Nghiên cứu xậy dựng vân tay sắc ký của một số loài thuộc chi Dây thìa canh (Gymnema R.Br)

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÂN
TAY SẮC KÝ CỦA MỘT SỐ LOÀI
THUỘC CHI DÂY THÌA CANH
(Gymnema R.Br)
Người thực hiện: Nguyễn Việt Cường
Người hướng dẫn: ThS. Phạm Thị Linh Giang
Nơi thực hiện: Bộ môn Thực vật


BỐ CỤC
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ


1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Ayurveda 2000 năm

Đái tháo đường

Acid gymnemic
Contos
o

1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Gymnema latifolium

Gymnema inodorum

Gymnema yunnanense
Contos
o


1. ĐẶT VẤN ĐỀ
R

3

R

R
H

R

R

4

H
R

5

R

2

R

OH
R1

R1

5

6

R3

Khung saponin chính
trong loài G. latifolium
CH 2R

OR 1

2

H

H

Khung saponin chính trong loài
G. sylvestre nguồn gốc Việt Nam

Khung saponin chính trong loài
G. sylvestre nguồn gốc Ấn Độ

4

4

OR 2
OH

R

OR

R3

HOOC

Khung saponin chính
trong loài G. yunnanense

OH

O

OH

R 3O

HO

O
CH 2R
OR

2

6

OR

5

1

Khung saponin chính
trong loài G. inodorum

Contos
o


1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Contos
o

1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Xây dựng vân tay sắc ký một số loài thuộc
chi Gymnema bằng phương pháp HPTLC,
từ đó xây dựng cây phân loại dựa trên thành
phần hóa học (SKĐ) của các mẫu NC
Các mục tiêu:

Ứng dụng kết quả nghiên cứu để so sánh sự
thay đổi về thành phần hóa học theo giai
đoạn sinh trưởng và phân tích sắc ký đồ của
một số mẫu Dây thìa canh thu được trên thị
trường

Contos
o


2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mẫu nghiên cứu
Chia làm 3 nhóm: N1- Mẫu nghiên cứu XD vân tay sắc ký theo loài: Gồm
12 mẫu thuộc 4 loài:
G. sylvestre

G. latifolium

G. yunnanense

G. inodorum

GS1,GS2,GS3, GS4, GS5

GL1, GL2, GL3, GL4, GS5

GY

GI

Địa điểm thu mẫu: 3 mẫu GS3 (Hải Hậu, Nam Định), GS4 (Lệ Thủy, Quảng
Bình) và GS5 (Ngư Thủy, Quảng Trạch, Quảng Bình) thu ở dạng dược liệu
đã khô; GI thu ở Kim Bôi, Hòa Bình dạng tươi; các mẫu còn lại thu tươi ở
vùng trồng DTC Phú Lương, Thái Nguyên; đều đã được gám định tên khoa
học; lưu tiêu bản tại HNIP.
Thời điểm thu mẫu: Tháng 5 và đầu tháng 6 năm 2020
Contos
o


2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mẫu nghiên cứu

Lá non

G. sylvestre/
1

N2- Mẫu nghiên
cứu sự thay đổi
thành phần hóa
học theo thời kỳ

sinh trưởng:

16/5/2020, Yên Ninh,

Dây thìa canh lá Phú Lương, Thái
nhỏ

Nguyên

6
7
8
9

G. latifolium/
Dây thìa canh
lá to

16/5/2020, Yên Ninh,
Phú Lương, Thái

10

Nguyên
G.

11

Bánh tẻ

GS1a

Non

GS1b

Bánh tẻ
Non
Bánh tẻ
Non
Bánh tẻ
Non
Bánh tẻ
Non
Bánh tẻ

GL1a
GL1b
GL2a
GL2b
GL3a
GL3b
GL4a
GL4b
GL5a

Non

GL5b

Bánh tẻ

GYa

Non

GYb

Bánh tẻ
Non

GIa
GIb

yunnanense/
Dây thìa canh
Vân Nam

12

Lá bánh tẻ

G. inodorum

T6/2020, Kim Bôi,
Hòa Bình

Contos
o

2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mẫu nghiên cứu
N3- Mẫu nghiên cứu xác định loài: Là các mẫu thu trên thị trường
STT
13
14
15
16

Thời gian, địa điểm thu mẫu

Dạng mẫu lúc thu

Ký hiệu trong

mua

nghiên cứu

T6/2020, sản phẩm Trà dây thìa canh đặc

GX1

biệt của công ty DK natura, Thái Nguyên
T6/2020, chợ thuốc Lãn Ông, Hà Nội
T5/2020, sản phẩm từ công ty Dược liệu
Indochina Herb, Hà Nội
T6/2020, mua tại chợ ở Kim Bôi, Hòa Bình

Dược liệu khô gồm
cành và lá

GX2
GX3
GX4

Contos
o


2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mẫu được sơ chế và chuẩn bị theo 2 quy trình chiết xuất: chiết toàn phần
và chiết thủy phân

Chiết toàn phần

Siêu âm
30’ với
EtOH
70% x3
lần

Gộp dịch
lọc, cô
cắn

Pha trong
MeOH làm
dịch chấm

TLC

Contos
o


Chuẩn bị dịch chiết sau thủy phân

Siêu âm
1h, lọc

Tủa
lạnh,
rửa tủa

Siêu âm
KOH 2%, 60
độ

Cx khoảng
2g bột lá
+
MeOH/HCl
2,5N, 60 độ

Cô cắn,
hòa nước

Lắc EA 3
lần, thu

lớp EA
Hòa MeOH, dịch
chấm HPTLC

Cô thu hồi
EA
Contos
o


2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
2.1. Để khảo sát một số thông số của quy trình phân
tích vân tay
sắcbị
kýmẫu
cácphân
mẫutích
nghiên
cứu
Chuẩn
và dung
dịch
chuẩn
a

d

Lựa chọn hệ dung môi pha động
Khảo sát 8 hệ dung môi pha động để chọn được hệ

b
dung môi có hiệu lực tách tốt nhất
Khảo sát thể tích chấm
mẫu
c
Khảo sát thể tích chấm mẫu tối ưu với từng cách
Triển
khai sắc ký lớp
chiết
mỏng
Khai triển SKLM bằng hệ thống CAMAG, phân tích SKĐ
Contos
dưới ánh sáng 366nm, 254nm, ánh sáng thường trước
và
o
phun thuốc thử vanilin-sulfuric


2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Để xây dựng vân tay hóa học của một số loài thuộc chi Gymnema
R.Br.
Xây dựng sắc ký đồ dịch chiết trước và sau thủy phân theo các điều
kiện phân tích HPTLC tối ưu, chụp ảnh bản mỏng, phân tích số lượng, màu
sắc, Rf của các vết trên SKĐ tương ứng các mẫu trong cùng loài và giữa
các loài với nhau để tìm ra vết đặc trưng chi/ loài/ giống.

Contos
o

2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Để xây dựng cây phân loại dựa trên thành phần hoá học (sắc ký
đồ) của các mẫu nghiên cứu.
- Tiến hành thống kê đặc điểm SKĐ thu được, mã hóa nhị biến sự có mặt
của các vết trên SKĐ, tính hệ số tương đồng Nei&Li giữa các mẫu trong
nghiên cứu
- Sử dụng PP khoảng cách liên kết trung bình UPGMA xây dựng cây phân
loại thành phần hóa học bằng phần mềm NTSYSpc 2.1

Contos
o


2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Để so sánh sự thay đổi về thành phần hóa học theo giai đoạn sinh
trưởng
Tiến hành so sánh sắc ký đồ về màu sắc, Rf, diện tích pic trên SKĐ và
tiến hành chồng phổ của các mẫu mẫu non và bánh tẻ của cùng một cây
nhằm bước đầu đánh giá sự thay đổi của thành phần hóa học theo giai
đoạn sinh trưởng của các mẫu nghiên cứu dựa trên các sắc ký đồ thu
được.

Contos
o


2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5. Để ứng dụng phân tích sắc ký đồ của một số mẫu Dây thìa canh
thu được trên thị trường
Tiến hành so sánh số lượng, màu sắc, Rf trên sắc ký đồ và tiến hành

chồng phổ của các mẫu Dây thìa canh trên thị trường với sắc ký đồ của các
mẫu nghiên cứu để có kết luận ban đầu về sự xuất hiện của các loài
Gymnema trong các mẫu Dây thìa canh thu được trên thị trường.

Contos
o


3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Kết quả khảo sát một số thông số của quy trình phân tích vân tay sắc ký các
mẫu nghiên cứu (trên mẫu GS1a)
Với dịch chiết toàn phần:
Hệ số 4 EA: MeOH: Nước (100:17:13), thể tích chấm mẫu 1,5µl

Contos
o


3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả khảo sát một số thông số của quy trình phân tích vân tay sắc ký
các mẫu nghiên cứu (trên mẫu GS1a)
Với dịch chiết sau thủy phân:
Hệ số 7 Toluen: EA: Acid formic (5:4:1), thể tích chấm mẫu 10 µl

Contos
o


3.1. Kết quả xây dựng vân tay sắc ký hóa học một số loài thuộc chi Gymnema R.Br

Với dịch chiết toàn phần

Các vết có nhiều điểm tương đồng nhau, 6 vết xuất hiện ở
tất cả các mẫu NC trong đó 3 vết tương đối đặc trưng

0,60
0,55
0,39

Contos
o


3.1. Kết quả xây dựng vân tay sắc ký hóa học một số loài thuộc chi Gymnema R.Br

Với dịch chiết toàn phần

Với mẫu thuộc loài DTC lá nhỏ: 0,11; 0,33; 0,49; 0,65;
0,70; 0,78.

0,70

Contos
o


Với mẫu thuộc loài DTC lá to và Dây thìa canh nhập nội

Với dịch chiết toàn phần

(GS2) 7 vết chung trên bản sau phun TT. Đặc biệt GS2-0,39;
GLx-0,55 huỳnh quang sáng dưới UV 366nm trước phun.

0,55
0,39

Contos
o


Với dịch chiết toàn phần

Với mẫu thuộc loài DTC inodorum: Vết 0,08 (Tím) và
0,22 (xám) ánh sáng trắng sau phun TT.

0,22
0,08
Contos
o


Với dịch chiết toàn phần

Với mẫu thuộc loài DTC inodorum: Đặc biệt nhất 3
vết trước phun thuốc thử soi ở UV 366nm.

0,70

0,38
0,22

Contos
o


Với dịch chiết toàn phần

Với mẫu thuộc loài DTC Vân Nam: Không có nhiều
khác biệt (0,28)

0,28

Contos
o