Luận văn sư phạm Tuyển chọn chủng nấm men, tìm điều kiện tối ưu cho quá trình lên men vang táo mèo
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (587.06 KB, 46 trang )
1
LêI C¶M ¥N
Trước khi trình bày đề tài nghiên cứu của mình, em xin được gửi đến cô
giáo TS. Đinh Thị Kim Nhung lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất. Cô đã
tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành đề tài
này.
Bằng tấm lòng thành kính, em xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các
thầy giáo, cô giáo trong khoa Sinh. KTNN đã tạo điều kiện thuận lợi để em
hoàn thành khoá luận này.
Một lần nữa em xin cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô cùng toàn thể các
bạn. Em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của quý thầy cô để đề tài của
em được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
ĐHSPHN2, ngày 14 tháng 5 năm 2007
Sinh viên
NguyÔn ThÞ Hång
K29A – SINH
2
Më §Çu
A. Lý do chọn đề tài.
Rượu là một trong những sản phẩm lên men đầu tiên của nhân loại, mặc
dù ban đầu người ta không hề biết đến các vi sinh vật đã thực hiện quá trình
chuyển hoá đường thành rượu. Trên các di vật lưu chữ được tìm thấy có các
hình vẽ từ thời cổ Hy Lạp minh hoạ quá trình nấu rượu. Các hình vẽ trên Kim
Tự Tháp cho thấy nghề nấu rượu đã hết sức phát triển ở vùng này. Riêng nghề
làm rượu vang đã có trước khi con người phát hiện ra nấm men (thế kỉ XVII)
và trước khi Louis Pasteur khám phá ra bản chất của quá trình lên men (1854
- 1864 ). Rượu vang đã trở thành một loại đồ uống được ưa thích ở hầu hết
các nước trên thế giới. Người ta biết đến rượu vang như một sản phẩm lên
men tự nhiên từ nước ép trái nho. Mỗi nước đều có sản phẩm vang nổi tiếng
và đã trở thành thương hiệu cả thế giới biết đến như các loại vang của Pháp,
Italia, Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha, Mỹ, Hà Lan...với các loại rượu nổi tiếng
như Brandy, Champagne, Sherry (Fino, Oloroso, Amontillado), Port,
Medeira, Venmouth [15].
Ngày nay, với những hiểu biết về bản chất của quá trình lên men rượu và
những hiểu biết về nấm men thì rượu vang còn được lên men từ các nguồn
hoa quả khác. Việt nam và một số nước trên thế giới đã sản xuất được một số
loại rượu vang từ các nguồn nguyên liệu như: Anh Đào, Mơ, Dâu, Vải
Thiều...Thị trường vang trong nước và thế giới hiện nay hết sức phong phú.
Tuy vậy, rượu vang ở Việt Nam được biết đến chưa nhiều và chưa có được
sản phẩm đặc sắc nổi tiếng. Với tâm nguyện tạo cho Việt Nam một sản phẩm
vang đặc trưng và nổi tiếng như các nước trên thế giới, chúng tôi đã tiến hành
tìm kiếm nguồn nguyên liệu để lên men vang. Thông qua việc quan sát và
3
phân tích sơ bộ một số chỉ tiêu, chúng tôi nhận thấy: Quả táo mèo rất có triển
vọng trong việc sử dụng làm nguồn nguyên liệu để sản xuất vang. Cũng đã có
một số công trình nghiên cứu về vang Táo Mèo, nhưng chúng tôi nhận thấy
còn rất nhiều yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình lên men chưa được
khám phá kỹ. Đối tượng nấm men phân lập từ quả Táo Mèo chưa được
nghiên cứu sâu. Do vậy, chúng tôi quyết định tiến hành đề tài nghiên cứu:
“Tuyển chọn chủng nấm men, tìm điều kiện tối ưu cho quá trình lên men
vang Táo Mèo”.
Với mong muốn những chỉ tiêu và kết quả phân tích được sẽ hỗ trợ cho
những nghiên cứu tiếp theo về nấm men. Và quy trình lên men sẽ được mở
rộng trên quy mô sản xuất. Rượu vang Táo Mèo sẽ là sản phẩm đặc trưng bổ
sung vào sự phong phú cho thị trường vang Việt Nam.
B. Mục tiêu nghiên cứu.
1. Phân lập và tuyển chọn được chủng nấm men lên men vang từ dịch
Táo Mèo. Định loại chủng nấm men này.
2. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng đã tuyển chọn.
3. Tách chiết DNA tổng số.
4. Lên men rượu vang Táo Mèo trên quy mô phòng thí nghiệm, xây
dựng quy trình lên men.
C. Đối tượng nghiên cứu.
- Quả Táo Mèo (Docynia indica).
- Chủng nấm men có khả năng lên men vang Táo Mèo.
D. Ý nghĩa lí luận và thực tiễn của công trình.
- Nghiên cứu đặc tính sinh lí, sinh hoá của chủng nấm men có khả năng
lên men vang Táo Mèo. Tách chiết DNA tổng số. Kết quả nghiên cứu này là
dẫn liệu góp phần bổ sung cho các nghiên cứu về nấm men và ứng dụng của
nấm men trong đời sống.
4
- Tạo ra sản phẩm vang mới làm phong phú thị trường vang trong nước
và thế giới.
E. Cấu trúc luận văn
Ngoài phần mở đầu, mục lục, phụ lục, danh mục, tài liệu tham khảo, đề
tài gồm 4 chương:
Chương 1. Tổng quan tài liệu
Chương 2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
Chương 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận
Chương 4. Kết luận và đề nghị.
5
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tìm hiểu chung về rượu vang
1.1.1. Khái niệm rượu vang
Rượu vang là một sản phẩm lên men không qua chưng cất từ nước ép
các loại hoa quả như: Nho, Dâu, Mơ, Vải Thiều, Táo...
Theo từ điển viện hàn lâm ẩm thực Pháp, rượu vang được định nghĩa
như sau: “Là một chất lỏng sinh động, rượu vang có thể mang bệnh, có thể
già và chết”.
Thành phần chủ yếu của rượu vang gồm có:
- Rượu Etylic: Đây là sản phẩm của quá trình lên men, quá trình chuyển
hoá đường thành rượu trong điều kiện kỵ khí.
Hàm lượng Etanol trong rượu vang thường ở mức 10 – 14 độ rượu. Đây
là sản phẩm của giai đoạn lên men chính.
Phương trình hoá học biểu diễn sự chuyển hoá đường thành rượu:
C6H12O6
2C2H5OH + 2CO2 + 33KCal
- Các chất bổ dưỡng có trong vang: Đường trong vang từ 62-132g/l. Chủ
yếu là glucoza, fructoza .....và galactoza.
- Các axit vô cơ và hữu cơ: axit malic, axit tartaric, axit citric, axit
axalic....hàm lượng axit tổng số từ 4-7 g/l(quy ra axit tartaric).
1.1.2. Phân loại rượu vang
Có nhiều cách để phân loại rượu vang. Hiện nay có thể chia rượu vang
thành các loại sau:
- Vang không gaz (still wines). Nổi tiếng là vang không bọt của Pháp,
ngoài ra kể đến Ý, Đức, Bồ Đào Nha, Tây Ban Nha, Nga, Mỹ....
- Vang có gaz (Spanking wine) tiêu biểu nhất là Champagne.
Champagne nổi tiếng ở Pháp, người ta phân biệt 3 loại Champagne:
+ Loại không ngọt (brut)
+ Loại rất ít đường (extra dry, extra see).
6
+ Loại ngọt (sec;dry).
Ngoài ra có các loại rượu được pha trộn từ nhiều loại vang khác nhau tạo
thành như: Brandy, sherry, rượu thơm (chủ yếu là vermouth)..... [15].
- Căn cứ vào màu sắc có thể chia rượu vang (chủ yếu là vang nho) thành
các loại:
+ Vang đỏ: lên men từ nho đỏ có xác quả.
+ Vang trắng: lên men từ nước ép nho trắng hoặc nước ép nho đỏ.
+ Vang hồng: lên từ nho đỏ và xác quả nhưng thời gian tiếp xúc giữa xác
quả và dịch ép ngắn hơn. [14]
1.1.3. Nguồn nguyên liệu sản xuất vang
Nguyên liệu sản xuất vang là dịch ép các loại trái cây tươi hoặc dịch
chiết siro của các loại trái cây như: Nho, Mơ, Dâu, Táo, Vải, Anh đào.....
Thành phần hoá học một số loại trái cây dùng để lên men vang bảng 1.1
và bảng 1.2
Bảng 1.1. Thành phần hoá học một số loại quả
Thành phần hoá học cơ bản (%)
Tên quả
Nước
Đườn
axit
Pectin
Tanin
g
Nho
73,1
9,88
0,56
0,092
0,07
Vải
84,28
16,1
5,16
0,249
0,83
Dứa
54,3
3,9
0,6
0,249
0,83
Mơ
73,8
9,0
1,1
0,249
0,83
Dâu
84,74
9,19
0,49
0,31
0,035
7
Bảng 1.2. Thành phần hoá học của dịch táo mèo
STT
Thành phần hóa học
Đơn vị
1
Đường tổng số
2
Nơi thu mẫu
Trung bình
Yên Bái
Sơn La
%
4,8
4,82
4,81
Axit tổng số
%
1,45
1,48
1,47
3
Vitamin C
mg/l
11,0
11,4
11,22
4
Nước
%
84,0
85,1
84,6
5
Protein toàn phần
%
0,92
0,92
0,92
6
Ph
2,8
3,0
2,9
Các chỉ tiêu cơ bản như hàm lượng đường, pH, axit tổng số cho thấy có
thể dùng táo mèo làm nguyên liệu cho lên men rượu vang.
1.2. Hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men vang và bệnh
vang
1.2.1. Nấm men
1.2.1.1. Cấu tạo và hình thái tế bào nấm men
- Cấu tạo tế bào: Nấm men thuộc loài Saccharomyces là đối tượng chính
tham gia vào quá trình chuyển hoá đường thành rượu. Nấm men là vi sinh vật
nhận thực, có cấu tạo đơn bào và cấu tạo phức tạp hơn vi khuẩn. Thành tế bào
là cơ quan bảo vệ và duy trì hình dạng tế bào. Thành chứa chất có khả năng
kết dính. Điều này có ý nghĩa lớn trong công nghệ sản xuất bia, rượu. Thành
có thành phần hoá học chủ yếu là hemixenluloza(70% trọng lượng khô).
Ngoài ra còn có kitin 1- 3%, protein 6- 10%, lipit 8- 8,5%, khoáng7%.
Thành phần nội bào quan trọng của nấm men đó là ty thể, không bào và
nhân. Số lượng ty thể khoảng 10- 20/ 1 tế bào. Chúng có vai trò quan trọng
trong quá trình sinh trưởng và sinh sản của nấm men. Không bào được hình
thành từ thể golgi hay mạng lưới nội chất. Không bào chứa hệ thống keo bao
8
gồm: enzym, protein, hydrocacbon, muối canxi, kali, phenolflavin, ribo
flavin, axit nucleic và các chất dự trữ khác. Nhân có hình ovan, hình tròn nằm
gần không bào trung tâm với kích thước khoảng 2,4µm. Nhân chứa toàn bộ
hệ gen tham gia điều khiển quá trình sinh tổng hợp của tế bào nấm men.
- Hình thái tế bào: đa số có hình trứng, cầu hay hình Ovan. Kích thước tế
bào từ 3-10µm, 5-12µm. Hình thái và kích thước tế bào thay đổi theo điều
kiện môi trường nuôi cấy. Khi môi trường nghèo dinh dưỡng nấm men
thường có dạng hình giày.
1.2.1.2. Sinh sản của tế bào nấm men
Nấm men sinh sản vô tính bằng hình thức đâm chồi và giữa các quá trình
này có xen lẫn hình thức sinh sản hữu tính. Nảy chồi là hình thức sinh sản phổ
biến nhất. Khi tế bào phát triển đến một mức độ nhất định thì trên cơ thể nảy
một chồi nhỏ là mầm. Mầm (tế bào con), phát triển trên cơ thể mẹ, cũng có
thể tách khỏi cơ thể mẹ để phát triển độc lập. Trong điều kiện thuận lợi chỉ 20
đến 30 phút có một thế hệ tế bào con được hoàn chỉnh.
Nấm men Saccharomyces có khả năng hình thành bào tử. Bào tử túi
được sinh ra trong những túi nhỏ gọi là túi nang. Mỗi túi nang chứa 1-8 bào
tử. Nấm men Saccharomyces được hình thành theo lối sinh sản vô tính. Đó là
quá trình tạo bào tử trực tiếp từ một tế bào riêng rẽ không qua tiếp hợp. Bào
tử túi sau khi ra khỏi túi gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành một tế bào
nấm men mới. Tiếp theo tế bào này lại sinh sản theo lối nảy chồi.
* Nấm men được dùng trong lên men rượu vang đó là Saccharomyces
cerevisiae.
Theo quan điểm kinh tế người ta chia thành các chủng:
- Chủng lên men với hiệu suất cao ở thời gian tối ưu sản sinh tới 20%V
cồn.
- Chủng lên men ở thời gian ngắn, lên men tạo 8-12%V cồn.
9
- Chủng chịu nồng độ cồn cao, lên men trong rượu vang dưới 30%
đường tạo 10-13%V cồn.
1.2.2 Vi khuẩn
Trong nước quả và rượu vang có thể phát triển những dạng vi khuẩn có
tính ổn định lớn với rượu và axit hữu cơ.
Chúng có thể là nguyên nhân gây nên những biến đổi sâu sắc trong rượu
vang về vị chua, mùi, có loại còn gây đục vang. Đó thường là các loại vi
khuẩn: Acetobacter xyllium, Acetobacter aceti. Louis Pasteur đã tìm ra cơ chế
làm hỏng vang khi rượu vang tiếp xúc với không khí có vi khuẩn Bacillus.
Do vậy, để bảo quản rượu vang người ta có thể thanh trùng Pasteur. Nhưng
phương pháp này có thể làm giảm chất lượng của vang. Ngoài ra, người ta
còn dùng phương pháp vi lọc hoặc dùng một số chất bảo quản như SO2 (75120mg/l).
1.2.3. Nấm mốc
Nấm mốc phát triển ở quả chất bã của sản xuất rượu vang, thùng thiết bị
hoặc trong không khí. Một số loại nấm mốc hay gặp thuộc các chi: Rhizopus,
Aspergillus.
1.2.4. Vi sinh vật làm hỏng vang
Có không ít vi sinh vật làm cho vang bị đục, bị chua gắt có mùi khó
chịu, làm cho vang bị hỏng như: Acetobacter xylium, Acetobacter aceti. [8].
Các vi khuẩn kị khí: các vi khuẩn lactic như: Lb.brevia, Lb.pastoerianus,
Lb.plantarum... đã làm cho vang bị vẩn đục, chúng tác động làm chuyển hoá
axit citric, tạo ra lượng lớn axit lactic, axit axetic và 2,3 butadiol.
Các vi khuẩn hiếu khí: một số loài nấm men tạo màng trên bề mặt vang
như: Candida, Zygopichia, Pichia... phân giải đường thành các axit hữu cơ:
xitric, axetic... làm cho vang bị đục, độ chua tăng, vị không ngon. [11].
10
1.3. Ảnh hưởng của các yếu tố tới quá trình sinh trưởng và phát
triển của nấm men
1.3.1. Nguồn cacbon
- Cacbon là nguồn nguyên liệu cơ bản kiến tạo nên bộ khung tế bào
nấm men. Là thành phần quan trọng của tất cả các chất trao đổi. Cacbon là
nguồn dinh dưỡng hàng đầu cho vi sinh vật.
- Nguồn cacbon cung cấp cho nấm men Saccharomyces cerevisiae
được lấy chủ yếu từ các nguồn đường: Glucoza, saccaroza, fructoza.
- Nguồn cacbon đáp ứng 3 nhu cầu cơ bản của nấm men.
+ Sản sinh năng lượng thông qua quá trình oxi hoá khử.
+ Tạo thành những tiền chất.
+ Tham gia vào các quá trình oxi hoá khử.
1.3.2. Nguồn nitơ và khoáng chất
Nitơ là thành phần quan trọng trong tế bào vi sinh vật, nó là một trong
những nguyên tố cấu thành lên axit nucleic.
Nitơ cung cấp cho vi sinh vật chủ yếu từ 2 nguồn: nguồn vô cơ và nguồn
hữu cơ.
1.3.3. Ảnh hưởng của oxy
Quá trình tăng sinh của nấm men là quá trình hiếu khí vì vậy oxy là
nguồn quan trọng để nấm men tăng sinh khối trong giai đoạn nhân giống.
1.4. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men
1.4.1 Hàm lượng cồn và pH
Nấm men lên men luôn sản sinh một lượng cồn. Nồng độ cồn thích hợp
cho nấm men phát triển tốt là 9-14%V. Khả năng chịu cồn và lên men tốt
trong môi trường có nồng độ cồn thích hợp là một tiêu chí để tuyển chọn
chủng nấm men cho quá trình sản xuất rượu.
11
Trong quá trình lên men pH môi trường luôn biến đổi. Ở giai đoạn cuối
pH hơi tăng do nấm men tự phân huỷ giải phóng ra NH3. Ở pH=2,3 quá trình
lên men yếu pH > 6,5 – 7,5 khả năng lên men không còn. pH thích hợp là
4-5.
1.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng khá lớn đến quá trình lên men.
- Nhiệt độ < 200C: sự lên men chậm chạp, độ rượu tạo thành thấp
- Nhiệt độ < 100C: không diễn ra quá trình lên men.
- Nhiệt độ ở 350C: nguy hiểm cho quá trình lên men, nấm men không
chết nhưng mất tác dụng
- Nhiệt độ > 350C: quá trình lên men dừng lại, lượng đường sót cao vi
khuẩn hoạt động đặc biệt nhiều vi khuẩn chuyển hoá đường thành axit axetic
gây chua, giảm chất lượng vang.
Nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm men phát triển là 26 - 280C.
1.4.3. Hàm lượng đường và hàm lượng men giống
Đường và các chất hoà tan tạo nên áp suất thẩm thấu ảnh hưởng đến quá
trình vận chuyển các chất ra vào tế bào. Hàm lượng đường thích hợp cho quá
trình lên men là 12-25%. Hàm lượng đường 30%V sẽ ức chế quá trình lên
men. Các kết quả nghiên cứu cho thấy khi hàm lượng đường trong dịch lên
men tăng thì hàm lượng axit axetic trong vang cũng cao. Mặt khác tỉ lệ các
loại đường trong dịch lên men cũng ảnh hưởng không nhỏ đến tốc độ và hiệu
xuất lên men. Kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy: glucoza là loại
đường phù hợp nhất cho sự sinh sản và phát triển của tế bào nấm men cũng
như quá trình tạo rượu , tiếp đó là đường fructoza và đường sacaroza… Vì
vậy quả có chứa hàm lượng đường khử càng cao càng có lợi cho quá trình lên
men và chất lượng vang thành phẩm[9].
Hàm lượng men giống cũng ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình sinh
trưởng cũng như quá trình lên men của nấm men. Hàm lượng tế bào nấm men
12
có trong dịch lên men càng thấp thì thời gian lên men càng kéo dài hơn, dễ bị
nhiễm khuẩn, ngược lại hàm lượng men giống trong dịch lên men cao thì thời
gian lên men ngắn hơn, hạn chế được khả năng nhiễm khuẩn do sự áp đảo của
tế bào nấm men. Nhưng hàm lượng tế bào men giống quá cao sẽ làm thay đổi
thành phần môi trường lên men và sẽ không có lợi cho quá trình lên men và
chất lượng vang. Nhìn chung hàm lượng men giống thích hợp cho quá trình
lên men khoảng 10%.
13
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, thiết bị và hoá chất
2.1.1. Nguyên liệu chính
- Quả táo mèo thu nhận từ hai tỉnh Yên Bái và Sơn La.
- Các chủng nấm men nghiên cứu được phân lập từ dịch quả táo mèo có vị
trí phân loại theo YelinovN.P (1996) sau đây:
1. Lớp
: Hemiascomycetes
2. Bộ
: Endomycetales
3. Họ
: Saccharomycetaceae
4. Giống
: Saccharomyces
5. Loài
: Cerevisiae
2.1.2. Hoá chất và thiết bị
2.1.2.1. Hoá chất
Một số hoá chất được sử dụng: MgSO4,KH2PO4, (NH4)2SO4, axit xitric
(hãng: FENXICHUN-Trung Quốc), K2S2O5 (hãng: BATOL-của C.H Pháp),
các loại muối nitrat, các loại đường (hãng: BDH-Anh)…
2.1.2.2. Thiết bị
Hộp petri, ống nghiệm, đường kế Đức, tủ sấy, tủ lạnh sâu, buồng cấy vô
trùng, buồng đếm Goriaev, máy đo pH, máy quang phổ kế, máy so màu, máy
ly tâm, kính hiển vi quang học Nikon Nhật, nồi khử trùng cao áp, máy lắc ổn
nhiệt, máy lắc sinh học, …
2.1.3 Các loại môi trường
2.1.3.1 Môi trường Hansen (môi trường 1) g/l
1. Đường glucoza :
2. Pepton
:
50g
5g
14
3. MgSO4
:
0,5g
4. KH2PO4
:
1g
5. (NH4)2SO4
:
1g
6. Thạch Aga
:
20g
7. Nước
:
1000ml
2.1.3.2. Môi trường nhân giống (môi trường 2) g/l
1. Đường glucoza :
50g
2. Pepton
:
5g
3. MgSO4
:
0,5g
4. KH2PO4
:
1g
5. (NH4)2SO4
:
1g
6. Nước
:
1000ml
2.1.3.3. Môi trường lên men (môi trường 3)g/l
1. Dịch siro hoa quả :
200ml
2. MgSO4.7H2O
:
0,5g
3. KH2PO4
:
1g
4. KH2PO4
:
1g
5. (NH4)2SO4
:
1g
6. Nước
:
1000ml
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp vi sinh: phân lập, tuyển chủng nấm men dựa trên việc
nghiên cứu hình thái tế bào nấm men, xác định số lượng tế bào nấm men, hoạt
lực lên men.
2.2.2 Phương pháp hóa lý: xác định hàm lượng đường tổng số bằng khúc xạ
kế, hàm lượng đường sót bằng phương pháp DNS [5], hàm lượng cồn bằng
phương pháp bicromatkali [3], hàm lượng axít tổng số theo axít tartaric, dựa
vào nguyên tắc trung hoà axít bằng dung dịch NaOH 0,1 N [4], pH bằng máy
đo pH
15
2.2.3 Phương pháp phân tích cảm quan [6].
2.2.4 Phương pháp xử lý các kết quả thu được bằng phần mềm Excel và
thống kê toán học.
2.3. Phạm vi nghiên cứu
Chủng nấm men Saccharomyces tuyển chọn trên đối tượng là quả táo mèo
được thu từ Trạm Tấu (Yên Bái), Sơn La.
2.4. Địa điểm thực hiện đề tài
Phòng thí nghiệm Vi sinh-CNSH, Khoa sinh-KTNN Trường ĐHSP Hà
Nội
Phòng thí nghiệm Vi sinh, Khoa sinh-KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2
16
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.2 PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN, XÁC ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA
CHỦNG NẤM MEN LÊN MEN VANG TÁO MÈO
3.2.1. Phân lập chủng nấm men có khả năng lên men vang táo mèo
Nguyên liệu dùng để sản xuất rượu vang ở đây là các loại quả táo mèo
(quả sơn tra ). Táo mèo được thu hoạch vào tháng 6, tháng 7. Quả thu hoạch
về cần phải được chọn lấy các quả đã chín, loại bỏ các quả non, quả dập nát
thối rữa. Quả đã chọn đem rửa sạch bằng nước đạt tiêu chuẩn vệ sinh rồi để
ráo nước. Sau đó cho vào các ang thùng ngâm đường theo tỉ lệ 1:1. Quả táo
mèo ta khía các đường nhỏ quanh quả. Khoảng hai ngày khuấy trộn một lần.
Sau một tháng ta thu được một thứ siro nước quả có nồng độ đường khoảng
60-80 % và nhiều dưỡng chất khác được chiết ra từ thịt quả.
Pha loãng dịch quả bằng nước đảm bảo vệ sinh cho đến khi đạt nồng độ
đường 20%. Dịch pha loãng được sunfít hoá bằng K2S2O5 với liều lượng thích
hợp để không giết chết nấm men thuần chủng. Sau đó để lên men tự nhiên ở
nhiệt độ 28 - 30 0C, đến ngày lên men thứ 3-5 chúng tôi lấy khoảng 5-10ml
dịch đang lên men đem pha loãng ở các nồng độ khác nhau: 10-1, 10-2, 10-3,
10-4, 10-5….10-10. Từ mỗi ống nghiệm chứa dịch pha loãng ta lấy 1 giọt, dùng
bàn trang trải đều trên hép lồng có chứa môi trường Hansen rồi để trong tủ ấm
28 - 300C trong khoảng thời gian 2 - 3 ngày [7]. Từ các hộp lồng này ta lựa
chọn lấy các khuẩn lạc to, trơn, nhẵn, bóng, sáng đem cấy riêng rẽ vào các
ống thạch nghiêng, nghiên cứu đặc tính sinh học của các chủng tuyển chọn.
Bằng cách tuyển chọn như trên lặp lại ba lần, chúng tôi thu được 38 mẫu nấm
men. Từ số mẫu này tuyển chọn được 4 chủng có đường kính khuẩn lạc lớn
hơn 1,5mm, chúng tôi dùng 4 chủng làm đối tượng nghiên cứu tiếp, các
chủng này kí hiệu là TM1, TM2, TM3, TM4. Tiếp theo xác định hoạt lực lên
17
men và dựa vào khoá phân loại của Yelinov N.P xác định tên khoa học của 4
chủng nấm men đã chọn là TM1, TM2, TM3, TM4.
3.2.2. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang táo mèo
Nấm men đóng vai trò quan trọng đối với toàn bộ quy trình sản xuất và
chất lượng của vang. Nấm men sử dụng lên men rượu vang từ dịch táo mèo
phải đạt các yêu cầu sau: [12]
1. Lên men được ở nồng độ đường và nồng độ axit khá cao.
2. Có hiệu suất lên men cao.
3. Có khả năng kết lắng tốt và làm trong sản phẩm.
4. Tạo được hương thơm đặc trưng và không có vị lạ, không sinh độc tố.
Ổn định lâu dài trong sản xuất
3.2.2.1. Nghiên cứu khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng nấm
men tuyển chọn
Môi trường chúng tôi dùng để thử khả năng sinh trưởng và phát triển của 4
chủng nấm men thu được là môi trường dịch siro táo mèo có bổ sung nước
chiết giá đỗ xanh. Môi trường nuôi cấy sau khi được khử trùng được đưa vào
các bình tam giác 250 ml và đặt lên máy lắc ổn nhiệt (28-300C) tốc độ 150
vòng /phút. Tiến hành xác định số lượng tế bào nấm men ở OD 610nm với
khoảng thời gian thử mẫu là 4 giờ một lần trong 23 giờ liên tục. Kết quả được
dẫn ra ở bảng 3.2.2.1 và đồ thị 3.1 Tốc độ sinh sản trung bình của các chủng
nấm men trong 1 giờ được tính bằng công thức: v =
dx
dt
Trong đó v : tốc độ sinh trưởng trung bình của nấm men trong 1 giờ
dx: số tế bào nấm men tăng thêm trong 1 ml dịch ( từ thời điểm t1 đến t2 )
dt : thời gian nuôi cấy ( dt = t2 – t1)
18
Bảng 3.2.2.1. Khả năng sinh trưởng và phát triển
của 4 chủng nấm men
SL tế
bào
6
Thời
Chủng nấm men x 10
gian
TM1
TM2
TM3
TM4
15
( giờ )
0h
3,2±1,1
3,2±1,1
3,2±1,1
3,2±1,1
4
h
3,5±1,1
3,6±1,1
7±1,1
3,6±1,1
8
h
6,2±1,1
5,4±1,1
10±1,1
6,4±1,1
8,4±1,1
12±1,1
20,75±1,1
14,8±1,1
16
87,25±1,1
65±1,1
100±1,1
102±1,1
20h
12h
h
16±1,1
147,5±1,1
205±1,1
210±1,1
h
24
245±1,1
305±1,1
390±1,1
405±1,1
28h
250±1,1
312±1,1
396,6±1,1
505±1,1
32h
248±1,1
310±1,1
390±1,1
498±1,1
20
10
5
0
TM1
TM2
TM3 TM4
Biểu đồ 3.1. Tốc độ sinh sản trung
bình của bốn chủng nấm men
Kết quả thí nghiệm cho thấy:
Chủng có tốc độ sinh sản trung bình cao nhất là chủng TM4
Chủng có tốc độ sinh sản trung bình thấp nhất là chủng TM1
3.2.2.2. Nghiên cứu khả năng lên men, thử hoạt lực lên men của bốn
chủng nấm men đã tuyển chọn
Các chủng nấm men được lên men trong môi trường dịch sirô táo mèo có
hàm lượng đường 240 g/l. Đây là hàm lượng đường thường được dùng cho
lên men rượu vang của các loại quả, nhiệt độ lên men 28-300C. Sau khi kết
thúc quá trình lên men rượu ( 15- 17 ngày ) chúng tôi tiến hành phân tích một
số chỉ tiêu hoá lý để xác định khả năng lên men của các chủng nấm men và
kết quả thí nghiệm được dẫn ra ở bảng 3.2.2.2a
19
Bảng 3.2.2.2a Khả năng lên men của bốn chủng nấm men
Chỉ tiêu đánh giá
Đơn
Chủng nấm men
vị
TM1
TM2
TM3
TM4
Đường tổng số
g/l
75
70
65
50
Đường khử
g/l
0,75
0,7
0,65
0,45
Độ cồn
%V
9,76
9,84
10,51
11,17
Hiệu suất lên men
%
76,2
76,6
81,9
87,06
Môi trường nghiên cứu là dịch siro táo mèo có bổ sung cao men và được
pha loãng để đạt nồng độ đường là 20%. Tiến hành lên men trong các bình
tam giác ở quy mô 150 ml với thời gian là 36h. Chúng tôi thu được kết quả
sau. Các chủng đều có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt và đạt số lượng
tế bào cực đại sau 28 giờ nuôi cấy. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.2.2.2b
Bảng 3.2.2.2b Hoạt lực lên men của bốn chủng nấm men
STT
Chủng
Độ pH
3,4
3,8
4,2
4,5
4,8
5,2
1
TM1
+
+
+
++
++
++
2
TM2
+
++
++
+++
++++
++++
3
TM3
++
++
+++
++++
++++
++++
4
TM4
++
+++
++++
++++
++++
++++
Trong đó
+ + + +: Hàm lương CO2 được tạo ra
> 32g/l dịch lên men
+ + +: Hàm lượng CO2 được tạo ra từ
1624g/l dịch lên men
+ + : Hàm lượng CO2 được tạo ra từ
816g/l dịch lên men
+ : Hàm lượng CO2 được tạo ra
< 8g/l dịch lên men
Từ kết quả thu được cho thấy rằng:
Các chủng đều có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt trong khoảng pH
từ 3,8-5,2. Hai chủng có hoạt lực lên men mạnh nhất là TM3 và TM4.
20
3.2.2.3. Khả năng kết lắng, khả năng tạo hương thơm và độ trong sản
phẩm
3.2.2.3.a Khả năng kết lắng
Hoà sinh khối nấm men thu được vào dung dịch đệm axetat rồi lắc trên máy
với tốc độ 200 vòng/ phút trong thời gian 3-5 phút và để lắng 15 phút. Chúng
tôi thu được kết quả sau:
Bảng 3.2.2.3a Khả năng kết lắng của bốn chủng nấm men
Tên chủng
TM1
TM2
TM3
TM4
Chiều cao cột sinh khối ( mm )
14
16
17,5
18
Theo kết quả ở bảng trên, chủng có khả năng kết lắng tốt nhất là TM4, tiếp
theo là các chủng TM3, TM2 và kém nhất là chủng TM1. Khả năng kết lắng
của nấm men có ý nghĩa rất lớn trong quá trình sản xuất vang. Đặc biệt là giai
đoạn lọc vang. Chủng có khả năng kết lắng càng tốt thì sản phẩm vang càng
trong, và càng dễ thu sinh khối tế bào. Chính vì vậy khả năng kết lắng được
xem như một tiêu chuẩn chọn lựa chủng nấm men dùng cho qua trình sản
xuất rượu vang.
3.2.2.3.b Khả năng tạo hương thơm và độ trong sản phẩm
Sau khi kết thúc lên men được 30 ngày, chúng tôi tiến hành xác định khả
năng tạo hương thơm bằng phương pháp cảm quan và xác đinh độ trong sản
phẩm ở OD 600 nm. Chúng tôi thu được kết quả dẫn ra ở bảng sau:
Bảng 3.2.2.3b Khả năng tạo hương thơm và độ trong sản phẩm của
bốn chủng nấm men
TT
Chỉ tiêu đánh
giá
Chủng
TM1
TM2
TM3
TM4
1
Độ đục ( OD )
0,08
0,12
0,98
0,033
2
Hương thơm
Thơm
Ít thơm
Ít thơm
Thơm
21
Kết quả phân tích cho thấy: hai chủng TM1 và TM4 đạt độ trong và hương
thơm tốt hơn các chủng TM2 và TM3. Khả năng tạo hương trong vang là do
quá trình lên men tạo ra các sản phẩm hữu cơ có mùi thơm. Đó là các loại
este, axit, anđêhit. Khả năng tạo hương còn do gen quy định. Người ta mong
muốn sẽ tách được gen mã hoá protein tạo hương cho rượu vang. Hương
thơm cũng là một đặc trưng của sản phẩm và đó cũng là tiêu chí để lựa chọn
chủng nấm men phù hợp.
Tổng hợp các kết quả nghiên cứu của 4 chủng nấm men, chúng tôi thu
được kết quả bảng sau.
Bảng 3.2.2.3c Tổng hợp kết quả tuyển chọn chủng nấm men
TT
Chỉ tiêu đánh giá
Chủng
TM1
TM2
TM3
TM4
1
Khả năng phát triển
1
2
3
4
2
Hiệu suất lên men
1
3
2
4
3
Khả năng lên men ở pH thấp
4
1
2
3
4
Độ trong của sản phẩm
3
1
2
4
5
Hương thơm của sản phẩm
2
3
1
4
6
Đánh giá chung
3
1
2
4
14
11
12
23
Tổng điểm
Chủng đạt số điểm cao nhất là chủng TM4, vì vậy chúng tôi quyết định
chọn chủng TM4 cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.3. Xác định tên khoa học của chủng TM4
Việc xác định tên khoa học đối với chủng nấm men TM4 được chúng tôi tiến
hành theo phương pháp:
Căn cứ vào đặc tính sinh học của chủng nấm men như:
- Khả năng lên men các loại đường.
- Khả năng đồng hoá các muối nitrat.
- Quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi.
22
3.2.3.1. Hình thái tế bào và khuẩn lạc
Khuẩn lạc của chủng nấm men TM4 cấy trên môi trường M1(sau 3-4 ngày)
là những khuẩn lạc có hình tròn, màu trắng, viền xung quanh nhẵn (hình3.1).
Chủng nấm men TM4 bao gồm các tế bào có hình ovan (hoặc hình trứng),
có kích thước tế bào khoảng: (4-7)x(9-12) m (Hình 3.2).
Những đặc điểm của nấm men TM4 hoàn toàn giống đặc điểm về khuẩn lạc
và tế bào của chủng Saccharomyces cerevisiae( S. cerevisiae) [7] nói chung.
Chính vì vậy từ đây chúng tôi gọi tên chủng nấm men này là S. cerevisiae
TM4 (viết tắt TM4). Sau đây là ảnh khuẩn lạc và tế bào chụp trên kính hiển vi
quang học x 1000 lần của chủng nấm men TM4.
Khuẩn lạc chủng TM4
Hình 3.1
Chủng nấm men TM4
Hình 3.2
3.2.3.2. Đặc điểm sinh học của chủng nấm men S. cerevisiae TM4
3.2.3.2a.. Khả năng lên men các loại đường
Để xác định khả năng lên men các loại đường của chủng nấm men S.
cerevisiae TM4, chúng tôi sử dụng phương pháp lên men trong các bình tam
giác 250ml bằng cách: cấy chủng TM4 vào 8 môi trường khác nhau (mỗi môi
23
trường ứng với 1 loại đường) với số lượng tế bào nấm men ban đầu như nhau
là 4,8.106/ml.(bảng 3.2.3.2)
Bảng 3.2.3.2. Khả năng lên men các loại đường của chủng TM4
Loại đường
Khả năng lên men
Loại đường
Khả năng lên men
D- glucoz
++
Sacaroza
+
D- Galactoz
+
Dextrin
_
Maltoza
+
Rafinoza
+
Melibioza
_
Lactoza
_
++: Lên men mạnh
+: Có khả năng lên men nhưng không mạnh
_ : Không có khả năng lên men
Chủng nấm men TM4 không có khả năng lên men ở các môi trường có
chứa đường Dextrin, Lactoza, Melibioza nhưng có khả năng lên men rất tốt
đối với môi trường có đường D- Galactoza, Maltoza, Saccaroza.
3.2.3.2b. Khả năng sử dụng nitrat làm nguồn nitơ duy nhất
Để xác đinh khả năng sử dụng nitrat của chủng nấm men TM4 chúng tôi đã
tiến hành nuôi cấy chủng TM4 trên môi trường có thành phần như sau:
1. Glucoza
:
20g
2. MgSO4. 7 H2O :
0,5g
3. Thạch
:
20g
4. KH2PO4
:
1g
5. Nước cất
:
1000ml
6. KNO3
:
0,78g
Đổ môi trường vào các ống nghiệm sau đó hấp thanh trùng (không để
nghiêng sau khi khử trùng) và bố trí các thí nghiệm theo 2 lô khác nhau:
+ Lô thứ 1: Mẫu đối chứng
+ Lô thứ 2: Bổ sung nitơ (pepton = 1g/l) lên bề mặt
24
Dùng que cấy có đầu nhọn để cấy chủng TM4 trích sâu vào bề mặt thạch
và tiến hành nuôi cấy ở nhiệt độ 28-30oC trong thời gian 2-3 ngày.
kết quả: Lô thứ 1: Không có sự phát triển của chủng TM4.
Lô thứ 2: Chủng TM4 đều phát triển rất tốt trong các ống nghiệm tạo
khuẩn lạc rất đặc trưng.
Tóm lại: Chủng nấm men TM4 không có khả năng sử dụng nitrat làm
nguồn nitơ duy nhất.
3.2.3.3. Xác định tên khoa học của chủng TM4
Căn cứ và khoá phân loại của Lodder (1972) và các kết quả thí nghiệm
đối với chủng TM4 có đặc tính:
- Sinh sản nảy chồi nhiều phía.
- Tế bào hình trứng, ovan, cầu.- Lên men glucoza mạnh, lên men được hầu
hết các loại đường saccaroza, galactoza, mantoza.
- Điều kiện không thuận lợi hình thành 1-4 bào tử, mỗi nang chứa 2 bào tử
Từ đó chúng tôi xác định chính xác tên khoa học của chủng nấm men TM4
phân lập từ dịch táo mèo là Saccharomyces cerevisiae TM4.
( S.cerevisiaeTM4).
3.3. TÌM ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG
Mục đích cơ bản của quá trình nhân giống nấm men để sản xuất vang là:
tìm các điều kiện phù hợp với những đặc tính sinh học của chủng nấm men để
trong một thời gian nhất định nấm men có thể sinh sản (có số lượng tế bào/ml
dịch nhân giống là nhiều nhất), chất luợng tốt nhất ( tỷ lệ các tế bào trẻ và tế
bào nẩy chồi nhiều nhất) để đáp ứng quá trình lên men vang.
Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của nấm men.
Trong công trình nghiên cứu này chúng tôi nghiên cứu các yếu tố như:
K2S2O5, cao men, nhiệt độ, pH, oxy hoà tan.
3.3.1. Hàm lượng K2S2O5
25
Môi trường nhân giống là môi trường 100 % dịch siro táo mèo đã được
pha loãng để đạt nồng độ đường 10%Bx (100g/l) . Dịch môi trường được đưa
vào các bình tam giác với dung tích 250ml rồi bổ sung K2S2O2.. Việc bổ sung
K2S2O5 có tác dụng tiêu diệt vi khuẩn, nấm mốc và nấm men dại. Sau khi bổ
sung giống các bình được đặt lên máy lắc ổn nhiệt (28-30 0C) với tốc độ 150
vòng/phút trong thời gian 28 giờ. Thu được kết quả dẫn ra ở bảng 3.3.1
Bảng 3.3.1 Hàm lượng K2S2O5 thích hợp cho quá trình nhân giống
SLTB
Thời gian bổ sung giống
6
x10 tb/ml
Sau 6 h sunfit hoá
Sau 12 h bổ sunfit hoá
Thanh trùng
Đối chứng
Hàm lượng
50mg/l
100mg/l
200mg/l
50mg/l
100g/l
200mg/l
0mg/l
0mg/l
T
0h
3,2±1,1
3,2±1,1
3,2±1,1
3,2±1,0
3,2±1,1
3,2±1,1
3,2±1,1
3,2±1,1
h
4h
7,5±1,1±1,1
5,5±1,2
4,25±1,2
5±1,1
4,5±1,0
4,15±1,3
6,25±1,2
3,5±1,0
ờ
8h
31,2±1,2
28,1±1,1
15±1,1
27,5±1,1
26,5±1,1
4,5±1,1
15±1,1
5,45±1,1
i
12h
64,2±1,1
56,5±1,0
29,5±1,1
54,5±1,3
50,2±1,1
7,5±1,1
29,5±1,1
21,5±1,1
g
16h
115±1,1
120±1,1
58,5±1,3
60,5±1,1
95,5±1,2
84,5±1,3
58,5±1,0
43,5±1,3
i
20h
137±1,0
142±1,1
148±1,1
178±1,1
148±1,1
137±1,1
118±1,1
96,5±1,1
a
24
h
n
172±1,1
178±1,3
155±1,1
165±1,2
145±1,1
135±1,1
155±1,1
175±1,1
28h
170±1,1
170±1,1
1470±1,0
162±1,1
148±1,3
130±1,0
150±1,1
172±1,2
Từ bảng cho thấy rằng: Chủng S.cerevisae TM4 sinh trưởng tốt trong môi
trường được sunfit hoá bằng K2S2O5 với hàm lượng từ 50-100 mg/l. Ở môi
trường được sunfit hoá với liều lượng lớn hơn đã ức chế sự sinh trưởng của
chủng TM4. Trong trường hợp môi trường không được sunfit hoá thì chủng
TM4 sinh trưởng yếu hơn và môi trường cũng dễ bị nhiễm khuẩn. Từ kết quả
thu được chúng tôi quyết định sunfit hoá môi trường bằng K2S2O5 với liều
lượng là 50 mg/l.
3.3.2. Hàm lượng cao men thích hợp cho quá trình nhân giống
Hàm lượng đạm trong dịch siro của các loại quả thường thấp. Vì vậy việc
bổ sung cao men trong quá trình nhân giống và lên men là rất cần thiết [9].
Chủng nấm men TM4 được nuôi cấy trong môi trường dịch siro táo mèo ở
nhiệt độ 28 - 300C trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút. Thời gian nuôi cấy
