Luận văn sư phạm Nghiên cứu một số yếu tố môi trường ảnh hưởng tới khả năng sinh Cellulase từ một số chủng nấm mốc được phân lập ở Vĩnh Phúc

TR

NG

IH CS

PH M HÀ N I 2

KHOA SINH- KTNN
_______***_______

V NG C MAI

NGHIÊN C U M T S Y U T
TR

NG NH H

CELLULASE T

MÔI

NG T I KH N NG SINH
M T S CH NG N M M C

C PHÂN L P

V NH PHÚC

KHÓA LU N T T NGHI P
Chuyên ngành: Vi sinh v t h c

Ng

ih
TS. Ph

HÀ N I - 2010

ng d n khoa h c
ng Phú Công


L IC M

N

Em xin g i l i c m n sâu s c t i gi ng viên - TS. Ph
h

ng Phú Công đã

ng d n, ch b o t n tình, giúp đ , t o đi u ki n đ em th c hi n và hoàn

thành t t lu n v n này.
Em c ng xin g i l i c m n chân thành t i các th y cô trong b môn Vi
sinh v t.
ng th i em xin c m n Ban giám hi u tr

ng

HSP Hà N i 2, khoa

Sinh – KTNN, phòng thí nghi m vi sinh, th vi n đã t o đi u ki n giúp đ đ
em hoàn thành t t lu n v n t t nghi p.
Ngoài ra, em xin c m n s giúp đ , đ ng viên c a b n bè, gia đình trong
su t quá trình làm đ tài.
Em xin chân thành c m n!
Hà N i, ngày

tháng

Sinh viên

n m 2010


L I CAM

OAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên c u c a riêng tôi. Các k t qu
nghiên c u, s li u đ

c trình bày trong khóa lu n là hoàn toàn trung th c và

không trùng v i k t qu c a tác gi khác.
Hà N i, ngày

tháng
Tác gi

n m 2010


M CL C
L i c m n.
L i cam đoan.
Danh m c t vi t t t.
Danh m c hình trong lu n v n.
Danh m c b ng bi u trong lu n v n.
M đ u
CH

NG 1: T NG QUAN TÀI LI U

1.1 Cellulose………………………………………………………………

..3

1.2 H th ng cellulase……………………………………………………… .7
1.3 C ch phân gi i cellulose………………………………………………. .8
1.4

ng d ng c a cellulase………………………………………………….. .11

1.5 Các nhóm vi sinh v t phân gi i cellulose ……………………………….. 15
1.5.1 N m s i ………………………………………………………………. 15
1.5.2 Vi khu n……………………………………………………………… .16
nh h

1.6 M t s y u t

ng đ n sinh t ng h p cellulase c a vi sinh v t…

17

1.6.1 Gi ng vi sinh v t………………………………………………………. 17
1.6.2 Ngu n dinh d

ng ……………………………………………………..18

1.6.3 i u ki n nuôi c y……………………………………………………... 19
CH

NG 2: NGUYÊN LI U VÀ PH

NG PHÁP NGHIÊN C U

2.1 Nguyên li u và vi sinh v t……………………………………………….. 21
2.1.1 Nguyên li u…………………………………………………………
2.1.2 Môi tr

.21

ng……………………………………………………………. .21

2.1.2.1 Môi tr

ng b o qu n và gi gi ng…………………………………. 21

2.1.2.2 Môi tr

ng nuôi c y………………………………………………… 22

2.1.2.3 Môi tr

ng th ho t tính enzyme…………………………………… 22

2.1.3 Hóa ch t- thi t b ……………………………………………………… 23
2.1.3.1 Hóa ch t…………………………………………………………….. 23
2.1.3.2 Thi t b ………………………………………………………………. 23
2.2 Ph

ng pháp nghiên c u……………………………………………….. 23


2.2.1 Ph

ng pháp vi sinh………………………………………………….. 23

2.2.2 Ph

ng pháp hóa sinh………………………………………………… 24

2.2.2.1 Xác đ nh ho t tính enzyme b ng ph

ng pháp c y ch m đi m ……..24

2.2.2.2 Xác đ nh ho t tính enzyme b ng ph
tr

ng pháp khu ch tán trên môi

ng th ch (William, 1983)…………………………………………………24

2.2.2.3 Nghiên c u nh h

ng c a y u t môi tr

ng đ n ho t tính

c a cellulase………………………………………………………………….. 25
CH

NG 3: K T QU VÀ BI N LU N

3.1 Tuy n ch n các ch ng n m m c có ho t tính phân gi i cellulose
3.2 nh h

……..26

ng c a m t s đi u ki n nuôi c y đ n kh n ng sinh cellulase c a

ch ng M3 và M6-1…………………………………………………………. 30
3.2.1 nh h

ng c a pH đ n kh n ng sinh cellulase……………………… 30

3.2.2 nh h

ng c a nhi t đ đ n kh n ng sinh cellulase………………..

3.2.3 nh h

ng c a th i gian nuôi c y đ n kh n ng sinh cellulase……… 33

3.2.4 nh h

ng c a ngu n nit đ n kh n ng sinh cellulase……………… 34

3.2.5 nh h

ng c a ngu n cellulose t nhiên……………………………… 35

32

K T LU N VÀ KI N NGH …………………………………………….44
TÀI LI U THAM KH O


DANH M C B NG BI U TRONG LU N V N

B ng 1.1 Các thành ph n chính c a ligno – cellulose và các enzyme phân gi i
c a n m………………………………………………………………………. .4
B ng 1.2 Hàm l

ng cellulose trong m t s nguyên li u……………………..7

B ng 3.1 Các ch ng vi sinh v t có kh n ng phân gi i cellulose(D-d, cm)..28
B ng 3.2 nh h

ng c a pH đ n ho t tính cellulase………………………….31

B ng 3.3 nh h

ng c a nhi t đ đ n ho t tính cellulase…………………….34

B ng 3.4 nh h

ng c a th i gian nuôi c y đ n kh n ng sinh cellulase…….36

B ng 3.5 nh h

ng c a ngu n nit đ n kh n ng sinh cellulase…………....38

B ng 3.6 nh h

ng c a ngu n cellulose t nhiên…………………………...41


DANH M C HÌNH TRONG LU N V N
Hình 1.1 C u trúc l p th c a phân t cellulose……………………………………..5
Hình 1.2 C u trúc c a cellulose……………………………………………………...6
Hình 1.3 S đ quá trình th y phân cellulose theo Erickson, 1973………………..10
Hình 3.1 Kh n ng sinh cellulase c a các ch ng đ

c nghiên c u………………...29

Hình 3.2

nh h

ng c a pH đ n kh n ng sinh cellulase…………………………..32

Hình 3.3

nh h

ng c a nhi t đ đ n ho t tính cellulase…………………………..34

Hình 3.4 Kh n ng sinh cellulase c a ch ng Penicilium M3 và AspergillusM5-3
25 0C…………………………………………………………………………………...34
Hình 3.5 Kh n ng sinh cellulase c a ch ng Penicilium M3 và Aspergillus M5-3
30 0C…………………………………………………………………………………..35
Hình 3.6

nh h

ng c a th i gian đ n ho t tính cellulase………………………….36

Hình 3.7

nh h

ng c a ngu n nit đ n kh n ng sinh cellulase…………………..38

Hình 3.8 Kh

n ng sinh cellulase c a ch ng Penicilium M3 trên ngu n nit

là

(NH4 )2SO4 và NaNO3………………………………………………………………....39
Hình 3.9 Kh n ng sinh cellulase c a ch ng AspergillusM5-3 trên ngu n nit

là

(NH4 )2SO4 và NaNO3…………………………………………………………………39
Hình 3.10 Kh n ng sinh cellulase c a ch ng A. niger M6-1 trên ngu n nit

là

(NH4 )2SO4 và NaNO3………………………………………………………………….40
Hình 3.11

nh h

ng c a ngu n cellulose t nhiên đ n kh n ng sinh cellulase…. 41

Hình 3.12 Kh n ng sinh cellulase c a ch ng Penicillium M3, AspergillusM5-3 và
A.niger M6-1 trên v tr u ……………………………………………………….......42


DANH M C T

VI T T T

CMC : Carboxylmethyl cellulose
M3

:M u3

M6-1 : M u 6-1
M5-3 : M u 5-3
Cx

: Endoglucanase

C1

: Exoglucanase

CBH : Celobiohydrolase
SSA : Vùng b m t đ c hi u (SSA) c a cellulose


Tr

Khóa lu n t t nghi p

M

ng ảSP ảà N i 2

U

1 Lý do ch n đ tài
T xa x a, con ng

i đã bi t s d ng vi sinh v t trong đ i s ng hàng

ngày. Các quá trình làm r

u, làm d m, làm t

ng, mu i chua th c

ph m…đ u ng d ng các đ c tính sinh h c c a các nhóm vi sinh v t. Khi
khoa h c phát tri n, bi t rõ vai trò c a vi sinh v t, thì vi c ng d ng nó trong
s n xu t và đ i s ng hàng ngày càng r ng rãi và có hi u qu l n [8].
Cellulose là thành ph n ch y u c a màng t bào th c v t. Hàng ngày,
hàng gi , m t l ng l n cellulose đ

c tích l y l i trong đ t do các s n ph m

t ng h p c a th c v t th i ra, cây c i ch t đi, cành lá r ng xu ng…N u không
có quá trình phân gi i c a vi sinh v t thì l ng ch t h u c kh ng l này s
tràn ng p trái đ t. Trong thiên nhiên, có nhi u nhóm vi sinh v t có kh n ng
phân h y cellulose nh có h enzyme cellulase ngo i bào nh : vi khu n(
Pseudomonas, Xenllulomonas, Achromobacter, Clostridium.), x

khu n

(Streptomyces..).Trong đó, vi n m là nhóm có kh n ng phân gi i m nh vì nó
ti t ra môi tr

ng m t l ng l n enzyme đ y đ các thành ph n, đ c bi t là

các loài n m m c có ho t tính phân gi i cellulose m nh h n c

nh

Aspegillus, Mucor, Tricoderma …
Cellulase là m t ph c h enzyme r t quan tr ng và đ
rãi trong nhi u l nh v c. Trong hi n t i và t

c ng d ng r ng

ng lai, ng

i ta s

d ng

cellulase cho hai m c đích chính:
- Dùng cellulase tr c ti p trong phân gi i ph th i c a công nghi p th c
ph m, ph th i nông nghi p b sung vào th c n gia súc và trong công ngh
môi tr

ng.

- Th y phân cellulose t o c ch t lên men đ thu các s n ph m cu i cùng
khác nhau.

V Ng c Mai

1

K32D Sinh - KTNN

Tr

Khóa lu n t t nghi p

ng ảSP ảà N i 2

c bi t, trong ch n nuôi, m t trong nh ng bi n pháp nâng cao n ng su t
v t nuôi là nâng cao hi u su t s d ng các ch t dinh d
cao nh t.

gi i quy t nhi m v này, ng

ng c a th c n

m c

i ta có th dùng ch ph m enzyme

b sung vào kh u ph n th c n c a v t nuôi. Các enzyme này cùng v i các
enzyme có s n trong đ

ng tiêu hóa s phân gi i các ch t dinh d

th c n giúp cho con v t tiêu hóa đ

c t t h n [13].

Cellulase là m t trong s các enzyme th
ch n nuôi gia súc. Tuy nhiên, ng

này mà th

ng c a

ng đ

c b sung vào th c n

i ta không b sung riêng ch ph m enzyme

ng b sung cùng v i các enzyme khác nh amylase, protease,

xylase... t o ra m t d ng ch ph m ch a nhi u lo i enzyme (multienzyme).
Vi c b sung nhi u lo i enzyme giúp v t nuôi s h p th t t h n các ngu n
th c n khác nhau.
T lâu, con ng

i c ng đã bi t đ n các ch ng n m m c và ng d ng c a

chúng trong nhi u l nh v c nh công nghi p ch bi n th c ph m, công nghi p
d

c ph m, công ngh môi tr

ng, nông nghi p. Tuy nhiên c ng ch a có

nhi u nghiên c u t p trung vào các ch ng n m m c phân gi i cellulose,
nguyên nhân có th do trong t nhiên có nhi u nhóm vi sinh v t t ra u th
h n so v i n m m c v kh n ng sinh cellulase. Nh ng n u xét v kh n ng
ch ng ch u pH, kh n ng s d ng ngu n cacbon, ngu n nit ... thì n m m c t

ra u th h n so v i các nhóm vi sinh v t khác.
Hàng n m, ho t đ ng trong ngành nông nghi p đã th i ra môi tr

ng

hàng tr m ngàn t n ph ph m, hi n đã và đang là m t trong nh ng nguyên
nhân gây ô nhi m môi tr

ng. N u l ng ph ph m này đ

c x lý làm th c

n gia súc ho c phân bón thì đó c ng s là m t ngu n l i l n.Trên th gi i
c ng nh

Vi t Nam, đã có nhi u nghiên c u v cellulose ng d ng trong

th c n ch n nuôi nh : Chu Th Thanh Bình và CS (2002) đã ng d ng các
ch ng n m men trong ch bi n bã th i hoa qu giàu cellulose làm th c n gia

V Ng c Mai

2

K32D Sinh - KTNN


Tr

Khóa lu n t t nghi p

ng ảSP ảà N i 2

súc [1]. Theo tác gi Nguy n Lân D ng (1991) đã lên men x p s n b ng cách
s d ng Aspergillus hennebergii, Aspergillus niger s n ph m dùng làm th c
n cho gà, l n, bò... và k t qu cho nhi u tri n v ng [4].
Nghiên c u c a tôi t p trung vào phân l p, tuy n ch n, các ch ng n m
m c có kh n ng phân gi i cellulose nh m tìm ra các ch ng có tri n v ng ng
d ng trong vi c x lí ph ph m nông nghi p làm th c n gia súc.
2 M c đích nghiên c u
- Phân l p, tuy n ch n ch ng n m m c có ho t tính phân gi i cellulose
- Nghiên c u nh h

ng c a m t s đi u ki n nuôi c y đ n kh n ng sinh

cellulase c a các ch ng n m m c đã đ
3

it

c tuy n ch n.

ng và ph m vi nghiên c u

Lá cây m c, đ t mùn, g cây m c, r m r m c đ

cly

m ts n i

nh : Xuân Hoà, huy n Yên L c, thành ph V nh Yên (V nh Phúc) đ

cs

d ng đ phân l p các ch ng vi sinh v t phân hu cellulose.
4 Ý ngh a khoa h c c a đ tài
4.1 Ý ngh a lý lu n
Nghiên c u nh m đi sâu, tìm hi u hình thái, đ c đi m sinh lý, sinh
hoá ch ng n m m c có kh n ng phân gi i cellulose.
4.2 Ý ngh a th c ti n
Hi v ng các ch ng đ

c l a ch n s có tri n v ng ng d ng trong

vi c x lý ph ph m nông nghi p làm th c n gia súc.

V Ng c Mai

3

K32D Sinh - KTNN


Tr

Khóa lu n t t nghi p

CH

ng ảSP ảà N i 2

NG 1: T NG QUAN TÀI LI U

1.1 Cellulose
Thành ph n ch t khô ch y u c a th c v t là cellulose, hemicellulose và
lignin. Các thành ph n này th

ng có t l không gi ng nhau

các lo i cây

khác nhau. Chúng ph i h p t o nên c u trúc và quy t đ nh tính ch t hóa h c
và c lí c a nguyên li u có ngu n g c th c v t. Các h p ph n này th
li n v i nhau, do đó ng

i ta th

ng đi

ng g i là ligno – cellulose (B ng 1.1).

B ng 1.1 Các thành ph n chính c a ligno – cellulose và các enzyme
phân gi i c a n m (Fengel và Wegener, 1989; Eaton và Hale, 1993)
% sinh kh i
n phân t

Cellulose

Hemicellulose

Lignin

40 – 50

25 – 40

20 – 35

D – anhydrogluco

Xylose

pyranose

Mannose
Hexoses

Coniferyl alcohol
– counmaryl alcohol
Sinapyl alcohol

và các Pentose
C u trúc đa
phân t

– o – 4 liên k t
m ch th ng

1 – o – 4 liên
k t m ch th ng

Kh hydro trùng h p
thành ch t không k t tinh

v i các m ch
nhánh thay th
Các enzyme

Endoglucanlase

Endoxylanase

Lignin peroxidase (E.C.

chính liên quan

(E. C. 3.2.1.4)

(E.C. 3.2.1.8)

1.11.1.7)

đ n phân gi i

Cellobiohydrolase

và hydrolases

Mn ph thu c vào

(E.C. 3.2.1.91)

khác

peroxidase (E.C. 1.11.1.7)

- glucosidase

Laccase (E.C.1.10.3.2)

Cellulose là thành ph n c b n c a t bào th c v t.T ng l ng c a
chúng chi m t i 50% t ng s hydratcacbon trên trái đ t. V c u trúc hóa h c
c a cellulose là m t polyme m ch th ng do các D-gluco-pyranose liên k t v i
V Ng c Mai

4

K32D Sinh - KTNN


Tr

Khóa lu n t t nghi p

ng ảSP ảà N i 2

nhau b ng liên k t -1,4glucozid. Các đ n phân glucose trong cellulose có
c u hình d ng gh , quay m t góc 1800 so v i phân t tr

c nó. Các nhóm

hydroxyl này đ u n m trên m t ph ng n m ngang.

Hình 1.1 C u trúc l p th c a phân t cellulose
M c đ trùng h p c a cellulose t nhiên có th đ t t i 10.000 đ n 14.000
g cđ

ng. Nh có ph

ng pháp phân tích b ng tia r nghen, ng

trong t bào th c v t cellulose có c u t o d ng s i.

i ta đã bi t

n v nh nh t hay d ng

s i s c p là chu i th ng, bao g m các g c D-glucopyranose, đ

ng kính ≈

3nm. Các s i s c p này liên k t v i nhau b i m i liên k t hydro ho c l c
Vandervan h p thành vi s i, đ

ng kính ≈ 10nm ÷ 40nm. Nh ng vi s i này

h p thành nh ng vi s i l n v ng ch c có th quan sát đ
quang h c. M i s i vi c p l i đ

cd

i kính hi n vi

c bao b c b i l p lignin và hemicellulose.

Chính nh s liên k t ch t ch gi a cellulose, hemicellulose và lignin đã làm
cho cellulose v ng ch c và khó phân gi i h n (Hình 1.2).

V Ng c Mai

5

K32D Sinh - KTNN


Tr

Khóa lu n t t nghi p

ng ảSP ảà N i 2

Hình 1.2 C u trúc c a cellulose
C u trúc c a cellulose không đ ng nh t và th

ng có 2 vùng:

- Vùng k t tinh có c u trúc tr t t cao nên b n v ng v i tác đ ng bên
ngoài.
- Vùng vô đ nh hình do c u trúc không ch t ch nên kém b n v ng h n.
Vùng vô đ nh c a cellulose có th h p th n

đó các m ng l

i liên k t hydro

c và tr

ng lên.Trong khi

vùng k t tinh l i ng n c n s tr

ng này,

nên enzyme ch tác đ ng lên b m t các s i.
M c dù v i nh ng ph

ng pháp hi n có ch a đ đ xác đ nh chính xác

c u t o c a cellulose nh ng có th th y có r t nhi u ki u gián đo n và k t
thúc chu i, các b m t d d ng và các vùng xo n ho c phân nhánh d c theo
các vi s i. Trong quá trình sinh t ng h p cellulose rõ ràng là không có s
kh ng ch ch t ch nào đ cho m i s i đ u có chi u dài nh nhau. Các s i
riêng bi t có th n m trong nhi u vùng k t tinh, d n đ n x y ra nhi u chu i
k t thúc b t ng ngay trong vùng có đ k t tinh cao.

V Ng c Mai

6

K32D Sinh - KTNN

Tr

Khóa lu n t t nghi p

Cellulose t nhiên không tan trong n

ng ảSP ảà N i 2

c, axit hay ki m loãng và nhi u

dung môi h u c khác. Ch có axit hay ki m nung nóng m i có tác d ng th y
phân cellulose. D

i tác d ng c a axit, các liên k t glucozid s b phá h y d n

t o thành các s n ph m th y phân không hòa tan có đ b n c h c kém và
cu i cùng n u th y phân hoàn toàn s thu đ
làm tr

c D-glucose. Dung d ch ki m

ng ph ng cellulose và hòa tan m t ph n cellulose m ch ng n. Trong

t nhiên có nhi u lo i vi sinh v t có kh n ng sinh enzyme th y phân đ

c

cellulose nh : vi khu n, x khu n, niêm vi khu n, n m m c…
Cellulose đ

v t c a Trái

c t ng h p hàng n m v i kh i l

ng l n. Sinh kh i th c

t là 1800 t t n, thì cellulose chi m t i 720 t t n. Kh i l

ng

cellulose kh ng l này ngoài vi c ch a trong qu n th th c v t ch y u còn có
trong đ ng v t và vi sinh v t nh ng v i s l ng r t nh . S li u th ng kê
trong b ng 1.2 cho th y hàm l ng cellulose trong m t s nguyên li u:
B ng 1.2 ảàm l
Nguyên li u

ng cellulose trong m t s nguyên li u
Cellulos

Nguyên

e
Ki u m ch
V đ ut

ng

Mía
Cây tr

ng thành

Bã s n

li u

e

42,8

V ht

60

51

Bông

91

34

G thông

41

42

Gi y báo

40÷80

R m

56,6

Thân ngô

36

Tr u lúa mì

C

28

Tr u lúa m ch

V Ng c Mai

Cellulos

7

44
30,5
34

K32D Sinh - KTNN

Tr

Khóa lu n t t nghi p

Trong các ph li u cellulose th

ng ảSP ảà N i 2

ng có m t trong các d ng sau:

- Ph li u nông nghi p: r m r , v l c, v tr u, lõi thân cây ngô…
- Ph li u công nghi p th c ph m: v và x qu , bã mía, bã cà phê, bã
s n…
- Ph li u trong công nghi p ch bi n g : r cây, mùn c a, g v n…
- Các ch t th i sinh ho t: rác, gi y báo, bao bì…
1.2 H th ng cellulase
có th phân gi i đ

c cellulose t nhiên c n ph i có s hi p tr c a

các enzyme trong ph c h cellulase. Ph c h cellulase bao g m 3 lo i enzyme
ch y u:
- Endoglucanase (EC.3.2.1.4

-Dglucan

glucanolhydrolase

hay

Carboxymethylcellulase vi t t t là CMCase): có kh n ng c t đ t cellulose
các liên k t bên trong phân t cellulose làm gi m nhanh chi u dài chu i
nh ng đ

ng kh t ng ch m do chúng th y phân liên k t -1,4glucozid m t

cách tùy ti n trong m ch cellulose và gi i phóng cellulodextrin, cellobiose.
Enzyme này phân gi i m nh m các cellulose hòa tan nh t là d ng cellulose
vô đ nh hình nh ng ho t đ ng r t y u
là enzyme C x. Chính nh s c t tr

vùng k t tinh. Enzyme này đ

c cho

c c a endoglucanase đã t o ra các đ u

không kh , t o đi u ki n d dàng cho cellobiohydrolase do đó mà th y phân
hoàn toàn đ

c cellulose k t tinh.

- Exoglucanase (EC.3.2.1.91. 1,4 - glucan – celobiohydrolase vi t t t là
CBH). Enzyme này xúc tác tách liên ti p các phân t cellobiose t đ u kh
(CBHI) và đ u không kh (CBHII) c a chu i cellulose. Ngày nay nó đ

c coi

là enzyme ch đ o phân gi i cellulose, b i nó có kh n ng phân c t cellulose

c vùng k t tinh. Ho t tính c a enzyme này r t m nh khi tác đ ng lên vùng
vô đ nh hình và cellulose đã b phân gi i m t ph n b i endoglucanase. B i

V Ng c Mai

8

K32D Sinh - KTNN


Tr

Khóa lu n t t nghi p

ng ảSP ảà N i 2

v y, khi k t h p endoglucanase v i exoglucanase ho t tính phân gi i cellulose
t ng rõ r t.
CBH tác đ ng r t kém lên CMC, nh ng có th c t đ
b tr

c CMC khi nó đã

ng lên m t ph n. Các s i bông có c u trúc ch c ch n b i các m i t

ng

tác hydro và m c đ polyme hóa cao (>10000 glucose) thì CBH phân gi i
c ng ch m, b i vì bông c ng có m t ít đ u kh t do. Tuy nhiên CBH có th
c t t t nh t Avicel, m t lo i cellulose có các m i liên k t hydro ch c ch n,

song m c đ polyme hóa th p (<200 g c glucose).
- - 1,4 glucosidase (EC.3.2.1.21 -1,4 glucosedase hay cellobiase): là
enzyme r t đ c hi u, có kh

n ng th y phân cellobiose hay các

cellooligosacarit hòa tan trong n

c gi i phóng glucose. Enzyme này có ho t

tính c c đ i trên cellobiose và có ho t tính gi m d n theo chi u dài c a chu i
cellulodextrin. Ch c n ng c a -1,4 glucosidase có l là đi u ch nh s tích l y
các ch t c m ng c a cellulase.
1.3 C ch phân gi i cellulose
Reese và các c ng s l n đ u tiên đ a ra c ch phân gi i vào n m 1952
nh sau:
Cellulose
t nhiên

C1

Cellulose
ho t đ ng

ng
hòa tan

Cx

Theo tác gi này thì enzyme C 1 (t

Cellobise

Glucose

ng ng v i exoglucanase) là “ti n

nhân t th y phân” hay là enzyme không đ c hi u, làm bi n d ng cellulose t
nhiên thành chu i cellulose ho t đ ng có m ch ng n h n, sau đó enzyme C x
(t

ng ng v i endoglucanase) ti p t c phân c t, gi i phóng các đ

ng hòa

tan cellodextrin và cellobiose, cu i cùng cellobiose b c t t o thành glucose
d

i tác d ng c a cellobiase.

V Ng c Mai

9

K32D Sinh - KTNN


Tr

Khóa lu n t t nghi p

ng ảSP ảà N i 2

Erickson và c ng s , 1973 l i có quan đi m khác, th hi n trên m t s đ
ph c t p h n nhi u v quá trình th y phân cellulose (Hình 1.3).

ảình 1.3 S đ quá trình th y phân cellulose theo Erickson, 1973
u tiên, endoglucanase t n công vào các vùng vô đ nh hình trên b m t
cellulose, c t đ t các liên k t -1,4 glucozid đ t o ra các đ u m ch t do.
Ti p đó, d

i tác d ng c a exoglucanase t phía c c kín (phía không có tính

kh ), cellulose b c t thành các cellodextrin, sau đó cùng v i s hi p tr c a
exoglucanase phân c t các cellulose t o ra cellobiose và glucose. Cu i cùng
-1,4 glucosidase th y phân m t ph n cellodextrin và cellobiose thành
glucose.
N m 1997, Tuula T.T, đã đ a ra m t s đ khác v c u t o c a cellulose
và tác đ ng c a cellulase. Theo ông cellulose là m t polyme t nhiên cho nên
s k t tinh c a nó c ng không hoàn h o. Các vùng vô đ nh hình xen k v i
các vùng k t tinh m t cách ng u nhiên. Các vùng vô đ nh hình có th
b m t s i cellulose ho c

ngay sát d

trên

i vùng k t tinh hoàn h o nh t. Các

lo i cellobiohydrolase (CBH) s t n công vào các vùng k t tinh và các m ch

b c t d dang có các đ u kh ho c không kh (CBHI t n công vào đ u kh

V Ng c Mai

10

K32D Sinh - KTNN


Tr

Khóa lu n t t nghi p

ng ảSP ảà N i 2

còn CBHII t n công vào đ u không kh ) l n l t tách các cellobiose ra kh i
chu i polyme. Kh n ng làm gi m m c polyme hóa c a exoglucanase ch m
song hàm l ng đ

ng kh l i t o ra nhi u. Trong khi đó endoglucanase phân

cách m ch polyme tùy ti n, không theo tr t t

nào, t o ra các chu i

oligosaccarit ng n, d n đ n gi m nhanh m c polyme hóa c a cellulose.Trong
quá trình c t g y m ch polyme, endoglucanase t o ra các đ u kh và không
kh t do, t o c h i cho CBH phân c t thành cellobiose. B i v y, khi có t
h p endo- exoglucanase quá trình phân gi i cellulose m nh lên nhi u.
Tính ch t và c u trúc c ng nh nh ng thay đ i c a c ch t trong quá

trình th y phân đ u tác đ ng đ n v n t c phân c t c a enzyme. Hi u ng này
đã đ

c nghiên c u trên quan đi m c ch ph n ng. Các k t qu quan tr ng

thu đ

c nh sau:

1. Ch s k t tinh c a cellulose k t tinh c c b t ng trong quá trình ph n
ng và s gi m đáng k c a v n t c ph n ng ph n l n là do s bi n đ i c u
trúc c a c ch t cellulose.
2.

k t tinh c a cellulose toàn ph n vô đ nh hình ví d : cellulose đã x

lí axit photphoric thay đ i không đáng k và v n t c cao đ

c duy trì trong

quá trình th y phân.
3. Vùng b m t đ c hi u (SSA) c a cellulose k t tinh c c b gi m đáng
k trong quá trình th y phân, trong khi đó SSA c a cellulose tái sinh thay đ i
không đáng k .
4. Tr s đ polyme hóa c a cellulose có đ k t tinh cao g n nh không
thay đ i, còn c a cellulose tái sinh vô đ nh hình thì thay đ i rõ r t.
5. T ng h p các y u t c u trúc, s h p ph c a cellulase, s kìm hãm
c a s n ph m và s vô ho t c a cellulase, t t c đ u có nh h

ng quan tr ng

đ n v n t c th y phân cellulose.

V Ng c Mai

11

K32D Sinh - KTNN


Tr

Khóa lu n t t nghi p

ng ảSP ảà N i 2

Nói chung, cho đ n nay ch a có gi thuy t nào gi i thích đ

c th t đ y

đ và th a đáng v c ch tác đ ng c a cellulase. Tuy nhiên, công ngh và
gi i pháp thi t b đ chuy n hóa cellulose b ng con đ
thì hi n nay nhi u n
ngh và đã thu đ
1.4

ng công ngh sinh h c

c trên th gi i đã đ a vào tri n khai

quy mô công

c nhi u k t qu r c r .

ng d ng c a cellulase
Ngu n c ch t đ cellulase phân gi i là vô cùng phong phú và đa d ng

trong t nhiên c ng nh trong đ i s ng sinh ho t.
Hàng ngày, m t l ng l n ch t th i lignocellulose t nông nghi p, công
nghi p, đô th luôn ch ng ch t ho c s d ng chúng m t cách kém hi u qu do
giá thành c a qui trình x lí rác th i r t cao.

i u này tr thành v n đ quan

trong hàng đ u đ i v i sinh thái, công nghi p hóa h c và công ngh sinh h c.
H n n a, đây còn là v n đ kinh t đáng quan tâm trong vi c phát tri n qui
trình tái s d ng cho hi u qu và l i d ng ch t th i cellulose nh là ngu n c
ch t r ti n.
Cellulase là ph c h enzyme r t quan tr ng và đ
trong nhi u l nh v c. Trong hi n t i và t

ng lai ng

c ng d ng r ng rãi
i ta s d ng cellulase

cho 2 m c đích chính:
- Dùng cellulase tr c ti p trong phân gi i ph th i c a công nghi p th c
ph m b sung vào th c n gia súc và trong công ngh môi tr

ng.

- Th y phân cellulose t o c ch t lên men đ thu các s n ph m cu i cùng
khác nhau.
Các l nh v c chính ng d ng cellulase bao g m:
- Công nghi p ch bi n th c ph m:
+ C i thi n đ tiêu hóa th c n.
+ Chi t rút các ch t gây v , d u, d ch ép protein t rau qu .
+ C i thi n đ hòa tan c a các nguyên li u trong công ngh lên men.

V Ng c Mai

12

K32D Sinh - KTNN


Tr

Khóa lu n t t nghi p

ng ảSP ảà N i 2

+ Ch bi n th ch t rau câu.
+ S n xu t r
- Công nghi p d

u và m t s axit h u c .
c ph m:

+ Ch bi n các ch t t tiêu hóa, lo i b các s i không mong mu n.
- S n xu t th c n gia súc:
+ C i thi n đ tiêu hóa r m, c làm th c n gia súc.
+ S n xu t th c n giàu protein.
- Công ngh môi tr
+

ng [14]:

ng d ng trong x lí ph li u sau thu ho ch, x lí rác đô th , phân

h y thành phân bón h u c .
+ Phân h y các ch t t n l u, trong đó có DDT, TNT.
- Công ngh lên men:
+ Cung c p c ch t cho t ng h p khí metan, glyxerin, axit xitric, axit
lactic, vitamin, protein đ n bào, ch t kháng sinh, các ch t có ho t tính sinh
h c khác.
Ngoài ra, trong giao thông v n t i, t sinh kh i lignocellulose s n xu t ra
etanol là nhiên li u tuy t v i cho đ ng c đ t trong và nó có th thay th cho
nhiên li u hóa th ch đ gi m b t s ô nhi m môi tr

ng và s nóng lên toàn

c u (Philippidis và Smith, 1995).
Trong công nghi p d t may, ng

i ta th y n u dùng cellulase

li u th p

đ x lí bông s làm bông tr ng và m n màng h n, do nó lo i b đ

c các s i

t và h t trên m t s i bông làm cho s i ph ng, bóng m

t và m m. Ho c có

th dùng cellulase (các lo i cellulase trung tính) đ mài v i qu n áo bò thay
th cho mài b ng đá b t đ t o ra nh ng đi m “b c” t nhiên c a qu n áo bò.
i u này có ý ngh a r t l n đ i v i ngành công nghi p mài v i bò vì khi x lí
b ng cellulase làm cho v i bò b n h n nhi u, nó không phá c u trúc c a v i

V Ng c Mai

13

K32D Sinh - KTNN


Tr

Khóa lu n t t nghi p

m nh nh đá mài, h n n a kh i l

ng ảSP ảà N i 2

ng mài m t m t ng lên 50% do đã lo i b

50% th tích đá b t ph i b sung vào v i thùng mài.
Trong công nghi p s n xu t b t gi y, gi y s d ng cellulase đ t y m c
trên các gi y ph th i thay th dùng Cl ho c ClO2 gây ô nhi m môi tr
làm s ch, tr ng gi y ng

i ta s

ng.

d ng ch y u là lo i hemicellulase,

xylanase t Sporotricchum pulverulentum, S. dimorphosphorum, cellulase t
A. niger ho c t Phanerochaeta chrysosporium, ho c mannase t T. reesei.
Cellulase th

ng đ

c dùng

(0.001÷0.1%), cellulase (0.05÷0.5%),

cellobiase (0.005÷0.015%).
Trong công nghi p s n xu t các ch t t y r a. Tác d ng c a cellulase
trong ch t t y r a ch y u là lo i b các s i h ng, làm cho v i tr nên m n
đ p, m m sáng màu h n. Cellulase th

ng đ

c s d ng k t h p v i lipase

(lo i b m ) và protease (lo i b protein). Các enzyme này dùng cho ch t gi t
đ u là các enzyme trung tính ho c ki m.
Cellulase còn đ

c s d ng có hi u qu đ phá v thành t bào th c v t

trong k ngh lai ghép t bào tr n - m t công ngh lai t bào gi a các loài
ho c th m chí gi a các chi khác nhau t o gi ng cây tr ng m i trong nông
nghi p.
* ng d ng c a Cellulase trong ch n nuôi
Trong ch n nuôi, m t trong nh ng bi n pháp nâng cao n ng su t v t nuôi
là nâng cao hi u su t s d ng các ch t dinh d
nh t.

gi i quy t nhi m v này, ng

ng c a th c n

m c cao

i ta có th dùng ch ph m enzyme b

sung kh u ph n th c n c a v t nuôi. Các enzyme này cùng v i các enzyme
có s n trong đ

ng tiêu hóa s phân gi i các ch t dinh d

giúp cho con v t tiêu hóa đ

c t t h n.

Cellulase là m t trong s các enzyme th
ch n nuôi gia súc. Tuy nhiên, ng

V Ng c Mai

ng c a th c n,

ng đ

c b sung vào th c n

i ta không b sung riêng ch ph m enzyme

14

K32D Sinh - KTNN


Tr

Khóa lu n t t nghi p

này mà th

ng ảSP ảà N i 2

ng b sung cùng v i các enzyme khác nh : amylase, protease,

xylanase… t o ra m t d ng ch ph m ch a nhi u lo i enzyme (multienzym).

Vi c b sung nhi u lo i enzyme giúp v t nuôi phân gi i đ

c nhi u lo i c

ch t, v t nuôi s h p th t t h n các ngu n th c n khác nhau.
Khi đ ng v t

giai đo n còn non, h enzyme tiêu hóa c a chúng ch a

hoàn ch nh, ch y u
nuôi, ng

đ ng v t n b t và n c . S d ng enzyme trong ch n

i ta th y l n con theo

t ng tr ng 20% và gi m th c n 6÷14%.

Thí nghi m trên l n 1÷3 tu n tu i thì l n t ng tr ng 8÷40%, t ng kh n ng s
d ng th c n t 10÷18% [6].
Ng

i ta c ng đã dùng enzyme b sung vào th c n c a trâu bò. Quá

trình tiêu hóa th c n trong d c c a trâu bò đ
enzyme c a các vi sinh v t s ng nh

c g n li n v i ho t đ ng

đ y. Vì v y, b sung vào th c n

nh ng ch ph m enzyme đ nâng cao kh n ng tiêu hóa là đi u r t c n thi t.
Dùng các ch ph m có ho t tính amylase, protease, cellulase… đ u thu đ

c

k t qu t t, k t qu t ng tr ng c a trâu bò có th đ t t i 12÷17%, có khi còn
cao h n [13], [14].
Trên th gi i ng

i ta đã s d ng th c n gia súc có ch a các enzyme

tiêu hóa t đ u nh ng n m 1990. Hi n nay, h ng n m ng

i ta s n xu t

kho ng 30 tri u t n th c n gia súc có b sung ch ph m enzyme. Chi m
kho ng 5% trong t ng s 600 tri u t n th c n gia súc đ

c s n xu t.

Vi t Nam đã có nhi u nghiên c u v cellulase ng d ng trong th c n
ch n nuôi nh : GS. Nguy n Lân D ng, 1991 đã lên men x p s n v i
Aspergillus henebergii, Aspergillus niger dùng làm th c n cho gà, l n, bò...
k t qu th y có nhi u tri n v ng [4]. Chu Th Thanh Bình và cs, 2002 đã ng
d ng các ch ng n m men trong ch bi n bã th i hoa qu gi u cellulose làm
th c n gia súc…[1]. G n đây, đã có nghiên c u th nghi m v s
c a enzyme th

V Ng c Mai

nh h

ng

ng m i: phytase ho c t h p các enzyme (amylase, protease,

15

K32D Sinh - KTNN


Tr

Khóa lu n t t nghi p

xylanase, cellulase…) đ n kh n ng t ng tr

ng ảSP ảà N i 2

ng và hi u qu s d ng th c n

c a l n con cai s a. K t qu th nghi m cho th y khi trong th c n có b
sung ch ph m phytase và t h p các enzyme thì t ng tr ng h n so v i đ i
ch ng t

ng ng là: 13.3% và 32%. N u s d ng ph i h p c hai ch ph m

này thì t ng tr ng h n so v i đ i ch ng là 50%
Nh v y, hi u qu c a vi c b sung enzyme vào th c n ch n nuôi là rõ

ràng làm t ng t l tiêu hóa cho v t nuôi và gi m chi phí. Tuy nhiên, hi n nay
Vi t Nam ch ph m enzyme th

ng ph i nh p kh u v i giá thành cao nên

nghiên c u và s n xu t ch ph m enzyme là v n đ r t c n thi t.
1.5 Các nhóm vi sinh v t phân gi i cellulose
Sinh t ng h p cellulase là quá trình ph c t p ch u s đi u khi n c a b
máy di truy n, s ho t hóa c a các ch t c m ng, và s ki m ch c a các ch t
trao đ i và các s n ph m cu i cùng.
1.5.1 N m s i
Theo Carle-Urioste và cs c ch c m ng c a cellulose đ n sinh t ng h p
cellulase

n m s i T. reesei d a trên s có m t m t l

có trong n m. L

ng nh cellulase s n

ng cellulase c s này phân gi i các oligosaccarit đã b tách

kh i cellulose và có th xâm nh p vào t bào, m đ u cho vi c t ng h p
cellulase.
Khi nghiên c u sinh t ng h p endoglucanase t Nectria catalinenesis
ng

i ta th y ch t c m ng t t nh t CMC-Na.
Các k t qu c a Hrmova và cs cho th y r ng các disaccarit trong t nhiên

c u t o b i glucose và xylose, có vai trò quan tr ng trong đi u hòa sinh t ng
h p cellulase c a n m s i Aspergillus terreus. Ch t c m ng t t nh t là 2-Obeta -D-glucopyranosyl D-Xylose (Glcbeta 1-2Xyl), Sophorose và 2-O-beta D-glucopyranosyl D-Xylose (Xylbeta 1-2Xyl) ho c các đ ng phân c a chúng
c ng là nh ng ch t c m ng t t. Loewenberg và cs khi nghiên c u cellulase

V Ng c Mai

16

K32D Sinh - KTNN


Tr

Khóa lu n t t nghi p

ng ảSP ảà N i 2

c a n m s i Trichoderma c ng có k t lu n r ng: ch m t l ng nh sophorose
c ng gây lên s t ng h p cellulase. B sung nhi u l n v i m t l ng nh
sophorose s t t h n là m t l n v i l ng l n.
Sorbose m t lo i đ

ng không kh và không ph i là s n ph m c a quá

trình th y phân cellulose c ng có vai trò đi u hòa sinh t ng h p và gi i phóng
cellulase.
Lactose là ch t c m ng hòa tan cho ph c h enzyme cellulase c a
Trichoderma lignorum. Tween-80 (0,1%) có nh h

ng t t đ n sinh t ng h p

cellulase c a Aspergillus terreus.
Nhi u s n ph m trung gian c a chu trình Krebs (axit xitric, suxinic …) là
nh ng ch t c ch qu quá trình sinh t ng h p cellulase. Alcol phenethylic
(PEA) là ch t kìm hãm sinh tr

ng và kích thích sinh t ng h p cellulase c a

Myrothecium verucaria. M t s h p ch t hóa h c khác có c u trúc t

ng t

PEA nh alcol benzylic, propylic, axeton c ng có tác d ng thúc đ y sinh t ng
h p cellulase. PEA tác đ ng đ n t bào ch t và thành t bào, n i x y ra quá
trình sinh t ng h p cellulase.
Các ch ng n m s i có kh n ng phân gi i cellulose th

ng thu c các chi:

alternaria, Aspergillus, Chaetomium, Coprinus, Myrothecium. Penicillium,
Rhizopus, Trichoderma,…
1.5.2 Vi khu n
Bacilus subtilis t ng h p CMC-ase t t nh t trên môi tr

ng có ch a ch t

c m ng là D (+) raffinose 0,2%. Các ch t kìm hãm là glucose và cellobiose.
Sinh t ng h p CMC-ase c a Acetivibrio cellulolyticus đ

c c m ng b i

cellulose, cellobiose và salicin b kìm hãm nh ng không hoàn toàn b i
glucose. Ho t tính exoglucannase đ

c t ng c

ng n u nuôi c y trên poly

glucozid polyme tan hay không tan và b kìm hãm b i s

-

t ng thêm

cellobiose.

V Ng c Mai

17

K32D Sinh - KTNN