Nghiên cứu sản xuất chế phẩm Probiotic cho tôm thẻ chân trắng (Litopenaeu Vannamei) quy mô Pilot

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LẠC HỒNG
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

BÁO CÁO
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM
PROBIOTIC CHO TÔM THẺ CHÂN TRẮNG
(LITOPENAEU VANNAMEI) QUY MÔ PILOT

PHẠM VŨ BẢO
NGUYỄN NGỌC TÙNG

ĐỒNG NAI, THÁNG 12/2017


TRƯỜNG ĐẠI HỌC LẠC HỒNG
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

BÁO CÁO
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM
PROBIOTIC CHO TÔM THẺ CHÂN TRẮNG
(LITOPENAEU VANNAMEI) QUY MÔ PILOT

SVTH: PHẠM VŨ BẢO
NGUYỄN NGỌC TÙNG
GVHD: ThS. ĐOÀN THỊ TUYẾT LÊ

CN. ĐỖ MINH ANH

ĐỒNG NAI, 12/2017


i

LỜI CẢM ƠN
Trước hết, chúng tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại học
Lạc Hồng, Lãnh đạo Khoa Kỹ Thuật Hóa Học và Môi Trường trường Đại học Lạc
Hồng, Liên Hiệp các Hội Khoa Học Kỹ Thuật Đồng Nai đã tạo điều kiện cho chúng
tôi hoàn thành nghiên cứu trong thời gian qua.
Chúng tôi xin trân trọng và bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô hướng dẫn Đoàn
Thị Tuyết Lê và cô Đỗ Minh Anh trong thời gian qua đã tận tình hướng dẫn, động
viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho chúng tôi được học tập, nghiên cứu, bồi
dưỡng kiến thức và hoàn thành đề tài nghiên cứu này.
Nhóm xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô quản lý các phòng thí nghiệm của
khoa Kỹ thuật Hóa Học và Môi trường đã tạo điều kiện về cơ sở, vật chất để nhóm
thực hiện đề tài một cách thuận lợi nhất.
Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, người thân đã
chia sẻ, động viên giúp chúng tôi có thêm nghị lực hoàn thành tốt nghiên cứu này.
Biên Hòa, Ngày 15 tháng 12 năm 2017
Sinh viên thực hiện
Phạm Vũ Bảo
Nguyễn Ngọc Tùng


ii

MỤC LỤC

DANH MỤC VIẾT TẮT ............................................................................................ iv
DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................... v
ĐỒ THỊ........................................................................................................................ vi
DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. vii
LỜI MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3
1.1. Tổng quan về probiotic ........................................................................................ 3
1.1.1. Định nghĩa ...................................................................................................... 3
1.1.2. Cơ chế tác dụng của probiotic ....................................................................... 3
1.1.3. Các chủng vi sinh vật thường sử dụng để làm probiotic cho tôm ................. 4
1.2. Tổng quan về chế phẩm probiotic cho tôm ......................................................... 7
1.2.1.Dạng chế phẩm ............................................................................................... 7
1.2.2.Thành phần...................................................................................................... 8
1.2.3.Tổng quan về quy trình sản xuất chế phẩm probiotic ..................................... 8
1.3. Tổng quan về tôm thẻ chân trắng ........................................................................ 9
1.3.1. Đặc điểm hình thái của tôm thẻ chân trắng ................................................... 9
1.3.3. Tình hình dịch bệnh tôm thẻ chân trắng ...................................................... 10
1.4. Tổng quan về tối ưu hóa .................................................................................... 10
1.5. Tổng quan một số công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về sử dụng
probiotic cho tôm ...................................................................................................... 11
1.5.1. Trong nước ................................................................................................... 12
1.5.2. Ngoài nước ................................................................................................... 12
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 14
2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện........................................................................ 14
2.2. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................... 14
2.3. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................... 18
2.3.1. Nguồn mẫu ................................................................................................... 18
2.3.2. Hóa chất ....................................................................................................... 18
2.3.3. Thiết bị sử dụng ........................................................................................... 18

2.3.4. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật ................................................................... 19


iii

2.4. Phương pháp nghiên cứu................................................................................... 19
2.4.1. Hoạt hóa và nhân giống.................................................................................. 19
2.4.2.Tối ưu hóa môi trường lên men và xác định các thông số lên men ................ 20
2.4.2.1.Tối ưu hóa thành phần môi trường lên men thu sinh khối......................... 20
2.4.2.2. Bố trí thí nghiệm xác định các thông số lên men...................................... 33
2.4.3. Lên men thử nghiệm ...................................................................................... 36
2.4.4. Lên men quy mô phòng thí nghiệm ............................................................... 36
2.4.5. Thu sinh khối probiotic từ bồn lên men và phối trộn với chất mang ............. 36
2.4.6. Kiểm tra chất lượng chế phẩm ....................................................................... 37
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 39
3.1. Kết quả tối ưu hóa môi trường lên men thu sinh khối ........................................ 39
3.3.1. Kết quả tối ưu hóa thành phần môi trường nhân sinh khối 2 chủng probiotic39
3.3.1. Kết quả bố trí thí nghiệm xác định các thông số lên men .............................. 53
3.3.1.1. Kết quả bố trí thí nghiệm xác định thời gian lên men thích hợp .............. 53
3.3.1.2. Kết quả bố trí thí nghiệm xác định pH môi trường lên men thích hợp..... 55
3.2. Kết quả lên men thử nghiệm ............................................................................... 56
3.3. Kết quả thu sinh khối và phối trộn chất mang..................................................... 57
3.4. Kết quả kiểm tra chất lượng sản phẩm ................................................................ 57
3.5. Kết quả hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm probiotic ................................. 58
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................... 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


iv

DANH MỤC VIẾT TẮT
• B.subtilis:

Bacillus subtilis

• B-B:

Box-Behken

• BB:

Bột bắp

• BS:

Bột sắn

• CFU:

Đơn vị tạo khuẩn lạc

• CCD:

Central composite design

• ĐN:

Đậu nành

• L.plantarum:

Lactobacillus plantarum

• L. salivarius:

Lactobacillus salivarius

• L. reuteri:

Lactobacillus reuteri

• E. coli:

Escherichia coli

• MRS agar:

Man, Rogosa, Sharpe

• MRSB:

Man, Rogosa, Sharpe Broth

• NA:

Nutrient Agar

• OD:

Optical Density

• P-B:

Plackett – Burman

• RSM:

Response surface method

• RĐ:

Rỉ đường

• FAO:

Food and Agriculture Organization

• VASEP:

Vietnam Association of Seafood Exporter and Producers

• V. parahaemolyticus: Vibrio parahaemolyticus
• V. alginolyticus:

Vibrio alginolyticus

• YE:

Yeast Extract

v

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1 Sơ đồ đề xuất quy trình nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic ...............15
Hình 3.1 Mặt đáp ứng sinh khối chủng L. plantarum LH theo hai yếu tố ..................43
Hình 3.2 Mặt đáp ứng sinh khối chủng B. subtilis LH theo hai yếu tố .......................50
Hình 3.3 Khuẩn lạc chủng L. plantarum LH được lấy mẫu từ chế phẩm và trải trên đĩa
thạch môi trường MRS Agar ........................................................................................ 55
Hình 3.4 Khuẩn lạc chủng B. subtilis LH được lấy mẫu từ chế phẩm và trải trên đĩa
thạch môi trường NA .................................................................................................... 56
Hình 3.5 Quy trình sản xuất probiotic cho tôm thẻ chân trắng (Litopennaeu vannamei)
quy mô pilot .................................................................................................................. 57


vi

ĐỒ THỊ
Đồ thị 3.1 Kết quả khảo sát OD nguồn cacbon chủng L. plantarum LH ..................... 37
Đồ thị 3.2 Kết quả khảo sát OD nguồn Nitơ chủng L. plantarum LH ......................... 38
Đồ thị 3.3 Kết quả khảo sát OD nguồn cacbon chủng Bacillus subtilis LH ................ 44
Đồ thị 3.4 Kết quả khảo sát OD nguồn Nitơ chủng Bacillus subtilis LH .................... 45
Đồ thị 3.5 Đường cong sinh trưởng chủng L. plantarum LH trong môi trường lên men
...................................................................................................................................... 51
Đồ thị 3.6 Đường cong sinh trưởng chủng B. subtilis LH trong môi trường lên men . 52
Đồ thị 3.7 Khả năng sinh trưởng theo pH của L. plantarum LH ................................. 53
Đồ thị 3.8 Khả năng sinh trưởng theo pH của B. subtilis LH ...................................... 54

vii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Các nguồn cacbon khảo sát ....................................................................... 20
Bảng 2.2 Các nguồn Nitơ khảo sát ........................................................................... 21
Bảng 2.3 Chú thích giá trị các yếu tố trong thí nghiệm Plackett-Burman ............... 22
Bảng 2.4 Ma trận thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman ........................................... 23
Bảng 2.5 Các biến trong ma trận Plackett-Burman .................................................. 24
Bảng 2.6 Nồng độ các yếu tố sử dụng trong Box-Behken ....................................... 24
Bảng 2.7 Thiết kế Box-Behken ................................................................................ 25
Bảng 2.8 Khảo sát nguồn cacbon ............................................................................. 26
Bảng 2.9 Các nguồn nitơ khảo sát ............................................................................ 27
Bảng 2.10 Chú thích giá trị các yếu tố trong thí nghiệm Plackett-Burman ............. 28
Bảng 2.11 Ma trận thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman ......................................... 29
Bảng 2.12 Các biến trong ma trận Plackett-Burman ................................................ 30
Bảng 2.13 Nồng độ các yếu tố sử dụng trong Box-Behken ..................................... 30
Bảng 2.14 Thiết kế Box-Behken .............................................................................. 31
Bảng 2.15 Mật độ tế bào (OD610nm) theo thời gian nuôi cấy chủng L. plantarum LH33
Bảng 2.16 Ảnh hưởng của pH môi trường đến hiệu quả thu sinh khối chủng L.
plantarum LH ........................................................................................................... 33
Bảng 2.17 Mật độ tế bào (OD610nm) theo thời gian nuôi cấy chủng B. subtilis LH .. 34
Bảng 2.18 Ảnh hưởng của pH môi trường đến hiệu quả thu sinh khối chủng L.
plantarum LH ........................................................................................................... 35
Bảng 3.1 Chú thích giá trị các yếu tố trong thí nghiệm Plackett-Burman ............... 38
Bảng 3.2 Ma trận thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman ........................................... 39


viii

Bảng 3.3 Các biến trong ma trận Plackett-Burman .................................................. 40

Bảng 3.4 Nồng độ các yếu tố sử dụng trong Box-Behken ....................................... 40
Bảng 3.5 Thiết kế Box-Behken ................................................................................ 41
Bảng 3.6 Kết quả phân tích ANOVA ....................................................................... 42
Bảng 3.7 Chú thích giá trị các yếu tố trong thí nghiệm Plackett-Burman ............... 45
Bảng 3.8 Ma trận thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman ........................................... 46
Bảng 3.9 Các biến trong ma trận Plackett-Burman .................................................. 47
Bảng 3.10 Nồng độ các yếu tố sử dụng trong Box-Behken ..................................... 47
Bảng 3.11 Thiết kế Box-Behken .............................................................................. 48
Bảng 3.12 Kết quả phân tích ANOVA ..................................................................... 49


1

LỜI MỞ ĐẦU
Đặt vấn đề
Nuôi tôm là lĩnh vực kinh tế mũi nhọn của nước ta, góp phần quan trọng trong
tổng giá trị xuất khẩu thủy sản, đưa Việt Nam là nước xuất khẩu thủy sản lớn trên thế
giới. Theo báo cáo của Tổng cục Thủy sản, tổng sản lượng thủy sản sản xuất năm
2016 đạt hơn 6,7 triệu tấn, tăng 2,5% so với năm 2015. Năm 2016, Theo thống kê của
Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thủy sản (VASEP), sản lượng tôm thu hoạch tăng vào
những tháng cuối năm. Sản lượng tôm nước lợ cả nước ước đạt 650 nghìn tấn (+3,2%).
Tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, diện tích tôm sú ước đạt 569.500 ha
(+1,8%), sản lượng ước đạt 251 nghìn tấn (+2,1%). Diện tích tôm thẻ chân trắng ước
đạt 64.440 ha, tăng 11,5% so với năm 2015, sản lượng ước đạt 253.1 nghìn tấn
(+15,6%) (Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thủy sản />Hơn nữa, Tôm thẻ chân trắng là đối tượng được thị trường thế giới đặc biệt ưa
chuộng, nước ta đặt biệt quan tâm phát triển vì chất lượng thịt thơm ngon và có giá trị
dinh dưỡng cao. Tuy nhiên, do là đối tượng mới nên hiện nay vẫn chưa có nhiều
nghiên cứu giúp người nuôi tránh được những rủi ro khi nuôi loại tôm này. Điều kiện
môi trường bất lợi do biến đổi khí hậu, bùng phát dịch bệnh, gây tổn thất nặng nề.
Trong đó có nhóm vi khuẩn gây hại Vibrio, điển hình như vi khuẩn Vibrio

alginolyticus là một trong những tác nhân gây ra bệnh và trở thành rào cản bất lợi
kiềm hãm sự phát triển của nghề nuôi tôm ở Việt Nam (Vaseeharan, Ramasamy, 2003;
Nguyễn Trọng Nghĩa, 2015).
Vấn đề dịch bệnh là vấn đề luôn song song tồn tại trong quá trình nuôi, giải pháp
sử dụng kháng sinh, thuốc khử trùng và chất hóa học đã được sử dụng, tuy nhiên việc
lạm dụng thuốc kháng sinh và chất hóa học đã gây ra những hậu quả nghiêm trọng đến
môi trường và sức khỏe con người (Dorsey, Robertson, 2013).
Probiotic là giải pháp hữu hiệu được các nhà khoa học khuyên nên sử dụng, với
tác dụng ức chế sự tăng trưởng đồng thời giảm khả năng gây bệnh của vi khuẩn gây
bệnh, ngoài ra probiotic giúp tăng cường dinh dưỡng cho các loài động vật thủy sản,
cải thiện chất lượng nước nuôi trồng và giảm việc sử dụng kháng sinh và hóa chất.
Điều này cho thấy lợi ích của việc sử dụng men vi sinh và các ứng dụng của men vi
sinh sẽ trở thành một lĩnh vực quan trọng trong việc phát triển nuôi trồng thủy sản


2

trong tương lai (Maqsood và Benjakul, 2010). Sử dụng các chế phẩm vi sinh trong
nuôi thủy sản nói chung và trong nuôi tôm nói riêng ở nước ta là một xu hướng tích
cực, ngày càng mở rộng để giải quyết vấn đề dịch bệnh và nâng cao chất lượng của
động vật thủy sản (Krishnaprakash, 2009; Senthong và cs, 2012).
Từ những lí do trên, đề tài: “ Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic cho
tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) quy mô pilot” đã được tiến hành.
Mục tiêu đề tài
• Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm sinh học từ chủng lợi khuẩn
Lactobacillus plantarum LH.
• Xậy dựng quy trình sản xuất chế phẩm sinh học từ chủng lợi khuẩn Bacillus
subtilis LH.
Mục đích đề tài
Góp phần nuôi tôm thẻ chân trắng có hiệu quả, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao

của ngành chăn nuôi thủy sản, góp phần nâng cao chất lượng sản phẩm, giảm chi phí
sản xuất, tăng giá trị lợi nhuận cho người nuôi tôm tỉnh Đồng Nai nói riêng và cả nước
nói chung.


3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về probiotic
1.1.1. Định nghĩa
Probiotic là một từ gốc tiếng Hy Lạp có nghĩa là “for life”, được dùng để mô tả
các vi khuẩn có lợi sống trong đường ruột của vật chủ. Thuật ngữ probiotics đã ra đời
và được Paker đưa vào tài liệu khoa học vào năm 1974 “Probiotic như hỗn hợp những
sinh vật và các chất mà giúp cân bằng hệ sinh vật đường ruột” (Paker, 1974). Năm
1989 định nghĩa về probiotic đã được làm rõ hơn bởi Fuller. Ông cho rằng probiotic là
chất bổ sung vi sinh vật sống vào thức ăn giúp cải thiện cân bằng của hệ vi sinh vật
đường tiêu hóa theo hướng có lợi cho vật chủ (Fuller, 1989). Qua thời gian cùng với
sự hiểu biết lớn hơn về probiotic, định nghĩa probiotic được phát triển xa hơn bởi
Havenaar và Huis Int Veld (1992): “Một hỗn hợp tập hợp các vi sinh vật sống, ứng
dụng cho động vật hoặc con người, ảnh hưởng có lợi cho hệ tiêu hóa bằng cách cải
thiện các tính chất của hệ vi sinh vật có sẵn trong vật chủ” (Yuan Kun Lee, Seppo
Salminen, 2009).
Năm 2002, tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO) và tổ
chức Y tế thế giới (WHO) khẳng định rằng probiotic là “các vi sinh vật sống khi đưa
vào cơ thể theo đường tiêu hóa với một số lượng đủ sẽ đem lại sức khỏe tốt cho vật
chủ”. Đây là định nghĩa thể hiện tương đối đầy đủ bản chất của probiotic và được
nhiều nhà khoa học sử dụng (FAO và WHO, 2002).
1.1.2. Cơ chế tác dụng của probiotic
• Sản sinh các hoạt chất ức chế
Các vi khuẩn probiotic (LAB, Bifidobacterium) có khả năng sản sinh hàng loạt

các chất ức chế: acid hữu cơ, H2O2, CO2, bacteriocin, các hợp chất kháng khuẩn phân
tử lượng thấp, và một số hợp chất khác. Các chất này được sinh ra bên trong đường
ruột và bên ngoài môi trường nuôi sẽ có tác dụng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn
gây bệnh khác (Maeda và cs, 2014).
• Cạnh tranh loại trừ vi khuẩn gây bệnh
Từ nghiên cứu của Kenneth H. Wilson & Fulvio Perini (1998), cho thấy các
khuẩn probiotic có khả năng cạnh tranh vị trí bám và thức ăn trong thành ruột với các


4

vi sinh vật gây bệnh, từ đó giúp ngăn ngừa dịch bệnh, đảm bảo sức khỏe cho vật nuôi.
Đây là rào cản hữu hiệu ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh.
• Tăng cường hệ miễn dịch
Các chế phẩm sinh học có thể kích thích hệ miễn dịch của vật nuôi, làm cân bằng
hệ vi sinh đường ruột góp phần quan trọng trong việc hình thành cơ chế miễn dịch của
vật chủ. Việc sử dụng Lactobacillus plantarum đã được chứng minh có hiệu quả trong
việc chống lại vi khuẩn gây bệnh V. alginolyticus bằng cách tăng sức đề kháng và kích
hoạt hệ miễn dịch của tôm thẻ chân trắng (Chiu-Hsia Chiu và cs, 2007).
• Cải thiện chất lượng nước
Có nhiều nghiên cứu cho thấy chất lượng môi trường nước ao nuôi được cải thiện
khi bổ sung probiotic, đặc biệt là khi bổ sung chế phẩm có chứa các chi Lactobacillus
và Bacillus (Verschuere và cs, 2000). Các vi sinh vật có lợi giải phóng enzyme ngoại
bào có tác dụng làm giảm vi khuẩn, virus gây bệnh, giúp chất lượng nước trong ao
nuôi được cải thiện, làm giảm mùi hôi, từ đó tăng sản lượng nuôi trồng thủy sản (Bùi
Quang Tề, 2009). Theo Sihag và Sharma (2012), việc bổ sung chế phẩm sinh học giúp
cải thiện chất lượng nước, đặc biệt là vi khuẩn Bacillus spp.
• Cải thiện hệ tiêu hóa
Chế phẩm sinh học là nguồn dinh dưỡng và enzyme cho bộ máy tiêu hóa của vật
nuôi. Các nghiên cứu cho thấy các dòng chế phẩm sinh học có khả năng sinh tổng hợp

một số enzyme như lactase, protease, amylase…. Điều này có ý nghĩa rất lớn vì nó góp
phần làm tăng khả năng tiêu hóa thức ăn, qua đó làm tăng tốc độ tăng trưởng và giảm
hệ số chuyển hóa thức ăn (FCR) (Xu-xia Zhou và cs, 2009).
1.1.3. Các chủng vi sinh vật thường sử dụng để làm probiotic cho tôm
Vi khuẩn được sử dụng làm probiotc chủ yếu là các chủng Bacillus và
Lactobacillus. Bên cạnh đó, nấm men cũng được xem là tiềm năng probiotic hiện nay.


5

Chủng Lactobacillus
Theo Bergey và cộng sự, (1923) Lactobacillus plantarum được phân loại:
Giới (Kingdom): Bacteria
Ngành (Division): Firmicutes
Lớp (Class): Bacilli
Bộ (Order): Lactobacillales
Họ (Family): Lactobacillaceae
Giống (Genus): Lactobacillus
Loài: L. Plantarum
Vi khuẩn Lactobacillus thường có dạng hình que, gram dương, không hình thành
bào tử và hiếm khi dao động, với kích thước khoảng 0,5 – 1,2 x 1 – 10 μm. Các tế bào
vi khuẩn Lactobacillus thường hình thành dạng chuỗi hoặc tồn tại đơn độc. được đặc
trưng bởi khả năng sản xuất axit lactic, chất kháng khuẩn kiểm soát một số vi sinh vật
gây bệnh: Vibrio, Pseudomonas, E.coli, Aeromonas….
Về nhu cầu oxy, Lactobacillus là vi khuẩn kỵ khí tùy ý, thường sinh trưởng chậm
trong không khí. Đôi khi, sự sinh trưởng của chúng có thể được kích thích bằng cách
thêm 5% CO2 vào môi trường nuôi cấy. Về nhu cầu dinh dưỡng, vi khuẩn
Lactobacillus cần chế độ dinh dưỡng đặc biệt, chúng phát triển rất tốt trên môi trường
có chứa nhiều phức chất.
Nhiệt độ tăng trưởng của Lactobacillus rộng, khoảng 2 oC đến 53 oC và nhiệt độ

tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn Lactobacillus là 30 – 40 oC. Nhưng chúng có thể
sinh trưởng trong phạm vi nhiệt độ là 5 – 53 oC.
Vi khuẩn Lactobacillus có khả năng chịu đựng được môi trường có tính axít. pH
tối ưu cho sự phát triển của chúng là pH 5,5 – 5,8. Lactobacillus có một số đặc tính
sinh hóa đặc trưng như: catalase âm tính, khử nitrate âm tính (đôi khi dương tính với
pH > 6), có khả năng lên men glucose (Paul De Vos và cs, 2011). Lactobacillus có khả
năng lên men monosaccarit và hầu hết các loại disaccarit nhưng không thể phân giải
tinh bột (trừ chủng Lactobacillus delbruceckii) (Paul De Vos và cs, 2011; Robinson và
cs, 2000).


6

Trong quá trình lên men một hoặc một số sản phẩm được tạo ra như: formic,
axetic, propionic, butyric, lactic và axit valerianic, cồn và cacbon dioxide. Khả năng
tạo thành axit lactic của các chủng Lactobacillus khác nhau thì rất khác nhau và độ bền
với axit này cũng rất khác nhau. Ngoài khả năng tạo ra axit lactic, Lactobacillus còn
sinh ra các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn (bacteriocin) (Paul De Vos và cs, 2011).
Lactobacillus là nhóm vi khuẩn phổ biến được sử dụng rộng rãi trong sản xuất
các chế phẩm probiotic. Với khả năng sinh acid lactic trong quá trình phát triển là tiềm
năng quan trọng trong sản xuất probiotic. Các chủng thường được sử dụng làm
probiotic như: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus
casei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus reuteri,
Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus lactis, Lactobacillus gasseri (Watchariya
Purivirojkul, 2007).
Chủng Bacillus subtilis
Theo khóa phân loại của Bergey vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc:
Bộ (Order): Eubacteriales
Họ (Family): Bacillaceae
Giống (Genus): Bacillus

Loài: Bacillus subtilis
Trong số các vi sinh vật sản xuất probiotics, Bacilus subtilis là đối tượng được sử
dụng phổ biến. Bacillus subtilis là những vi khuẩn Gram dương, hình que thẳng với
kích thước 0,5 - 2,5 x 1,2 - 10 µm, phân bố rộng rãi trong đất, nước và không khí, có
khả năng kháng nhiệt, kháng điều kiện khô hạn, chịu mặn và tạo bào tử. Đa số chúng
thích nghi sinh trưởng tốt ở pH = 7, nhiệt độ sinh trưởng phù hợp các chủng ưa nóng
từ 45 oC đến 75 oC hoặc cao hơn, chủng ưa lạnh từ -5o C đến 25o C. Đặc biệt, Bacillus
subtilis an toàn cho người và động vật. Phần lớn các chủng Bacillus đều phân giải chất
hữu cơ mạnh nhờ sinh khả năng tiết các enzyme ngoại bào (amylase, protease,
cellulase…) trong quá trình phát triển (Robinson và cs, 2000; Jorge và cs, 2014).
Với đặc điểm tạo bào tử, có khả năng sinh enzyme và thích nghi nhanh với các
điều kiện bất lợi của môi trường nên các chủng Bacillus đã trở thành lựa chọn cho các
nghiên cứu về chế phẩm sinh học hiện nay (Rengpipat và cs, 2000). Một số chủng


7

Bacillus thường dùng để sản xuất chế phẩm sinh học: Bacillus subtilis, Bacillus
pumilus, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis (Robinson và cs, 2000).
1.2. Tổng quan về chế phẩm probiotic cho tôm
Hiện nay đã có rất nhiều chế phẩm probiotic thương mại sử dụng Lactobacillus
như BZT® AQUA, BZT® DIGESTER (Bio -Form, L.L.C., Tulsa, Oklahoma, USA);
Aqua Ron (International Biologicals, Ấn Độ); EPICIN - Pond (Epicore BioNetworks
Inc - USA), QM-probiotic…. Các chế phẩm này có tác dụng làm ổn định chất lượng
nước và nền đáy trong ao nuôi tôm cá; nâng cao sức khoẻ và sức đề kháng tôm cá
nuôi; giảm thiểu ô nhiễm môi trường ao nuôi và xung quanh do nuôi trồng thuỷ sản
gây nên; nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn của thủy sản [5], [14], [22], [26].
1.2.1. Dạng chế phẩm
Theo tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO), chế phẩm
sinh học (Probiotic) có thể phân làm các dạng sau:

• Chứa vi sinh vật hoặc không chứa vi sinh vật.
• Hình thành bào tử hoặc không hình thành bào tử.
• Đơn chủng vi sinh vật hoặc đa chủng vi sinh vật.
• Chế phẩm ngoại lai hoặc chế phẩm bản địa.
(FAO, 2016)
Ngoài ra, các chế phẩm sinh học có thể phân loại dựa theo trạng thái của sản
phẩm, trên thị trường hiện nay tồn tại phổ biến 2 dạng là khô (bột, viên nén, viên
nhộng,...) và dung dịch (nước, hỗn hợp sệt,...), bên cạnh đó là các dạng khác ít phổ
biến hơn như chế phẩm trên môi trường thạch hoặc cơ chất gelatin [39].
Dạng khô:
Có 2 dạng chế phẩm ở trạng thái khô là:
Chế phẩm vi sinh vật dạng khô: sinh khối vi sinh vật sau khi thu được sục khí, ly
tâm để loại bỏ nước và tách vi sinh vật ra khỏi cơ chất, sau đó thêm chất mang và cho
hấp thụ vào CaSO4 (Na2SO4) [39].
Chế phẩm dạng đông khô: các chế phẩm ở dạng này thường là kết quả của sau
quá trình sấy đông khô nhằm loại bỏ nước mà không làm tổn hại đến cấu trúc cũng


8

như chức năng của các vi khuẩn, đưa chúng trở về trạng thái tiềm sinh để có thể bảo
quản trong thời gian dài. Khi được sử dụng, các vi khuẩn này sẽ hấp thụ lại lượng
nước cần thiết và trở lại hoạt động như bình thường. Đây là một dạng chế phẩm sinh
học rất phổ biến trên thế giới [29].
Dạng dung dịch:
Chế phẩm dạng này thường chứa vi sinh vật sống và hỗn hợp chất mang nhằm
duy trì điều kiện sống cho các vi sinh vật đó. Các chế phẩm dạng dung dịch có thể trực
tiếp sử dụng ngay mà không phải qua các bước trung gian khác [39].
1.2.2. Thành phần
Dựa vào mục đích sử dụng có thể chia các sản phẩm chế phẩm sinh học làm hai

loại chính là chế phẩm sinh học sử dụng như thuốc và chế phẩm sinh học thực phẩm
với các thành phần cấu tạo nên sản phẩm khác nhau [42].
Đối với chế phẩm sinh học sử dụng như thuốc: thường bao gồm chủng vi sinh vật
chính được sử dụng làm chế phẩm sinh học ở các chế phẩm đơn dòng hoặc kết hợp với
các chủng vi sinh vật khác ở các chế phẩm đa dòng. Bên cạnh đó là sự bổ sung của các
chất ổn định, chất mang hoặc chất chống đông ở các sản phẩm dạng dung dịch lỏng.
Ngoài ra, đối với các sản phẩm dưới dạng viên nhộng (viên nang) còn kèm theo vỏ
làm bằng chất liệu có thể tiêu hóa được [19].
Đối với chế phẩm sinh học thực phẩm: chế phẩm sinh học ở dạng này thường
được sử dụng như thực phẩm, thành phần bổ sung vào thực phẩm hoặc thực phẩm bổ
sung [18]. Một số thực phẩm thường là thực phẩm lên men bao gồm vi sinh vật, môi
trường lên men và các sản phẩm của quá trình lên men [36]. Thành phần bổ sung vào
thực phẩm như vi sinh vật được bổ sung trực tiếp vào thực phẩm hoặc được sử dụng
trực tiếp. Thực phẩm bổ sung bao gồm vi sinh vật và chứa ít nhất một trong các chất
bổ sung sau: vitamin, khoáng chất, thảo dược (hoặc các loại thực vật khác ngoại trừ
cây thuốc lá), amino acid,… hoặc tổng hợp của nhiều chất trong các chất trên [39].
1.2.3. Tổng quan về quy trình sản xuất chế phẩm probiotic
Để xây dựng một quy trình sản xuất chế phẩm probiotic hoàn thiện và có tính khả
thi cao, nhóm đã tham khảo một số công trình sản xuất chế phẩm probiotic trước đây
như quy trình sản xuất chế phẩm BIO-TS3 của Khuất Hữu Thanh (2012), quy trình sản
suất chế phẩm probiotic bổ sung vào thức ăn cho cá chim vây vàng của Lê Đình Đức


9

(2012) cũng như quy trình sản xuất chế phẩm probiotic đã được đăng ký cấp bằng sáng
chế/giải pháp hữu ích tại Cục sở hữu Công nghiệp, số đơn 1-2005-01623 của Võ Thị
Thứ (2006) và quy trình sản xuất chế phẩm MA18/5M từ chủng P. acidilactici của
Castex và Panes (2012) [3] [4] [13] [34]. Nhìn chung, các công trình trên đã khái quát
hóa được những bước cần thiết trong quy trình sản xuất một chế phẩm, những chỉ tiêu

theo dõi quan trọng cũng như các yếu tố có thể ảnh hưởng đến chất lượng, sản lượng
thành phẩm. Tuy cũng có một số khác biệt đến từ đặc thù của từng mục tiêu sản phẩm
của các công trình trên nhưng nhờ đó nhóm vẫn rút ra được những kinh nghiệm cần
thiết để hoàn thành quy trình mục tiêu đã đặt ra.
1.3. Tổng quan về tôm thẻ chân trắng
1.3.1. Đặc điểm hình thái của tôm thẻ chân trắng
• Tên gọi
Tên khoa học: Litopenaeus vannamei
Tên tiếng anh: White Shrimp
Tên tiếng việt: Tôm thẻ chân trắng
• Nguồn gốc và phân bố
Tôm thẻ chân trắng hay tôm bạc Thái Bình Dương là tôm nhiệt đới, với tên tôm
bạc Thái Bình Dương vì phân bố ở phía Đông Thái Bình Dương. Hiện nay tôm thẻ
chân trắng phân bố ở nhiều khu vực các nước Đông Nam Á và Đông Á như Việt Nam,
Indonesia, Philippin, Thái Lan, Trung Quốc.
• Hình thái cấu trúc
Vỏ mỏng, màu trắng đục, bình thường màu xanh lam, chân bò trắng ngà [18].
1.3.2. Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến tôm nuôi
Nhiệt độ để tôm thẻ chân trắng sinh trưởng và phát triển tốt là 25 oC đến 32 oC.
Nhiệt độ tối ưu cho tôm chưa trưởng thành (khoảng 1g) là 30 oC và tôm trưởng thành
(12g - 18g) là 27 oC.
pH nước dao động từ 7,7 - 8,3.
Độ mặn trong phạm vi 5 - 50‰, thích hợp ở độ mặn nước biển từ 28 - 34‰.
Độ kiềm từ 60 - 100mg CaCO3/l [18].


10

1.3.3. Tình hình dịch bệnh tôm thẻ chân trắng
Việc phát triển mô hình thâm canh trong nghề nuôi tôm hiện nay đang đối mặt

với nguy cơ dịch bệnh nguy hiểm và gây ra không ít tổn thất cho người nuôi tôm ở các
địa phương trong cả nước. Trong đó một số bệnh nguy hiểm và phổ biến hiện nay như:
bệnh đốm trắng (WSSV), bệnh còi (MBV), bệnh đầu vàng (YHV), hội chứng Taura
(TSV), bệnh phát sáng, bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPNS), bệnh hoại tử cơ (IMNV),
bệnh đốm trắng (WSD).
Theo báo cáo trong các cuộc họp về tình hình dịch bệnh nuôi tôm nước lợ 2012,
các vùng nuôi tôm thâm canh và bán thâm canh xảy ra hội chứng hoại tử cấp ở tất cả
các tháng trong năm nhưng nghiêm trọng nhất là tháng 4 đến tháng 7, chiếm 75% tổng
diện tích dịch bệnh trong cả năm. Vùng có độ mặn cao sẽ có tỉ lệ nhiễm bệnh cao hơn
vùng có độ mặn thấp. Những tháng mùa khô, nhiệt độ cao thì tỉ lệ dịch bệnh cao hơn
những tháng nhiệt độ thấp, mùa mưa (Châu Tài Tảo, 2013).
Năm 2013 tình hình dịch bệnh hội chứng hoại tử cấp và đốm trắng giảm đi rất
nhiều so với năm 2011 và 2012 (Tổng Cục Thủy Sản, 2013), nhưng nó vẫn còn gây ra
rất nhiều thiệt hại cho nghề nuôi tôm (Châu Tài Tảo, 2013).
1.4. Tổng quan về tối ưu hóa
Gần đây, việc nghiên cứu phát triển môi trường nuôi cấy mới để tăng cường sản
xuất sinh khối có thể dẫn đến việc sản xuất probiotic có hiệu quả kinh tế hơn
(Shahravy, 2012), đã thúc đẩy sự phát triển của ngành công nghiệp công nghệ sinh học
nỗ lực cải tiến môi trường nuôi cấy, tối đa hóa năng suất nhằm đáp ứng được nhu cầu
của thị trường và giảm giá thành sản phẩm, trong đó bước tối ưu hóa môi trường nuôi
cấy là khâu hết sức quan trọng, có ảnh hưởng lớn đến toàn bộ quá trình. Trong những
hướng nhằm nâng cao hiệu quả thu nhận sinh khối, thì tối ưu hóa thành phần môi
trường lên men đang được quan tâm nghiên cứu. Phương pháp tối ưu hóa truyền thống
dựa trên việc tối ưu từng nhân tố (one-factor-at-a-time) là đơn giản, dễ thực hiện và
những ảnh hưởng của các thành phần được trình bày trên đồ thị mà không cần phải
phân tích thống kê. Tuy nhiên, kết quả mô hình thường xuyên thất bại trong việc xác
định vị trí tại khu vực đáp ứng tối ưu vì những tác động chung của các yếu tố trên bề
mặt đáp ứng không thấy được, điều này có ý nghĩa trong lên men quy mô lớn. Hiện
nay, với việc sử dụng phương pháp toán học qui hoạch thực nghiệm, cho phép xác

11

định được điều kiện tối ưu của đa yếu tố một cách chính xác và mức độ ảnh hưởng của
các yếu tố đến quá trình thu nhận sinh khối vi khuẩn trong cùng một thời điểm. Hơn
nữa, phương pháp này còn cho thấy vai trò tác động qua lại giữa các yếu tố trong cùng
một thời gian nuôi cấy với số lần thí nghiệm ít, đánh giá được sai số trong mỗi lần thực
nghiệm theo các tiêu chuẩn thống kê, xem xét ảnh hưởng của các yếu tố với mức độ
tin cậy cần thiết, tiết kiệm được thời gian, chi phí mà vẫn đem lại hiệu quả mong
muốn. Do đó, nghiên cứu đã sử dụng thiết kế Plackett-Burman là một cách hiệu quả để
sàng lọc các thông số chính trong một số lượng lớn các yếu tố của quá trình tối ưu [8].
1.5. Tổng quan một số công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về sử dụng
probiotic cho tôm
Để giảm thiểu những bất lợi của hóa chất trong nuôi trồng thủy sản, cần phải hạn
chế việc sử dụng. Điều đó có ý nghĩa là phải thường xuyên đối mặt với hàng loạt vấn
đề ô nhiễm môi trường và dịch bệnh. Vì vậy, nghiên cứu để tìm ra các yếu tố sinh học
như probiotic, enzyme góp phần cải tạo môi trường, tăng sức đề kháng cho các đối
tượng nuôi được tiến hành mạnh mẽ [16]. Tuy nhiên, việc sử dụng chế phẩm sinh học
trong nuôi trồng thủy sản hiện nay cũng là vấn đề cần bàn. Bởi vì hầu hết các chế
phẩm hiện nay đang lưu hành trên thị trường là sản phẩm nhập ngoại. Theo công bố
của Sih và cs, thì hiện có 123 loại chế phẩm sinh học được sử dụng bao gồm chế phẩm
trộn vào thức ăn và chế phẩm xử lý nước. Chủ yếu do các công ty cung cấp, phân phối,
đại lý do nước ngoài hay sử dụng công nghệ của nước ngoài để sản xuất và phân phối
tại Việt Nam. Bởi vậy, dù cho nhiều công ty tham gia chuyển giao tiến bộ khoa học kỹ
thuật đến với người nuôi thì trước hết vì mục đích thương mại để có thể thu càng nhiều
lợi nhuận càng tốt chứ không phải vì quyền lợi của người sử dụng. Chưa kể đến tác
dụng của chế phẩm ra sao, bởi vì những chế phẩm nhập ngoại hay chủng vi sinh vật
nước ngoài đưa vào Việt Nam có phù hợp với điều kiện của Việt Nam hay không, thì
việc đưa lượng đáng kể chủng vi sinh vật vào Việt Nam cũng là mối nguy hiểm tiềm
tàng, xét về khía cạnh an toàn sinh học.

12

1.5.1. Trong nước
Trước tình hình dịch bệnh trên tôm thẻ chân trắng đang diễn ra và có xu hướng
lan rộng tại các khu vực nuôi tôm đặc biệt là tôm thẻ chân trắng như hiện nay, nhiều
nghiên cứu về probiotic đã được tiến hành. Trong các nghiên cứu trong nước về sử
dụng probiotic cho tôm và tôm thẻ chân trắng gần đây đã mang lại những hiệu quả tích
cực.
Năm 2003, Võ Thị Thứ và cộng sự đã nghiên cứu tạo chế phẩm BIOCHE và
đánh giá tác dụng của chế phẩm đến môi trường nước nuôi tôm cá”, Tuyển tập báo cáo
tại Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc năm 2003, 119-122.
Năm 2010, Khuất Hữu Thanh và cộng sự đã có công trình “Nghiên cứu ứng dụng
công nghệ sinh học hoàn thiện chế phẩm BIO TS3 có khả năng tăng sức đề kháng của
tôm trong nuôi tôm sú thâm canh”. Trường đại học quốc gia Hà Nội, Viện Công Nghệ
Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm, truy cập ngày 2 tháng 4 năm 2016.
Năm 2014, Phạm Thị Tuyết Ngân và Trần Sương Ngọc thuộc khoa Thủy sản,
Trường Đại học Cần Thơ đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của Bacillus lên môi
trường nuôi và tăng trưởng của tôm thẻ chân trắng. Hai chủng vi khuẩn Bacillus sp.
(B2) và Bacillus amiloliquefaciens (B41) có trong chế phẩm sinh học khi bổ sung vào
bể nghiên cứu đều mang lại những tác động tích cực đến môi trường nước nuôi cũng
như khả năng sinh trưởng của tôm. Bên cạnh đó, việc sử dụng chế phẩm sinh học cũng
mang lại những ảnh hưởng tốt đến tỷ lệ sống và tăng cường sức đề kháng của tôm đối
với vi khuẩn gây bệnh Vibrio (Phạm Thị Tuyết Ngân, Trần Sương Ngọc, 2014).
Cùng năm 2014, Tuan Nguyen Anh và Huong Nguyen Thuy đã công bố kết quả
nghiên cứu công trình tối ưu hóa môi trường lên men Bacillus subtilis để thu sinh khối
cao nhất. Nghiên cứu chỉ ra rằng với thành phần môi trường bao gồm 5.625 g/l
glucose, 13 g/l pepton đậu nành, 2.125 g/l K2HPO4, 0.875 g/l MgSO4.7H2O, 5 g/l
NaCl, 0.05 g/l CaCl2 thì khối lượng tế bào khô cao nhất thu được là 3.033 g/l.

1.5.2. Ngoài nước
Năm 2007, nghiên cứu của Chiu-Hsia Chiu và cộng sự đã chỉ ra rằng L.
plantarum 7 - 40 (NTU102) có tiềm năng là một probiotic giúp tăng giúp chống lại
mạnh mẽ với chủng gây bệnh Vibrio alginolyticus khi cảm nhiễm ở tôm thẻ chân trắng


13

(Litopenaeus vannamei). L. plantarum 7 - 40 (NTU102) được phối trộn vào thức ăn
của tôm thẻ chân trắng trong 168 giờ với hàm lượng 107 cfu/kg thức ăn, giúp giảm tỷ
lệ chết từ 43,3% đến 33,3% và với hàm lượng 1010 cfu/kg thức ăn, tỷ lệ chết giảm là
23,3% (Chiu-Hsia Chiu và cs, 2007).
Năm 2012, Hu và cộng sự đã công bố nghiên cứu về tối ưu hóa môi trường
nuôi cấy Lactobacillus plantarum YSQ khi sử dụng các sản phẩm nông nghiệp có giá
thành thấp như bột đậu nành, bột ngô, lúa mì và nước ép cà chua làm nguồn dinh
dưỡng, từ đó làm giảm giá thành sản phẩm khi lên men theo quy mô lớn.
Năm 2015, Swapna và cộng sự đã kết hợp 2 chủng Bacillus licheniformis và
Lactobacillus rhamnosus trong nghiên cứu. Kết quả cho thấy, đã có nhiều cải thiện
đáng kể về chất lượng cũng như sự tăng trưởng của tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus
vannamei) (Swapna và cs, 2015).
Năm 2016, Faranak Noori1 và cộng sự đã tiến hành tối ưu hóa môi trường nhân
giống chủng Lactobacillus plantarum nhằm phục vụ sản xuất chế phẩm probiotic
(Faranak và cs, 2016).


14

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện
• Thời gian: 04/2017 đến 12/2017

• Địa điểm: Phòng thí nghiệm Vi Sinh I301, Trung tâm Nghiên cứu và Ứng dụng
trường Đại học Lạc Hồng
2.2. Nội dung nghiên cứu
• Tối ưu hóa thành phần môi trường lên men và xác định các thông số lên men thu
sinh khối vi khuẩn Lactobacillus plantarum LH.
• Tối ưu hóa thành phần môi trường lên men và xác định các thông số lên men thu
sinh khối vi khuẩn Bacillus subtilis LH.
• Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm sinh học từ chủng lợi khuẩn Lactobacillus
plantarum LH quy mô pilot.
• Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm sinh học từ chủng lợi khuẩn Bacillus
subtilis LH quy mô pilot.


15

Sơ đồ đề xuất quy trình nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic
Chủng
giống

Hoạt hóa,
nhân giống

Tối ưu hóa môi
trường

Lên men thử
nghiệm

Xác định các
thông số lên men

Lên men

Thu sinh
khối

Phối trộn
chất mang

Đóng gói,
bảo quản

Kiểm tra
chất lượng
sản phẩm
Hình 2.1. Sơ đồ đề xuất quy trình nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic