Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư đầu cổ của virus vaccine sởi phối hợp với Nimotuzumab trên thực nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

NGÔ THU HẰNG

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ
ĐẦU CỔ CỦA VIRUS VACCINE SỞI PHỐI HỢP
VỚI NIMOTUZUMAB TRÊN THỰC NGHIỆM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2020


\

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

NGÔ THU HẰNG

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ
ĐẦU CỔ CỦA VIRUS VACCINE SỞI PHỐI HỢP
VỚI NIMOTUZUMAB TRÊN THỰC NGHIỆM
Chuyên ngành: Khoa học y sinh

Mã số: 9720101

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: GS. TS. NGUYỄN LĨNH TOÀN
PGS. TS. HỒ ANH SƠN

HÀ NỘI– 2020


LỜI CẢM ƠN
Sau thời gian học tập tại Học viện Quân Y, được sự giúp đỡ của Nhà
trường và các Phòng, Ban, Bộ môn của Học viện, đến nay tôi đã hoàn thành
chương trình học tập.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Đảng ủy - Ban Giám đốc, Phòng
Sau đại học, Bộ môn Sinh lý bệnh - Học viện Quân Y và Đảng ủy, Ban Giám
hiệu Trường Cao đẳng Y tế Hà Đông đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi
thực hiện và hoàn thành luận án.
Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến Giáo sư, Tiến sỹ
Nguyễn Lĩnh Toàn, Phó Giáo sư, Tiến sỹ Hồ Anh Sơn, người Thầy kính mến
đã hết lòng giúp đỡ, chỉ dạy, động viên, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện
thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Phó Giáo sư, Tiến sỹ Cấn Văn Mão –
chủ nhiệm Bộ môn, các thầy giáo cùng toàn thể cán bộ nhân viên Bộ môn
Sinh lý bệnh, Học viên Quân Y đã luôn giúp đỡ, hướng dẫn và tạo mọi điều
kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu để tôi hoàn thành
luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các Giáo sư, Phó Giáo sư, Tiến sỹ, các Nhà
khoa học trong Hội đồng chấm luận văn đã dành thời gian để cho tôi những ý
kiến quý báu trong quá trình hoàn thiện và bảo vệ luận án.

Tôi vô cùng biết ơn sự chăm sóc, động viên của Gia đình, Cha Mẹ,
Chồng và hai con thân yêu của tôi, luôn luôn bên cạnh chia sẻ với tôi mọi
điều trong cuộc sống. Tôi trân trọng cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ và tình cảm
quí báu của bạn bè, đồng nghiệp đã dành cho tôi.
Hà Nội, ngày .... tháng .... năm 2020

Ngô Thu Hằng


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi với sự hướng
dẫn khoa học của tập thể cán bộ hướng dẫn.
Các kết quả nêu trong luận án là trung thực và được công bố một phần
trong các bài báo khoa học. Luận án chưa từng được công bố. Nếu có điều gì
sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Hà Nội, ngày

tháng

Tác giả luận án

Ngô Thu Hằng

năm 2020


MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Mục lục

Danh mục chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
LỜI CẢM ƠN...................................................................................................i
Phospholipase C.............................................................................................xi
DANH MỤC CÁC BẢNG...........................................................................xiii
DANH MỤC HÌNH......................................................................................xiv
ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................1
CHƯƠNG 1:....................................................................................................3
TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................3
1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ UNG THƯ ĐẦU CỔ..............................................
1.1.1. Khái niệm ung thư đầu cổ.................................................................3
1.1.2. Tỷ lệ mắc ung thư đầu cổ.................................................................4
1.2. CÁC YẾU TỐ NGUY CƠ LIÊN QUAN ĐẾN UNG THƯ ĐẦU
CỔ...........................................................................................................
1.2.1. Khói thuốc lá và ung thư..................................................................4
1.2.2. Rượu liên quan đến ung thư..............................................................5
1.2.3. HPV và ung thư biểu mô tế bào vảy họng miệng...............................7
1.2.4. EBV và ung thư biểu mô họng mũi...................................................9
1.3. CƠ CHẾ BỆNH PHÂN TỬ CỦA UNG THƯ BIỂU MÔ TẾ
BÀO VẢY ĐẦU VÀ CỔ.......................................................................
1.3.1. Đột biến gen liên quan đến sự tăng sinh tế bào.................................10
1.3.1.1. Đột biến gen P53.....................................................................10
1.3.1.2. Đột biến gen mã hóa Retinoblastoma......................................11
1.3.1.3. Đột biến gen mã hóa CDKN2A...............................................12


1.3.1.4. Đột biến gen CCND1...............................................................12
1.3.2. Đột biến gen Notch/p63..................................................................13
1.3.3.1. Vai trò của thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì.........................13

Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (Epidermal growth factor receptor EGFR) là thành viên của họ thụ thể ErbB (Erythroblastic B), bao gồm
4 thành viên: EGFR (ErbB-1), HER2/neu (ErbB-2), HER3 (ErbB-3) và
HER4 (ErbB-4). Protein EGFR gồm 1210 acid amin có trọng lượng
phân tử 170 kiloDaltons (kDa), có cấu trúc gồm 3 vùng: vùng ngoại
bào chứa miền tương tác với yếu tố tăng trưởng, vùng xuyên màng và
vùng nội bào chứa miền kinase có thể phosphoryl hóa tyrosine của
protein (nên được gọi là thụ thể tyrosine kinase).................................13
1.3.3.2. Vai trò của RAS........................................................................16
1.3.3.3. Vai trò của PIK3CA/PTEN......................................................17
1.3.4. Vai trò của tín hiệu TGF-β/SMAD đối với sự kết dính và xâm lấn....18
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ĐẦU CỔ...............
1.4.1. Các phương pháp điều trị kinh điển..............................................
1.4.2. Các liệu pháp điều trị đích trong ung thư tế bào vảy vùng đầu và cổ. 19
1.4.2.1. Liệu pháp hướng đích thụ thể yếu tố phát triển biểu bì...........20
1.4.2.2. Liệu pháp chất ức chế tyrosine kinase.....................................22
1.4.2.3. Liệu pháp hướng đích thụ thể tăng sinh biểu mô mạch máu...22
Thụ thể tăng sinh biểu mô mạch máu (VEGF) là protein tín hiệu được
tạo ra bởi các tế bào mà có vai trò kích thích tăng sinh mạch . Sự thiếu
oxy mô là một yếu tố mà tạo ra biểu hiện quá mức VEGF. Vấn đề này
xảy ra ở vùng hoại tử và thiếu oxy của tổ chức khối u. Do đó, biểu hiện
quá mức VEGF xuất hiện phổ biến ở HNSCC, sự tăng biểu hiện VEGF
sẽ kích thích tăng trưởng khối u bằng cách thay đổi mật độ vi mạch
trong vùng lân cận của các tế bào, sự di cư tế bào và sự hình thành di
căn xa của tế bào ung thư . Có một bằng chứng ngày càng rõ là giảm
sự nhạy cảm với bức xạ và sự tiến triển của HNSCC có liên quan đến
sự kích thích sự hình thành mạch máu bởi các tế bào khối u đã trải qua
xạ trị .....................................................................................................22
1.4.2.4. Liệu pháp hướng đích con đường tín hiệu PI3K/AKT/mTOR. 23
1.4.2.5. Liệu pháp hướng đích thụ thể chết tế bào theo chương trình..23
1.5. KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG NIMOTUZUMAB TRONG LIỆU

PHÁP ĐIỀU TRỊ ĐÍCH UNG THƯ ĐẦU CỔ.................................


1.5.1. Khái niệm kháng thể đơn dòng.......................................................24
1.5.2. Cơ chế tác dụng của Nimotuzumab trong điều trị ung thư đầu cổ.....24
1.6. VIRUS VACCINE SỞI TRONG LIỆU PHÁP VIRUS LY GIẢI
TẾ BÀO UNG THƯ............................................................................
1.6.1. Virus sởi........................................................................................27
1.6.1.1. Virus sởi hoang dại..................................................................27
1.6.1.2. Chủng virus vaccine sởi giảm độc lực.....................................29
1.6.2. Thụ thể của virus sởi......................................................................30
1.6.3. Hiệu lực vaccine sởi giảm độc lực và tính an toàn............................31
1.6.4. Virus vaccine sởi và các phản ứng miễn dịch chống ung thư.............32
1.6.4.1. Tế bào ung thư đầu cổ có các thụ cảm thể đặc hiệu với virus
vaccine sởi............................................................................................32
1.6.4.2. MeV ly giải tế bào ung thư thông qua protease đặc hiệu........32
1.6.4.3. Sự khiếm khuyết trong phản ứng Interferon............................33
1.6.5. Các cơ chế gây ly giải tế bào ung thư..............................................33
1.6.5.1. MeV trực tiếp giết chết tế bào u qua hình thành hợp bào.......33
1.6.5.2. Ly giải tế bào u qua trung gian kích thích miễn dịch đặc hiệu
kháng u.................................................................................................34
1.6.5.3. Nhiễm MeV kích hoạt tế bào đuôi gai.....................................34
1.6.5.4. Ảnh hưởng của MeV đối với các loại tế bào miễn dịch khác. .35
1.6.6. Các thử nghiệm lâm sàng...............................................................36
1.7. SỬ DỤNG PHỐI HỢP VIRUS VACCINE SỞI VÀ KHÁNG
THỂ ĐƠN DÒNG NIMOTUZUMAB TRONG ĐIỀU TRỊ UNG
THƯ......................................................................................................
CHƯƠNG 2:..................................................................................................39
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................39
2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU.................................

2.1.1. Động vật........................................................................................39
2.1.2. Vaccine sởi....................................................................................39
2.1.3. Các dòng tế bào.............................................................................39
2.1.4. Kháng thể đơn dòng Nimotuzumab................................................40


2.1.5. Trang thiết bị sử dụng cho nghiên cứu.............................................40
2.1.5.1. Thiết bị sử dụng.......................................................................40
2.1.5.2. Các dụng cụ thí nghiệm tiêu hao.............................................40
2.1.5.3. Hóa chất..................................................................................40
Môi trường nuôi cấy tế bào Vero M199, môi trường nuôi cấy tế bào
ung thư EMEM mã No.30-2004 được cung cấp bởi công ty ATCC được
bổ sung thêm 10% huyết thanh bê (FBS - fetal bovine serum) và kháng
sinh (100 U/ml penicillin và 100 µg/ml streptomycin).........................40
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....................................................
2.2.1. Đánh giá khả năng ức chế tế bào và chết theo chương trình của virus
vaccine sởi phối hợp Nimotuzumab trên dòng tế bào ung thư đầu cổ
người Hep2...................................................................................41
2.2.1.1. Các chỉ tiêu đánh giá...............................................................41
2.2.1.2. Các kỹ thuật thực hiện.............................................................42
2.2.2. Đánh giá tác dụng kháng ung thư của MeV phối hợp Nimotuzumab
trên mô hình chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối u đầu cổ người
Hep2............................................................................................58
2.2.2.1. Chỉ tiêu đánh giá.....................................................................58
2.2.2.2. Các kỹ thuật thực hiện.............................................................58
2.3. THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU........................................
2.4. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH KẾT QUẢ, XỬ LÝ SỐ LIỆU......
2.5. ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU TRÊN ĐỘNG VẬT..............................
2.6. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU......................................................................
CHƯƠNG 3:..................................................................................................67

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU...........................................................................67
3.1. TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ CỦA VIRUS VACCINE SỞI
PHỐI HỢP VỚI NIMOTUZUMAB IN VITRO..............................
3.1.1. Tăng sinh virus vaccine và các dòng tế bào......................................67
3.1.1.1. Tăng sinh các dòng tế bào.......................................................67
Quan sát bằng kính hiển vi thường: Sau 24 giờ, các tế bào bám dính và
phân bố tương đối đều trên bề mặt đĩa nuôi cấy. Tốc độ tăng sinh gấp
đôi của dòng tế bào Hep2 khoảng 24 giờ, tế bào phát triển tốt và đạt


khoảng 80-90% bề mặt nuôi cấy sau 6-7 ngày nuôi cấy tế bào (hình
3.1)........................................................................................................68
3.1.1.2. Tăng sinh virus vaccine...........................................................68
3.1.2. Chuẩn độ virus CCID50.................................................................69
3.1.3. Tế bào Hep2 điều trị bằng virus tạo hợp bào in vitro........................70
3.1.4. Kết quả đánh giá khả năng ức chế tế bào bằng thử nghiệm MTT......71
3.1.4.1. Kết quả ức chế tế bào ở các nhóm nghiên cứu........................71
3.1.5. Đánh giá tỷ lệ tế bào chết theo chương trình (chết apoptosis)............76
3.1.5.1. Hình thái tế bào chết apoptosis dưới kính hiển vi thường.......76
3.1.5.2. Đánh giá tế bào chết apoptosis và hoại tử bằng phương pháp
flow cytometry.......................................................................................78
3.2. KẾT QUẢ TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ CỦA VIRUS
VACCINE SỞI VÀ NIMOTUZUMAB TRÊN MÔ HÌNH
CHUỘT THIẾU HỤT MIỄN DỊCH MANG KHỐI UNG THƯ
ĐẦU CỔ NGƯỜI................................................................................
3.2.1. Kết quả tạo khối u tế bào Hep2 trên chuột nude...............................96
3.2.2. Kết quả tác dụng kháng ung thư của MeV và Nimotuzumab............97
3.2.2.1. Tình trạng toàn thân chuột trong quá trình thí nghiệm...........97
Sau khi ghép tế bào Hep2, chuột vẫn ăn uống, tăng cân, vận động bình
thường, nhanh nhẹn, đáp ứng với kích thích bình thường, hậu môn khô,

không thấy biểu hiện đi lỏng. Tại chỗ tiêm da chuột bình thường, không
chảy máu, không nhiễm trùng (bảng 3.6).............................................97
3.2.2.2. Diễn biến trọng lượng cơ thể ở chuột nghiên cứu...................98
3.2.2.3. Kết quả thể tích trung bình khối u ở các chuột nghiên cứu.....99
3.2.2.4. Kết quả thời gian sống, tỉ lệ chết của chuột nude sau thời gian
điều trị bằng MeV và Nimotuzumab...................................................104
3.2.2.5. Tỷ lệ sống tích lũy của chuột thí nghiệm giữa nhóm chứng và
các nhóm điều trị................................................................................106
3.2.3. Kết quả đánh giá tế bào chết theo chương trình bằng phương pháp
Flow cytometry trên tế bào tách ra từ mô ung thư.........................109
3.2.4. Hình ảnh mô bệnh học khối ung thư đầu cổ người Hep 2 trên chuột
thiếu hụt miễn dịch ghép dị loài....................................................110


3.2.5. Đánh giá siêu cấu trúc tế bào ung thư đầu cổ người Hep2 sau điều trị
bằng MeV phối hợp với Nimotuzumab dưới kính hiển vi điện tử
truyền qua...................................................................................111
CHƯƠNG 4:................................................................................................114
BÀN LUẬN..................................................................................................114
4.1. LỰA CHỌN KẾT HỢP VIRUS VACCINE SỞI VÀ KHÁNG
THỂ.....................................................................................................114
4.2. TÁC DỤNG LY GIẢI TẾ BÀO HEP2 IN VITRO CỦA MEV VÀ
NIMOTUZUMAB.............................................................................118
4.2.1. Xác định nồng độ virus bằng phương pháp chuẩn độ CCID50
.............................................................................................................118
4.2.3. Đánh giá khả năng ức chế tế bào bằng thử nghiệm MTT................123
4.2.4.1. Hình thái tế bào chết apoptosis dưới kính hiển vi thường.....127
4.2.4.2. Đánh giá tỉ lệ tế bào chết apoptosis và hoạt tử bằng phương
pháp flow cytometry............................................................................130
4.2.5. MeV và Nimotuzumab có tác dụng ức chế quá trình tăng sinh tế bào in

vitro thông qua kích hoạt STAT3, ISG15......................................133
4.3. HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ CỦA MEV KẾT HỢP
NIMOTUZUMAB TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT THIẾU HỤT
MIỄN DỊCH MANG KHỐI UNG THƯ BIỂU MÔ VẢY ĐẦU
CỔ.......................................................................................................136
4.3.1. Tỷ lệ tạo khối ung thư trên chuột nude bằng kỹ thuật ghép dị
loại.......................................................................................................136
4.3.2. MeV kết hợp Nimotuzumab không gây độc toàn thân cho chuột nude
mang khối u đầu cổ.....................................................................139
4.3.3. MeV và Nimotuzumab có tác dụng hạn chế sự phát triển khối ung thư
biểu mô vảy đầu cổ.....................................................................140
4.3.4. Kết hợp MeV và Nimotuzumab có tác dụng kéo dài thời gian sống của
chuột mang khối ung thư biểu mô vảy đầu cổ...............................143


4.3.5. Kết quả phân tích siêu cấu trúc tế bào Hep2 trên chuột nude được điều
trị bằng MeV kết hợp với Nimotuzumab......................................145
4.4. HẠN CHẾ CỦA ĐỀ TÀI.................................................................147
KẾT LUẬN..................................................................................................149
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN.................................................................................1
TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................2


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
TT
1
2
3
4

5

Phần viết tắt
ADN
ARN
AKT
CCID50

Phần viết đầy đủ
Deoxyribonucleic Acid
Ribosomal ribonucleic acid
Protein Kinase B
50% cell culture infectious dose (liều chết 50% tế

CD

bào nuôi cấy)
Cluster of Differentiation (hệ thống phân tử xác định
biệt hóa tế bào)
Cyclin-dependent kinase (Kinase phụ thuộc Cyclin)
Cyclin-dependent kinase Inhibitor 2A
Cytopathic effect (hiệu ứng tế bào bệnh lý)
Computed Tomography (chụp cắt lớp vi tính)
Damage-associated molecular patterns
Dendritic cells (tế bào tua)
Epstein Barr virus
Epstein–Barr nuclear antigen 1
Food and Drug Administration (cục quản lý thực

6

7
8
9
10
11
12
13

CDK
CDKN2A
CPE
CT
DAMPs
DC
EBV
EBNA1

14

FDA

15

EGF

phẩm và dược phẩm)
Epidermail growth factor (Yếu tố tăng trưởng biểu

EGFR

mô)
Epidermail growth factor receptor (Thụ thể yếu tố

16

22
23
24
25

tăng trưởng biểu mô)
EMEM
Eagle's Minimum Essential Medium
ErbB
Erythroblastic B
ERT
Extracellular signal-regulated kinase
EBERs
Epstein–Barr virus-encoded small RNAs
FITC
Fluorescein isothiocyanate
Phần viết tắt
Phần viết đầy đủ
Foxn1
Forkhead box protein N1
Hep2
Human epithelial týp 2
HPV
Human Papillomavirus
HNSCC

Head and neck squamous-cell carcinoma (ung thư

26

IARC

biểu mô tế bào vảy vùng đầu cổ)
International Agency for Research on Cancer (Cơ

IFN
IL

quan nghiên cứu ung thư thế giới)
Interferon
Interleukin

17
18
19
20
21
TT

27
28


29
30
31

32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43

INK4a
INHANCE
ISG15
JAK
mTOR
LMP1
MDM2

Inhibitors of cyclin-dependent kinase 4a
International Head and Neck Cancer Epidermiology
Interferon-stimulated gene 15
The Janus kinase
Mammalian target of rapamycin
Latent membrane protein 1
Mouse double minute 2 homolog (E3 ubiquitin-

MeV

MHC
MOI
MTT

protein ligase Mdm2)
Measles virus (Virus sởi)
The major histocompatibility complex
Multiplicity of infection
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

MV-wt
OD
OLV
OPSCC

Diphenyltetrazolium Bromide
Measles virus wild-týp (virus sởi hoang dại)
Optical density (mật độ quang)
Oncolytic virus (virus ly giải tế bào)
Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma (Ung thư
biểu mô tế bào vảy họng miệng)

TT
44
45
46
47
48
49
50

51
52
53
54
55
56
57
58

Phần viết tắt
PAMPs
PCR
PD1
PET

Phần viết đầy đủ
Pathogen-associated molecular pattern molecules
Polymerase Chain Reaction
Programmed cell death-1
Positron Emission Tomography (Chụp cắt lớp bằng

PBS
PFU
PI3K
PLC
PTEN
PVRL-4
Rb
RNP
RT-PCR

SCC

phóng xạ)
Phosphate-buffered saline
Plaque forming units
Phosphatidylinositol 3-kinase
Phospholipase C
Phosphatase and tensin homolog
Poliovirus receptor-related protein 4
Retinoblastoma1
Ribonucleoprotein
Real time - Polymerase chain reaction
Squamous cell carcinoma (Ung thư biểu mô tế bào

STAT

vảy)
Signal Transducer and Activator of Transcription
(chất truyền tín hiệu và hoạt hóa phiên mã)


59
60
61
62
63
64

TLR
TNFR

UTĐC
VEGF

Toll Like Receptor
Tumor necrosis factor receptor
Ung thư đầu cổ
Vascular endothelial growth factor (yếu tố tăng

VEGFR
WHO

trưởng nội mô mạch máu)
Vascular endothelial growth factor receptor
World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Tran

Bảng

Tên bảng

1.1.
1.2.

Các liệu pháp điều trị đích trong điều trị ung thư biểu mô vảy đầu cổ
Các thử nghiệm sử dụng virus vaccine sởi trong điều trị ung thư

g

20
37

3.1.
3.2.
3.3.
3.4.
3.5.
3.6.
3.7.
3.8.
3.9.
3.10.
3.11.
3.12.
3.13.
3.14.
3.15.
3.16.
3.17.

trên lâm sàng
So sánh sự phiên mã STAT3 ở các nhóm điều trị thời điểm 48 giờ
So sánh sự phiên mã STAT3 ở các nhóm điều trị thời điểm 72 giờ
So sánh sự phiên mã ISG15 ở các nhóm điều trị thời điểm 48 giờ
So sánh sự phiên mã ISG15 ở các nhóm điều trị thời điểm 72 giờ
Kết quả tạo khối u tế bào Hep2 trên đùi chuột nude
Kết quả theo dõi sức khỏe chuột trong quá trình điều trị
So sánh khối lượng trung bình chuột trước điều trị (g)
So sánh thể tích trung bình khối u chuột ngày đầu điều trị

So sánh thể tích trung bình khối u chuột sau 2 tuần điều trị
So sánh thể tích trung bình khối u chuột sau 4 tuần điều trị
So sánh thể tích trung bình khối u chuột sau 6 tuần điều trị
So sánh thể tích trung bình khối u chuột sau 8 tuần điều trị
Thời gian sống sót trung bình của các nhóm chuột điều trị
Tỷ lệ sống tích lũy của chuột ở nhóm chứng
Tỷ lệ sống tích lũy của chuột ở nhóm MeV
Tỷ lệ sống tích lũy của chuột ở nhóm Nimotuzumab
Tỷ lệ sống tích lũy của chuột ở điều trị kết hợp MeV và

91
92
93
94
95
97
98
99
101
101
102
103
104
106
107
107
108

Nimotuzumab

DANH MỤC HÌNH
Hìn

Tên hình

Tran

h
1.1.
1.2.

Giải phẫu vùng mũi họng
Sơ đồ tổng quan về tác dụng của rượu và thuốc lá trên sự tiến triển

g
3
6

1.3.

của ung thư đầu cổ
Sơ đồ tổng quan sự tiến triển ung thư dưới tác dụng của HPV và

8

1.4.
1.5.

EBV trong ung thư biểu mô đầu cổ

Mối liên quan giữa ung thư biểu mô đầu cổ và các gen
Vai trò của Rb và E2F trong việc thúc đẩy tế bào chuyển từ pha G1

10
11

1.6.
1.7.
1.8.
2.1.
2.2.
2.3.

sang pha S
Những con đường tín hiệu và ức chế của EGFR
Cơ chế tác dụng của nimotuzumab
Chu trình nhân lên của virus sởi
Sơ đồ nhiễm virus để chuẩn độ CCID50
Máy phân tích tế bào qua dòng chảy BD FACSLyric
Sơ đồ điều trị bằng MeV và Nimotuzumab đánh giá tế bào chết

15
26
28
46
50
51

2.4.
3.1.

3.2.
3.3.

apootosis và hoại tử
Hệ thống chuồng nuôi chuột lưu thông khí độc lập
Tế bào Hep2 bám đáy và phát triển
Tế bào Vero nhiễm virus vaccine sởi (vật kính 10)
Kết quả nhuộm xanh methylen chuẩn độ CCID50 cho MeV ở các

58
66
67
68

3.4.
3.5.

giếng của phiến 96 giếng
Hình ảnh tế bào Hep2 nhiễm virus tạo hợp bào
Hình ảnh tế bào ở các giếng điều trị bằng MeV của thử nghiệm

69
70

3.6.

MTT thời điểm 72 giờ
Kết quả ức chế tế bào ở các nhóm nghiên cứu bằng thử nghiệm

71

MTT sau điều trị bằng MeV 72 giờ
Hìn

Tên hình

Tran

h
3.7.

Hình ảnh tế bào ở các giếng điều trị bằng MeV của thử nghiệm

g
72

3.8.

MTT thời điểm 96 giờ
Kết quả ức chế tế bào ở các nhóm nghiên cứu bằng thử nghiệm

73

MTT sau điều trị bằng MeV 96 giờ


3.9.

Tỷ lệ tế bào sống ở các thời điểm điều trị bằng virus ở nhóm MeV

74

và nhóm phối hợp MeV và Nimotuzumab
3.10. Tỷ lệ tế bào sống ở các thời điểm nghiên cứu của nhóm điều trị

75

bằng Nimotuzumab
3.11. Sự biến đổi hình thái tế bào Hep2 ở nhóm chứng và các nhóm điều

76

trị bằng virus theo thời gian
3.12. Tỉ lệ tế bào chết ở các nhóm nghiên cứu
3.13. Tỉ lệ tế bào apoptosis, tế bào hoại tử ở thời điểm 48 giờ sau điều trị

77
78

bằng MeV và Nimotuzumab
3.14. Kết quả chạy flow cytometry tế bào Hep2 ở thời điểm 48 giờ

79

sau điều trị bằng MeV và Nimotuzumab
3.15. Kết quả chạy flow cytometry tế bào Hep2 ở các thời điểm

80

sau điều trị MeV và Nimotuzumab liều 2 MOI

3.16. Tỉ lệ tế bào chết apoptosis, chết hoại tử ở thời điểm 72 giờ sau điều

81

trị bằng MeV và Nimotuzumab
3.17. Tỉ lệ tế bào apoptosis, tế bào hoại tử ở thời điểm 96 giờ sau điều trị

83

bằng MeV và Nimotuzumab
3.18. Kết quả chạy flow cytometry tế bào Hep2 ở thời điểm 96 giờ

85

sau điều trị bằng MeV và Nimotuzumab
3.19. Tỉ lệ tế bào chết theo thời gian điều trị bằng MeV và Nimotuzumab
3.20. So sánh tỉ lệ tế bào apoptosis theo thời gian điều trị bằng MeV và

86
87

Nimotuzumab
Hìn

Tên hình

Tran

h
3.21. So sánh tỉ lệ tế bào apoptosis sớm theo thời gian điều trị bằng MeV

g
88

và Nimotuzumab
3.22. So sánh tỉ lệ tế bào apoptosis muộn theo thời gian điều trị bằng

89

MeV và Nimotuzumab
3.23. So sánh tỉ lệ tế bào chết hoại tử theo thời gian điều trị bằng MeV và

90

Nimotuzumab
3.24. So sánh sự phiên mã của STAT3 theo thời gian điều trị bằng MeV

92

và Nimotuzumab
3.25. So sánh sự phiên mã của ISG15 theo thời gian điều trị bằng MeV

94


3.26.
3.27.
3.28.
3.29.
3.30.

3.31.
3.32.
3.33.
3.34.

và Nimotuzumab
Kết quả ghép u dưới da đùi chuột của chuột C2
Trọng lượng cơ thể chuột nghiên cứu (g)
Kết quả thể tích khối u ở các nhóm chuột trong quá trình điều trị
Thể tích trung bình khối u ở các thời điểm (mm3)
Kết quả thời gian sống trung bình các nhóm chuột
Kết quả tỉ lệ chuột chết ở các nhóm nghiên cứu
Tỷ lệ apoptosis tế bào Hep2 tách từ mô khối u các nhóm chuột
Hình ảnh mô bệnh học khối u tế bào Hep2 trên chuột nude
Hình ảnh siêu cấu trúc bình thường tế bào u Hep2 của nhóm chứng

(chuột C3)
3.35. Hình ảnh siêu cấu trúc tế bào u Hep2 sau điều trị bằng MeV kết
hợp với Nimotuzumab (mẫu KH4, KH5)

96
98
99
100
105
106
109
110
111
112

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh ung thư là một vấn đề sức khỏe lớn, ngày càng được quan tâm
nhiều hơn ở tất cả các nước trên thế giới. Ung thư đang là nguyên nhân gây tử
vong đứng hàng thứ 2 sau các bệnh lý tim mạch, chiếm khoảng ¼ tổng số các
nguyên nhân gây tử vong. Nhìn chung, xu hướng mắc bệnh ung thư trên thế
giới ngày càng gia tăng về cả số trường hợp mới mắc và số ca tử vong. Theo số
liệu thống kê của chương trình GLOBOCAN, năm 2012 trên thế giới có
khoảng 14,1 triệu ca ung thư mới mắc và 8,2 triệu ca tử vong ; năm 2018, số
ca ung thư đã tăng mạnh trên toàn thế giới với 18,1 triệu trường hợp ung thư
mới và 9,6 triệu ca tử vong do ung thư .
Ung thư đầu cổ (UTĐC) là khối u ác tính phát triển trong khu vực này
của cơ thể, bao gồm: xoang mũi, xoang cạnh mũi, vòm mũi họng, thanh quản,
hạ họng, khoang miệng và hầu họng. 90% ung thư đầu cổ có mô bệnh học là
ung thư biểu mô tế bào vảy . Trên thế giới, UTĐC đứng hàng thứ 7 và chiếm
khoảng 4,8% tổng số các ca ung thư mới chẩn đoán. Ở Việt Nam hàng năm có
khoảng 7,8% bệnh nhân được chẩn đoán là UTĐC trong tổng số các bệnh
nhân ung thư . Hiện nay, điều trị ung thư đầu cổ vẫn dựa trên ba phương pháp
cổ điển như phẫu thuật, tia xạ, hoá trị liệu, dù các phương pháp này đã mang
lại nhiều kết quả nhưng tỷ lệ sống sót thêm 5 năm thấp hơn nhiều so với các
ung thư khác. Hóa chất, xạ trị cũng gây nhiều tác dụng phụ làm ảnh hưởng tới
chất lượng cuộc sống của bệnh nhân.
Trị liệu ung thư bằng virus đã có lịch sử gần 100 năm. Tuy nhiên, thời
kỳ trị liệu bằng virus ly giải tế bào ung thư (Oncolytic virus, OLV) được mở
ra bắt đầu từ những năm đầu thập kỷ 90 của thế kỷ 20, đến nay một vài OLV
đã được thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I-III . Trị liệu bằng OLV dựa trên cơ
chế do các OLV có khả năng xâm nhập và nhân lên đặc hiệu trong các tế bào

ung thư của khối u. OLV nhân lên và thoát ra khỏi tế bào đồng thời gây ly giải


2
tế bào ung thư. Các OLV được giải phóng tiếp tục lây nhiễm vào các tế bào
ung thư khác, tạo ra một làn sóng tấn công của OLV vào các tế bào khối u.
Bên cạnh đó, khi OLV xâm nhập vào các tế bào ung thư cũng kích thích các tế
bào ung thư chết theo chương trình. Đồng thời, quá trình này sẽ kích thích đáp
ứng miễn dịch chống ung thư , .
Sử dụng kháng thể đơn dòng là phương pháp điều trị đích đã được các
nhà khoa học trên thế giới tích cực nghiên cứu với nhiều sản phẩm đã được sử
dụng trên lâm sàng, trong đó Nimotuzumab là kháng thể đơn dòng hướng
đích là thụ thể tăng trưởng biểu bì (EGFR) đang được quan tâm nghiên cứu.
Cơ chế điều trị ung thư của Nimotuzumab là chống tăng sinh mạch, kìm hãm
tăng sinh tế bào, cảm ứng tế bào chết theo chương trình (apoptosis), làm tế
bào tăng nhạy cảm với xạ trị và hóa trị liệu .
Một số thử nghiệm kết hợp Oncolytic virus với liệu pháp miễn dịch
điều trị ung thư đã được tiến hành và có kết quả khả quan , . Tuy nhiên, chưa
có bất kỳ nghiên cứu nào trong và ngoài nước đánh giá hiệu quả kháng ung
thư của virus vaccine sởi phối hợp với Nimotuzumab.
Chính vì vậy, nghiên cứu sử dụng virus vaccine sởi phối hợp với kháng
thể đơn dòng Nimotuzumab được mong đợi như một phương pháp có tiềm
năng cho điều trị một số loại ung thư nguồn gốc tế bào biểu mô biểu lộ
EGFR, trong đó có UTĐC. Từ những cơ sở lý luận và thực tiễn trên. Chúng
tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư đầu cổ của virus
vaccine sởi phối hợp với Nimotuzumab trên thực nghiệm” nhằm 2 mục tiêu:
1. Đánh giá tác dụng kháng ung thư của virus vaccine sởi phối hợp với
Nimotuzumab in vitro.
2. Đánh giá tác dụng kháng ung thư của virus vaccine sởi phối hợp với
Nimotuzumab trên mô hình chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung

thư đầu cổ (in vivo).


3

CHƯƠNG 1:
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ UNG THƯ ĐẦU CỔ
1.1.1. Khái niệm ung thư đầu cổ
Ung thư đầu cổ (UTĐC) là những khối u ác tính phát sinh trong vùng
đầu cổ như: ung thư khoang miệng, mũi, xoang cạnh mũi, lưỡi, họng, tuyến
nước bọt và thanh quản (hình 1.1).
Vị trí giải phẫu của vùng đầu - cổ là ngã tư của đường tiêu hóa và hô
hấp do vậy vùng này thường xuyên tiếp xúc với nhiều loại mầm bệnh khác
nhau. Khoảng 90% ung thư đầu cổ là ung thư biểu mô tế bào vảy có nguồn
gốc từ tế bào biểu mô khoang miệng, họng và thanh quản, với tỉ lệ mắc bệnh
ở nam cao hơn ở nữ . Vị trí giải phẫu và nguồn gốc của ung thư biểu mô tế
bào vảy ở đầu cổ có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán, bệnh sinh, sự di căn,
điều trị và tiên lượng bệnh. Điều đó là do sự khác biệt trong nội tại sinh học
của các tế bào niêm mạc, ái tính với các loại virus gây ung thư và sự phân bố
các mạch bạch huyết.

Hình 1.1. Giải phẫu vùng mũi họng
Nguồn: Terese Winslow LLC (2012) www.teresewinslow.com


4
Tỉ lệ mắc UTĐC ngày càng gia tăng ở Việt Nam và trên một số khu vực
thế giới. Đây là một bệnh ác tính có tiên lượng xấu, nguy hiểm và có nhiều
biến chứng lớn, triệu chứng bệnh không rõ ràng, là một gánh nặng cho bệnh

nhân và toàn xã hội đặc biệt là ở những nước đang phát triển như Việt Nam.
1.1.2. Tỷ lệ mắc ung thư đầu cổ
UTĐC là một trong số những loại ung thư phổ biến trên thế giới với
ước tính khoảng 686.328 trường hợp mắc năm 2012, bao gồm 300.373 trường
hợp ung thư ở môi và khoang miệng, 156.877 ở thanh quản, 142.387 ở họng
và 86.691 ung thư ở họng mũi . Tỉ lệ mắc của từng loại ung thư ở vùng đầu cổ
khác nhau tùy thuộc vào vùng địa lý, dân cư và các mức độ tiếp xúc với các
yếu tố nguy cơ.
Theo Globocan 2018, số ca ung thư mắc mới ở Việt Nam là 164.671
trường hợp, số ca tử vong vì ung thư là 114.871. Trong đó, ung thư vòm họng
xếp hàng thứ 6 trong các ung thư thường gặp ở cả hai giới với 6.212 ca mắc
mới chiếm tỷ lệ 4,06%, 4.232 ca tử vong chiếm tỷ lệ 3,92% (ở nam giới xếp
hàng thứ 5 trong các ung thư thường gặp với 4.559 ca mắc mới chiếm tỷ lệ
5%); ung thư thanh quản có 1.685 ca mắc mới và 859 ca tử vong chiếm tỷ lệ
1,1% và 0,8%; ung thư môi và khoang miệng có 1.877 ca mắc mới và 922 ca
tử vong chiếm tỷ lệ 1,23% và 0,85%; ung thư họng có 2.900 ca mắc mới và
1.682 ca tử vong chiếm tỷ lệ 1,9% và 1,56% .
1.2. CÁC YẾU TỐ NGUY CƠ LIÊN QUAN ĐẾN UNG THƯ ĐẦU CỔ
Các yếu tố nguy cơ chính liên quan đến UTĐC bao gồm sử dụng thuốc
lá, uống rượu, nhiễm Human Papillomavirus (HPV - đối với ung thư họng
miệng), nhiễm virus Epstein Barr (EBV- đối với ung thư vòm họng).
1.2.1. Khói thuốc lá và ung thư
Khói thuốc lá chứa một hỗn hợp của khoảng 5.000 hóa chất khác nhau
và trong đó có chứa ít nhất 60 chất là các hydrocarbon thơm đa vòng, Nnitrosamines và Aszerenes . Những chất này đã được chứng minh là có tính


5
kháng nguyên, gây độc tế bào, gây đột biến, làm thay đổi hệ thống miễn dịch
và gây ung thư (hình 1.2) .
Hydrocarbon thơm đa vòng và nitrosamines có nguồn gốc từ thuốc lá

cụ thể như 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)1-butanone được tạo ra trong
quá trình đốt thuốc lá và chủ yếu hiện diện trong giai đoạn hạt. Khi vào cơ
thể, những chất này tạo ra những ADN adducts (là một đoạn ADN liên kết
hóa học với chất gây ung thư), chủ yếu là 6-methyl-guanine, tác động vào
ADN trong giai đoạn nhân đôi và gây tổn hại những tế bào đang phân chia,
bao gồm cả những tế bào trong hệ thống miễn dịch . Các chất từ khói thuốc
gây tăng sản xuất những yếu tố chống lại quá trình chết theo chương trình và
hoạt hóa các yếu tố phiên mã NF-κB, có chức năng liên quan với quá trình tự
miễn và ung thư .
Ngoài ra, khói thuốc còn gây ra các phản ứng tạo gốc oxy hóa (ROSreactive oxygen species) gây kích hoạt biểu hiện các gen tiền viêm như
interleukin-8 và TNF-α và gây ra viêm mạn tính , . Tế bào biểu mô bị tổn
thương và thay đổi hệ thống miễn dịch liên quan đến khói thuốc lá tạo điều
kiện thuận lợi cho sự lây nhiễm bởi một loạt các mầm bệnh vi khuẩn, virus
bao gồm cả HPV. Tất cả những yếu tố trên góp phần làm giảm chức năng
kháng khuẩn và xu hướng dễ bị nhiễm trùng mạn tính ở những người hút
thuốc lá .
1.2.2. Rượu liên quan đến ung thư
Nghiện rượu nặng là một yếu tố nguy cơ có liên quan đến các khối u
đường tiêu hóa và hô hấp trên. Rượu và các chất chuyển hóa của nó, đặc biệt
là acetaldehyde, có một số các tác dụng lên những tế bào tiếp xúc bao gồm
cảm ứng cytochrome P4502E1 (CYP2E1), hình thành các phản ứng oxy hóa,
gây mất kiểm soát chu trình nhân lên của tế bào (hình 1.2) .


6
Acetaldehyde là chất chuyển hóa đầu tiên của ethanol đã được chứng
minh là một chất độc, gây đột biến và gây ung thư. Acetaldehyde tác động
vào quá trình tổng hợp và sửa chữa ADN do ức chế enzyme O6-methylguanyl-transferase, gây đột biến điểm trong locus HGPRT (hypyxanthineguanin-phosphoribosyl transferase) trong tế bào lympho của người, gây viêm
và dị sản ở tế bào biểu mô khí quản. Ngoài ra, acetaldehyde đã được chứng
minh là có thể gắn với các protein và ADN của tế bào gây ra sự thay đổi hình

thái và chức năng của tế bào cũng như các phản ứng miễn dịch . Nghiện rượu
dẫn đến sự biến đổi phức tạp trên cả hai phản ứng miễn dịch bẩm sinh và mắc
phải. Bằng chứng thực nghiệm đã chỉ ra rằng khi sử dụng rượu quá nhiều gây
ra sự suy giảm tế bào lympho và các tế bào giết tự nhiên .

Hình 1.2. Sơ đồ tổng quan về tác dụng của rượu và thuốc lá trên sự tiến triển
của ung thư đầu cổ
* Nguồn: Theo Pezzuto F. và cộng sự (2015)


7
Theo một phân tích được thực hiện bởi INHANCE (International Head
and Neck Cancer Epidermiology) trên 11.221 trường hợp UTĐC và 16.168
người khỏe mạnh làm nhóm chứng, cho thấy 72% các ca UTĐC liên quan đến
hút thuốc lá và uống rượu, trong số này có 4% do rượu, 33% do hút
thuốc, và 35% kết hợp cả thuốc lá và rượu. Quan trọng hơn, quan sát còn
thấy rằng: (1) nguy cơ ung thư do kết hợp cả rượu và thuốc lá là khác nhau
tùy thuộc vào vị trí giải phẫu, trong đó 89% ở thanh quản, 72% ở họng miệng
và 64% ở khoang miệng; (2) có sự khác nhau về giới trong đó tỉ lệ thấp hơn ở
nữ (57%) so với nam giới (74%); (3) và cũng có sự khác nhau về tuổi tỉ lệ
thấp hơn ở những đối tượng trẻ (33%) so với những đối tượng già (73%) .
Ngoài ra, đối tượng sử dụng cả rượu và thuốc lá có tỉ lệ bị ung thư đầu
cổ khác nhau theo khu vực địa lý, chiếm tỉ lệ cao ở Châu Mỹ Latin (83%) và
Châu Âu (84%) và thấp hơn ở Hoa Kỳ (51%) . INHANCE cũng đánh giá ảnh
hưởng của hút thuốc lá trên những đối tượng không bao giờ hoặc đã từng
uống rượu, cũng như ảnh hưởng của uống rượu trên những đối tượng không
bao giờ hoặc đã từng hút thuốc, kết quả cho thấy hút thuốc lá là yếu tố nguy
cơ gây ra UTĐC mạnh hơn là uống rượu .
1.2.3. HPV và ung thư biểu mô tế bào vảy họng miệng
Một nghiên cứu đánh giá về sự hiện diện của HPV ở các khối ung thư

đầu cổ người cho thấy: ung thư tế bào vảy ở lưỡi (18%), amidal (29%) và hầu
họng (13%) có sự hiện diện của HPV, đặc biệt là HPV-16 . Khi có các tổn
thương tại niêm mạc làm bộc lộ lớp tế bào sừng (keratinocytes) của lớp màng
cơ bản, HPV sẽ bám dính vào các tế bào này để xâm nhiễm vào biểu mô
niêm mạc . Sự biểu hiện gen của virus trong tế bào chủ được giới hạn trong
đoạn đầu các gen E5, E6 và E7, có tác dụng làm suy yếu sự kiểm soát chu kỳ
nhân lên của tế bào bị nhiễm HPV (hình 1.3) . Tại khu vực đầu cổ, nhiễm
HPV dai dẳng chủ yếu xảy ra ở các tế bào biểu mô của vòm miệng và amidan,
tương tự như những gì xảy ra ở cổ tử cung, sự tích hợp ADN của HPV vào bộ