Cơ sở khoa học và ứng dụng của sinh học phân tử trong giám định hài cốt

Cơ sở khoa học và ứng dụng của
sinh học phân tử trong giám định
hài cốt


NỘI DUNG
I. TỔNG QUAN
II. CƠ SỞ KHOA HỌC
1. SƠ ĐỒ PHẢ HỆ VÀ TY THỂ
2. CÁC BƯỚC VÀ KỸ THUẬT DÙNG TRONG GIÁM ĐỊNH HÀI CỐT
3. GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG HVI VÀ HVII

III. ỨNG DỤNG VÀ THÀNH TỰU


I.TỔNG QUAN
• Giám định hài cốt là một lĩnh vực chuyên môn của giám định khoa học hình
sự (GĐKHHS)
• Là một chuyên môn nghiệp vụ của ngành công an phục vụ công tác điều tra,
truy tố, xét xử tội phạm cũng như xử lí các vi phạm pháp luật.
• Giúp giải quyết các nhu cầu về dân sự và hành chính.
• Việc giám định hài cốt có ba cách là giám định hình thái, giám định hài cốt
bằng kỹ thuật phân tích gen ty thể và giám định qua di vật.


⁕ Ưu, nhược điểm các phương
pháp:

Tên phương pháp
Ưu điểm
Giám định qua

● Xác định khá chính
hình thái xương
xác độ tuổi và giới tính
hài cốt.

Nhược điểm
● Đòi hỏi hộp sọ còn nguyên vẹn.
● Không phải lúc nào cũng thành công, đặc
biệt là khi các đặc điểm nhận dạng và thông
tin trước khi chết không rõ ràng, hồ sơ nha

Giám định qua di
vật

khoa và y tế không có.
 ● Không phải lúc nào cũng có di vật kèm
theo.
● Đối với hài cốt liệt sĩ , do chiến tranh nên
di vật bị phá hủy và không trùng khớp.
● Di vật có thể bị làm giả.


Tên phương pháp
Giám định hài cốt

Ưu điểm
● Gen ty thể có cấu trúc dạng vòng bền

bằng kĩ thuật phân vững
tích hệ gen ty thể

● Tồn tại lâu dài sau khi tế bào bị phân hủy,
được bảo tồn trong xương và răng.
● Có tỉ lệ thành công và độ chính xác cao.

Nhược điểm
● Chỉ xác định được khi có
dòng mẹ.


II.CƠ SỞ KHOA HỌC
-Ty thể là một bào quan của tế bào, là “nhà máy” cung cấp năng lượng
cho tế bào. Điều đặc biệt là ty thể có hệ gene riêng, độc lập với hệ gen di
truyền ở trong nhân. Khi thụ tinh, ty thể của người cha tập trung nằm ở
phần sát đuôi của tinh trùng và không tham gia vào quá trình thụ tinh.
Trong khi đó, tế bào trứng (của người mẹ) lại chứa ty thể tham gia vào
quá trình thụ tinh và hình thành phôi thai. Chính vì vậy, một đứa trẻ ra
đời sẽ chỉ mang ty thể của người mẹ và hưởng các gen ty thể từ đó. Nói
cách khác, ty thể được truyền theo dòng mẹ.
 -Đặc điểm của hệ gen ty thể: Hệ gen này có cấu trúc mạch vòng do đó
bền vững hơn hệ gen nhân. Trong khi đó, hệ gen nhân có mạch thẳng nên
dễ bị phá huỷ trong điều kiện hài cốt được mai táng sơ sài và lâu năm.
Trong các mẫu hài cốt, nhất là những mẫu lâu năm, thì chỉ có hệ gen ty
thể là còn tồn tại và nằm trong xương. Đây chính là nguồn nguyên liệu
quan trọng trong việc giám định hài cốt.


SƠ ĐỒ PHẢ HỆ THEO DÒNG TY THỂ

=> Giám định ADN ty thể : Xét nghiệm bằng cách so sánh hệ DNA ty
thể - xét nghiệm theo dòng mẹ- có thể xác định được mối quan hệ của
một người trong những mối quan hệ họ hàng đã mất từ rất lâu và tổ tiên
thông qua dòng mẹ. Nó cũng có thể cung cấp thêm thông tin cho các
hoàn cảnh nghi vấn về quan hệ huyết thống mẹ con nhưng người mẹ
không thể tham gia vào xét nghiệm. Xét nghiệm này còn dùng để định
danh tính của hài cốt chưa rõ tên. Quá trình này được thực hiện theo
quy trình rất chặt chẽ, vô khuẩn, chính xác với máy móc hiện đại với
mẫu đối chứng thuận lợi nhất là máu của người thân liên quan tới dòng
mẹ (mẹ đẻ, anh chị em cùng mẹ, con của chị em gái...) bởi hệ gien ty
thể của người cha nằm ở đuôi tinh trùng nên không tham gia vào quá
trình tạo phôi khi thụ thai.
=> Giám định nhiễm sắc thể X : Nhiễm sắc thể X tuy số gen tìm được
trên đó chỉ tương đương với khoảng 4% tổng số gen của người nhưng
nó đóng vai trò đặc biệt, xét nghiệm nữ-nữ


SƠ ĐỒ PHẢ HỆ THEO DÒNG BỐ ( nts Y)


=> Giám định ADN giới tính Y : tuy hệ gen nhân di truyền theo
dòng cha có mạch thẳng, dễ bị phá huỷ khó tiến hành với các thi
xác chôn lâu năm những nó chỉ truyền từ người bố cho con trai
và di truyền qua các thế hệ với độ ổn định lớn nên có nhiều ứng
dụng việc truy nhận cha-con trai


1. TY THỂ
a. Ty thể là gì?
- Ty thể là một bào quan màng kép của tế bào sinh vật nhân thực,

- Mỗi ty thể đều có màng ngoài và màng trong
(với đặc tính khác nhau), cấu tạo từ lớp phospholipid
kép cùng protein .
- Cấu tạo gồm 5 bộ phận: màng ty thể ngoài, xoang
gian màng, màng ty thể trong, xoang mào (tạo thành
từ sự gấp nếp màng trong) và chất nền. Ty thể nào bị
tước đi màng ngoài thì gọi là mitoplast.


b. Hệ gen ty thể (mtDNA-mitochondrial)
● Ty thể là bào quan có hệ gen riêng, nhân bản độc lập với gen nhân. Khá bền vững và ít bị
phá hủy hơn so với gen nhân có cấu trúc mạch thẳng dễ bị phân hủy bởi enzyme nội bào hoặc vị
khuẩn
● DNA ty thể người tồn tại ở dạng mạch vòng kép (2 chuỗi: chuỗi nặng H và chuỗi nhẹ L),
dạng trần không có histon , có kích thước 16569 bp, gồm 37 gen, trong đó:
- Có 13 gen mã hóa tham gia vào tạo enzyme có vai trò trong chuỗi điện tử phospholyl hóa.
- 22 gen mã hóa tRNA và 2 gen mã hóa rRNA. Các RNA này tham gia vào quá trình dịch
mã trong tế bào ti thể và vẫn đảm bảo thông tin di truyền bộ gen của ti thể


Mô hình DNA ty thể ở người

- Vùng điều khiển D – Loop
viết tắt là mtDNA: có vùng siêu
biến HVI và vùng siêu biến
HVII ( quan trọng nhất) và
HVIII
- Cytochrome b hoạt động như
chuỗi vận chuyển điện tử
- NADH dehydrogenase

subunits xen kẽ các gen mã hóa
ARN
- 16S rRNA vai trò cấu trúc,
hoạt động như một giàn giáo
xác định vị trí của các protein
ribosome 
- 12S rRNA thành phần của tiểu
đơn vị nhỏ


*** Vùng điều khiển D - Loop (Displacement Loop) của bộ gen ty thể hay DNA ty
thể viết tắt là mtDNA (mitochondrial Deoxyribo Nucleic Acid) người với các ưu
điểm như di truyền độc lập với DNA nhân, tần số đột biến cao, di truyền theo dòng
mẹ, không tái tổ hợp và số lượng bản sao lớn ,đặc biệt là vùng siêu biến HVI và
vùng siêu biến HVII
=> Mục đích của xét nghiệm ADN là tìm ra sự khác biệt giữa các trình tự nucleotic
giữa các cá thể. HVI và HVII là những trình tự quan trọng và được phân tích để xác
định danh tính của mỗi người. Trình tự gen của 2 vùng HVI và HVII có độ đa hình
cao nhất, không chứa các gen mã hóa và có tỉ lệ đột biến cao hơn 10 lần so với các
vùng gen mã hóa
Trình tự HVIII là một phần cuả vùng gen mã hóa


● Hệ gen ty thể không chứa intron và toàn bộ trình tự đều mã hóa protein
● Chỉ có 1 vùng không mã hóa gọi là vùng kiểm soát hay vùng D-Loop chứa
điểm khởi đầu sao chép chuỗi nặng và promoter cho phiên mã chuỗi nặng và
chuỗi nhẹ
● Hệ gen ty thể có thể tồn tại lâu hơn sau khi tế bào bị phá hủy so với hệ gen
trong nhân.

c. Đặc điểm di truyền của mtDNA
● Đặc điểm di truyền của mtDNA là theo dòng mẹ, giống tất cả các DNA
ngoài nhân khác.
● Đó là do khi thụ tinh thì hợp tử thừa kế tế bào chất và các bào quan độc
quyền từ tế bào trứng của mẹ, trong đó có mtDNA, còn tinh trùng chỉ góp
vào DNA nhiễm sắc thể và bỏ lại các bào quan,.. bên ngoài hợp tử.
→ Người mẹ truyền hệ gen ty thể cho các con nhưng chỉ con gái bà mới có
thể truyền hệ gen này cho thế hệ tiếp theo.


2. CÁC BƯỚC TRONG GIÁM ĐỊNH HÀI CỐT
A. Chuẩn bị mẫu
Lấy mẫu hài
cốt

Lấy
mẫu

Lấy mẫu sinh
phẩm của thân
nhân

Mẫu hài cốt còn
nguyên vẹn

Mẫu hài cốt
không còn
nguyên vẹn

Mẹ, Bà
ngoại→Bác,
Cậu, Dì

Lấy từ 1 đến 2
chiếc răng
Lấy khoảng 2x2
cm xương còn
cứng
Lấy khoảng 2x2
cm xương ống
Móng tay hoặc
móng chân (5
mảnh)
Tóc (10 sợi có
chân tóc)

Bảo quản trong
túi nilon có niêm
phong, ngoài bì
ghi rõ đề nghị
xác định danh
tính đối với hài
cốt.
Bảo quản trong
túi nilon đặt
trong bì thư,
ngoài bì ghi rõ
thông tin người
được lấy mẫu.

⁕ Chuẩn bị mẫu để thực hiện phản ứng
PCR

‣ Lấy 1 lượng xương
nhỏ trong mẫu hài cốt
để tách chiết DNA

‣ Làm sạch mẫu bằng thuốc tẩy
và nước cất
‣ Nghiền thành bột trong nitơ
lỏng
‣ Ngâm bột xương trong dung
đệm phân giải.
‣ Cần 750 mg bột xương và 1,6
ml dd đệm phân giải.
‣ Đệm phân giải gồm EDTA
0.1M; dd muối và proteinase K.

‣ Ủ hỗn hợp bột xương
và đệm phân giải qua
đêm ở 37⁰C

Mục đích : Phân giải
tối ưu mẫu xương để
giải phóng DNA ty
thể

Mục đích: Loại
bỏ dịch
Mục đích : Loại
bỏ tạp chất không
cần thiết.
Ly tâm tốc độ cao
mẫu

Ly tâm lạnh hỗn hợp
với tốc độ 1500 v/ph
‣ Loại bỏ cặn lắng.
‣ Bổ sung thêm muối
amoni acetat và tủa DNA
ty thể trong cồn tinh khiết

Mục đích : Kết tủa
DNA

Thu và hòa tan
DNA trong nước
khử ion

MỌI CÔNG ĐOẠN ĐỀU THỰC HIỆN TRONG MÔI TRƯỜNG INVITRO VÀ VÔ TRÙNG


B. Khuếch đại DNA ty thể
● Một đoạn gen đặc hiệu HV1 nằm trong
vùng D-Loop của ADN ty thể được nhân bản
bằng máy PCR để tạo ra hàng tỷ bản sao,
phục vụ cho khâu tách dòng gen

● Thành phần tham gia QT PCR gồm :
⁃ Mạch khuôn của DNA ty thể
⁃ Mồi primer
⁃ Enzyme chịu nhiệt DNA polymerase
(Taq)
⁃ dNTP
⁃ dung dịch đệm ( buffer)
⁃ ion Mg2+


Sử dụng phần mềm Primer premier 6.0 để thiết kế hai cặp mồi (primer) cho trình tự
HVI và HVII của bộ gen ty thể dựa trên trình tự rCRS của Andrews đã được công
bố vào năm 1999. Xác định hàm lượng của trình tự HVI, HVII bằng phân tử gắn
huỳnh quang EvaGreen vào dsDNA. Dùng bộ kit Kapa 2G Robust Hotstart
Readymix (2X) xây dựng phản ứng định lượng với 5 đường chuẩn và thực hiện
phản ứng Real - Time PCR trên máy LightCycler® Nano Real - Time PCR System
của hãng Roche. Chu trình luân kỳ nhiệt theo Bảng 1.


Công đoạn

Nhiệt độ (0C)

Tốc độ gia nhiệt (giây)

Thời gian (giây)

Chương trình PCR (35 ÷ 40 chu kỳ)

Tiền biến tính

95

5,0

180

Biến tình

90

2,5

5

Bắt cặp

55

2,5

15

Kéo dài mạch

72

2,5

10

Kéo dài sau cùng

95

5,0

120

Phân tích đỉnh chảy

Giai đoạn đầu

60

4,0

15

Giai đoạn cuối

90

0,5

15


Tên mồi

Khuếch đại gen:
Sau khi tách chiết AND ti thể, kiểm tra
nồng độ ADN, tiến hành phản ứng PCR
bằng cặp các mồi trên 2 vùng siêu biến
HVI, HVII của ADN ti thể:

Khuếch đại
vùng siêu
biến

Trình tự mồi
 

F15971

HVI

5’-TTA ACT CCA CCA TTA GCA CC-3’

R16391

HVI

5’-GAG GAT GGT GGT CAA GGG AC-3’

F15

HVII

5’-CAC CCT ATT AAC CAC TCA CG-3’

R408

HVII

5’-ATT ATT TAT CGC ACC TAC GT-3’


Đối với những mẫu xương lâu năm, ADN ti thể bị phân hủy thành những đoạn
ngắn thì có thể sử dụng thêm những cặp mồi khác để phân tích những đoạn
gen ngắn hơn sau đây:
Tên mồi

Vùng

Kích thước

Ta

F15997 - R16236

HV1A

278bp

51.28

F16159 - R16401

HV1B

281bp

51.28

F6 - R285

HV2A

301bp

53.77

F172 - R408

HV2B

278bp

49.75


Chu trình nhiệt của quá trình
Kéo dài
Biến tính

36 chu kỳ

Kết thúc
 

72oC/10 phút

95oC/11 phút

95oC/1 phút
55oC/1 phút
72oC/1 phút

4oC/ ∞