Nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase của dịch chiết rong sagassum swartzll thu hoạch tại vùng biển khánh hòa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ỨC CHẾ
ENZYME ACETYLCHOLINESTERASE CỦA DỊCH CHIẾT
TỪ RONG SARGASSUM SWARTZII THU HOẠCH
TẠI VÙNG BIỂN KHÁNH HÒA

Giảng viên hướng dẫn: TS. Phan Thị Khánh Vinh
TS. Nguyễn Thế Hân
Sinh viên thực hiện:

Phạm Thị Khuê

Mã số sinh viên:

57130052

Khánh Hòa - 2019


TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ỨC CHẾ

ENZYME ACETYLCHOLINESTERASE CỦA DỊCH CHIẾT
TỪ RONG SARGASSUM SWARTZII THU HOẠCH
TẠI VÙNG BIỂN KHÁNH HÒA

GVHD: TS. Phan Thị Khánh Vinh
TS. Nguyễn Thế Hân
SVTH:

Phạm Thị Khuê

MSSV:

57130052

Khánh Hòa – 7/2019


i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đồ án này là công trình nghiên cứu thực sự của tôi, được thực
hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Phan Thị Khánh Vinh và TS. Nguyễn Thế
Hân. Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá
được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham
khảo.
Ngoài ra, trong luận án còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu
của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc.
Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình.
Khánh Hòa, tháng 7 năm 2019
Phạm Thị Khuê

ii
LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian hoàn thành đồ án tốt nghiệp của mình, tôi đã nhận được sự giúp
đỡ nhiệt tình của thầy cô và các bạn. Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám
Hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm, các thầy
cô trong khoa đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành đề tài này.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Phan Thị
Khánh Vinh và TS. Nguyễn Thế Hân đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình thực hiện và hoàn thành nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Công Nghệ Thực Phẩm, và các thầy cô phụ
trách phòng thí nghiệm đã tạo mọi điều kiện tốt nhất về cơ sở vật chất, các dụng cụ
phòng thí nghiệm để tôi có thể thực hiện tốt đề án tốt nghiệp. Tôi xin trân trọng gửi lời
cảm ơn tới thầy cô đã giúp đỡ, trang bị cho tôi nhiều điều bổ ích, đó là những hành trang
quý báu giúp tôi thêm vững bước trên con đường đi sắp tới của mình. Xin kính chúc
thầy cô giáo thật nhiều sức khỏe để tiếp tục sứ mệnh trồng người của mình.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt và ý nghĩa nhất tới gia đình, người thân
và bạn bè đã luôn chỉ bảo, động viên, chia sẻ, sát cánh bên tôi để tôi vượt qua những
khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Nha Trang, tháng 7 năm 2019
Sinh viên thực hiện

Phạm Thị Khuê


iii
MỤC LỤC
Đề mục

Trang

Lời cam đoan .................................................................................................................... i
Lời cảm ơn.......................................................................................................................ii
Mục lục .......................................................................................................................... iii
Danh mục hình ............................................................................................................... vi
Danh mục bảng ............................................................................................................ viii
Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt ................................................................................ ix
LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ......................................................................................... 4
1.1. Tổng quan về bệnh Alzheimer và rong biển ................................................4
1.1.1 Bệnh Alzheimer .......................................................................................... 4
1.1.1.1 Khái niệm về bệnh Alzheimer .................................................................4
1.1.1.2 Thực trạng của bệnh ................................................................................4
1.1.1.3. Đặc điểm lâm sàng của bệnh Alzheimer ................................................5
1.1.1.4. Các thuốc điều trị bệnh Alzheimer hiện nay ..........................................5
1.1.2 Acetylcholine, enzyme acetylchoinesterase và giả thuyết cholinergic ......6
1.1.2.1. Acetylcholine.......................................................................................... 6
1.1.2.2. Enzyme acetylchoinesterase ...................................................................7
1.1.2.3 Giả thuyết cholinergic .............................................................................8
1.1.3. Tổng quan về rong biển và rong mơ Sargassum swartzii .........................8
1.1.3.1 Rong biển ................................................................................................ 8
1.1.3.2. Rong mơ Sargassum swartzii .................................................................9
1.2. Cơ sở lý thuyết ........................................................................................... 10
1.2.1 Một số phương pháp thường dùng trong nghiên cứu đánh giá hoạt tính ức
chế enzyme acetylcholinesterase. ..............................................................................10
1.2.1.1 Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman ...............................................11
1.2.1.2. Phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B.............................. 12
1.2.2. Cơ sở khoa học của quá trình chiết ......................................................... 13
1.2.2.1 Một số phương pháp chiết truyền thống ...............................................14

1.2.2.2 Một số phương pháp tách chiết khác .....................................................15


iv
1.2.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết ............................................16
1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước có liên quan đến lĩnh vực của
đề tài ........................................................................................................................... 17
1.3.1. Nghiên cứu trong nước ............................................................................17
1.3.2. Nghiên cứu trên thế giới ..........................................................................18
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 21
2.1. Mẫu rong biển ............................................................................................ 21
2.1.1. Thu mẫu ...................................................................................................21
2.1.2. Xử lý và bảo quản mẫu............................................................................21
2.2. Hóa chất, dung môi và máy thiết bị ........................................................... 21
2.2.1. Hóa chất và thuốc thử ..............................................................................21
2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................22
2.3.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát ............................................................ 22
2.3.2. Giải thích sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát............................................23
2.3.3. Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của điều kiện chiết đến hoạt tính
ức chế enzyme acetylcholinesterase của dịch chiết rong Sargassum swartzii. .............24
2.3.3.1. Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết .............24
2.3.3.2. Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ chiết ............................. 26
2.3.3.3. Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian chiết ............................ 27
2.3.3.4. Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi ........28
2.3.4. Bố trí thí nghiệm tách phân đoạn và đánh giá hoạt tính ức chế enzyme
acetylcholinesterase của các phân đoạn .....................................................................29
2.4. Phương pháp phân tích ...............................................................................30
2.4.1 Xác định một số thành phần hóa học cơ bản trong rong .......................... 30
2.4.2. Định tính một số hợp chất tự nhiên có trong dịch chiết rong ..................31
2.4.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính enzyme acetylcholinesterase ...............31

2.5 Phương pháp xử lý số liệu ...........................................................................33
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................. 35
3.1 Kết quả định lượng và định tính một số thành phần có trong rong
Sargassum swartzii.....................................................................................................35
3.1.1 Kết quả định lượng một số thành phần hóa học trong rong .....................35
3.1.2. Kết quả định tính một số hợp chất có trong dịch chiết rong ...................36


v
3.2. Kết quả ảnh hưởng của điều kiện chiết đến hoạt tính ức chế enzyme
acetylcholinesterase của rong Sargassum swartzii ......................................................37
3.2.1. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết .....................................37
3.2.2. Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ chiết .....................................................39
3.2.3. Kết quả ảnh hưởng của thời gian chiết ....................................................42
3.2.4 Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi.................................44
3.3. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase của rong
Sargassum swartzii ở điều kiện thích hợp .................................................................46
3.4. Kết quả đánh giá khả năng ức chế enzyme acetylcholinesterase của các
phân đoạn dịch chiết từ rong Sargassum swartzii......................................................47
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................. 52
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................... 53
PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 63
Phụ lục 1: Xác định một số thành phần hóa học trong rong ............................. 63
Phụ lục 2: Cách tiến hành đánh giá hoạt tính ức chế enzyme
acetylcholinesterase....................................................................................................66
Phụ lục 3: Kết quả đo quang xác định ảnh hưởng của điều kiện chiết đến khả
năng ức chế enzyme acetylcholinesterase của mơ sargassum swartzii .....................68
Phụ lục 4: Kết quả xác định khả năng ức chế enzyme acetylcholinesterase của
rong mơ Sargassum swartzii ở các nồng độ khác nhau được chiết ở điều kiện thích
hợp đã chọn ................................................................................................................70

Phụ lục 5: Kết quả đo quang xác định khả năng ức chế enzyme
acetylcholinesterase của các phân đoạn dịch chiết từ rong Sargassum swartzii .......71


vi
DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1: Quá trình tổng hợp acetylcholine ....................................................................7
Hình 1.2: Rong Sargassum swartzii ................................................................................9
Hình 2.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát ..................................................................22
Hình 2.2: Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến hoạt
tính ức chế enzyme acetylcholinesterase .......................................................................25
Hình 2.3: Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính ức chế
enzyme acetylcholinesterase ......................................................................................... 26
Hình 2.4: Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt tính ức chế
enzyme acetylcholinesterase ......................................................................................... 27
Hình 2.5: Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỷ lệ NL/DM đến hoạt tính ức chế
enzyme acetylcholinesterase ......................................................................................... 28
Hình 2.6: Bố trí thí nghiệm tách phân đoạn dịch chiết ở các dung môi khác nhau và hoạt
tính ức chế enzyme acetylcholinesterase. ......................................................................29
Hình 2.7: Quá trình phản ứng diễn ra trong phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử
Ellman ............................................................................................................................ 32
Hình 3.1: Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến khả năng ức chế enzyme
acetylcholinesterase của rong (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa
thống kê p < 0,05). .........................................................................................................38
Hình 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến khả năng ức chế enzyme acetylcholinesterase
của dịch chiết rong (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê
p < 0,05). ........................................................................................................................ 40
Hình 3.3: Ảnh hưởng của thời gian chiết đến khả năng ức chế enzyme
acetylcholinesterase của dịch chiết rong (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau

có ý nghĩa thống kê p < 0,05). .......................................................................................42


vii
Hình 3.4: Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến khả năng ức chế enzyme
acetylcholinesterase của dịch chiết rong (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau
có ý nghĩa thống kê p < 0.05). .......................................................................................44
Hình 3.5: Khả năng ức chế enzyme acetylcholinesterase của dịch chiết rong ở các nồng
độ khác nhau ..................................................................................................................46
Hình 3.6: Khả năng ức chế enzyme acetylcholinesterase của các phận đoạn dung môi chiết
từ dịch chiết rong.............................................................................................................49


viii
DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 2.1: Phản ứng nhận biết một số hợp chất trong dịch chiết rong .......................... 31
Bảng 3.1: Thành phần hóa học có trong rong ............................................................... 35
Bảng 3.2: Định tính một số hợp chất có trong dịch chiết rong . ...................................36
Bảng 3.3: Giá trị IC50 của một số loài rong có khả năng ức chế enzyme
acetylchoinesterase ........................................................................................................47
Bảng 3.4: Khối lượng chất khô và hiệu suất chiết của các phân đoạn .......................... 48
Bảng 3.5: Giá trị IC50 của các phân đoạn dịch chiết rong .............................................50


ix
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
A: Absorbance (Độ hấp thụ)
AD: Alzheimer
Ach: Acetylcholin

AChE: Enzym actylcholinesterase
ACTI: Acetylthiocholine iodid
BuOH: Butanol
ChE: Cholinesterase
DTNB: Acid 5-5’-dithiobis-2-nitrobenzoic
EtOAc: Ethyl acetate
HIV: Human Immunodeficiency Virus Infection
HPLC: High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao)
IC50: Inhibitory Concentration 50% (Nồng độ ức chế 50%)
IU: International Unit (Đơn vị quốc tế)
MeOH: Methanol
pH: Hydrogen power (Chỉ số đo hoạt động của ion hydro)
SD: Standard Deviation (Độ lệch chuẩn)
TCL: Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng)
UV: Ultraviolet (Tia tử ngoại)


1
LỜI MỞ ĐẦU
Bệnh suy giảm trí nhớ (Alzheimer, AD) ngày càng phổ biến không chỉ đối với
người cao tuổi mà còn cả đối tượng trẻ. Người mắc bệnh Alzheimer bị mất dần khả năng
tự chăm sóc bản thân và ngày càng phụ thuộc vào người khác trong việc thực hiện các
hoạt động thể chất và tinh thần cơ bản nhất, đặc biệt giai đoạn cuối cần có sự chăm sóc
của người khác và theo dõi thường xuyên. Chi phí cho điều trị bệnh Alzheimer rất lớn,
trở thành gánh nặng cho gia đình và xã hội [15].
Acetylchoinesterase (AChE) là enzyme xúc tác quá trình thủy phân acetylcholine
(ACh) (một chất dẫn truyền thần kinh) thành cholin và acid acetic. Enzyme AChE có
mặt ở khe synap của hệ thần kinh trung ương, có vai trò duy trì sự ổn định nồng độ của
chất dẫn truyền thần kinh ACh [18]. AChE là enzyme có chức năng làm ngưng lại hoạt
động của chất dẫn truyền thần kinh acetylcholine tại các synapse thần kinh cholinergic

thông qua việc thủy phân acetylcholine tạo thành cholin và acid acetic. Ở các bệnh nhân
mắc bệnh AD, do có sự tích tụ các mảng amyloid và các đám rối thần kinh, khiến cho
nồng độ acetylcholine bị suy giảm đáng kể. Do vậy, các thuốc ức chế enzyme AChE
nhằm duy trì nồng độ ACh đóng một vai trò quan trọng trong việc ngăn chặn sự tiến
triển của bệnh AD [27]. Các thuốc điều trị bệnh hiện nay bao gồm rivastigmine,
galantamine, donepezil, memantine và memantine kết hợp với donepezil. Các thuốc này
đã được cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) phê duyệt [24]. Tuy
nhiên, người tiêu dùng ngày càng lo ngại về việc sử dụng các loại thuốc, và hướng tới
nhu cầu sử dụng các sản phẩm điều trị từ tự nhiên. Do đó nhu cầu nghiên cứu phát triển
thuốc mới có nguồn gốc từ tự nhiên để hỗ trợ và điều trị Alzheimer là rất cần thiết.
Rong biển được xem là một nguồn nguyên liệu dồi dào, rẻ và có giá trị khai thác.
Trong tương lai diện tích đất trồng ngày càng thu hẹp, rong biển được xem là nguồn
thực phẩm quan trọng của con người. Ở Khánh Hòa, với điều kiện khí hậu thuận lợi, bờ
biển dài có gần hàng trăm loài rong biển đã được định danh. Trong đó, ngành rong nâu
(Phaeophyta) chiếm số lượng khá lớn, đặc biệt là loài Sargassum. Ngành rong nâu là
nguồn tài nguyên giàu các hoạt chất sinh học với hoạt tính sinh học phong phú và đa
dạng, như chống oxy hóa, kháng nấm, kháng khuẩn, chống đông tụ, chống bức xạ UV,
và khả năng làm lành vết thương, tái tạo cấu trúc tế bào [51]. Một số nghiên cứu cho
thấy rong nâu chứa nhiều chất sinh học chẳng hạn như fucoidan, alginate, polyphenols,


2
phlorotanin và diệp lục…. [28]. Phạm Đức Thịnh (2015) đã tách hợp chất fucoidan từ
một số loài rong nâu tại vịnh Nha Trang và đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thư
[20]. Cuong và cộng sự (2016) đã đánh giá hoạt động chống oxy hóa của sáu loài
Sargassum từ vịnh Nha Trang [34].
Sargassum swartzii là một loài rong nâu phổ biến ở Khánh Hòa, theo Agardh loài
rong này tìm thấy nhiều ở Bãi Tiên, Nha Trang [10]. Một số nghiên cứu cho thấy loài
rong này có tiềm năng ứng dụng trong khoa học rất lớn: hoạt tính độc tế bào với ba dòng
tế bào gây ung thư màng tim, ung thư gan, và ung thư phổi trên người [17], tác dụng

giảm đau và chống viêm [46]. Rong Sargassum swartzii được thu hái ở nhiều địa điểm
trên thế giới cũng cho thấy nhiều các hoạt tính sinh học như: chống lại các dòng tế bào
ung thư [55], chống lại vectơ sốt rét Anophele stephensi [54], kháng khuẩn và chống
oxy hóa [88], chống HIV-1 [81]. Dịch chiết từ rong và các thành phần trong rong biển
đã được chứng minh trong nhiều nghiên cứu là có hoạt tính ức chế mạnh enzyme AChE
[43] [60] [67] [78] [92]. Các nghiên cứu chỉ ra rằng chiết xuất rong biển có tiềm năng
ứng dụng trong ức chế enzyme AChE, điều trị bệnh AD. Với nguồn tài nguyên rong
biển dồi dào nhưng đến nay ở Việt Nam các công trình nghiên cứu hoạt tính ức chế
enzyme AChE được thực hiện trên đối tượng rong biển vẫn còn hạn chế.
Xuất phát từ những vấn đề trên, đề tài “Nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme
acetylcholinesterase của dịch chiết từ rong Sargassum swartzii thu hoạch tại vùng
biển Khánh Hòa” được thực hiện nhằm xác định một số thành phần hóa học có trong
rong, điều kiện chiết thích hợp và phân đoạn giàu chất có hoạt tính ức chế enzyme AChE.
Từ đó tận dụng được nguồn rong biển dồi dào và thúc đẩy phát triển ngành nuôi trồng
rong biển.
Mục tiêu đề tài:
- Định tính và định lượng một số thành phần hóa học có trong rong Sargassum
swartzii.
- Xác định được điều kiện chiết thích hợp để thu nhận dịch chiết có hoạt tính ức
chế cao enzyme acetylcholinesterase rong Sargassum swartzii.
- Xác định được khả năng ức chế enzyme acetylcholinesterase của các phân đoạn
dung môi chiết từ rong Sargassum swartzii.


3
Đề tài gồm các nội dung chính như sau:
- Nghiên cứu định lượng và định tính một số thành phần hóa học có trong rong
Sargassum swartzii.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chiết (dung môi, nhiệt độ, thời gian và tỷ
lệ nguyên liệu/dung môi) đến hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase rong

Sargassum swartzii.
- Nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase của các phân đoạn
dung môi chiết từ rong Sargassum swartzii.
Ý nghĩa thực tiễn của đề tài:
- Kết quả của đề tài sẽ cung cấp dữ liệu khoa học về hoạt tính ức chế enzyme
acetylcholinesterase của rong Sargassum swartzii tại vùng biển Khánh Hòa. Dữ liệu này
là tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu sâu hơn về rong S. swartzii.
- Thành công của đề tài là cơ sở để phát triển một số thuốc hoặc thực phẩm chức
năng có khả năng hỗ trợ điều trị bệnh Alzheimer từ nguồn lợi rong biển. Qua đó tận
dụng và thúc đẩy ngành nuôi trồng rong biển, đưa lại lợi ích về kinh tế.


4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về bệnh Alzheimer và rong biển
1.1.1 Bệnh Alzheimer
1.1.1.1 Khái niệm về bệnh Alzheimer
Bệnh Alzheimer là một trong những nguyên nhân phổ biến dẫn đến suy thoái tinh
thần ở người cao tuổi, chiếm khoảng 50% - 60% trong tổng số các trường hợp mất trí
nhớ ở những người trên 65 tuổi [41]. Bệnh AD được mô tả là một bệnh thoái hóa của hệ
thần kinh trung ương, đặc trưng bởi sự suy giảm nhận thức rõ rệt, được xác định bằng
việc mất trí nhớ và khả năng học tập, cùng với việc giảm khả năng thực hiện các hoạt
động cơ bản trong cuộc sống hàng ngày, các kỹ năng ngôn ngữ, sự tập trung và sự chú
ý cũng bị ảnh hưởng. Điều này dẫn đến khả năng học hỏi và duy trì các kỹ năng mới
kém hiệu quả cũng như mất đi những kỹ năng hiện có [63].
Theo giả thuyết cholinergic, việc phát sinh bệnh Alzheimer có liên quan đến sự
thiếu hụt chất dẫn truyền thần kinh acetylcholin trong não tới gần 90% [37]. ACh là chất
dẫn truyền thần kinh tại khe synap có vai trò quan trọng trong hoạt động của hệ thần
kinh và nồng độ ACh được duy trì ổn định bởi enzyme AChE. AChE là một enzyme có
chức năng làm ngăn chặn các dẫn truyền xung động thần kinh tại các synap thần kinh

cholinergic thông qua việc thủy phân ACh tạo thành cholin và acid acetic [18] [63].
1.1.1.2 Thực trạng của bệnh
Hơn một nửa số bệnh nhân mắc chứng mất trí nhớ sống tại các quốc gia có thu
nhập thấp và trung bình. Ước tính có khoảng 5,8 triệu người Mỹ (81% ở độ tuổi 75 trở
lên) ở mọi lứa tuổi mắc chứng mất trí nhớ Alzheimer vào năm 2019, ước tính 5,6 triệu
người từ 65 tuổi trở lên và khoảng 200.000 người dưới 65 tuổi mắc bệnh Alzheimer
[24].
Thống kê tại châu Á có khoảng gần 13 triệu người, dự đoán đến năm 2050 số
lượng có thể tăng lên đến 62,8 triệu người. Theo một nghiên cứu về bệnh nhân mất trí
nhớ ở Thái Lan của Dharmasaroja (2017), bệnh nhân mắc chứng bệnh được điều trị tại
phòng khám thần kinh và tâm thần từ tháng 9 năm 2004 đến tháng 2 năm 2016. Kết quả
cho thấy có 207 bệnh nhân, tuổi trung bình là 77 tuổi. Bệnh Alzheimer là nguyên nhân
phổ biến nhất của chứng mất trí nhớ (55%). Thời gian trung bình từ chẩn đoán đến giai
đoạn tiến triển bệnh là 49 tháng [35]. Ở Việt Nam có khoảng hơn 9 triệu người. Đây


5
được coi là căn bệnh nặng nhất trong nhóm bệnh sa sút trí tuệ, hiện nay là mối quan tâm
hàng đầu trên toàn thế giới cũng như ở nước ta khi tuổi thọ trung bình ngày càng cao,
số người mắc bệnh ngày càng nhiều [11].
1.1.1.3. Đặc điểm lâm sàng của bệnh Alzheimer
Bệnh Alzheimer biểu hiện bằng giảm trí nhớ và những rối loạn nhận
thức khác, kèm theo các thay đổi về hành vi, cụ thể như sau [15]:
+ Giảm trí nhớ: là biểu hiện đầu tiên của bệnh và là triệu chứng đặc trưng nhất.
Trong giai đoạn đầu của bệnh trí nhớ giảm dần, giảm khả năng hiểu ngữ nghĩa, nhắc đi
nhắc lại một chi tiết. Khi bệnh tiến triển nặng hơn, bệnh nhân hầu như quên những thông
tin đã tiếp thu được từ trước, có thể quên tên người thân.
+ Mất ngôn ngữ: Giảm ngôn ngữ là triệu chứng nổi bật trong biểu hiện lâm sàng
của bệnh. Bệnh nhân diễn đạt ý nghĩ ngày càng khó, ngôn ngữ nghèo nàn, không lưu
loát, không hiểu hết lời nói của người đối diện, không thể tiếp xúc cùng lúc với nhiều

người. Trong giai đoạn sau của bệnh, bệnh nhân hoàn toàn mất giao tiếp, gây khó khăn
lớn cho mối quan hệ giữa bệnh nhân và người chăm sóc.
+ Mất khả năng sử dụng động tác: Đa số bệnh nhân AD ở giai đoạn nặng đều có
biểu hiện mất khả năng sử dụng động tác. Bệnh nhân mất khả năng chuyển một ý định
thành động tác, làm cho bệnh nhân khó thực hiện các hoạt động sinh hoạt hàng ngày.
+ Mất khả năng nhận biết: Bệnh nhân mất khả năng nhận mặt những người quen
và khả năng nhận diện đồ vật.
+ Suy giảm khả năng thực hiện hoạt động: bệnh nhân mất khả năng quản lý các
nhiệm vụ phức tạp như chi tiêu trong gia đình hoặc chuẩn bị bữa ăn.
+ Các triệu chứng về hành vi: bệnh nhân không thừa nhận bệnh, rối loạn tâm
thần, rối loạn cảm xúc và có thể dẫn đến kích động.
1.1.1.4. Các thuốc điều trị bệnh Alzheimer hiện nay
Các thuốc hiện đang sử dụng để điều trị triệu chứng liên quan đến nhận thức
trong bệnh AD. Hiệp hội Quản lý Thuốc và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã phê chuẩn
lưu hành một số thuốc dùng để điều trị các triệu chứng liên quan đến nhận thức của bệnh
AD [15] [24] [42]:


6
+ Donepezil được dùng để điều trị trong tất cả các giai đoạn của bệnh AD.
+ Rivastigmin được dùng để điều trị bệnh AD trong giai đoạn nhẹ và vừa.
+ Galantamin được dùng để điều trị bệnh AD trong giai đoạn nhẹ và vừa.
+ Memantin giúp điều hòa hoạt động của glutamate, một loại chất chuyển dẫn
truyền thần kinh khác liên quan đến quá trình ghi nhớ và học hỏi. Loại thuốc này được
cấp phép dùng để điều trị bệnh Alzheimer trong giai đoạn vừa và nặng.
+ Memantine kết hợp với donepezil
Ngoài ra để hỗ trợ điều trị bệnh hiệu quả, một số biện pháp điều trị kết hợp được
sử dụng. Đối với những bệnh nhân có các bệnh kèm theo như tăng huyết áp, đái tháo
đường và bệnh AD cần điều trị kết hợp với các bệnh này [15]. Các biện pháp bổ sung:
tạo ra một cuộc sống ổn định tránh căng thẳng hàng ngày và hỗ trợ thân nhân của người

bệnh về cách chăm sóc. Đồng thời, cần hỗ trợ thêm các hoạt động sinh hoạt trong cuộc
sống hàng ngày, hành vi và biện pháp hòa nhập xã hội có thể hữu ích [21].
1.1.2 Acetylcholine, enzyme acetylchoinesterase và giả thuyết cholinergic
1.1.2.1. Acetylcholine
Acetylcholine là chất dẫn truyền thần kinh và là một ester của choline và axit
acetic. Acetylcholine tìm thấy ở hành não, cầu não, thân não, não trung gian, thể vân,
vỏ não mới (nhiều nhất ở vùng vận động), trong tủy sống và các hạch thần kinh thực vật
đều chứa ACh. ACh đóng một vai trò quan trọng trong trí nhớ và học tập. Khi
một xung thần kinh đến đầu dây thần kinh, ACh lưu trữ trong các túi sẽ được giải phóng
và liên kết với một thụ thể sau synap, gây ra khử cực [18].
ACh là chất trung gian hóa học có mặt trong phần lớn các khe synap thần kinh
trung ương, thần kinh cơ, thần kinh thực vật. ACh được tổng hợp từ cholin và acetyl
Coenzym A do enzyme cholin acetyl transferase xúc tác phản ứng. Các chất trong túi
được giải phóng ở vị trí cuối dây thần kinh, khi đó ACh được giải phóng vào khe synap
gắn với thụ thể. ACh sau khi được giải phóng có thời gian bán thải rất ngắn vì sự có mặt
của enzyme AChE. Sau đó cholin được thu nhận lại vào tế bào thần kinh để tổng hợp
ACh. Do đó, những chất có tác dụng ức chế enzyme AChE sẽ kéo dài thời gian tồn tại
và thời gian hoạt động của ACh [24]. Quan sát ở một bệnh nhân Alzheimer có sự giảm
trầm trọng nồng độ chất dẫn truyền thần kinh ACh. Tình trạng này gây suy giảm khả


7
năng nhận thức đối với người bệnh. Quá trình thủy phân ACh trong não là một mục tiêu
quan trọng trong điều trị bệnh AD [37].

Hình 1.1: Quá trình tổng hợp acetylcholine

1.1.2.2. Enzyme acetylchoinesterase
Acetylchoinesterase là enzyme xúc tác quá trình thủy phân ACh thành cholin và
acid acetic, làm ngưng lại hoạt động của ACh. AChE có mặt ở khe synap của hệ

thần kinh trung ương, có vai trò duy trì sự ổn định nồng độ của chất dẫn truyền thần
kinh ACh [18]. Hoạt động của enzyme AChE ở các tế bào thần kinh vận động cao hơn
so với tế bào thần kinh cảm giác. AChE cũng được tìm thấy trong màng tế bào hồng
cầu. Enzyme này tồn tại ở nhiều dạng phân tử, có tính chất xúc tác tương tự, nhưng khác
nhau về sự lắp ráp oligomeric và chế độ gắn vào bề mặt tế bào [33].
Enzyme AChE là một protein hình elip chứa một rãnh sâu, được gọi là hẻm. Ở
đáy của hẻm, có 4 vị trí hoạt động chính là vị trí este hóa, 14 vị trí oxy-anion, vị trí anion
và túi acyl [59]. AChE là một trong những enzyme thủy phân nhanh nhất. Hoạt tính
mạnh gấp khoảng 10 lần so với serin protease và butyrylcholinesterase (enzyme thủy
phân ACh chủ yếu ở tế bào thần kinh đệm) ở cùng điều kiện pH và nhiệt độ [42]. Khi
ACh được đưa đến trước màng khe synap, sau đó được giải phóng vào khe synap và liên
kết với các thụ thể dẫn truyền thần kinh, khi gặp enzyme AChE thì enzyme này sẽ thủy
phân ACh tạo thành choline và acid acetic làm ngưng hoạt động dẫn truyền thần kinh.
Choline được bơm trở lại màng trước synap nhờ chất mang và được tái sử dụng cho quá
trình tổng hợp tiếp theo. Tuy nhiên khi có chất đối kháng acetylcholinesterase liên kết
với enzyme sẽ làm ngăn cản quá trình thủy phân ACh và khi đó ACh có thể tiếp tục thực
hiện vai trò dẫn truyền thần kinh. Việc giữ cho chu kỳ hoạt động của ACh ổn định trong
não sẽ giúp duy trì khả năng ghi nhớ và nhận thức của con người [19].


8
1.1.2.3 Giả thuyết cholinergic
AChE chủ yếu có mặt trong hệ thần kinh trung ương, xúc tác thủy phân chất dẫn
truyền ACh. Quá trình này cần thiết để chuyển tế bào thần kinh hệ cholinergic từ trạng
thái hoạt động sang trạng thái nghỉ. Ở bệnh nhân Alzheimer thấy có sự giảm trầm trọng
nồng độ chất dẫn truyền thần kinh ACh. Tình trạng này gây suy giảm khả năng nhận
thức đối với người bệnh. Giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic trong bệnh Alzheimer
được đưa ra lần đầu tiên vào năm 1982 bởi tác giả Whitehouse và cộng sự. Sau đó, giả
thuyết này nhanh chóng trở thành động lực cho quá trình nghiên cứu theo hướng cải
thiện chức năng cho hệ cholinergic trên bệnh nhân mắc bệnh Alzheimer. Theo giả thuyết

này, những chất ức chế sự hoạt động của enzyme AChE làm tăng nồng độ và thời gian
hoạt động của ACh ở synap thần kinh từ đó cải thiện triệu chứng bệnh [70] [89].
1.1.3. Tổng quan về rong biển và rong mơ Sargassum swartzii
1.1.3.1 Rong biển
Rong biển từ lâu được biết đến là nguồn thực phẩm quan trọng của con người.
Rong biển là nhóm thực vật bậc thấp, sống ở vùng ven biển và biển. Rong biển có cấu
tạo đơn bào hay đa bào sống thành quần thể, có kích thước hiển vi hoặc có loài dài hàng
chục mét. Hình dạng đa dạng, có thể là hình cầu, hình sợi, hình phiến lá hay hình thù rất
đặc biệt [12]. Dựa vào thành phần cấu tạo, sắc tố, đặc điểm hình thái và sinh sản rong
biển được chia thành 3 ngành: rong đỏ (Rhodophyta), rong nâu (Phaeophyta) và rong
lục (Chlorophyta) [72].
Rong biển có khả năng thích nghi với điều kiện môi trường biển khắc nghiệt bằng
cách sản xuất nhiều hợp chất hoạt tính sinh học. Rong biển được biết đến là một nguồn
giàu vi chất và vi lượng (khoáng chất, hợp chất phenolic, carotenoid, protein và
polysacaride) với các hoạt động chống oxy hóa, kháng nấm, kháng khuẩn, chống đông
tụ, khả năng làm lành vết thương, điều trị dị ứng, tiểu đường, viêm, tăng huyết áp [56].
Rong biển có vai trò quan trọng đối với hệ sinh thái biển và đời sống của con người.
Ngoài giá trị về môi trường, rong biển góp phần giảm khí thải nhà kính, làm sạch môi
trường, hấp thụ kim loại nặng tại các vùng biển ô nhiễm, thì còn có giá trị sinh thái như
tham gia vào các chu trình dinh dưỡng của thủy vực, là nơi sống, trú ẩn, kiếm ăn của
nhiều loài sinh vật biển nhất là thời kỳ con non [9] [66]. Ngoài ra, rong biển còn có giá
trị lớn đối với đời sống con người như cung cấp nguyên liệu cho các ngành công nghiệp


9
chế biến (chiết xuất keo agar, alginat, carrageenan,…), làm thực phẩm và thuốc chữa
bệnh. Đồng thời, rong biển còn là nguyên liệu dồi dào cho công nghiệp sản xuất thức ăn
cho gia súc và phân bón [9].
1.1.3.2. Rong mơ Sargassum swartzii

Hình 1.3: Rong Sargassum swartzii

Ngành: Phacophyta
Lớp: phaeophyceae
Bộ: Fucales
Họ: Sargassaceae
Chi: Sargassum
Loài: Sargassum swartzii
» Đặc điểm hình thái và phân bố
Rong mơ Sargassum swartzii có nhánh đẹp và nhẵn, lá hình đường có răng cưa
thưa. Túi khí hình trứng đến bầu dục, không gai. Rong dài 1 đến 1,5 m, mọc trên đá
vùng dưới triều, nơi sóng vừa [10]. Rong có đĩa bám hình nón rộng 1 cm, thường các
đĩa bám hay dính nhau. Đế hình trụ, mọc thành chùm dày, phân nhánh, đôi khi hơi dẹp,
có ít răng, dài 4-5 mm. Trục chính ngắn 4-5 mm, mang nhiều nhánh chính dẹp như dây
nịt, rọng 2-2,5 mm, nhánh bên nhiều, mọc dày. Lá dày, dai, hình mũi giáo dài 4-6 cm,
rộng 5-7 mm, mép lá nguyên, dợn sóng, gân giữa rõ, suốt đỉnh, ổ lông nhỏ, rải rác, cuống
lá thon, ở các nhánh phía trên lá mọc dày, nhỏ hơn, dài 2-3 cm, rộng 2-4 mm. Phao ít,


10
hình xoan, to 2-4 mm, có vài cái to 4-6 mm, cọng thường to, dài bằng phao hoặc hơn.
Phao thường không có gai. Rong dạng khô có màu nâu đậm [3].
Sargassum swartzii là một loài rong nâu phổ biến ở nước ta, phân bố ở các tỉnh
Đà Nẵng, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận và Kiên Giang. Rong trưởng thành vào
các tháng 5-6 [4]. Theo Agardh (2004) loài rong này tìm thấy nhiều ở Bãi Tiên, Nha
Trang [10].
» Ứng dụng trong nghiên cứu
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng rong mơ Sargassum swartzii có hoạt tính sinh
học cao. Nguyễn Duy Nhứt và cộng sự (2009) đã nghiên cứu đặc điểm fucoidan trong
rong S. swartzii thu hoạch tại Khánh Hòa. Fucoidan tách từ loài rong này cho thấy hoạt

tính độc tế bào với ba dòng tế bào gây ung thư màng tim, ung thư gan, và ung thư phổi
trên người [17]. Tác dụng giảm đau và chống viêm của chiết xuất methanolic từ loài
rong biển này đã được Hong và cộng sự (2011) nghiên cứu. Kết quả cho thấy rong S.
swartzii có thể được sử dụng như một phương thuốc hiệu quả cho điều trị các triệu chứng
viêm và tác dụng giảm đau [46].
Rong Sargassum swartzii thu hái ở nhiều địa điểm khác nhau trên thế giới cũng
cho thấy nhiều tiềm năng ứng dụng nổi bật. Khanavi và cộng sự (2010) đã đánh giá hoạt
động gây độc tế bào từ chiết xuất methanol và một số phân đoạn (hexane, chloroform,
ethyl acetate) của loài rong này thu hái ở Vịnh Ba Tư. Kết quả nghiên cứu cho thấy các
chiết xuất đều có tác dụng chống lại các dòng tế bào ung thư [55]. Một số nghiên cứu
khác cho thấy rong Sargassum swartzii có nhiều hoạt tính sinh học như: chống lại vectơ
sốt rét Anophele stephensi [54]; khả năng chống oxy hóa tự nhiên tốt và tác dụng kháng
khuẩn [88] và hoạt động chống HIV-1 [81]. Từ một số nghiên cứu kể trên cho thấy rằng
rong S. swartzii có tiềm năng nghiên cứu và ứng dụng rất lớn trong y học.
1.2. Cơ sở lý thuyết
1.2.1 Một số phương pháp thường dùng trong nghiên cứu đánh giá hoạt tính ức
chế enzyme acetylcholinesterase.
Phương pháp thử nghiệm để xác định hoạt tính của enzyme AChE, gồm có:
phương pháp đo quang, phương pháp điện di, phương pháp huỳnh quang với cơ chất
phát huỳnh quang, phương pháp sử dụng thang pH hay xác định hoạt độ điện hóa của


11
enzyme AChE. Đối với nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzyme AChE in vitro, có
2 phương pháp thường được sử dụng nhiều nhất là phương pháp sử dụng thuốc thử
Ellman và phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B.
1.2.1.1 Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman
Trong số những phương pháp được sử dụng để đánh giá tác dụng ức chế enzyme
AChE in vitro, phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman được xây dựng và ứng dụng sớm
nhất. Hiện nay, phương pháp này vẫn được sử dụng khá phổ biến, trong đó phương pháp

đo quang được sử dụng nhiều hơn phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học. Phương pháp
này sử dụng cơ chất là acetylthiocholin iodid (ATCI) và thuốc thử là 5,5'-dithiobis-(2nitrobenzoic acid) (DTNB) [39].
 Phương pháp đo quang
Phương pháp của Ellman dùng để xác định hoạt tính của enzyme AChE dựa vào
đo quang được tác giả mô tả lần đầu tiên vào năm 1961. Nguyên tắc của phương pháp
là cơ chất ATCI bị thủy phân nhờ xúc tác của enzyme AChE tạo thiocholin. Thiocholin
phản ứng với thuốc thử DTNB giải phóng ra hợp chất 5-thio-2-nitrobenzoic acid có màu
vàng. Hợp chất này được xác định bằng cách đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng
412 nm. Dựa trên phương pháp này nhiều nghiên cứu sàng lọc về tác dụng ức chế
enzyme AChE in vitro khác tiếp tục được thực hiện. So với phương pháp gốc được công
bố bởi Ellman, phương pháp được triển khai trong các nghiên cứu sau đó đều có một số
thay đổi về: nguồn gốc và hoạt độ của enzyme, loại đệm sử dụng, nồng độ dung dịch cơ
chất và thuốc thử, tỷ lệ phối hợp của chúng vào hỗn hợp phản ứng [39].
 Phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học
Trên cơ sở phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman, phương pháp sắc
ký lớp mỏng sinh học đã được phát triển. Ở phương pháp này, sau khi bản mỏng được
triển khai, hỗn hợp gồm dung dịch thuốc thử DTNB và cơ chất ATCI được phun lên bản
mỏng, sau đó phun dung dịch enzyme. Những chất gây ức chế enzyme AChE sẽ làm
xuất hiện các vết màu trắng trên nền vàng. Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp sắc ký
lớp mỏng sinh học là có thể gặp phải hiện tượng dương tính giả, hiện tượng vết màu
trắng xuất hiện trên bản mỏng không phải do tác dụng ức chế enzyme AChE. Để khắc
phục hạn chế này, cần tiến hành làm thí nghiệm với một bản mỏng khác (bản đối chiếu).


12
Các bước tiến hành trên bản đối chiếu tương tự trên bản thử chỉ khác ở giai đoạn phun
thuốc thử hiện màu. Đối với bản thử, hỗn hợp dung dịch thuốc thử DTNB và cơ chất
ATCI được phun trước, sau đó mới phun dung dịch enzyme AChE. Với bản đối chiếu,
dung dịch thuốc thử DTNB được phun trước, sau đó mới phun hỗn hợp gồm dung dịch
cơ chất ATCI và dung dịch enzyme AChE. Cách bố trí thử nghiệm như trên nhằm đảm

bảo những vết màu trắng xuất hiện trên cả hai bản là những vết cho phản ứng dương
tính giả [23].
1.2.1.2. Phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B
Phương pháp thuốc thử muối Fast Blue B sử dụng cơ chất là α-naphthyl acetat
và thuốc thử là muối Fast Blue B (muối O-dianisidin bis (diazotized) zinc double). Số
lượng nghiên cứu sử dụng phương pháp này để đánh giá tác dụng ức chế AChE in vitro
còn hạn chế.
 Phương pháp đo quang
Thử nghiệm đo quang sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B được công bố lần đầu
tiên bởi Van Asperen vào năm 1962 [87]. Nguyên tắc của phương pháp: cơ chất αnaphthyl acetat bị thủy phân bởi enzyme esterase giải phóng chất α-naphthol. Sau đó αnaphthol phản ứng với thuốc thử muối Fast Blue B tạo thành sản phẩm màu diazo. Hợp
chất này được xác định bằng cách đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 600 nm.
Tuy nhiên, không có nhiều nghiên cứu sử dụng phương pháp này để nghiên cứu sàng
lọc tác dụng ức chế enzyme AChE in vitro và một trong số đó là nghiên cứu của tác giả
Di Giovanni. Phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu của tác giả này có một số
thay đổi so với phương pháp của tác giả Van Asperen về nguồn gốc và hoạt độ của
enzyme, hóa chất để bất hoạt enzyme và nồng độ dung dịch cơ chất [37].
 Phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học
Muối Fast Blue B cũng được sử dụng như một loại thuốc thử trong phương pháp
sắc ký lớp mỏng sinh học để nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzyme AChE in
vitro. Ở phương pháp này, dung dịch enzyme được phun lên bản mỏng sau khi bản mỏng
được triển khai. Sau đó, hỗn hợp gồm dung dịch cơ chất α-naphthyl acetat và dung dịch
thuốc thử muối Fast Blue B được phun lên bản mỏng. Những chất gây ức chế enzyme
AChE sẽ làm xuất hiện các vết màu trắng trên nền màu tím sẫm [35]. Giống phương


13
pháp TLC sử dụng thuốc thử Ellman, phương pháp BTLC sử dụng thuốc thử muối Fast
Blue B cũng có thể gặp phải hiện tượng dương tính giả. Một bản mỏng đối chiếu tương
tự với bản mỏng thử được triển khai. Sau đó, các dung dịch α-naphthol và muối Fast
Blue B được phun lên bản mỏng mà không có dung dịch enzyme. Nếu xuất hiện vết màu

trắng thì vết đó là vết dương tính giả. Ngoài ra, phương pháp điện di mao quản cũng đã
được sử dụng để nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzyme AChE in vitro trong
nghiên cứu của Tang (2007) [82]. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi phải có trang
thiết bị phù hợp với thao tác thử nghiệm tương đối phức tạp. Và phương pháp này hạn
chế về số lượng mẫu thử được đánh giá ở mỗi lần thao tác máy cũng góp phần cản trở
việc ứng dụng phương pháp điện di mao quản trong nghiên cứu sàng lọc.
Ở nghiên cứu này phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman được lựa
chọn. Nghiên cứu thừa kế các nghiên cứu trước, đồng thời phương pháp đo quang thuận
lợi hơn về khả năng thử nghiệm đồng thời nhiều mẫu khác nhau, khả năng tự động hóa
và lượng mẫu cần cho từng phản ứng ít. Hơn nữa, phương pháp đo quang sử dụng máy
chuyên dụng để đánh giá nên kết quả thu được là chính xác, đáng tin cậy và tiết kiệm
thời gian.
1.2.2. Cơ sở khoa học của quá trình chiết
Chiết xuất (hay trích ly) là quá trình tách chiết chất hòa tan trong chất lỏng hay
chất rắn bằng một chất lỏng khác. Chiết là phương pháp dùng một dung môi (đơn hay
hỗn hợp) để tách lấy một hay một nhóm chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu. Sản phẩm thu
được là một dung dịch các chất hòa tan trong dung môi, được gọi là dịch chiết. Có 3 quá
trình xảy ra đồng thời trong quá trình chiết xuất là: Sự hòa tan của chất tan vào dung
môi. Sự khuếch tán của chất tan trong dung môi. Sự dịch chuyển của các phân tử chất
tan qua vách tế bào của thực vật [6].
Quá trình chiết gồm 2 giai đoạn chính [6]:
- Giai đoạn 1: Dung môi thấm ướt lên bề mặt nguyên liệu, sau đó dung môi thấm
sâu vào bên trong nguyên liệu nhờ quá trình thẩm thấu. Với sự tương đồng về độ phân
cực giữa dung môi và các hoạt chất bên trong nguyên liệu, các hoạt chất hòa tan dần vào
dung môi.


14
- Giai đoạn 2: Do sự chênh lệch nồng độ của các chất hòa tan giữa bên trong
nguyên liệu và bên ngoài nên các chất hòa tan sẽ theo dung môi khuếch tán ra bên ngoài

màng tế bào cho đến khi cân bằng nồng độ chất tan bên ngoài và bên trong nguyên liệu.
1.2.2.1 Một số phương pháp chiết truyền thống
Tách chiết bằng dung môi là quá trình tách và phân ly các chất dựa vào quá trình
chuyển một chất tan trong một pha lỏng vào trong một pha lỏng khác không hòa tan với
nó, nhằm mục đích chuyển một lượng nhỏ chất nghiên cứu trong một thể tích lớn dung
môi này vào một thể tích nhỏ dung môi khác, nhằm nâng cao nồng độ của chất cần
nghiên cứu. Đồng thời việc chiết thành cao dịch thô là vô cùng quan trọng vì khi đó giữ
được hoạt chất tốt hơn và dễ dàng bảo quản sử dụng cho công đoạn sau [6].
 Chiết bằng phương pháp ngấm kiệt (Percolation)
Phương pháp ngấm kiệt là quá trình chiết liên tục, dung môi đã bão hòa hoạt chất
sẽ được liên tục thay thế bằng dung môi mới. Mẫu được ngâm trong dung môi khoảng
12 giờ, cho dung môi bão hòa chảy ra rồi thay thế bằng dung môi mới và tiếp tục quá
trình tách chiết. Ngấm kiệt là một trong những phương pháp trích ly được sử dụng phổ
biến nhất, không đòi hỏi nhiều thao tác [6].
 Chiết bằng phương pháp ngâm dầm (Maceration)
Phương pháp ngâm dầm là phương pháp ngâm nguyên liệu trong bình chứa thủy
tinh có nắp đậy. Dung môi được rót vào đủ để phủ lớp mẫu, thực hiện quá trình chiết ở
điều kiện nhiệt độ theo yêu cầu, dung môi sẽ thấm vào nguyên liệu và hòa tan các chất
tự nhiên trong đó. Sau một thời gian dung môi trong bình được đổ ra và rót môi mới vào
[6].
 Tách chiết bằng phương pháp chiết hồi lưu
Chiết hồi lưu là một trong những phương pháp chiết truyền thống sử dụng phổ
biến trong phòng thí nghiệm. Sự đun hồi lưu là sự chuyển chất trở lại môi trường phản
ứng thông qua hệ thống ngưng tụ. Cơ sở của phương pháp này là sự tách các chất có
nhiệt độ sôi khác nhau ra khỏi hỗn hợp của chúng. Ưu điểm của chiết hồi lưu là sử dụng
một lượng ít dung môi mà vẫn có thể chiết kiệt được hoạt chất trong nguyên liệu. Quá
trình chiết suất diễn ra tự động, liên tục nên nhanh chóng. Tuy nhiên, nhược điểm của