Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán nhanh vi-rút gây bệnh khảm vàng (PYMoV) trên cây hồ tiêu ở Việt Nam

BVTV - Sè 5/2018 Kết quả nghiên cứu khoa học

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR CHẨN ĐOÁN NHANH VI-RÖT
GÂY BỆNH KHẢM VÀNG (PYMoV) TRÊN CÂY HỒ TIÊU Ở VIỆT NAM
Study on PCR Techniques for Detection of Piper Yellow Mottle Virus (PYMoV)
on Black Pepper in Viet Nam
1

1

1

Tạ Hoàng Anh , Nguyễn Hồng Tuyên , Nguyễn Thúy Hạnh ,
1
2
Nguyễn Thị Thúy và A Ishwara Bhat .
Ngày nhận bài: 25.09.2018

Ngày chấp nhận: 28.09.2018
Abstract

Four pairs of primers designed at conserved regions corresponding to four Open Reading Frames - OFR1,
OFR2, OFR3 and OFR4, of the Piper yellow mottle virus (PYMoV) genome were used in four separated tubes
in the same polymerase chain reaction (PCR) for each sample after extraction of total DNA using CTAB
method. All four primer pairs gave bright and a single band of expected size including 379bp, 352bp, 539bp
and 420bp, respectively, only on the lanes of infected sample but not any in the lane of healthy plant sample
(as negative control) on a 0.8% agarose gel after electrophoresis. Like many other Budnavirus, PYMoV was
found to occur endogenous virus intergrated most of their genomic sequence in the sequence of the host plant.
Hence, in this study for the confirmation of any unspecific amplification in PCR (though no band was found on
the healthy control DNA after PCR), the One-Step RT-PCR was done using the same pairs of primers after
total RNA extraction using Tri-Reagent. The same result was obtained after electrophoresis as done previously

by PCR. Afterwards, the serial dilution of DNA extract was done and gave the sensitivity of PCR protocol was
-3
of 10 . These results of PCR and RT-PCR helped to recommend a good protocol using either one of or all
those four pairs of primers for a specific and sensitive detection of PYMoV from infected black pepper plants in
Vietnam by PCR.
Keywords: Piper yellow mottle virus, detection, PCR, RT-PCR

1. ĐẶT VẤN ĐỀ

*

Cây hồ tiêu (Piper nigrum L., Piperaceae) là
một cây gia vị quan trọng, đem lại giá trị kinh tế
cao và được trồng phổ biến ở nhiều nước Đông
Nam Á, trong đó có Việt Nam. Theo thống kê của
Hiệp hội Hồ tiêu Việt Nam, tính đến năm 2015,
tổng diện tích trồng hồ tiêu cả nước lên đến
101.623 ha, tập trung chủ yếu ở miền Đông Nam
Bộ và Tây Nguyên, chiếm 93,50% diện tích trồng
hồ tiêu trong cả nước. Có 3 giống hồ tiêu được
ưa chuộng và trồng phổ biến hiện nay gồm Tiêu
Vĩnh Linh (Tiêu Sẻ), Tiêu Trâu và Tiêu Ấn Độ.
Diện tích hồ tiêu của Việt Nam năm 2015 đạt
176.789 tấn, chiếm 32% sản lượng của thế giới.
Năng suất hồ tiêu bình quân của nước ta đạt 2,6
tấn/ha, vùng Tây Nguyên cao nhất đạt 3,1 tấn/ha.
Hiện tượng cây hồ tiêu sinh trưởng kém, độ
dài đốt ngắn lại, phần mô lá giữa các gân lá bị
khảm vàng, lá biến dạng… đã xuất hiện khá phổ
1. Viện Bảo vệ thực vật (PPRI) - P. Đức Thắng, Q. Bắc

Từ Liêm, Hà Nội, Việt Nam.
2. Viện Nghiên cứu cây gia vị Ấn Độ (IISR) Kozhikode 673012, Kerala, Ấn Độ.

58

biến ở hầu khắp các vườn trồng tiêu trên thế
giới, nhất là ở các khu vực có vĩ độ cao, năng
suất và chất lượng hạt tiêu giảm đáng kể, cây lụi
dần và chết (Bhat et al., 2003, 2005). Những
triệu chứng này đã được xác định là do vi-rút
khảm vàng hồ tiêu, tên tiếng Anh là Piper yellow
mottle virus (PYMoV), thuộc nhóm Badnavirus,
họ Caulimoviridae, và đã được ghi nhận ở các
nước Braxin, Ấn Độ, Indonesia, Malaysia, Sri
Lanka, Thái Lan (Lockhart et al., 1997; Duarte et
al., 2001; de Silva et al., 2002; Bhat et al., 2003).
Bên cạnh PYMoV, các nhóm tác giả cũng ghi
nhận Cucumber mosaic virus (CMV) gây nhi m
trên hồ tiêu nhưng chủ yếu nhi m kép với
PYMoV với tần suất xuất hiện thấp đến rất thấp
(Deeshma and Bhat, 2017).
Các triệu chứng tương tự như đã được ghi
nhận ở các nước trồng hồ tiêu trên thế giới cũng
được ghi nhận ở Việt Nam từ nhiều năm nay.
Bên cạnh đó, các dạng triệu chứng vàng lá do
sinh lý; vàng lá và còi cọc do thiếu dinh dưỡng,
do chăm sóc và cắt tỉa không hợp lý hay do thâm
canh quá mức khiến cây hồ tiêu kiệt quệ… dẫn
đến những biểu hiện bất thường hay do phức

Kết quả nghiên cứu khoa học

BVTV - Sè 5/2018

hợp nhiều yếu tố…được người nông dân và cán
bộ địa phương gọi chung là hiện tượng “tiêu
điên” với những mô tả không thống nhất gữa các
khu vực trồng tiêu khác nhau.
Piper yellow mottle virus có cấu trúc phân tử là
sợi kép DNA mạch vòng. Bộ gene gồm 4 khung
đọc mở (ORF) mã hóa 4 protein. PYMoV cũng
như nhiều Budnavirus khác có đặc tính
“enogenous” (Deeshma et al., 2017), có nghĩa là
trong quá trình tái sinh PYMoV “copy” phần lớn bộ
gene của mình ở nhiều vị trí khác nhau từ trình tự
gene của cây ký chủ. Điều này đã gây khó khăn
trong việc xác định một công cụ chẩn đoán có tính
đặc hiệu nếu chỉ thực hiện theo các phương pháp
thông thường bởi hiện tượng “dương tính giả”. Khi
đó, các sản phẩm PCR không chỉ thu được trên
các mẫu nhi m mà cũng được khuyếch đại trên
cả mẫu đối chứng cây khỏe. Hiện tượng này xảy
ra khi đoạn gene được khuyếch đại trong phản
ứng PCR nằm trong vùng gene mà PYMoV đã
copy từ trình tự gene của cây chủ.
Để có được những cặp mồi có tính đặc hiệu
với PYMoV thì cần phải được thiết kế trên vùng
gene của riêng vi-rút. Các cặp mồi sẽ được thiết
kế trên các vùng gene có tính bảo thủ cao của

các Budnavirus (trong tự nhiên, các Budnavirus
có tính đa dạng rất cao) và chỉ những cặp mồi
cho sản phẩm PCR với kích thước như mong đợi
trên các mẫu giám định và âm tính trên mẫu đối
chứng cây khỏe sẽ được lựa chọn cho các bước
tiếp theo. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử
dụng cùng lúc 4 cặp mồi, trong 4 tube PCR riêng

biệt, được thiết kế tại các vùng gene bảo thủ
tương ứng trên 4 ORFs (OFR1 - OFR4) của bộ
gene PYMoV trong cùng 1 phản ứng PCR với
yêu cầu cả 4 cặp mồi đều cho kết quả dương
tính rõ trên DNA của mỗi mẫu nhi m bệnh và
đều âm tính trên mẫu đối chứng khỏe. Các cặp
mồi này chỉ được đề xuất sử dụng khi chúng đều
cho kết quả tương tự trong phản ứng RT-PCR, ở
bước tiếp theo, sử dụng RNA tổng số tách chiết
từ cùng 1 mẫu giám định.
2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
- Mẫu lá hồ tiêu nhi m bệnh:
 Mẫu giám định: mẫu lá thu thập tại ấp 1, xã
Minh Lập, huyện Chơn Thành, tỉnh Bình Phước,
giống tiêu Vĩnh Linh, vườn 5 năm tuổi.
 Mẫu đối chứng dương và âm: DNA tách
chiết từ mẫu lá bệnh và mẫu lá khỏe thu tại nhà
lưới Viện Nghiên cứu cây gia vị (IISR) – Calicut,
Kerala, Ấn Độ.
- Các cặp mồi được thiết kế tại các vùng
gene bảo thủ của Budnavirus tương ứng trên các

khung đọc mở ORF1, ORF2, ORF3 và ORF4
trong bộ gene của PYMoV, sử dụng trình tự gene
trên GenBank với mã truy cập NC_022365 (Hany
et al., 2014).
- Phần mềm sử dụng để phân tích và lựa
chọn các cặp mồi là VectorNTI 11 và MEGA6.
- Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí
nghiệm Viện BVTV và IISR (Ấn Độ).

Bảng 1. Danh sách các cặp mồi đƣợc sử dụng
ORFs
1
2
3
4

Tên mồi

Trình tự mồi (5'  3')

PYMoV-1F
PYMoV-1R
PYMoV-2F
PYMoV-2R
PYMoV-3F
PYMoV-3R
PYMoV-4F
PYMoV-4R

GAGAGATCAATCGAGGATTG

CAACCTTGGCTATCATCAAC
TTTGTCAAGCCAAGAGACCAC
TTGAGTGATTTGGTCCTCCAC
GAGTACCAACAGGTGATGA
GTGCTTCCTCTTCTCAATC
TATGGAAGCAGCTCTCGTTCA
CTTTGCCCGCACAGATTTGAT

2.2 Phƣơng pháp
- Tách chiết DNA tổng số từ mẫu lá: 100 mg
lá tươi được nghiền bằng chày cối sứ với 500 µl

Sản phẩm PCR
(bp)
379
352
539
420

Ext-Bf (DNA Extraction Buffer) cùng 1% (V/v) ME
(β-mercaptoethanol) rồi chuyển toàn bộ sang
tuýp 2-ml. Tuýp được ủ trong waterbath tại nhiệt
o
độ 65 C trong 30 phút. Lắc nhẹ tube trước khi

59


BVTV - Sè 5/2018 Kết quả nghiên cứu khoa học
thêm 500 µl PCI (Phenol : Chloroform : Isoamyl

alcohol - 25:24:1) rồi lắc thật mạnh hoặc vortex.
g
Ly tâm 2.500 trong 10 phút ở nhiệt độ phòng..
Phần dịch trong phía trên được chuyển sang 1
tuýp 1,5-ml khác, cho thêm vào mỗi tuýp 2 l
o
RNase, lắc nhẹ rồi để ở nhiệt độ 3 C trong 30
phút. Thêm 500 µl CI (Chloroform : Isoamyl
alcohol – 24:1) rồi lắc thật mạnh hoặc vortex
g
trước khi ly tâm 2.500 trong 10 phút ở nhiệt độ
phòng. Phần dịch trong phía trên được chuyển
sang 1 tuýp 1,5-ml mới. Thêm 50 l Sodium
acetate 3M (pH 4,0), lắc nhẹ, rồi thêm một lượng
tương đương Isopropanol, lắc nhẹ rồi để lạnh
trong nước đá ít nhất 30 phút. Ly tâm 10.000
o
vòng/phút trong 15 phút ở 4 C. Đổ bỏ phần dung
o
dịch và rửa phần kết tủa bằng 150 l cồn 70 . Để
khô ở nhiệt độ phòng trước khi hòa tan kết tủa
với 100 l DEPC-H2O.
- Tách chiết RNA tổng số từ mẫu lá: 50 mg
lá tươi được nghiền bằng chày cối sứ với 495 µl
- DNA Extraction Buffer:
Dung dịch mẹ
100 mM Tris-HCl (pH 8,0)
0,5 M EDTA (pH 8,0)
1,4 M NaCl
Nước Deionized – thêm cho đủ 50 ml

- Thành phần và chu trình nhiệt PCR:
Thành phần PCR
Master Mix
Primer forwards
Primer reverse
Deionized H2O
DNA
Tổng dung tích

Dung tích (l)
12,50
0,25
0,25
11,00
1,00
25,00

Tri-Reagent
cùng
1%
(V/v)
ME
(βmercaptoethanol) rồi chuyển toàn bộ sang tuýp
1,5-ml. Thêm lần lượt 50 µl Sodium sulphite 3M
và 50 µl Sodium acetate 2M (pH 4,0), lắc thật
mạnh hoặc vortex. Thêm 500 l Phenol (water
saturated) rồi lắc thật mạnh hoặc vortex. Ly tâm
o
12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 C. Chuyển
phần dịch trong phía trên sang 1 tuýp mới. Thêm

100 µl CI (24:1) rồi lắc thật mạnh hoặc vortex
trước khi ủ trong nước đá 15 phút. Thêm vào mỗi
o
tuýp 2 l DNase, lắc nhẹ rồi để ở nhiệt độ 37 C
trong 30 phút. Thêm 100 µl CI (24:1) rồi lắc thật
mạnh hoặc vortex trước khi ly tâm 12.000
o
vòng/phút trong 15 phút ở 4 C. Thêm một lượng
tương đương Isopropanol, lắc nhẹ rồi để lạnh
trong nước đá ít nhất 45 phút. Ly tâm 12.000
o
vòng/phút trong 15 phút ở 4 C. Đổ bỏ phần dung
o
dịch và rửa phần kết tủa bằng 150 l cồn 70 . Để
khô ở nhiệt độ phòng trước khi hòa tan kết tủa
với 100 l DEPC-H2O.

Dung lượng (ml)
5,0
0,4
14,0
30,6
Nhiệt độ
o
1. 94 C
o
2. 94 C
o
3. 52 C
o

4. 72 C
o
5. 72 C
o
6. 4 C

Thời gian
3:00
0:30
0:30
0:30  quay lại 3 (35X)
10:00
Hold

Nhiệt độ
o
1. 42 C
o
2. 94 C
o
3. 52 C
o
4. 72 C
o
5. 72 C
o
6. 4 C

Thời gian
45:00

0:30
0:30
0:30  quay lại 3 (35X)
10:00
Hold

- Thành phần và chu trình nhiệt RT-PCR:
Thành phần PCR
10X PCR-buffer
0.1M DTT
25 Mm dTNPs
1U Taq
100U RT
10U RI
Primer forwards
Primer reverse
Deionized H2O
RNA
Tổng dung tích
60

Dung tích (l)
5,00
5,00
2,00
3,00
0,50
0,25
0,50
0,50

10,25
50,00


Kết quả nghiên cứu khoa học
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Xác định nồng độ DNA và RNA tổng số
Hàm lượng và chất lượng DNA hay RNA là một
yếu tố rất quan trọng ảnh hưởng đến kết quả phản
ứng PCR hay RT-PCR. Hàm lượng DNA hay RNA

BVTV - Sè 5/2018
quá thấp hoặc độ tinh sạch không đảm bảo sẽ dẫn
đến phản ứng PCR hoặc RT-PCR thất bại. Hàm
lượng DNA và RNA được tách chiết và tinh sạch
theo các qui trình đã nêu được xác định trên máy
đo NANO-DROP ND-100 (bảng 2).

Bảng 2. Nồng độ DNA và RNA tổng số xác định bằng máy NANO-DROP ND-100
Nồng độ DNA tổng số
43 ng/l
54 ng/l
(Mẫu Ấn Độ)
(Mẫu Việt Nam)
Kết quả đo nồng độ DNA và RNA tổng số
được tách chiết từ mẫu lá hồ tiêu như trên bảng
2 đã cho thấy lượng nucleic-axits tổng số thu
được ở mức thấp thấp. Với qui trình tách chiết
RNA tổng số sử dụng Trizol của Viện BVTV (Tạ
Hoàng Anh và cs, 2009) luôn cho hàm lượng

cao, trên dưới 500 ng/l với mẫu lá lúa và trên
dưới 200 ng/l với cá thể rầy. Tuy nhiên, hàm
lượng DNA/RNA tổng số như trên bảng 2 cũng là
lượng thông thường khi thực hiện trên mẫu lá hồ
tiêu. Mặt khác, hàm lượng vi-rút trong cây hồ tiêu
luôn thấp đến rất thấp (Bhat et al., 2018) và do
đó kỹ thuật ELISA đã từng được thử nghiệm
trong chẩn đoán vi-rút PYMoV nhưng không hiệu
quả, tỷ lệ phát hiện rất thấp, nói cách khác độ
nhạy rất thấp (Bhadramuphy et al., 2005). Đây
cũng là lý do mà dung lượng RNA được sử dụng
trong mỗi phản ứng RT-PCR như đã nêu trong
mục 2.2 là 23 l, so với lượng thông thường khi
áp dụng với vi-rút lúa chỉ 2 - 3 l (Tạ Hoàng Anh
và cs, 2009). Tuy nhiên, phản ứng PCR có độ
nhạy rất cao nên với hàm lượng DNA tổng số
như trong bảng 2, mỗi phản ứng PCR chỉ cần 1
l (Xem mục 2.2).
3.2 Kết quả PCR giám định PYMoV
Kết quả chạy điện di trên gel-agarose 0,8%
trong dung dịch TBE đã ghi nhận cả 4 cặp mồi
PYMoV-1F/R, PYMoV-2F/R, PYMoV-3F/R và
PYMoV-4F/R đều cho kết quả dương tính với cả
mẫu lá hồ tiêu thu tại nhà lưới của Viện Nghiên
cứu Cây gia vị (IISR), Ấn Độ là cây đối chứng
dương và mẫu lá thu tại Bình Phước (Việt Nam)
với kích thước của sản phẩm PCR như thiết kế
(bảng 1), tương ứng là 379bp, 352bp, 539bp và
420bp (hình 1).

Nồng độ RNA tổng số
28 ng/l
32 ng/l
(Mẫu Ấn Độ)
(Mẫu Việt Nam)
M

A
B
H
A
B
H
------- Primer 1 -------- ------- Primer 2 --------(380 bp)
(352 bp)

A
B
H
A
B
H
------- Primer 3 ------- ------ Primer 4 --------(540 bp)
(420 bp)

500 bp

Hình 1. Kết quả giám định PYMoV bằng PCR
trên mẫu lá hồ tiêu thu tại nhà lƣới của IISR Ấn Độ (A: đối chứng cây bệnh; H: đối chứng
cây khỏe) và Việt Nam (mẫu B). M: 100bp

marker (Thermo Scientific); 380, 352, 540 và
420 là kích thƣớc mong đợi của các sản
phẩm PCR tƣơng ứng với các cặp mồi
(Primer-1 ~ 4) ở bảng 1
Kết quả PCR thu được như trên hình 1 với độ
đậm của các vạch DNA trên gel đã cho thấy độ
nhạy cao của kỹ thuật PCR. Mặt khác, việc sử
dụng cùng lúc cả 4 cặp mồi đặc hiệu gene như
trên cũng nâng cao tính đặc hiệu của phản ứng
PCR. Cả 4 cặp mồi này đều không cho phản ứng
dương tính giả trên mẫu đối chứng cây khỏe.
3.3 Kết quả one-tube RT-PCR giám định
PYMoV
Một đặc điểm chung của nhiều vi-rút thuộc
nhóm Budnavirus là hiện tượng “endogenous“
được hiểu là trong quá trình tái sinh trong cây
chủ, vi-rút đã “copy“ nhiều đoạn trình tự của cây
chủ để tái thiết bộ gene của mình. Các đoạn trình
tự này có thể nằm rải rác trong bộ gene của cây
chủ. Nói cách khác, một phần bộ gene của vi-rút
nằm trong trình tự gene của cây chủ. Điều này
đã gây khó khăn cho việc xác định các cặp mồi
đặc hiệu cho vi-rút trong quá trình chẩn đoán
bệnh. Thực tế tạo ra hiện tượng “dương tính giả“
trên mẫu cây khỏe.

61


BVTV - Sè 5/2018 Kết quả nghiên cứu khoa học

Để khắc phục hiện tượng này, cũng nhằm lựa
chọn các cặp mồi có tính đặc hiệu cho vi-rút
PYMoV. Cả 4 cặp mồi trên được sử dụng trong
phản ứng One-Step RT-PCR. Việc này dựa trên
nguyên lý bộ gene của vi-rút được hình thành từ
quá trình phiên mã ngược từ RNA sang cDNA và
do đó chỉ có mẫu nhi m vi-rút mới tạo ra sản
phẩm PCR như mong đợi.
M

A

H

A

H

---Primer-1--- ---Primer-4--(340 bp)

(420 bp)

A

H

A

H

---Primer-3--- ---Primer-2--(540 bp)

(352 bp)

500 bp

Hình 2. Kết quả giám định PYMoV bằng OneStep RT-PCR trên mẫu lá hồ tiêu thu tại Việt
Nam (B); H: đối chứng cây khỏe. M: 100bp
marker (Thermo Scientific); 380, 352, 540 và
420 là kích thƣớc mong đợi của các sản
phẩm PCR tƣơng ứng với các cặp mồi đã
sử dụng ở bảng 1
Từ kết quả thu được sau khi sử dụng 4 cặp
mồi để chẩn đoán PYMoV bằng kỹ thuật PCR
(hình 1) và One-Step RT-PCR (hình 2) đã cho
thấy cả 4 cặp mồi này đều cho sản phẩm sắc nét
với kích thước tương ứng với kích thước đã thiết
kế. Cả 4 cặp mồi này đều không cho phản ứng
“dương tính giả“ trên mẫu đối chứng cây khỏe,
cả ở phản ứng PCR và RT-PCR. Từ kết quả này,
đề xuất sử dụng cả 4 cặp mồi trên (bảng 1) trong
việc giám định PYMoV trên mẫu lá cây hồ tiêu
nhi m bệnh bằng kỹ thuật PCR hoặc RT-PCR.
Tuy nhiên, chi phí cho kỹ thuật PCR luôn rẻ tiền
hơn, độ nhạy cao hơn sẽ là sự lựa chọn hợp lý.
Trong nghiên cứu của Nguy n Xuân Dũng và
Dương Hoa Xô (2017), phản ứng PCR sử dụng
đối chứng âm là “nước cất” là không chính xác, sẽ
không kiểm chứng được khả năng dương tính giả
của các cặp mồi đã sử dụng bởi đặc tính

“endogenous” của PYMoV (Deeshma et al. 2017).
4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1 Kết luận
- Các qui trình tách chiết DNA tổng số và
RNA tổng số trên mẫu lá hồ tiêu đã đem lại chất
62

lượng DNA và RNA tốt, cho kết quả rõ nét ở các
phản ứng PCR và RT-PCR.
- Việc sử dụng đồng thời cả 4 cặp mồi
PYMoV-1F/R, PYMoV-2F/R, PYMoV-3F/R và
PYMoV-4F/R đã cho kết quả dương tính rõ nét
trên mẫu đối chứng dương thu tại Ấn Độ và mẫu
nhi m bệnh thu tại Bình Phước (Việt Nam)
nhưng âm tính trên mẫu đối chứng âm khi sử
dụng kỹ thuật PCR và One-Step RT-PCR.
4.2 Đề nghị
- Có thể sử dụng 4 cặp mồi nêu trong bảng
1 để giám định vi-rút gây bệnh khảm vàng trên
hồ tiêu (PYMoV).
- Cần giải trình tự hoàn chỉnh bộ gene
PYMoV của Việt Nam và phân tích các đặc điểm
phân tử căn bản cũng như so sánh mức độ đa
dạng với isolate của Ấn Độ và các nước khác đã
có trên GenBank. Từ đó, xác định các cặp mồi
mới đặc hiệu cho các isolate của Việt Nam.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Tạ Hoàng Anh, Ngô Vĩnh Vi n, Nguy n Tuấn
Anh, Nguy n Thu Huyền, Nguy n Văn Chung và
Nguy n Doãn Phương, 2009. Nghiên cứu ứng dụng kỹ

thuật one-step RT-PCR chẩn đoán nhanh vi-rút gây
bệnh vàng lùn và lùn xoắn lá hại lúa. Tạp chí Bảo vệ
thực vật, 5: 21-26.
2. Nguy n Xuân Dũng và Dương Hoa Xô, 2017.
Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán Piper yellow mottle
virus gây hại hồ tiêu (Piper nigrum L.) ở Việt Nam. Tạp
chí Khoa học Công nghệ Việt Nam, 6: 59-63.
3. Bhat, A. I., Devasahayam, S., Venugopal, M. N.
and Suseela Bhai, R., 2005. Distribution and incidence
of viral diseases of black pepper in Karnataka and
Kerala, India. J. Plantation Crops, 33: 59-64.
4. Bhat A. I., Devasahayam S., Sarma Y. R. and
Pant R. P. 2003. Association of a badnavirus in black
pepper (Piper nigrum L.) transmitted by mealybug
(Ferrisia virgata) in India. Current Science, 84(12):
1547-1550.
5. Bhat A.I. and Siju S. 2007. Development of a
single tube multiplex RT-PCR for the simultaneous
detection of Cucumber mosaic virus and Piper yellow
mottle virus associated with stunt disease of black
pepper. Current Science 93: 973-976.
6. Duarte M. L. R., Albuquerque F. C. and Chu E.
Y., 2001. New diseases affecting black pepper crop in
Brazil. Int. Pepper Bull., pp. 51–57.