THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT

Trường ĐH Công nghiệp Tp.HCM
Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm

THỰC HÀNH
CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT
GV biên soạn: Lê Trầm Nghĩa Thư

1
Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư


BÀI 1, 2 TẾ BÀO SINH DỤC CỦA ĐỘNG VẬT HỮU NHŨ

1. ĐẠI CƯƠNG
1.1 Hệ sinh dục đực
1.1.1 Cấu tạo
Tinh hoàn (testis): có cấu trúc dạng cặp được bọc trong một túi (bìu). Bên trong tinh
hoàn có nhiều ngăn, trong mỗi ngăn đều là tổ chức mô biệt hóa và sinh sản tinh trùng.
Mào tinh (epididymis): được nối với tinh hoàn, đây là các đường dẫn của tinh trùng.
Ống dẫn tinh (ductus deferens): nối với các ống mào tinh.
Túi tinh: nơi chứa tinh trùng và tiết dịch trộn với tinh trùng tạo tinh dịch. Túi tinh
còn là nơi tập kết tạm thời của tinh trùng trước khi ra ngoài.
Tuyến tiền liệt: sản xuất dịch (có trong thành phần của tinh dịch) được tiết vào túi
tinh.
Niệu đạo: nằm trong dương vật, tinh trùng phóng ra ngoài qua niệu đạo.
Dương vật: xuất tinh và bài xuất nước tiểu
1.1.2 Sinh lý tinh trùng
Cấu tạo tinh trùng gồm 3 phần: đầu, thân và đuôi.
Phần đầu: chứa thể đỉnh acrosome, đây là nơi giải phóng các enzyme giúp cho tinh
trùng xâm nhập trứng.
Phần thân: chứa ty thể, có liên quan đến các hoạt động chuyển hóa chất và năng

lượng.
Phần đuôi: có vai trò vận động, không tham gia vào quá trình thụ tinh.

2
Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư


Hình Cấu tạo tế bào tinh trùng
Số lượng tinh trùng: chiếm trung bình 5% thể tích tinh dịch (95% dịch tiết). Ở người,
trung bình có 3 ml tinh dịch cho một lần xuất tinh, số lượng tinh trùng trung bình từ 60
– 120 triệu tế bào/ml. Số lượng tinh dịch ở bò là 4-5 ml và lợn là 150-200 ml.
Tinh trùng vận động bằng cách của tự quẫy đuôi.
Sự sinh tinh xảy ra gần như suốt đời sống của cá thể đực, tuy nhiên số lượng và chất
lượng tế bào có thể thay đổi.
Điều kiện để quá trình thụ tinh xảy ra bình thường là:
-

Tinh trùng gặp trứng sau 12 giờ phóng vào ống dẫn trứng.

-

Số lượng tinh trùng phải đảm bảo trong 1 ml tinh dịch

-

Tỷ lệ % tinh trùng dị dạng không vượt quá 2 – 5%

-

Phần đầu tinh trùng có chứa đủ lượng enzyme hyaluronidase.

3
Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư


Hình Cấu tạo tinh hoàn và sự sinh tinh
1.2 Hệ sinh dục cái
1.2.1 Cấu tạo
- Buồng trứng: nơi chứa các nang trứng.
- Vòi tử cung (ống dẫn trứng): nơi trứng gặp tinh trùng và thụ tinh (ở 1/3 ống dẫn trứng).
- Tử cung: cơ quan để thai làm tổ và phát triển.
- Âm đạo: cơ quan giao hợp.
- Một số cơ quan phụ (thứ cấp) khác.
1.2.2 Sinh lý buồng trứng
Buồng trứng cấu tạo dạng cặp, gồm 2 phần vỏ và tủy. Phần vỏ chứa các tế bào trứng đã
phát triển, phần tủy có nhiều mạch máu và bạch huyết, một số tế bào phụ trợ khác.
Các trứng non nằm dưới màng liên kết (nang nguyên thủy).

4
Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư


Hình Buồng trứng và sự phát triển các giai đoạn của trứng
Ở người, khi sơ sinh có khoảng 3.104 - 3.105 nang trứng nguyên thủy. Khi trưởng thành
còn 400 – 500 nang.

Hình Thời điểm kích hoạt hormone cho tới khi rụng trứng

5
Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư

1.3 Đặc điểm cơ bản của các tế bào sinh dục
Một trong các đặc điểm của tế bào sinh dục trưởng thành ở sinh vật nói chung là bộ
nhiễm sắc thể đơn bội (n). Đây là kết quả của hai lần phân chia giảm nhiễm trước khi
thụ tinh.
Các tế bào sinh dục trưởng thành không thể hiện đầy đủ các cơ quan nội bào như các tế
bào soma. Kích thước các tế bào sinh dục trưởng thành thường lớn hơn các tế bào khác.
Trong một giai đoạn phát triển nhất định, chúng có thể không cần giá thể bám dính.
Điều này trong nuôi cấy in vitro thuận lợi hơn tế bào soma.
Trong quá trình phát triển luôn xuất hiện các cấu trúc đặc thù dành cho chức năng thụ
tinh (thể cực, màng thụ tinh…).
1.4 Sự thụ tinh ở động vật hữu nhũ
Tinh trùng được phóng vào âm đạo đi theo ống dẫn trứng. Lúc này trứng đã di chuyển
được khoảng 1/3 chiều dài ống dẫn trứng. Tinh trùng gặp trứng, sự thụ tinh diễn ra và
tạo hợp tử (2n).
Mỗi lần phóng tinh, số tinh trùng đi vào vòi trứng tới hàng trăm triệu, tuy nhiên chỉ còn
chừng vài ngàn tế bào vào được tới vị trí thụ tinh. Thế nhưng khi gặp trứng thì chỉ còn
vài trăm tinh trùng. Tiến hành thụ tinh thì chỉ có 1 tinh trùng.
Tinh trùng tiết enzyme hyaluronidase phá màng trong suốt của trứng, nhờ vậy phần đầu
tinh trùng chui được vào trứng. Lúc này, tinh trùng loại bỏ phần đuôi.
Trong lĩnh vực thụ tinh nhân tạo trên người và động vật, việc thu nhận được số lượng
lớn các tế bào sinh dục gồm tế bào trứng và tinh trùng là một yêu cầu thiết yếu. Các tế
bào sinh dục thu nhận được phải đảm bảo các yêu cầu về chất lượng nhằm đạt kết quả
tốt cho thụ tinh in vitro.

6
Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư

Trứng có thể thu nhận từ động vật được kích hoạt bằng kích dục tố gây sự rụng trứng
gồm có PMSG (Pregnant-Mare’s-Serum-Gonadotrophin) và hCG (Human Chorionic
Gonadotrophin) hoặc từ buồng trứng động vật giết mổ.
Trứng thu nhận từ các động vật được kích hoạt bằng kích dục tố là những trứng đã thành
thục (trứng chín), tức sẵn sàng cho sự thụ tinh nếu gặp tinh trùng. Người ta thu trứng
bằng phương pháp nội soi đối với những động vật lớn. Trong trường hợp thí nghiệm ở
chuột, không thể tiến hành nội soi, người ta có thể giết chuột để thu nhận trứng chín và
rụng từ các ống dẫn trứng.
Trứng thu nhận từ buồng trứng động vật giết mổ (heo, bò…) là các trứng chưa chín, do
đó cần đưa trứng vào môi trường nuôi chín. Trong môi trường này người ta cần bổ sung
các yếu tố dinh dưỡng và các loại hormone… để kích thích sự chín của trứng.
Sự chín của trứng có nghĩa là có sự thay đổi hình thái học, sinh hóa ở tế bào chất, nhân
tế bào và các bộ phận khác, sao cho các trứng này có khả năng thụ tinh và phát triển
thành phôi. Thời gian thành thục và chín của trứng non trong môi trường nhân tạo
thường từ 24-44 giờ, tùy theo loài.
Như vậy, thụ tinh nhân tạo có thể thực hiện được cần hai yếu tố quan trọng là thu nhận
được những tế bào trứng tốt có khả năng thụ tinh và những tinh trùng tốt, khỏe.
1.5 Các kỹ thuật cần thiết
Trong hai bài thực tập này, sinh viên thực hiện hai kỹ thuật: thu nhận tế bào trứng từ
buồng trứng heo và đánh giá một số chỉ tiêu sinh lý của tinh dịch heo.
Thu nhận tế bào trứng
Thu nhận tế bào trứng từ buồng trứng của con vật: có thể từ con vật còn sống (qua nội
soi hoặc giải phẩu) hoặc từ lò mổ (cắt buồng trứng từ động vật đã bị giết).
1.5.1 Kỹ thuật để lấy trứng
-

Thu nhận buồng trứng từ lò mổ
7

Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư

-

Mổ buồng trứng

-

Chọc nang trứng

-

Hút nang trứng

-

Cắt buồng trứng thành lát mỏng

Các trứng chưa được thụ tinh này thường không đồng nhất và khó phát triển thành trứng
chín, tỷ lệ thụ tinh của chúng rất thấp. Để có thể thu nhận được những tế bào trứng có
khả năng thụ tinh, người ta phải nuôi trứng vào môi trường thúc trứng chín có bổ sung
một số hormone.
1.5.2 Đánh giá phân loại trứng
Theo sự hiện diện hoặc độ dày, mỏng của tế bào hạt cumulus bao xung quanh trứng (tế
bào cumulus là các tế bào có nhiều hạt được hình thành sau khi trứng rụng vào ống
dẫn). Trong môi trường nuôi cấy, lớp tế bào này cũng được hình thành. Các tế bào
cumulus có nhiệm vụ chính là cung cấp chất dinh dưỡng cho trứng trong khi chưa được
thụ tinh. Khi gặp tinh trùng, lớp tế bào này bị bong ra. Trong thụ tinh in vitro, người ta
phải tìm cách gỡ bỏ lớp tế bào này nhưng không được gây tổn thương trứng).
Loại A: trứng có lớp tế bào cumulus bao kín xung quanh.

Loại B: trứng có lớp tế bào cumulus bao vây một phần.
Loại C: trứng không có lớp tế bào cumulus bao quanh.
Thường chỉ dùng trứng loại A để nuôi cấy và thụ tinh nhân tạo.

8
Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư


Hình Trứng loại A

Hình Trứng loại B

Hình Trứng loại C

Việc đánh giá, phân loại các trạng thái của trứng chỉ có tính ước lệ tương đối, tuy nhiên
trong thụ tinh in vitro, đây là tiêu chuẩn quan trọng nhất, đồng thời cũng dễ nhận biết
nhất.

Thu nhận và đánh giá chất lượng tinh dịch
Nội dung chủ yếu để đánh giá tinh dịch là:
Lấy tinh: ngày, tháng, năm, giờ lấy tinh; phương pháp lấy tinh; nhiệt độ không khí, quá
trình vận chuyển, bảo quản.
Đánh giá đại thể: lượng xuất tinh, màu sắc, mùi, độ keo dính, pH, tỷ lệ dị dạng … Thông
thường, người ta có chế độ dinh dưỡng đặc biệt cho con vật được chọn lấy tinh trước
đó vài ngày.
Đánh giá vi thể: nồng độ tinh trùng, tinh trùng dị hình, sức đề kháng của tinh trùng, tỷ
lệ tinh trùng sống, sức hoạt động của tinh trùng
Những đánh giá khác dùng trong nghiên cứu: tình trạng acrosome, áp suất thẩm thấu,
năng lực đệm, độ nhớt tỷ trọng, hệ số hô hấp, sức sống bền, sự chuyển động…
Giống di truyền, thể trạng con vật (thường có các bộ phận chuyên môn hóa việc đánh

giá tinh trùng cho công nghệ tạo giống vật nuôi).
Việc đánh giá tinh trùng cần tiến hành thật nhanh, chính xác và cẩn thận.
2

CHUẨN BỊ

2.2 Mẫu vật
Buồng trứng heo
Tinh dịch heo
2.3 Hóa chất
Dung dịch pha loãng tinh trùng
9
Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư


Thuốc nhuộm Eosin 1%, Nigrosine 10%
Nước cất
Alcol
2.4 Dụng cụ - thiết bị
Kính hiển vi
Kính soi nổi
Dao mổ
Becher
Lame và lamelle
Đĩa petri
Ống hút
Phòng đếm hồng cầu
Ống trộn bạch cầu
Kim 23 G
Pipet thủy tinh

3

TIẾN HÀNH

3.1 Thu nhận trứng từ buồng trứng
Buồng trứng được thu nhận từ lò mổ, đặt trong nước muối 0,9% ấm (25 – 300C), có bổ
sung kháng sinh. Chuyển nhanh về phòng thí nghiệm. Trứng chỉ sử dụng được trong
vòng từ 3 – 4 giờ sau đó.
Rửa buồng trứng nhiều lần bằng nước muối ấm đến khi sạch máu, sau đó để buồng
trứng vào nước muối sạch và giữ ở 380C trong điều kiện vô trùng đến khi sử dụng.
Sử dụng một buồng trứng, giữ buồng trứng phía trên becher có chứa dung dịch nước
muối sinh lý (khoảng 50 ml) và dùng dao mổ tạo những vết cắt dọc theo những nang
trứng cho đến khi thấy được dung dịch trong buồng trứng chảy vào becher.
10
Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư


Nhúng buồng trứng vào becher và khuấy mạnh nhiều lần cho trứng có thể rơi vào dung
dịch. Lấy buồng trứng ra khỏi becher.
Để trứng lắng trong 5 phút, dùng pipet hút bỏ dung dịch phía trên, chừa lại khoảng 20
ml. Cẩn thận ở bước này, nếu không sẽ mất nhiều trứng. Nếu khi hút dung dịch bị xáo
trộn, phải ngưng lại và đợi vài phút cho trứng lắng trở lại.
Lặp lại bước rửa 2 lần nữa, chừa lại khoảng 20 ml dung dịch ở đáy. Chuyển dung dịch
nước muối sinh lý có trứng vào đĩa petri.
Quan sát trứng dưới kính hiển vi, đánh giá phân loại trứng. Căn cứ vào vùng tế bào
cumulus để đánh giá chất lượng trứng.
(Chú ý: làm nhanh, chính xác và tránh để trứng quá lâu ngoài không khí).

Hình Các bước thu nhận trứng từ buồng trứng
3.2 Đánh giá tinh dịch

Trong phần thực tập này, sinh viên đánh giá các chỉ tiêu về tinh dịch động vật như: pH,
xác định mật độ tinh trùng bằng phòng đếm hồng cầu và xác định tỷ lệ tinh trùng sống
bằng nhuộm màu tinh trùng.
11
Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư


3.2.1 Mật độ tinh trùng (C) là số tinh trùng hiện diện trong 1 ml tinh dịch.
Thực hiện việc đếm tinh trùng heo bằng phương pháp đếm hồng cầu
Pha loãng tinh trùng trong ống trộn bạch cầu bằng dung dịch pha loãng tinh trùng.
Đếm số lượng tinh trùng trong 400 ô nhỏ (của 25 ô lớn) của phòng đếm. Trong phần
này, tinh dịch được pha loãng 20 lần bằng ống trộn bạch cầu. Công thức tính như sau:
C = 104 x D x N (tế bào/ml)
C: Mật độ tinh trùng trong tinh dịch
D: Độ pha loãng tinh dịch
N: Số tinh trùng đếm được
3.2.2 Xác định tỷ lệ tinh trùng sống
Có thể đánh giá tỷ lệ sống của tinh trùng bằng cách nhuộm tinh trùng (đang còn sống)
trong thuốc nhuộm. Khi nhuộm, nếu tinh trùng còn sống thì đầu tinh trùng không bắt
màu, ngược lại, nếu tinh trùng chết thì đầu tinh trùng bắt màu hồng.
Phương pháp nhuộm bằng thuốc nhuộm Eosin 0,5%: trộn một giọt tinh trùng tươi với
một giọt dung dịch Eosin 1% lên một phiến kính, phủ lamell lên, tiến hành kiểm tra sau
30 giây ở kính hiển vi (vật kính 40). Quan sát kết quả: Tinh trùng sống không nhuộm
màu. Tinh trùng chết nhuộm màu đỏ hồng.
Phương pháp nhuộm bằng hỗn hợp Eosin- Nigrosin: trộn 1 giọt tinh trùng với hai giọt
Eosin 1%. Sau 30 giây, thêm ba giọt Nigrosin 10% và trộn (30 giây). Đặt một giọt mẫu
lên một phiến kính và trải ra lớp mỏng. Để mẫu khô, kiểm tra dưới vật kính 10, 40.
Quan sát kết quả: tinh trùng sống có màu trắng, tinh trùng chết nhuộm màu đỏ.
Đặt mẫu lên kính hiển vi dưới vật kính 10, kiểm tra tổng số 100 tinh trùng trong đó tính
số lượng tinh trùng sống (không bắt màu) và suy ra tỷ lệ phần trăm. Nếu tinh trùng sống

đạt 80% trở lên, chứng tỏ tỏ tinh dịch tốt, sử dụng đạt hiệu quả cao.

12
Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư


Hình Cách kéo tiêu bản

Hình Tinh trùng chết bắt màu thuốc nhuộm
4 YÊU CẦU
Thu nhận được trứng từ buồng trứng, phân loại trứng A, B, C.
Xác định mật độ tinh trùng
Xác định được phần trăm tinh trùng sống, dị hình từ tiêu bản nhuộm.
Xác định được pH tinh dịch

13
Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư


BÀI 3
TẠO PHÔI ĐỘNG VẬT HỮU NHŨ IN VITRO

I. MỤC ĐÍCH
Thực hiện các phương pháp nhằm tạo phôi động vật hữu nhũ: bò, heo trong điều
kiện in vitro.
II. CƠ SỞ LÝ THUYẾT
Ở động vật hữu nhũ, sự thụ tinh là quá trình kết hợp giữa tinh trùng
(spermatozoa) ở con đực và tế bào trứng (oocyte) ở con cái trong cơ thể con cái (1/3
ống dẫn trứng) để tạo nên hợp tử (zygote), hợp tử phát triển thành phôi (embryo) và phôi
phát triển thành cá thể mới. Quá trình này bao gồm hàng loạt biến đổi sinh lý, sinh hóa

phức tạp ở tinh trùng và trứng trước và sau khi chúng kết hợp với nhau.
Thụ tinh trong ống nghiệm (In vitro fertilization – IVF) là quá trình kết hợp giữa
tinh trùng và trứng để tạo thành hợp tử được thực hiện bên ngoài cơ thể mẹ, tại phòng
thí nghiệm. Tuy xảy ra ở ngoài cơ thể nhưng các điều kiện cho quá trình IVF như môi

14
Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư


trường, nhiệt độ, độ ẩm, độ nhớt…cùng các chỉ số sinh học khác phải giống như trong
cơ thể mẹ.
Các bước tạo phôi động vật hữu nhũ.
Chuẩn bị giao tử cái
Thu nhận buồng trứng và có thể tiến hành các phương pháp sau
+ Phương pháp chọc hút: dùng kim 18 G và syringe 5 ml chọc vào nang trứng và hút
ra.
+ Phương pháp rạch múc: dùng dao phẫu thuật rạch nang trứng rồi múc trứng ra
+ Phương pháp nghiền nát: buồng trứng được cắt nhỏ và lọc lấy tế bào trứng.
Sau khi thu nhận, phân loại và chọn những trứng A, B đem nuôi trưởng thành.
Chuẩn bị giao tử đực
+ Phương pháp swim-up: nguyên tắc của phương pháp này là những tinh trùng di động
tốt sẽ tự bơi lên trên, thoát ra khỏi lớp tinh dịch phía dưới.
+ Phương pháp ly tâm theo thang nồng độ trong dung dịch Percoll: nguyên tắc của
phương pháp này là sau khi ly tâm trong dung dịch Percoll, những thành phần khác
nhau trong tinh dịch sẽ phân tách thành những lớp khác nhau và lớp tinh trùng di động
tốt sẽ được nằm ở lớp cuối cùng của đáy ống nghiệm.
Các phương pháp tạo phôi in vitro
-Phương pháp IVF: thụ tinh trong ống nghiệm, theo đó trứng và tinh trùng sẽ được đặt
chung với nhau trong vi giọt môi trường, và tinh trùng sẽ tự xâm nhập vào trứng.
-Phương pháp vi tiêm: tinh trùng được tiêm trực tiếp vào trong bào tương của trứng.

III. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
1. Vật liệu
1.1. Mẫu vật
- Buồng trứng heo
15
Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư


- Mẫu tinh heo tươi
1.2. Dụng cụ
- Kéo, kẹp
- Kim tiêm 18G và syringe
- Đĩa petri nhựa 60 mm
- Pipette Pasteur
- Dây chuyền nước biển
- Đầu tip xanh, đầu tip vàng
1.3. Hóa chất
- Dung dịch muối sinh lý
- Dầu khoáng
2. Phương pháp
2.1. Phương pháp tạo vi giọt: với 100 µl/1 vi giọt (tinh trùng) trong đĩa 35mm.

Tạo 4 vi giọt trên đĩa

Phủ dầu khoáng

(40µl/giọt)

Bổ sung 60 µl ở mỗi giọt

Vi giọt 100µl/vi giọt

16
Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư


2.2. Phương pháp kéo pipette Pasteur

Bước 1

Bước 2

Bước 3

Pipette Pasteur được dùng để chuyển trứng, chuyển phôi, phá cumulus. Kéo pipette
Pasteur trên ngọn lửa đèn cồn sao cho đầu pipette bằng và đường kính đầu kim phù hợp
với mục đích sử dụng theo các bước:
Bước 1: Đưa pipette lên ngọn đèn cồn
Bước 2: Đưa pipette ra ngoài đèn cồn và kéo

Bước 3: Bẻ đầu pipette bằng kẹp
2.3. Phương pháp chọc hút buồng trứng
Sử dụng syringe 5 ml với đầu kim 18 G hút khoảng 1 ml dung dịch thu trứng.
Sau đó, chọc kim tiêm vào các nang trứng có đường kính từ 2 đến 10 mm và hút lấy
dịch nang trứng. Khi thu được khoảng 3 ml dịch nang trứng, chuyển dịch nang vào đĩa.
Tiếp tục thực hiện cho đến khi thu hết dịch nang trứng của buồng trứng.
17
Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư

Chọc nang

Chuyển dịch nang vào

trứng

đĩa

2.4. Phương pháp swim-up tinh trùng.

Chuyển 1 ml tinh dịch vào ống ly tâm. Nhẹ nhàng bổ sung 3 ml môi trường vào bên
trên ống. Để nghiêng 45oC ở nhiệt độ 37OC trong 30 phút, thu nhận nhẹ nhàng 1 ml dịch
bên trên.

Hình Thu nhận tinh trùng bằng phương pháp swim up
2.5. Phương pháp chuyển tinh trùng vào trứng (phương pháp thụ tinh).
Dùng pipette mouth có gắng pipette pastuer hút cụm trứng đã trưởng thành,
nhanh chóng chuyển sang vi giọt tinh trùng đã chuẩn bị sẵn. Các thao tác được thực
hiện dưới kính hiển vi đảo ngược.

18
Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư


Chú thích hình
1: KHV đảo ngược
1

2: pipette mouth
3: pipette Pastuer

2

4: Đĩa chứa giao tử
3
4
IV. YÊU CẦU
1.

Kéo pipette Pasteur với kích thước phù hợp và tạo được vi giọt

2.

Thu nhận và nhận diện, phân loại được trứng

3.

Thu nhận và nhận diện được tinh trùng

4.

Trình bày được quy trình thụ tinh trong ống nghiệm

5.

Thực hiện được thao tác chuyển trứng, tinh trùng vào vi giọt.

6.

Thực hiện được thao tác chuyển trứng từ vi giọt chứa trứng vào vi giọt chứa tinh

trùng.

BÀI 4
TÁCH TẾ BÀO TỪ MÔ ĐỘNG VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP TRYPSIN

1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT
Nuôi cấy sơ cấp (primaty culture) là giai đoạn nuôi cấy đầu tiên với những tế bào vừa
được tách ra từ mô hay cơ quan.
Các tế bào thu được trong lần nuôi sơ cấp này được gọi là tế bào sơ cấp (primary cell).
Các tế bào sơ cấp thường không thuần nhất vì là hậu duệ của nhiều tế bào ban đầu khác
nhau.
19
Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư


Để thực hiện quá trình nuôi cấy sơ cấp tế bào động vật, bước đầu là tách chúng thành
các tế bào riêng rẽ từ những mảnh mô và cho chúng bám vào giá thể phù hợp.
Việc tách tế bào có thể thực hiện bằng biện pháp cơ học hay bằng enzyme để tạo thành
một dịch huyền phù tế bào. Hầu hết các loại tế bào động vật bình thường (trừ tế bào
máu) đều cần bám vào một giá thể để sống và phát triển với hiệu quả cao nhất, tuy
nhiên, những tế bào ung thư có thể phát triển ở trạng thái lơ lửng trong môi trường.
Có nhiều loại enzyme được sử dụng để tách tế bào như collagenase, elastase,
hyaluronidase, pronase… nhưng trypsin được dùng phổ biến nhất vì hiệu quả tách tế
bào cao và giá rẻ.
Trypsin có thể tách hoàn toàn tế bào từ mô bằng cách thủy phân các protein liên kết các
tế bào với nhau. Tuy nhiên trypsin cũng có thể làm tổn thương màng tế bào trong quá
trình tách, do đó cần phải xác điịnh nồng độ enzyme và thời gian tách tối ưu.
Các nhà khoa học thường mong muốn có thể tiến hành nghiên cứu một chức năng nhất
định của một mô hay một tế bào trong một hệ thống đơn giản. Để thực hiện điều này,
người ta tìm cách tách tế bào ra khỏi mô nội quan của cơ thể và tiến hành nuôi cấy

chúng trong điều kiện nhân tạo. Đây là kỹ thuật cơ bản trong nuôi cấy tế bào động vật.
Bằng kỹ thuật tách tế bào động vật, chúng ta có thể làm chủ được những dòng tế bào
tạm thời hay liên tục, từ đó có những ứng dụng quan trọng về sau.
Tế bào sơ cấp là các tế bào được tách ra lần đâu tiên và chưa hề qua nuôi cấy. Các tế
bào này có thể tạo lớp đơn. Người ta có thể dùng các tế bào lớp đơn để thực hiện các
test vi sinh vật và miễn dịch. Mỗi lớp đơn của các tế bào sơ cấp thường rất nhiều chủng
loại, có thể tìm kiếm được các tế bào mầm trong lớp đơn khi phân lập và đem cấy
chuyền nhiều lần.
Việc tách tế bào theo phương pháp sử dụng enzyme cho phép có thể thu được một lượng
lớn tế bào đơn trong một thời gian ngắn. Nhờ đó, việc nuôi cấy sơ cấp có nhiều thuận
20
Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư


lợi và tiết kiệm được thời gian do có sự tăng cường khả năng tiếp xúc giữa các tế bào
với môi trường.
Tuy nhiên, điều kiện quan trọng cần chú ý là phải làm giảm đến mức thấp nhất sự tiếp
xúc giữa tế bào với trypsin hoạt động, nhằm giữ cho tỷ lệ sống của tế bào càng cao càng
tốt. Do đó trong quá trình tách tế bào bằng trypsin ở 36,50C thì các tế bào đơn cần được
thu mỗi 30 phút. Trypsin được loại ra bằng cách ly tâm hoặc ức chế hoạt tính trypsin
khi cho huyết thanh vào môi trường. Quy trình tách tế bào bằng cách ngâm mô trong
trypsin ở 40C, 6-18 giờ sẽ cho phép trypsin thấm vào khối mô với hoạt tính trypsin thấp
nhất và quá trình phân giải có thể tiến hành tiếp theo đó với thời gian ngắn hơn nhiều
(20-30 phút), ở 370C.
Mặc dù phương pháp sử dụng trypsin lạnh cho phép thu được nhiều tế bào sống và tế
bào cũng ít bị ảnh hưởng của trypsin hơn, nhưng phương pháp sử dụng trypsin ấm vẫn
được sử dụng một cách rộng rãi do ít tốn thời gian và ít phức tạp hơn.

21
Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư

2. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, DỤNG CỤ
2.1 Vật liệu
Gan heo
2.2 Hóa chất
Dung dịch PBS (Phosphate buffer salin)
Dung dịch trypsin 1%
2.3 Dụng cụ và thiết bị
Erlen 50 ml
Pipetman 100 – 1000 µl
Pipetman 10 – 100 µl
22
Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư


Đầu tip 100 – 1000 µl
Kéo nhỏ
Đĩa petri
Becher 250 ml
Pipette 1 ml, 2 ml, 5 ml
Bóp cao su
Buồng đếm tế bào
Máy vortex
Máy sấy
Máy lắc
Lamelle
3. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM
Cân 3 mẫu mô gan, mỗi mẫu 5 g. Rửa mẫu trong đĩa petri vô trùng bằng dung dịch PBS
3 lần, hút bỏ dịch rửa.

Cho 3 mẫu gan vào erlen, cắt nhuyễn mô gan bằng kéo.
Cho vào mỗi erlen đánh số 1,2, 3
Erlen 1: 18 ml PBS + 2 ml trypsin 1%
Erlen 2: 15 ml PBS + 5 ml trypsin 1%
Erlen 3: 12 ml PBS + 8 ml trypsin 1%
Như vây, ta được 3 dung dịch trypsin có nồng độ 0,1, 0,25, 0,4% tương ứng với erlen
1, 2, 3.
Lắc các erlen mẫu trên máy lắc.
Sau 15, 30, 45 phút, lấy mẫu ở mỗi erlen và xác định mật độ tế bào gan trong dung dịch
bằng buồng đếm.

23
Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư


Hình Tế bào động vật trong phòng đếm
4. NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý
- Thời gian phải chính xác trong suốt quá trình lắc và đếm mật độ tế bào
- Rửa sạch máu để tránh đếm nhầm tế bào máu trong buồng đếm
5. YÊU CẦU
-Nhận diện được tế bào gan
- Tính được mật độ tế bào gan trong buồng đếm hồng cầu
- Xác định được nồng độ trypsin và thời gian tối ưu để tách tế bào gan từ mô theo quy
trình trypsin ấm và lạnh.

24
Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư


BÀI 5

THU NHẬN VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐƠN
TỪ TỦY XƯƠNG CHUỘT NHẮT TRẮNG

I. MỤC ĐÍCH
Tiếp cận với kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật.
Xây dựng được quy trình thu nhận tế bào đơn từ tủy xương.
II. CƠ SỞ LÍ THUYẾT
Trong tủy xương có chứa rất nhiều loại tế bào quan trọng cho cơ thể như các loại tế bào
máu, tế bào tạo máu, tế bào gốc trung mô...Thu nhận tế bào đơn từ tủy xương nhằm
mục đích chuẩn bị nguồn nguyên liệu để nuôi cấy tế bào mong muốn sau này.
III. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
1. Vật liệu
1.1. Mẫu vật
Chuột nhắt trắng: chuột trưởng thành hay chưa trưởng thành, khỏe mạnh.
1.2. Dụng cụ
- Kéo
- Kẹp
- Kim tiêm 1 CC
- Khay inox
- Bông gòn
- Găng tay
- Becher 50 ml
- Ống li tâm 15 ml
25
Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư