5000 người nam [38]. Ở Việt
Nam, theo thống kê của Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương, có khoảng
30.000 người mang gen F8 đột biến [82]. Điều trị hemophilia A chủ yếu bằng truyền
máu tươi hoặc yếu tố VIII nên kinh phí điều trị rất cao nhưng không giải quyết được
nguyên nhân bị bệnh. Vì vậy, việc dự phòng không sinh con bị bệnh hoặc không
mang gen bệnh bằng chẩn đoán trước sinh và xét nghiệm di truyền trước chuyển phôi
là rất cần thiết.
Kỹ thuật chẩn đoán trước sinh giúp tránh sinh con bị bệnh dựa trên việc chọc

ối ở thời điểm thai 16 tuần tuổi - tuy nhiên, cặp vợ chồng mang gen phải đối mặt với
nguy cơ đình chỉ thai nghén khi thai nhi bị bệnh. Để khắc phục hạn chế này, kỹ thuật
xét nghiệm di truyền trước chuyển phôi (Preimplantation Genetic Testing –PGT)
được ưu tiên sử dụng. PGT là sự kết hợp giữa kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (In
vitro fertilization – IVF) tạo phôi với việc chẩn đoán di truyền. Việc lựa chọn trên
nhiều phôi giúp khả năng chọn được phôi và mang thai không bị bệnh cao hơn nhiều
việc chỉ lựa chọn trên một thai nhi trong chẩn đoán trước sinh. Hơn nữa, PGT giúp
các thai phụ tránh phải đình chỉ thai nghén, giảm gánh nặng về tâm lý và bảo vệ sức
khỏe của người phụ nữ.
Gen F8 lớn, tổn thương trong bệnh hemophilia A phức tạp nên khó có một kỹ
thuật xác định trực tiếp các đột biến gen F8 trên tế bào phôi. Bên cạnh đó, hiện tượng
khuếch đại hỏng một hoặc cả hai allele (Allele DropOut-ADO) ở mẫu tế bào phôi,
được xác định trên 40% các ca chẩn đoán trước chuyển phôi [12], có thể dẫn tới chẩn
đoán sai. Ngoài ra, ngoại nhiễm cũng là nguyên nhân phổ biến thứ hai gây chẩn đoán
sai trong PGT. Do vậy, kỹ thuật phân tích liên kết gen sử dụng nhiều trình tự lặp ngắn
(Short Tandem Repeat – STR) giúp chẩn đoán trước chuyển phôi hemophilia A được
ưu tiên lựa chọn vì giúp kiểm soát ADO và ngoại nhiễm.
Các STR phục vụ PGT phải có tính đa hình cao và nằm gần gen tổn thương để

1


Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

đảm bảo tính liên kết. Tỷ lệ dị hợp tử quan sát là một trong những chỉ tiêu quan trọng
đánh giá tính đa hình của các STR, quyết định giá trị của STR trong chẩn đoán. Tỷ lệ
dị hợp tử quan sát càng cao, giá trị STR trong chẩn đoán càng cao. Ngược lại, tỷ lệ dị
hợp tử quan sát thấp, sử dụng các STR này trong chẩn đoán ít có giá trị, gây lãng phí
về kinh tế, thời gian và công lao động. Trên thế giới, một số nghiên cứu đã đánh giá
tính đa hình trên quần thể người Brazil [47, 50], New Zealand [42], Trung Quốc [17,

72], nhằm lựa chọn các STR phục vụ chẩn đoán trước chuyển phôi hemophilia A.
Ngoài ra, lựa chọn các STR nằm càng gần gen tổn thương giúp hạn chế hiện tượng
trao đổi chéo gây chẩn đoán sai.
Tại Việt Nam, đã có nghiên cứu xây dựng quy trình PGT cho bệnh hemophilia
A dựa trên phân tích STR [2] nhưng một số STR nằm khá xa gen F8. Hơn nữa, các
báo cáo trên thế giới thấy tính đa hình của các STR này thấp, thậm chí tỷ lệ dị hợp tử
quan sát chỉ đạt 1,5% trên một số quần thể người khác nhau [6, 61]. Tính đa hình của
các STR phục vụ PGT chưa được đề cập trên quần thể người Việt Nam [2].
Vì vậy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu “Thiết kế bộ chỉ thị STR phục vụ
chẩn đoán hemophilia A trước chuyển phôi” với hai mục tiêu:
1. Thiết kế bộ chỉ thị STR phục vụ chẩn đoán hemophilia A cho quần thể
người Việt Nam, đảm bảo liên kết chặt với gen F8 và có chỉ số đa hình cao
trong quần thể này.
2. Áp dụng bộ chỉ thị thiết kế được trong chẩn đoán di truyền trước
chuyển phôi bệnh hemophilia A cho gia đình bệnh nhân người Việt Nam.
Nghiên cứu thuộc đề tài “Ứng dụng kỹ thuật Multiplex PCR phân tích các
trình tự lặp ngắn trong chẩn đoán bệnh hemophilia A trước chuyển phôi tại Hà Nội”
mã số 01C-08/11-2017-3 thực hiện tại Phòng phân tích DNA, Bộ môn Giải Phẫu,
Học viện Quân Y.

2


Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Bệnh hemophilia A
1.1.1. Tổng quan hemophilia A
Hemophilia, hay bệnh ưa chảy máu, là bệnh rối loạn đông máu di truyền biểu
hiện lâm sàng chủ yếu là máu chảy khó cầm ở các vết thương như đứt tay, nhổ răng

và các khối máu tụ ở khớp, cơ thường xuất hiện nhiều lần ở một khớp (hình 1). Người
mắc bệnh này phải truyền máu thường xuyên, sống nhờ máu người khác với dung
tích lớn, không được hoạt động mạnh. Cơ chế di truyền của bệnh liên quan đến giới
tính, gen bệnh nằm trên NST X, không có allele tương ứng trên NST Y, gây thiếu hụt
hay bất thường chức năng của các yếu tố đông máu. Bệnh gồm 3 thể: hemophilia A
(80-85%) thiếu yếu tố VIII, hemophilia B (15-20%) thiếu yếu tố IX, hemophilia C
(chủ yếu ở người Do Thái với tỷ lệ mắc đồng hợp tử khoảng 1-3‰ ) thiếu yếu tố XI
[34].

Hình 1. Bệnh nhân hemophilia bị chảy máu trong cơ và biến dạng khớp
[15, 83]
Trong ba thể bệnh trên, hemophilia A là thể phổ biến nhất trên toàn thế giới,
cứ 100000 người nam thì khoảng 10 người mắc bệnh này trong đó 3 – 4 người thuộc
các nước châu Á [49, 74]. Sự xuất hiện của các đột biến tự phát trên gen F8 được
phản ánh qua 30-33% các ca bệnh ở gia đình không có tiền sử. [34, 51, 54]. Người

3


Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

đột biến gen F8 gây thiếu hoặc không tổng hợp được yếu tố VIII, làm rối loạn quá
trình đông máu biểu hiện thành triệu chứng lâm sàng của bệnh hemophilia A. Triệu
chứng lâm sàng thể hiện khác nhau giữa các bệnh nhân, trong đó triệu chứng chảy
máu là đặc trưng của bệnh. Các thể xuất huyết nhẹ có triệu chứng xuất huyết xảy ra
khi răng sữa rụng hoặc nhổ răng. Bệnh càng nặng thì triệu chứng xuất hiện càng sớm.
Bệnh hemophilia A thể nặng đặc trưng bởi bầm tím và chảy máu thường xuyên tái
phát vào khớp, đặc biệt là đầu gối, mắt cá chân, hông và khuỷu tay gây giới hạn
chuyển động của các khớp. Bệnh nhân có thể chảy máu tự phát hoặc sau một chấn
thương nhỏ. Đây là nguyên nhân phổ biến khiến bệnh nhân hemophilia A có thể chảy

máu đến chết sau chấn thương.
Có thể chẩn đoán thể bệnh hemophilia A theo mức độ yếu tố VIII: bình thường
nồng độ FVIII ở người là 200 ng/ml, trường hợp bị bệnh, lượng yếu tố VIII giảm
dưới 30%. Hemophilia A được chia làm ba thể: nặng, trung bình và nhẹ. Ở thể nặng,
hoạt tính FVIII dưới 1%, những bệnh nhân này thường bị chảy máu vài lần trong
tháng. Với thể trung bình, hoạt tính FVIII từ 1-5%, những bệnh nhân này chỉ bị chảy
máu sau những chấn thương nhẹ. Còn ở thể nhẹ, hoạt tính FVIII từ 5-30% so với mức
bình thường, những người này chỉ bị chảy máu sau phẫu thuật hoặc những chấn
thương nặng, sau những động tác mạnh khi chơi thể thao [5].
Bảng 1. Phân loại thể bệnh Hemophilia theo biểu hiện lâm sàng [86]
Thể bệnh
Nặng
(chiếm 70%)

Nồng độ % yếu tố

Biểu hiện chảy máu

VIII (đơn vị/ml)
1% (<0,01)

Trung bình

1–5%

(chiếm 15%)

(0,01 – 0,05)

Nhẹ

5 – 40%

(chiếm 15%)

(0,04 – 0,4)

Chảy máu tự nhiên không liên quan đến chấn
thương, thường chảy máu ở khớp và cơ.
Chảy máu tự nhiên hoặc liên quan đến chấn
thương nhỏ. Chảy máu nặng sau chấn
thương, phẫu thuật.
Chảy máu sau chấn thương lớn/phẫu thuật.

4


Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Hiện nay đã có nhiều phương pháp điều trị và hỗ trợ bệnh nhân mắc
hemophilia, trong đó điều trị liệu pháp gen hứa hẹn nhiều lợi ích vì bệnh được gây ra
bởi khiếm khuyết gen, có thể điều trị để biến đổi một dạng bệnh từ thể nặng thành
thể nhẹ của bệnh. Sử dụng liệu pháp gen có thể kích hoạt lên đến 150% hoạt động
của FVIII [48]. Các nghiên cứu thực nghiệm trên chuột và chó đã chứng minh sự
thành công khi sử dụng liệu pháp gen điều trị, tuy nhiên vẫn cần thêm các nghiên cứu
và thử nghiệm về khả năng đáp ứng miễn dịch ở người để đảm bảo độ an toàn khi áp
dụng [33]. Thêm vào đó, kinh phí cho liệu pháp gen còn cao so với mặt bằng kinh tế
xã hội ở Việt Nam (trung bình một người bệnh mức độ nặng chảy máu 40 lần 1 năm
với chi phí điều trị có thể lên tới 1 – 2 tỷ đồng [88]) nên việc chẩn đoán hemophilia
nói chung và chẩn đoán di truyền trước sinh và trước chuyển phôi nói riêng là công

tác quan trọng nhằm giảm thiểu tối đa các hậu quả cho thế hệ sau của các gia đình
mang gen bệnh.
1.1.2. Cơ sở phân tử của bệnh
Gen

F8

nằm

ở

vị

trí

Xq28

trên

NST

giới

tính

X

(chrX:

154,835,795-155,022,753; University of California, Santa Cruz genome browser,

GRCh38/hg38), là một trong những gen lớn nhất cơ thể, có kích thước 186 kb gồm
26 exon trong đó 24 exon có kích thước từ 62 bp - 262 bp và 2 exon lớn nhất exon 14
(3106 bp) và exon 26 (1958 bp) [27, 65], mã hóa cho protein FVIII gồm 2332 amino
acid và có trọng lượng phân tử khoảng 300 kD.

Hình 2. Vị trí của gen tổng hợp FVIII [65]

5


Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Khi gen F8 bị đột biến, tế bào giảm hoặc mất khả năng tổng hợp protein FVIII
gây nên bệnh hemophilia A [18]. Cơ sở phân tử của hemophilia A được phân tích
trong nhiều năm và rất nhiều dạng đột biến gen F8 gây bệnh đã được công bố. Các
nghiên cứu khẳng định dạng đột biến khác nhau sẽ gây những kiểu hình đặc trưng
khác nhau [65]: Bệnh nhân hemohilia A thể nặng thường gặp dạng đột biến đảo đoạn
intron 22 (chiếm 45-50%), trong khi đó đột biến điểm chiếm đa số ở bệnh nhân
hemophilia A thể bệnh vừa và nhẹ 90-95% [25] . Ở Việt Nam, đột biến đảo đoạn
chiếm tỷ lệ cao nhất 38,1%. Tiếp theo là đột biến sai nghĩa chiếm tỷ lệ 23,9%. Chiếm
tỷ lệ cao thứ ba là các dạng đột biến mất nucleotide, đột biến vô nghĩa, đột biến thêm
nucleotide với tỷ lệ 9,8%. Tỷ lệ thấp nhất là dạng đột biến ở biên giới exon-intron và
đột biến mất đoạn lớn chiếm tỷ lệ 4,3% [1].
Vào năm 2014, bản đồ đột biến gen F8 của các bệnh nhân Hemophilia ở Việt
Nam đã được xây dựng nhằm hỗ trợ chẩn đoán và điều trị bệnh này (hình 3) [1].

Hình 3. Bản đồ vị trí đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A ở Việt Nam [1]
Nghiên cứu của Kaufman và cộng sự năm 1995 khẳng định dạng đột biến khác
nhau sẽ gây những kiểu hình đặc trưng khác nhau của bệnh nhân mắc hemophilia
[65].

Cụ thể, nhiều cơ chế đột biến khác nhau có thể gây bệnh hemophilia A thể

6


Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

nặng, tuy nhiên dạng đột biến thường gặp nhất là đảo đoạn intron 22, chiếm 45-50%
bệnh nhân (hình 4) và intron 1 chiếm khoảng 5% bệnh nhân (hình 5) của gen F8 [16,
53]. Đảo đoạn intron 22 xảy ra do sự tái tổ hợp giữa bản sao của vùng int22h1 (vùng
lặp lại gồm 9,5 kb) thuộc intron 22 với một trong hai bản sao của vùng tương đồng
nằm ở telomere vùng int22h2, int22h3; vị trí 400 kb ở đầu 5’ ngoài gen F8 [41]. Hiện
tượng đảo đoạn dẫn đến đứt gãy gen F8 và gây thể bệnh nặng cho bệnh nhân với biểu
hiện kiểu hình là chảy máu ở mức độ nặng và biến dạng khớp. Đảo đoạn intron 1 xảy
ra tương tự, do sự tái tổ hợp vùng int1h1thuộc intron 1 (kích thước 900 bp) nằm vị trí
140 kb ở đầu 5’ của gen F8 với bản sao int1h2 nằm ngoài gen F8 [41].

Hình 4. Cơ chế đột biến đảo đoạn intron 22 [25]
Đột biến mất đoạn lớn phát hiện thấy ở 2-5% bệnh nhân hemophilia A thể
nặng [9], có thể ở dạng mất một exon hoặc mất toàn bộ gen [70]. Dạng đột biến này
là do quá trình tái tổ hợp giữa các đoạn lặp Alu [23, 75, 77]. Đột biến chèn đoạn lớn
làm đứt gãy gen F8 cũng gây hemophilia A thể nặng [55, 68].
Ngoài ra, đột biến thay thế một nucleotide cũng có thể gây hemophilia A thể
nặng: đột biến vô nghĩa (nonsense) tạo mã kết thúc hoặc đột biến mất nucleotide gây
lệch khung dịch mã dẫn đến không tổng hợp hoặc tổng hợp protein không có chức
năng. Đột biến tại biên giới intron và exon đã được các tác giả công bố. Nhiều đột

7

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

biến thay thế ảnh hưởng đến dinucleotide CpG được phát hiện trên một số bệnh nhân,
ví dụ đột biến c.6496C>T dẫn đến chuyển thành Arg2147X (Tại vị trí 6496 trên trình
tự Genebank nucleotide C thay bằng nucleotide T làm thay đổi protein Arginine ở vị
trí 2147 tạo thành stop codon) [39]. Mất đoạn và chèn đoạn nhỏ cũng thường thấy
trong hemophilia A thể nặng, thay đổi từ 1-55 nucleotide. Phổ biến nhất là mất hoặc
chèn nucleotide A vào exon 14 [8], thường xảy ra trong vùng từ c.3637 đến c.4379
[39].

Hình 5. Cơ chế đột biến đảo đoạn intron 1 [25]
Đối với hemophilia A thể vừa và nhẹ, cơ chế chính là đột biến điểm gây lệch
khung dịch mã và đột biến thay thế nucleotide (missense), chiếm 90-95% bệnh nhân.
Đột biến tại vị trí nối và vùng promoter của gen được phát hiện ở một số bệnh nhân.
Hiện tượng lặp đoạn exon 13 cũng được mô tả ở các bệnh nhân hemophilia A thể nhẹ
[25].
Thông thường, các trường hợp nam giới bị đột biến gen F8 thể nặng gây bệnh
hemophilia A trong cùng một gia đình có những biểu hiện lâm sàng nặng nề tương tự
nhau. Tuy nhiên, hiệu ứng di truyền và môi trường khác nhau có thể thay đổi mức độ
biểu hiện lâm sàng của bệnh [19]. Các nghiên cứu đã chỉ ra 10-15% bệnh nhân với
“kiểu hình đặc trưng” chảy máu mức độ nặng (khi nồng độ FVIII hoạt động <1%) có
biểu hiện triệu chứng tương đối nhẹ trên lâm sàng [12, 22, 59]. Không phải tất cả
8


Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

những bệnh nhân hemophilia A thể nặng thường xuyên chảy máu tự phát, thậm chí
trong số những người bị chảy máu, mức độ nặng của bệnh cũng khác biệt đáng kể.
Cơ sở cho sự khác biệt này vẫn chưa được hiểu rõ hoàn toàn [36, 71]. Gần đây đã có

báo cáo chứng minh được tần số một số loại đột biến là khác nhau ở hai giới: tỷ lệ
đảo đoạn intron 22 ở tế bào mầm sinh dục nam nhiều hơn 15 lần ở tế bào mầm sinh
dục nữ. Đối với đột biến điểm ở tế bào sinh dục nam cao hơn gấp 5 – 10 lần, còn đột
biến mất đoạn cao hơn 5 lần so với tế bào mầm sinh dục nữ [58].
Nghiên cứu sinh học phân tử giúp phát hiện ra các dạng, các vị trí đột biến trên
gen F8 gây bệnh hemophilia A để chẩn đoán phát hiện người mang gen bệnh. Có
nhiều phương pháp để xác định đột biến gen, tuỳ thuộc vào kiểu đột biến mà có các
phương pháp phân tích khác nhau. Một số kỹ thuật phân tích đột biến được sử dụng
hiện nay là PCR phát hiện đột biến mất exon, Longrange-PCR, Inversion PCR (IPCR) phát hiện đảo đoạn intron 22 [41, 44, 69], PCR đa mồi phát hiện đảo đoạn
intron 1 [7] và Southern Blot. Ngoài ra còn có hai kỹ thuật sàng lọc đột biến dựa trên
phân tích sợi kép là phương pháp điện di gel phân biệt cấu hình phân tử
(Conformation Sensitive Gel Electrophoresis - CSGE) và sắc ký lỏng biến tính hiệu
năng cao (Denaturing high pressure liquid chromatography - DHPLC), trong đó
DHPLC hiện là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi nhất để phân tích gen F8 [6, 57].
Những năm gần đây, kỹ thuật nhân bản các đoạn đầu dò phụ thuộc vào phản
ứng nối (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification - MLPA) là phương
pháp được ưu tiên chọn lựa trong chẩn đoán đột biến mất đoạn, lặp đoạn gen F8 [6,
57]. Đây là phương pháp bán định lượng xác định số lượng bản sao tương đối của
trình tự DNA, được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu về bệnh lý di truyền người.
Ngoài ra, MLPA còn giúp phát hiện tổn thương gen, chẩn đoán dị hợp tử với độ chính
xác cao, cho kết quả nhanh chóng [52].
Phương pháp giải trình tự DNA của toàn bộ gen F8 có thể được sử dụng để xác
định các đột biến điểm gây bệnh. Tuy nhiên, do kích thước lớn của gen F8 và các cơ chế
đột biến phức tạp nên giải trình tự cũng không thể giúp chẩn đoán bệnh trong mọi trường
hợp. Tại Việt Nam, phát hiện đột biến gen F8 bằng kỹ thuật giải trình tự hiện nay đang

9


Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

được tiến hành tại Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội [1].
Bảng 2. Các phương pháp phát hiện đột biến gây bệnh hemophilia
Phương

Loại đột biến

pháp

phát hiện

Southern

Đảo

blot

intron 22

Ưu điểm

Nhược điểm

đoạn Cho phép xác định những Thời gian thực hiện
đoạn DNA đột biến với lâu, nhiều công đoạn.
nồng độ nhỏ trong hỗn
hợp mẫu mà khó có thể
xác định được bằng các
phương pháp khác.

Longrange-

Xét nghiệm phân tích Có nhiều yếu tố ảnh

PCR

gen được tiến hành đơn hưởng kết quả PCR;

I-PCR

giản, dễ thực hiện.

PCR đa mồi
PCR

Đảo

đoạn

đòi hỏi nồng độ DNA
trong mẫu cao và mẫu

intron 1

phải được bảo quản

Mất exon 14,

tốt.

26
DHPLC

Các dạng đột Có thể phát hiện 85-90% Đòi

CSGE

biến khác.

đột biến gen F8 [6, 26].

hỏi

thiết

bị

chuyên môn đắt tiền,

MLPA

tốn kém tiền bạc và

Giải trình tự

công sức

DNA
Kết quả đột biến DNA cần phải được giải thích một cách thận trọng, do những
nguy cơ tiềm ẩn của thể khảm trong gia đình có tiền sử bệnh hemophilia A (chiếm

khoảng 10%) có thể gây ra sự không chắc chắn về tình trạng mang gen bệnh: quy
trình phát hiện đột biến thông thường có thể không phát hiện ra khiếm khuyết di
truyền tiềm ẩn, nếu tỷ lệ các allele đột biến là <5% so với nền allele kiểu thông thường
[61].

10


Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

1.1.3. Chẩn đoán trước sinh bệnh hemophilia A
Hiện nay với các liệu pháp điều trị có hiệu quả, người bị bệnh hemophilia A
hoàn toàn có thể lập gia đình, sinh con. Tuy vậy, để có thể sinh ra các con không
mang bệnh này và thậm chí loại bỏ được gen bệnh đang tồn tại trong dòng họ, trước
khi tiến tới hôn nhân, cần phải xét nghiệm chẩn đoán toàn thể, mức độ bệnh và có thể
được tư vấn trước sinh. Dựa trên cơ chế di truyền bệnh hemophilia A (hình 6), để loại
bỏ gen bệnh, nếu người cha bị bệnh thì không được sinh con gái vì 100% con gái sẽ
mang gen gây bệnh di truyền từ NST X của bố. Còn với người phụ nữ mang gen
bệnh, hoặc cả hai bố mẹ cùng mang gen bệnh thì ở thời kỳ thai nghén, người phụ nữ
cần làm chẩn đoán trước sinh vì gen gây bệnh từ NST X của mẹ sẽ di truyền cho 50%
con gái và 50% con trai.

Hình 6. Cơ chế di truyền bệnh Hemophilia A [85]
Chẩn đoán trước sinh là sử dụng những phương pháp thăm dò trong thời kỳ
thai nghén nhằm phát hiện các bất thường về hình thái hay những bất thường về nhiễm
sắc thể của thai để chẩn đoán sớm các bệnh và từ đó đưa ra các biện pháp can thiệp
kịp thời nhằm giảm tỷ lệ tử vong sơ sinh, tỷ lệ trẻ bị dị tật, khuyết tật nặng nề và góp
phần nâng cao chất lượng dân số. Các phương pháp cơ bản được ứng dụng hiện nay
là siêu âm chẩn đoán, định lượng các chất đánh dấu và các phương pháp lấy bệnh
11

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

phẩm thai như: chọc hút nước ối, lấy máu tĩnh mạch rốn, sinh thiết bánh rau… để xác
định những bệnh lý liên quan đến bất thường về nhiễm sắc thể. Tuy nhiên, vì các
phương pháp lấy bệnh phẩm thai đều phải sử dụng kỹ thuật xâm lấn nên đều có thể
gây các biến chứng như rỉ ối, sảy thai với tỷ lệ nhất định nếu kỹ thuật viên không tuân
thủ nghiêm ngặt các quy định, hướng dẫn khi thực hiện [87].
Xét nghiệm chẩn đoán trước sinh cho hemophilia nói riêng và các rối loạn đơn
gen nói chung thường tiến hành trên bệnh phẩm thai là dịch ối hoặc DNA tự do của
thai nhi tách từ máu ngoại vi của người mẹ. Ở nước ta hiện nay Long-range PCR
được sử dụng chủ yếu để phát hiện đảo đoạn intron 22. Trong kỹ thuật này, bốn mồi
P, Q, A&B có khả năng phân biệt người nam bị bệnh mang hoặc không mang đảo
đoạn, và người nữ mang gen: hai mồi P&Q được thiết kế trong gen F8 và nằm 2 đầu
int22h1. Hai mồi xa hơn là A&B, nằm 2 đầu int22h2 và 22h3, vùng tương đồng ngoại
gen của int22h1 (hình 7). Các mồi P & Q khuếch đại đoạn 12 kb, A & B đoạn 10 kb
và P & B và A & Q đoạn 11 kb (mỗi cặp) trên gel agarose.

Hình 7. Vị trí 4 mồi A, B, P, Q trong Long-range PCR phát hiện đảo đoạn
int22 trong gen F8
Đoạn A & B luôn được tạo ra và đảm nhiệm với tư cách là một đối chứng
12


Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

dương, bởi vì ít nhất một bản sao của int22h2 và int22h3 vẫn còn nguyên vẹn. Sử
dụng tất cả bốn mồi cùng một lúc trong một PCR ống đơn, DNA hệ gen không có
đảo đoạn, mẫu của bệnh nhân nam hoặc bệnh nhân nữ mang đảo đoạn tạo ra ba mô

hình khuếch đại: một băng 12 kb phía trên, và một băng 10 kb phía dưới chỉ có nghĩa
là không có đảo đoạn (làn 2- hình 8). Băng 11 kb ở giữa, và một băng 10 kb ở phía
dưới nghĩa là có sự đảo đoạn ở bệnh nhân nam mắc bệnh (làn 1- hình 8). Các băng
10 kb, 11 kb và 12 kb cho biết một người nữ mang đảo đoạn (làn 3 và 4 - hình 8).
Protocol Longrange-PCR để phát hiện đảo đoạn F8C khác với các protocol long range
PCR tiêu chuẩn [63]. Sự thay đổi bao gồm việc bổ sung nồng độ cao của dimethyl
sulphoxide (DMSO) và kết hợp 7-deaza-dGTP để có thể đọc qua vùng có hàm lượng
GC cao nằm phía đầu của nhân tố gen F8, và tăng đáng kể lượng Taq and Pwo DNA
polymerases. Các sửa đổi bổ sung bao gồm điều chỉnh điều kiện của chu kỳ và các
thành phần khác của phản ứng PCR (Liu và Sommer 1998; Liu và cộng sự 1999) [43,
45]. Tuy nhiên, kỹ thuật này còn nhiều hạn chế như đòi hỏi kỹ thuật phức tạp, thời
gian thực hiện chưa nhanh chóng, các phương pháp PCR có thể bị âm tính giả. Bên
cạnh đó, hiện tượng nhiễm máu mẹ trong quá trình thu mẫu và ngoại nhiễm trong vận
chuyển, thao tác kỹ thuật trên dịch ối cũng có thể dẫn tới kết quả không chính xác.

Hình 8. Kết quả LD-PCR phát hiện đảo đoạn int22 gen F8 (Làn 1: mẫu nam có
đảo đoạn – người mắc bệnh; Làn 2: mẫu nữ không có đảo đoạn – người không
mang gen bệnh; Làn 3,4: mẫu nữ có đảo đoạn – người mang gen bệnh)
13


Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Ngoài ra, trong chẩn đoán trước sinh hemophilia A còn có xét nghiệm phát
hiện đột biến trên intron 18 sử dụng kỹ thuật phân tích đa hình chiều dài đoạn cắt giới
hạn của enzyme BclI. Cụ thể trong phương pháp này, mẫu DNA của người mẹ (tách
từ máu) và thai nhi (tách từ dịch ối) được làm PCR khuếch đại đoạn sản phẩm kích
thước 142bp. Trên NST X bình thường, đoạn này chứa vị trí cắt giới hạn của enzyme
BclI tại nucleotide thứ 99 (hình 9) nên sau khi xử lý với enzyme, kết quả điện di sẽ
cho 2 băng kích thước 99bp và 43bp. Khi xảy ra đột biến điểm làm thay đổi trình tự

tại vị trí nhận biết của BclI, đoạn DNA không bị cắt và giữ nguyên kích thước 142bp.
Trên cơ sở đó, có thể phân tích kết quả xét nghiệm của một số cặp mẹ con làm chẩn
đoán trước sinh bệnh hemophilia A [3]. Đây là phương pháp dễ thực hiện và phù hợp
với điều kiện kinh tế của nhiều gia đình bệnh nhân, nhưng chưa đảm bảo được khả
năng phát hiện đầy đủ đột biến gây bệnh cũng như kết quả chẩn đoán phụ thuộc khá
nhiều vào hoạt tính enzyme, khó tránh khỏi phải lặp lại thí nghiệm nhiều lần hay hiện
tượng âm tính giả khi enzyme mất hoạt tính.

Hình 9. Vị trí cắt giới hạn của enzyme BclI
Do các hạn chế nói trên của chẩn đoán trước sinh, nên các cặp vợ chồng có
người mang gen bệnh hemophilia A được khuyến cáo lựa chọn phương pháp thụ tinh
ống nghiệm (In vitro Fertilization – IVF) và sàng lọc phôi bệnh để có thể tránh được
việc sinh trẻ mắc các bệnh này từ giai đoạn trước mang thai để giảm thiểu tối đa các
rủi ro cho thai nhi cũng như sức khỏe và tâm lý của người mẹ.

14


Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

1.2. Chẩn đoán trước chuyển phôi Hemophilia A
1.2.1. Kỹ thuật chẩn đoán trước chuyển phôi
Để nâng cao tỷ lệ thành công và trẻ sinh sống khoẻ mạnh trong điều trị IVF
thì việc chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi (Preimplantation Genetic Diagnosis PGD) là một trong những yêu cầu quan trọng, cấp thiết và thực tiễn [21, 30]. Cụ thể,
trong suốt chu trình IVF, một hoặc một số tế bào được sinh thiết vào ngày thứ 3 hoặc
thứ 5. DNA trong tế bào phôi được phân tích kiểu gen, đồng thời phòng thí nghiệm
cũng phân tích DNA trong máu của bố, mẹ và một số thành viên gia đình khác để xác
định kiểu gen gây bệnh và so sánh với phôi để kiểm tra phôi có bị bệnh không. Sau
khi hoàn thành các bước này, các phôi được sàng lọc để chỉ giữ lại phôi không mang
bệnh. PGD được báo cáo lần đầu tiên trên thế giới vào năm 1990, cho đến nay đã

được sử dụng như một phương tiện chẩn đoán lâm sàng trong điều trị và áp dụng một
cách rộng rãi. Hàng năm số trường hợp PGD tăng gần gấp đôi, hàng chục ngàn trẻ ra
đời từ các trung tâm IVF trên thế giới sau chẩn đoán PGD và chưa có công bố nào
tìm thấy ảnh hưởng xấu của PGD ở trẻ ra đời bằng phương pháp này. Hiện nay, thuật
ngữ PGD được thay thế bằng PGT-M (đối với bệnh lý đơn gen); PGT-SR (đối với
cấu trúc NST); PGT-A (đối với dị bội). Hiện nay ngoài kỹ thuật IVF truyền thống thì
kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương trứng (Intra-Cytoplasmic Sperm Injection ICSI) cũng được thực hiện tạo nhiều trung tâm hỗ trợ sinh sản để tăng hiệu quả thụ
tinh, vì trong IVF trứng được cấy với hàng trăm tinh trùng còn trong ICSI chỉ với một
tinh trùng được lựa chọn là tốt nhất về mặt hình thái cũng như khả năng di động.
Để có thể phân tích DNA từ mẫu phôi đơn bào, trước tiên cần tiến hành khuếch
đại toàn hệ gen (Whole Genome Amplification – WGA). WGA là phương pháp
khuếch đại toàn bộ hệ gen từ những mẫu có lượng DNA rất ít chỉ khoảng vài pg/µl.
Phương pháp này được áp dụng phổ biến trong lĩnh vực pháp y và nghiên cứu, chẩn
đoán các bệnh di truyền [67, 80]. Đây cũng là bước chuẩn bị cho các kỹ thuật tiếp
theo như giải trình tự thế hệ mới [20, 64] và array CGH [35]. Để tiến hành WGA, có
thể sử dụng 1 trong 3 phương pháp: PCR bằng mồi thoái hóa (Degenerate
Oligonucleotide Primed PCR – DOP PCR), khuếch đại thay thế đa điểm (Multiple

15