Khảo sát thành phần hóa học và khả năng kích thích hệ miễn dịch của cỏ sữa lá lớn (euphorbia hirta l ) vùng đồng bằng sông cửu long trên đối tượng cá tra tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

----------------------------LÊ THỊ BẠCH

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ
KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH HỆ MIỄN DỊCH
CỦA CỎ SỮA LÁ LỚN (Euphorbia hirta L.)
VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG
TRÊN ĐỐI TƯỢNG CÁ TRA

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 9.44.01.14

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

TP Cần Thơ – Năm 2020


Công trình được hoàn thành tại:
+ Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng, Học viện Khoa học và
Công nghệ – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
+ Trường Đại học Catholique de Louvain, Bỉ
+ Viện Công nghệ Kyoto, Nhật Bản Học viện Khoa học và Công
nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Người hướng dẫn khoa học 1: …

Người hướng dẫn khoa học 2: ….

Phản biện 1: …
Phản biện 2: …
Phản biện 3: …

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ, họp tại
Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng, Học viện Khoa học và Công nghệ
- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ..’,
ngày … tháng … năm 20…

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ
- Thư viện Quốc gia Việt Nam


GIỚI THIỆU LUẬN ÁN
1. Tính cấp thiết của luận án
Ngành thủy sản Việt Nam gần đây đã phát triển mạnh mẽ và
giữ vai trò quan trọng trong xuất khẩu. Tuy nhiên, đi đôi với việc
phát triển nuôi trồng thủy sản thì dịch bệnh cũng bùng phát mạnh mẽ
và gây thiệt hại đáng kể. Việc sử dụng thuốc và hóa chất sẽ gây ra
nhiều trở ngại cho nghề nuôi như sự kháng thuốc của vi khuẩn ngày
càng nhiều, ô nhiễm môi trường nuôi, sự tồn lưu thuốc trên cá
thương phẩm ảnh hưởng đến sức khoẻ của người tiêu dùng và cũng
là rào cản cho các doanh nghiệp Việt Nam trong xuất khẩu thủy sản.
Để hạn chế dịch bệnh cũng như việc sử dụng thuốc và hóa chất trong
nuôi trồng thủy sản, một số giải pháp được nhiều người quan tâm và
áp dụng trong các mô hình nuôi thủy sản. Trong đó, sử dụng thảo
dược để thay thế kháng sinh, tăng cường hệ miễn dịch cho vật nuôi

và kéo dài thời gian bảo quản sản phẩm thủy sản đang là hướng đi
mới cho ngành thủy sản hiện nay.
Với sự khác biệt lớn về khí hậu, từ vùng gần xích đạo tới giáp
vùng cận nhiệt đới, cùng với sự phân hóa cao về địa hình đã góp
phần tạo nên sự đa dạng về hệ sinh thái nói chung cũng như hệ thực
vật nói riêng ở Việt Nam. Bên cạnh đó, Việt Nam là một trong
những quốc gia có nền y học cổ truyền lâu đời sử dụng nhiều loại
thảo dược trong điều trị bệnh và tăng cường sức khoẻ. Đây là nguồn
hợp chất thiên nhiên vô cùng quý báu cần được nghiên cứu về mặt
hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học để tìm ra các hoạt chất có thể
sử dụng làm thuốc phục vụ cho đời sống, hướng nghiên cứu này
đang được nhiều nhà khoa học quan tâm.
1


Cây Cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.), theo Đông y có nhiều
tác dụng. Ngoài ra, theo kết quả sàng lọc ban đầu trên tác dụng tăng
cường hệ miễn dịch cá tra của 20 loài dược thảo, Cỏ sữa lá lớn thể
hiện hoạt tính khá tốt. Tuy nhiên, các nghiên cứu về thành phần hóa
học và hoạt tính sinh học của loài này ở Việt Nam chưa nhiều. Do
vậy đề tài: “Khảo sát thành phần hóa học và khả năng kích thích
hệ miễn dịch của Cỏ sữa lá lớn vùng Đồng bằng sông Cửu Long
trên đối tượng cá tra” được thực hiện nhằm đóng góp thêm những
hiểu biết về thành phần hóa thực vật cũng như tác dụng sinh học của
loài Cỏ sữa lá lớn ở Việt Nam.

2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án
Nghiên cứu thành phần hóa học chủ yếu của Cỏ sữa lá lớn
nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học, làm cơ sở khoa
học cho những nghiên cứu tiếp theo để tạo ra sản phẩm ứng dụng

trong thủy sản nói riêng hay cuộc sống nói chung.

3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án
1. Sàng lọc các loài dược thảo có hoạt tính tăng cường hệ miễn
dịch trên cá tra;
2. Phân lập các hợp chất từ toàn cây Cỏ sữa lá lớn thu hái tại
thành phố Cần Thơ;
3. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được bằng
các phương pháp vật lý và hóa học;
4. Đánh giá hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra, hoạt
tính kháng khuẩn, kháng oxi hóa và hiệu quả bảo vệ tế bào MIN6

2


khỏi ER stress của các cao chiết và một số hợp chất sạch phân lập
được.

NỘI DUNG LUẬN ÁN
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Phần tổng quan tập hợp các nghiên cứu trong nước và quốc tế
về các vấn đề:


Đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

của chi Euphorbia.


Đặc điểm thực vật, công dụng trong dân gian, thành phần

hóa học và hoạt tính sinh học của loài cây Cỏ sữa lá lớn (Euphorbia
hirta L.).


Tổng quan về miễn dịch.

CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM
2.1 Mẫu thực vật, hóa chất và thiết bị
2.1.1

Mẫu thực vật
Dựa vào kết quả khảo sát kinh nghiệm dân gian trong các hộ

nông dân nuôi trồng thủy sản ở vùng ĐBSCL kết hợp với lược khảo
tài liệu, 20 loài thực vật đã được chọn để tiến hành khảo sát hoạt tính
tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra.
Toàn cây Cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.) được thu hái vào
cuối tháng 2 năm 2016 tại thành phố Cần Thơ. Tên khoa học được
TS. Đặng Minh Quân - Bộ môn Sinh, Khoa Sư phạm, Trường Đại
học Cần Thơ giám định và mẫu tiêu bản được lưu trữ tại đây.
3


2.1.2

Hóa chất và thiết bị

 Hóa chất
Bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck 60 F254 và bản mỏng pha

đảo RP-18 F254 (Merck). Silica gel pha thường và silica gel pha đảo
RP-18. Sắc ký lọc gel: Sephadex LH-20 (GE Healthcare). Dung môi
triển khai cột: n-hexane, CHCl3, EtOAc, BuOH, MeOH được chưng
cất lại trước khi sử dụng.
 Thiết bị


Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi bằng máy

Bruker Avance 500 tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam và máy AV-600, Bruker BioSpin Inc.,
Billerica, MA, USA, tại Viện Công nghệ Kyoto, Nhật Bản.


Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS được đo trên máy:

SCIEX X500 QTOF tại Viện Hóa học TPHCM và Viện Công nghệ
Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và máy
MicroTOF, Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA, USA, tại Viện
Công nghệ Kyoto, Nhật Bản.


Phổ UV-Vis được đo trên máy Jasco V-730; Độ quay cực

được đo trên thiết bị ADP 440; Nhiệt độ nóng chảy được đo trên máy
Stuart Scientific SMP3. Các phân tích này đều được thực hiện tại Bộ
môn Hóa học, Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ.
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1

Phương pháp điều chế 20 loại cao tổng
Đối với 20 mẫu thực vật, lấy 100 g bột nguyên liệu khô đã

nghiền nhỏ của mỗi loại, thực hiện quá trình ngâm dầm trực tiếp
4


trong dung môi ethanol (5 lần × 24 giờ mỗi lần). Dịch chiết ethanol
được gộp chung lại và cất loại dung môi dưới áp suất thấp thu được
các cao chiết ethanol tổng tương ứng.
2.2.2

Phương pháp phân lập các hợp chất
Sử dụng sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký cột (CC).

2.2.3

Phương pháp xác định cấu trúc và định danh
Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng cách kết hợp

các phương pháp phổ nghiệm hiện đại như phổ tử ngoại (UV-Vis),
phổ khối (ESI-, HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều
(1H-,

13

C-NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, COSY,

NOESY) đồng thời kết hợp phân tích, so sánh tài liệu tham khảo.
2.2.4

Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học

2.2.4.1 Hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra
(Pangasianodon hypophthalmus)
Nguồn cá thí nghiệm: Cá tra (50 ± 5 gram/con) được chuyển
về phòng thí nghiệm từ trại giống ở Vĩnh Long. Cá khi đem về trại
thực nghiệm được trữ trong bể composite có sục khí liên tục, cho ăn
bằng thức ăn công nghiệp theo nhu cầu của cá và thuần hóa hai tuần
trước khi tiến hành thí nghiệm. Trước khi bố trí thí nghiệm, cá được
kiểm tra ngẫu nhiên về hình dạng, kí sinh trùng, vi khuẩn.
Bố trí thí nghiệm: Tế bào bạch cầu (5×106 tế bào/mL) thu từ
thận và máu ngoại vi cá tra dựa theo phương pháp của Boyum (1968)
và Pierrard et al. (2012). Ficoll Paque PLUS (1.077 g/mL, GE
Healthcare, Uppsala, Sweden) được sử dụng để phân lập tế bào bạch
cầu. Tế bào thu được đuợc nuôi trong môi trường L-15 (pH 7.4,
5


Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) có bổ sung 5% huyết thanh
thai bò (fetal bovine serum-FBS, Invitrogen), 1% Hepes 20 mM và
1% kháng sinh streptomycin/penicillin 10 000 UI (Invitrogen) và
nuôi ở 28ºC.
Thí nghiệm bao gồm các nghiệm thức được bổ sung cao chiết
(tế bào bạch cầu thu từ thận và từ máu ngoại vi được bổ sung các loại
cao chiết tại 2 nồng độ 10 và 100 μg/mL) và 2 nghiệm thức đối
chứng (tế bào bạch cầu thu từ thận và từ máu ngoại vi được bổ sung
DMSO 1%), mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Sau 24 giờ bổ sung các
cao chiết, tiến hành phân tích các chỉ tiêu miễn dịch: xác định hoạt
tính lysozyme, bổ thể và tổng kháng thể.

2.2.4.2 Hoạt tính kháng khuẩn của Cỏ sữa lá lớn
Khả năng kháng khuẩn của các mẫu thử (cao chiết và các chất
phân lập được từ Cỏ sữa lá lớn) được xác định dựa trên khả năng ức
chế sự phát triển của các chủng vi khuẩn thể hiện qua sự hình thành
vòng vô khuẩn xung quanh giếng thạch tạo ra trên đĩa petri và nồng
độ ức chế tối thiểu (MIC).
Khả năng kháng khuẩn của các mẫu thử và kháng sinh
(Vancomycin HCl và Cefixim) được tiến hành đối với năm chủng vi
khuẩn gây bệnh trên thủy sản: Aeromonas hydrophila-N, Aeromonas
dhakensis-D, Aeromonas hydrophila-D, Aeromonas dhakensis-W, và
Vibrio parahaemolyticus đươ ̣c cung cấ p từ Viện nghiên cứu nuôi
trồng thủy sản 2, thành phố Hồ Chí Minh.
2.2.4.3 Phương pháp đánh giá khả năng kháng oxi hóa
Phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hóa thông qua
khả năng trung hòa gốc tự do DPPH, ABTS•+ đã được chọn sử dụng
6


để đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa của các cao chiết và các chất
sạch phân lập được từ Cỏ sữa lá lớn. Ngoài ra, phương pháp đánh giá
khả năng kháng oxi hóa trên tế bào MIN6 cũng đã được tiến hành.
2.2.4.4 Hoạt tính bảo vệ tế bào β tụy tạng khỏi ER stress
Thapsigargin (TG) 2 µM được dùng để gây chết tế bào. Tác
dụng của các cao chiết hay chất phân lập bảo vệ tế bào khỏi sự chết
được đánh giá bằng cách so sánh thống kê tỷ lệ sống của nhóm tế
bào được xử lý với TG sau đó xử lý thêm với cao chiết hay chất phân
lập so với nhóm chỉ được xử lý với TG. Tỷ lệ sống của tế bào được
đánh giá bằng phương pháp so màu dựa trên hoạt tính của enzyme
dehydrogenase.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1

Sàng lọc các đối tượng nghiên cứu theo định hướng hoạt

tính tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra
Dựa vào kết quả khảo sát kinh nghiệm dân gian trong các hộ
nông dân nuôi trồng thủy sản kết hợp với lược khảo tài liệu, 20 loài
thực vật đã được thu hái từ các tỉnh khác nhau của vùng ĐBSCL và
được tiến hành sàng lọc hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch cá tra.
Bảng 3.1 Danh sách các cao chiết ethanol tổng thu được
STT

Tên thực
vật

Tên khoa học của
mẫu thực vật

Địa điểm
thu mẫu

Bộ phận
nghiên
cứu

Hiệu
suất điều
chế cao
(%)

1

Dây vác

Cayratia trifolia (L.)
Domin

Sóc Trăng

Phần trên
mặt đất

7.51

2

Rau sam

Portulaca oleracea L.

Vĩnh Long

Toàn cây

5.73

3

Tỏi

Allium sativum L.

Củ

6.87

7

Cần Thơ


4

Húng
quế

Ocimum basilicum L.

Cần Thơ

5

Bình bát
nước

Annona reticulata L.

Sóc Trăng

6

Cỏ sữa lá
lớn

Euphorbia hirta L.

7

Gừng

8

Rau má

9

Sài đất

10

Diệp hạ
châu
Sầu đâu

Zingiber officinale
Rosc.
Centella asiatica (L.)
Urb
Wedelia

chinensis
(Osbeck) Merr.
Phyllanthus amarus L.

11
12
13
14

Ổi
Trầu
không
Mướp
đắng

Phần trên
mặt đất

5.15

Lá

13.71

Cần Thơ

Toàn cây

8.38

Cần Thơ

Củ

5.65

Hậu Giang

Toàn cây

5.41

Cần Thơ

Toàn cây

5.76

Sóc Trăng

Phần trên
mặt đất

6.29

Cần Thơ

Lá

8.84

Psidium guajava L.

Vĩnh Long

Lá

10.41

Piper betle L.

Hậu Giang

Lá

5.47

Momordica charantia
L.
Houttuynia cordata
Thunb.

Vĩnh Long

Lá

5.98

Vĩnh Long

Phần trên
mặt đất

8.93

Azadirachta indica A.
Juss

15

Giấp cá

16

Mắc cỡ

Mimosa pudica L.

Cần Thơ

Phần trên
mặt đất

6.28

17

Tía tô

Perilla frutescen (L.)

Britt

Cần Thơ

Phần trên
mặt đất

5.42

18

Cỏ
lợn

Ageratum conyzoides
L.

Hậu Giang

Phần trên
mặt đất

8.40

19

Rau dệu

Alternanthera sessilis
(L.) A. DC

Cần Thơ

Phần trên
mặt đất

6.10

20

Cỏ mực

Eclipta prostrata (L.)
L.

Cần Thơ

Phần trên
mặt đất

5.07

cứt

8


Dựa vào kết quả sàng lọc đạt được, loài cây Cỏ sữa lá lớn hứa
hẹn nhiều tiềm năng sẽ phân lập được các hợp chất có khả năng tăng
cường hệ miễn dịch trên cá tra, bổ sung dữ liệu về các loài dược liệu

có tác dụng hỗ trợ phòng và trị bệnh cho đối tượng nuôi trồng thủy
sản. Vì vậy, đề tài đã chọn Cỏ sữa lá lớn là đối tượng nghiên cứu tiếp
theo về thành phần hóa học, đồng thời cũng khảo sát thêm hoạt tính
sinh học của các cao phân đoạn và một số hợp chất sạch phân lập
được từ loài cây này.
3.2 Chiết tách, phân lập các hợp chất từ Cỏ sữa lá lớn
3.2.1

Xử lý nguyên liệu và điều chế các cao phân đoạn

3.2.2

Phân lập các hợp chất
Từ các cao phân đoạn được phân lập trên cột sắc ký với các hệ

dung môi thích hợp thu được 22 hợp chất. Phần này trình bày chi tiết
quá trình phân lập các hợp chất từ cao chiết n-hexan, ethyl acetate,
n-butanol và methanol của Cỏ sữa lá lớn.
3.2.3

Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập

được từ Cỏ sữa lá lớn
Phần này trình bày chi tiết các đặc trưng vật lý, các dữ kiện
phổ của 22 hợp chất được phân lập từ Cỏ sữa lá lớn.
3.3 Kết quả sàng lọc hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch trên cá
tra của 20 cao chiết
Từ kết quả sàng lọc của 20 cao chiết trên tế bào bạch cầu thu
từ máu và từ thận cá tra đã cho thấy các cao chiết Cỏ sữa lá lớn, Diệp
hạ châu thân xanh, Gừng, Sầu đâu, Tỏi… có nhiều tiềm năng cải

thiện đáng kể hệ miễn dịch trên cá tra khi so sánh với đối chứng. Tế
9


bào bạch cầu thu từ máu và từ thận đều tăng đồng thời cả ba chỉ tiêu
miễn dịch với thời gian tối ưu của thí nghiệm được chọn là 24 giờ, ở
hai loại nồng độ 10 và 100 µg/mL.
Kết quả sàng lọc đã hứa hẹn nhiều tiềm năng to lớn của Cỏ
sữa lá lớn trong việc hỗ trợ tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra đặc
biệt là tế bào bạch cầu thu từ thận. Ngoài ra, Cỏ sữa lá lớn đã được
nghiên cứu ở một số nước trên thế giới. Tuy nhiên, ở Việt Nam loài
cây này chủ yếu mọc hoang, chưa được sử dụng nhiều trong ngành
dược phẩm nước ta. Mặc dù loài Cỏ sữa lá lớn có nhiều tác dụng
chữa bệnh trong dân gian, nhiều hoạt tính sinh học đáng quý lại dễ
tìm kiếm nhưng còn rất ít công trình nghiên cứu ở Việt Nam. Với
những lý do trên, đề tài đã lựa chọn Cỏ sữa lá lớn để tiến hành
nghiên cứu thành phần hóa học, đồng thời đánh giá thêm một số hoạt
tính sinh học của các cao phân đoạn và một số hợp chất sạch phân
lập được từ loài cây này.
3.4 Xác định cấu trúc các hợp chất đã phân lập
Từ loài Cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.), đề tài đã phân lập
và xác định được cấu trúc hóa học của 22 hợp chất sạch (Bảng 4.24),
trong đó có một hợp chất mới lần đầu tiên được phân lập từ thiên
nhiên và bảy hợp chất lần đầu được phân lập từ loài cây này. Cấu
trúc của các hợp chất này đã được xác định dựa trên các phương
pháp phổ nghiệm hiện đại.

10

Bảng 4.24 Tổng hợp các hợp chất phân lập được từ Cỏ sữa lá lớn
Chất mới

Các hợp chất thuộc nhóm flavonoid

11


12


Các hợp chất thuộc nhóm phenol

Hợp chất diterpenoid

Các hợp chất thuộc nhóm triterpenoid

13


Hợp chất steroid

14


Hợp chất khác
2
3

1

7

1'

HO
OH
OH

O
O

6

4

6'

5

O
6"

H3 C
HO

1"

O
HO

OH

Eup18: 1'-O-benzyl-rutinoside

3.5 Kết quả đánh giá hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch trên
cá tra
Tế bào bạch cầu phân lập từ thận cá tra, được nuôi trong môi
trường L-15 có bổ sung cao chiết Cỏ sữa lá lớn ở 2 nồng độ 10
µg/mL và 100 µg/mL và bổ sung các hợp chất sạch phân lập được ở
2 nồng độ 10 µg/mL và 50 µg/mL. Sau 24 giờ bổ sung mẫu thử, tiến
hành phân tích các chỉ tiêu: lysozyme, bổ thể, tổng kháng thể để
đánh giá ảnh hưởng của Cỏ sữa lá lớn lên đáp ứng miễn dịch của tế
bào bạch cầu cá tra.
Kết quả phân tích cho thấy các nghiệm thức sau 24 giờ bổ
sung cao tổng, cao MeOH và cao n-hexane Cỏ sữa lá lớn tại nồng độ
100 µg/mL có hoạt tính lysozyme tăng cao đáng kể so với đối chứng.
Trong đó, tăng cao nhất ở nghiệm thức bổ sung cao MeOH (tăng
khoảng hơn 2 lần so với đối chứng) và khác biệt có ý nghĩa thống kê
so với nghiệm thức đối chứng (p<0.01). Ngoài ra, cao EtOAc và cao
BuOH cũng làm tăng đáng kể hoạt tính lysozyme tại nồng độ thấp
(10 µg/mL) trên tế bào bạch cầu thận cá tra. Tại nồng độ 10 µg/mL,
quercitrin đã làm tăng đáng kể hoạt tính lysozyme; trong khi
15


taraxerol và rutin tuy cũng có làm gia tăng hoạt tính này nhưng khác
biệt không có ý nghĩa thống kê so với đối chứng.
Hoạt tính bổ thể của tế bào bạch cầu thận tăng rõ rệt khi bổ
sung cao EtOAc, cao BuOH và rutin ở nồng độ 10 µg/mL (p<0.01).

Sau 24 giờ bổ sung các cao chiết hay hợp chất sạch phân lập
được, hàm lượng tổng kháng thể của các nghiệm thức bổ sung cao
tổng, cao MeOH và cao BuOH của Cỏ sữa lá lớn đều khác biệt rõ rệt
và có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng. Trong đó, hàm
lượng tổng kháng thể ở nghiệm thức bổ sung 10 µg/mL cao BuOH
đã tăng 2.0 lần so với đối chứng. Hàm lượng tổng kháng thể đã tăng
đáng kể ở nghiệm thức bổ sung cao tổng, cao MeOH và cao nhexane ở nồng độ 100 µg/mL. Tuy nhiên, các chất phân lập khảo
nghiệm đều không có tác dụng tăng cường nhiều hoạt tính tổng
kháng thể sau 24 giờ bổ sung vào tế bào bạch cầu thận cá tra.
Như vậy, kết quả thí nghiệm đã cho thấy cao chiết Cỏ sữa lá
lớn có khả năng tăng cường hoạt tính lysozyme, hoạt tính bổ thể
cũng như cho thấy hàm lượng tổng kháng thể cũng tăng cao khi có
sự tác động của cao chiết Cỏ sữa lá lớn. Điều này chứng minh tiềm
năng to lớn của Cỏ sữa lá lớn trong việc hỗ trợ tăng cường hệ miễn
dịch trên cá tra.
3.6 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn
Khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết và chất phân lập
từ Cỏ sữa lá lớn được khảo sát trên năm chủng vi khuẩn gây bệnh
trên thủy sản: Aeromonas hydrophila-N, Aeromonas dhakensis-D,
Aeromonas hydrophila-D, Aeromonas dhakensis-W, và Vibrio
parahaemolyticus.
16


Qua kết quả đánh giá cho thấy tất cả các mẫu khảo sát đều có
khả năng kháng khuẩn đối với năm chủng vi khuẩn ở các nồng độ
khảo nghiệm ngoại trừ cao n-hexane (0.3125 mg/mL) đối với khuẩn
Aeromonas dhakensis-W (MIC = 625 µg/mL). Trong đó, cao chiết
EtOAc cho hiệu quả ức chế khuẩn Aeromonas dhakensis-D. và
V.parahaemolyticus cao nhất (MIC = 18 µg/mL) và rutin, taraxerol

lại cho hiệu quả ức chế khuẩn Aeromonas hydrophila -N mạnh nhất
(MIC = 1.5 µg/mL), tạo được vòng vô khuẩn lớn nhất ở tất cả các
nồng độ so với các chủng vi khuẩn khác.
Cao EtOAc có khả năng ức chế mạnh vi khuẩn A. hydrophila D với đường kính vòng vô khuẩn 22.80 mm ở nồng độ 5 mg/mL và
có giá trị MIC = 39 µg/mL. Rutin cũng thể hiện khả năng kháng
khuẩn A. hydrophila-D mạnh với đường kính vòng vô khuẩn tăng
nhanh từ 13.60 đến 29.33 trong khoảng nồng độ khảo sát.
Cao tổng, các cao phân đoạn và chất phân lập khảo sát đều có
hoạt tính kháng chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila-N. Cao
EtOAc có khả năng kháng A. hydrophila-N mạnh hơn cao MeOH thể
hiện qua đường kính vòng vô khuẩn của cao EtOAc tăng đáng kể từ
13.73 lên 23.20 mm với giá trị MIC = 78 µg/mL
Cao n-butanol có khả năng kháng Aeromonas dhakensis-W
cao nhất trong tất cả các loại cao chiết được khảo sát với giá trị MIC
= 18 µg/mL. Hiệu quả kháng A. dhakensis-W của các loại cao chiết
tăng dần theo thứ tự: n-hexane, MeOH, BuOH và EtOAc tại nồng độ
5 mg/mL.
Cao BuOH và MeOH đều có khả năng ức chế Aeromonas
dhakensis-D gần như là tương đương nhau và khác biệt có ý nghĩa về
17


mặt thống kê. Cao EtOAc có khả năng kháng A. dhakensis-D mạnh
hơn cả với giá trị MIC = 18 µg/mL.
Đối với khuẩn Vibrio parahaemolyticus: cao EtOAc, taraxerol
và kháng sinh thương mại Vancomycin HCl ức chế hiệu quả chủng
vi khuẩn này với giá trị MIC lần lượt là 18.0; 2.0 và 3.0 µg/mL.
Trong trường hợp này, chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
không nhạy cảm với kháng sinh cefixim.
3.7 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa

3.7.1

Hoạt tính kháng oxi hóa theo phương pháp DPPH và
•+

ABTS

Khả năng trung hòa gốc tự do DPPH của Cỏ sữa lá lớn được
so sánh với chất chuẩn là vitmin C. Kết quả cho thấy, quercitrin và
rutin (IC50 = 5.32 và 6.43 µg/mL) trung hòa gốc tự do DPPH tương
đương Vitamin C (IC50 = 4.39 µg/mL). Cao BuOH và MeOH có khả
năng trung hòa gốc tự do DPPH cao với IC50 lần lượt là 11.43 và
12.69 µg/mL; chỉ kém vitamin C 2.6 và 2.9 lần.
Khả năng trung hòa gốc tự do ABTS•+ của quercitrin và rutin
cao (IC50 = 6.92 và 7.57 µg/mL) tuy vẫn thấp hơn so với chất chuẩn
trolox (IC50 = 2.90 µg/mL). Cao BuOH có khả năng trung hòa gốc tự
do ABTS•+ kém chất chuẩn trolox khoảng 4 lần.
3.7.2

Kết quả đánh giá khả năng kháng oxi hóa trên tế bào

MIN6
3.7.2.1 Khảo sát độc tính của các cao chiết trên dòng tế bào MIN6
Ở các nghiệm thức môi trường nuôi cấy có cao chiết với
những nồng độ khác nhau đều có mật độ tế bào sống khác biệt không
18


có ý nghĩa về mặt thống kê đối với nghiệm thức đối chứng chỉ có
môi trường DMEM. Kết quả này cho thấy các mẫu cao chiết ở các

nồng độ khảo sát (0.01-10.00 mg/ml) không có độc tính đối với tế
bào MIN6.
3.7.2.2 Khả năng kháng oxi hóa trên tế bào MIN6

+ Ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến khả năng tồn tại của tế bào
MIN6
Kết quả cho thấy khi xử lý với 0.1-0.5 mM H2O2 trong hai giờ
đã gây chết tế bào đáng kể so với đối chứng và số tế bào sống phụ
thuộc vào nồng độ H2O2. Trên cơ sở kết quả đã đạt được và một số
báo cáo trước đây, nồng độ H2O2 0.4 mM (gây chết 51% tế bào) đã
được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
+ Hiệu quả bảo vệ tế bào MIN6 của các cao chiết
Việc bổ sung các cao chiết đã cải thiện đáng kể số lượng tế
bào sống so với các mẫu môi trường nuôi cấy chỉ có H2O2, ngoại trừ
cao n-hexane ở nồng độ 0.01 mg/mL. Ở nghiệm thức môi trường có
chứa cao EtOAc hiệu quả bảo vệ tế bào mạnh nhất và kết quả cho
thấy khả năng tồn tại của tế bào là 81% ở nồng độ 0.1 mg/mL so với
đối chứng dương vitamin E (84% ở 0.2 mg/mL). Cao tổng cho hiệu
quả bảo vệ tế bào cao nhất là 78% ở nồng độ 1.0 mg/mL, trong khi
nghiệm thức xử lý với cao MeOH và cao BuOH cho thấy khả năng
bảo vệ tế bào tương đối tốt và cao n-hexane kém hiệu quả nhất.
+ Hiệu quả bảo vệ tế bào MIN6 của các chất phân lập
Các hợp chất khảo sát đều có khả năng bảo vệ các tế bào
MIN6 khỏi sự chết do H2O2 gây ra trong khoảng nồng độ khảo sát từ
19


1.0 đến 1000 µg/mL. Quercitrin (10 µg/mL) và rutin (100 µg/mL) có
khả năng bảo vệ tế bào khá mạnh, tương ứng với 65% và 70% tế bào
tồn tại (so với 49% tế bào sống sót khi không được xử lý với các mẫu

thử). Taraxerol không có hiệu quả bảo vệ tế bào đáng kể tại nồng độ
100 µg/mL và chỉ có tác động tại nồng độ 1000 µg/mL với khả năng
bảo vệ tế bào là 61%. Quercetin và luteolin ở nồng độ 100 µg/mL có
tác dụng bảo vệ tế bào mạnh nhất khi so sánh với vitamin E (0.2
mg/mL, 84%). Quercetin và luteolin có tác dụng tốt nhất ở 100
µg/ml (tương ứng với 82% và 78% tế bào sống sót), trong khi các
hợp chất khác cũng thể hiện khả năng bảo vệ tế bào nhưng kém hiệu
quả hơn.
3.8

Khả năng bảo vệ tế bào β tụy tạng khỏi ER stress
Ở nghiệm thức tế bào được nuôi cấy trong môi trường có

thapsigargin (TG) và các cao chiết hay các chất phân lập được, phần
trăm tế bào sống cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức
môi trường nuôi cấy chỉ có TG. Cụ thể ở nghiệm thức môi trường có
chứa cao chiết MeOH Cỏ sữa lá lớn (0.1 mg/mL) số tế bào sống đạt
69%, cao hơn so với môi trường chỉ có TG (40%). Kết quả cho thấy
các hợp chất phân lập được từ Cỏ sữa lá lớn (1.0 – 1000 µg/mL)
được thử nghiệm đều có khả năng bảo vệ tế bào MIN6 khi bị TG gây
ER stress dẫn đến chết tế bào. Hiệu quả bảo vệ tế bào cao nhất được
quan sát đối với quercitrin (78%, 10 µg/mL). Đối với rutin và
taraxerol, hiệu quả bảo vệ tế bào đạt được cao nhất là 70% và 64%
tại nồng độ 100 µg/mL. Tùy thuộc vào nồng độ (1.0–1000 µg/mL),
phần trăm tế bào sống sót của nhóm được bổ sung luteolin và
quercetin dao động tương ứng từ 66% đến 69%, và từ 62% đến 70%.
Như vậy, quercetin và luteolin đã chứng minh được tác dụng bảo vệ
20

tế bào MIN6 và cho thấy hiệu quả tối đa của chúng ở nồng độ 10
µg/mL và caffeic acid cũng cho thấy sự bảo vệ tế bào cao nhất (68%)
ở nồng độ này. Các kết quả thí nghiệm này chứng minh Cỏ sữa lá lớn
có khả năng bảo vệ các tế bào MIN6 chống lại sự chết do TG gây ra,
là ứng viên tiềm năng trong việc nghiên cứu thảo dược trong việc hỗ
trợ điều trị bệnh đái tháo đường.
* Nhận xét chung:
Các kết quả phân tích về hóa học cho thấy Cỏ sữa lá lớn thu
hái tại Cần Thơ cũng thừa hưởng các đặc điểm hóa thực vật của các
loài thuộc chi Euphorbia với các lớp chất chính là flavonoid,
triterpenoid; trong đó rutin, quercitrin, taraxerol chiếm hàm lượng
cao.
Từ các kết quả đánh giá hoạt tính cho thấy: các cao chiết và
một số hợp chất phân lập được từ cây Cỏ sữa lá lớn thể hiện tốt các
hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra, hoạt tính kháng khuẩn,
kháng oxi hóa và hoạt tính bảo vệ tế bào khỏi ER stress ở các mức
độ khác nhau.
Việt Nam với nguồn hệ thực vật rất phong phú và là một trong
những quốc gia có nền y học cổ truyền lâu đời sử dụng nhiều loại
thảo dược trong điều trị bệnh và tăng cường sức khoẻ. Đây là nguồn
hợp chất thiên nhiên vô cùng quý báu cần được nghiên cứu về mặt
hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học để tìm ra các hoạt chất ứng
dụng trong đời sống.
Nuôi trồng thủy sản đang từng bước trở thành ngành kinh tế
quan trọng của nước ta. Trong đó, cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus) được xem là một trong những đối tượng nuôi chủ
21


lực ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long. Tuy nhiên, trong những năm

gần đây, nghề nuôi cá tra phát triển quá nhanh, không theo quy
hoạch nên bệnh trên cá tra nuôi hiện nay xảy ra ngày càng nhiều và
phức tạp, gây thiệt hại đáng kể. Kháng sinh và hóa chất đã được sử
dụng để phòng và trị bệnh, nhưng lại đưa đến hiện tượng kháng
thuốc. Nghiêm trọng hơn, sự tồn dư kháng sinh trong sản phẩm gây
độc, ảnh hưởng sức khỏe cho người và cũng là rào cản cho các doanh
nghiệp Việt Nam trong xuất khẩu thủy sản. Do đó, khuynh hướng
chung hiện nay là nghiên cứu tìm ra những thảo dược thân thiện thay
thế kháng sinh, tăng cường hệ miễn dịch cho cá. Với cách tiếp cận
như trên, kết quả của các nghiên cứu trên đã mở ra tiềm năng cho Cỏ
sữa lá lớn Việt Nam nhằm có thể tạo ra các sản phẩm chăm sóc sức
khỏe cộng đồng, sử dụng thảo dược nhằm thay thế kháng sinh, tăng
cường miễn dịch trên thủy sản từ đó nâng cao chất lượng nuôi trồng
thủy sản ở nước ta.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
Từ toàn cây của Cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.) thu hái tại
thành phố Cần Thơ đề tài đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa
học một hợp chất mới là sodium β-D-glucopyranosyl 12-hydroxy
jasmonate (Eup16) cùng 21 hợp chất đã biết bao gồm: 11 flavonoid:
quercitrin (Eup01), rutin (Eup02), avicularin (Eup04), astragalin
(Eup05),

luteolin

(Eup08),

quercetin

(Eup09),

(+)-catechin

(Eup11), afzelin (Eup14), myricitrin (Eup15), hymenoxin (Eup19)
và cynaroside (Eup21); ba hợp chất phenol: caffeic acid (Eup10),
protocatechuic acid (Eup12) và gallic acid (Eup13); năm hợp chất
22


triterpen:

taraxerol

(Eup06),

taraxerone

(Eup07),

3β,7β,25-

trihydroxycucurbita-5,(23E)-dien-19-al (Eup03), cycloart-23-ene3β,25-dioltrifolin (Eup17) và campesterol (Eup20); một hợp chất
diterpen: 2β,16α,19-trihydroxy-ent-kaurane (Eup23) cùng với một
hợp chất khác: 1-O-benzyl-rutinoside (Eup18). Trong đó, có bảy
hợp chất lần đầu được phân lập từ loài này, đó là: avicularin
(Eup04), (+)-catechin (Eup11), hymenoxin (Eup19), cynaroside
(Eup21), 3β,7β,25-trihydroxycucurbita-5,(23E)-dien-19-al (Eup03),
cycloart-23-ene-3β,25-dioltrifolin (Eup17) và 1-O-benzyl rutinoside
(Eup18).

Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học cho thấy:


Cao chiết Cỏ sữa lá lớn có khả năng tăng cường hệ miễn

dịch trên cá tra thông qua việc gia tăng hoạt tính lysozyme, bổ thể và
tổng kháng thể.


Hợp chất Eup02 (rutin) thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn A.

hydrophila-D tốt với giá trị đường kính vòng vô khuẩn lớn nhất là
29.33 ±0.35 mm tại nồng độ 64 µg/mL và hợp chất Eup06
(taraxerol) đạt 24.50±0.44 mm đối với khuẩn A. hydrophila-N cũng
tại nồng độ 64 µg/mL.


Hợp chất Eup01 (quercitrin) và Eup02 (rutin) và thể hiện

hiệu quả trung hòa gốc tự do DPPH và ABTS•+ cao với giá trị IC50
tương ứng là 5.32; 6.43 và 6.92; 7.57 µg/mL khi so với chất đối
chứng dương vitamin C (3.66 µg/mL) và trolox (2.90 µg/mL). Khả
năng kháng oxi hóa còn được khảo nghiệm qua khả năng bảo vệ tế
bào β tụy tạng MIN6 trên mô hình sử dụng H2O2 gây chết tế bào và
so sánh với đối chứng dương là vitamin E (0.2 mg/mL), kết quả cho
thấy cao EtOAc (0.1 mg/mL) và hợp chất Eup09 (quercetin) với
23