tách dòng gen defensin thực vật và thiết kế vector chuyển gen để tạo dòng ngô chuyển gen kháng mọt

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM TIN SINH HỌC
ĐỀ TÀI: TÁCH DÒNG GEN DEFENSIN THỰC VẬT VÀ
THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN ĐỂ TẠO DÒNG NGÔ
CHUYỂN GEN KHÁNG MỌT 


• Cây ngô (Zea mays L.) là một trong những cây ngũ cốc
chính có giá trị kinh tế cao, góp phần nuôi sống 1/3 dân số
thế giới. Trên thế giới, cây ngô hiện đứng thứ ba về diện
tích, đứng thứ hai về sản lượng và đứng đầu về năng suất.

Đặt vấn đề
(Lí do chọn
đề tài)

• Là ngũ cốc giầu tình bột, hạt ngô là một trong đối tượng
dễ bị mọt xâm hại. Mọt ngô (Sitophilus zeamais Motsch) là
loại đa thực, có thể ăn được hầu hết các loại ngũ cốc, các
loại đậu, hạt có dầu và nhiều sản phẩm thực vật khác.
Thức ăn thích hợp nhất với mọt là hạt ngô và gạo.
• Các mẫu ngô lai được trồng ở Việt Nam hiện nay cho năng
suất cao nhưng sản lượng, giá thành, chất lượng bị giảm
đáng kể do hạt của các mẫu ngô này rất dễ bị mọt xâm
hại
 Nghiên cứu ứng dụng công nghệ tạo giống ngô kháng mọt
đang được nhiều nhà khoa học quan tâm


• Là protein đa chức năng nhỏ bao gồm 45-54 amino acid,
giàu cysteine,  ức chế sự sinh trưởng của nấm, chống vi
khuẩn, làm thay đổi kênh màng, ức chế hoạt động của

trypsin, α-amylase.

Gen Defensi
n
thực vật

• Defensin của thực vật có 18 nhóm, trong đó nhóm 1 bao
gồm các defensin có khả năng ức chế enzyme α-amylase
hoặc trypsin.
• Trong ruột mọt ăn ngô, defensin liên kết với trung tâm hoạt
động của α-amylase trong ruột mọt, dẫn đến ức chế quá
trình tiêu hóa tinh bột của mọt.
Thiết kế vector chuyển gen mang gen defensin1 phục vụ việc
phát triển mẫu ngô chuyển gen có khả năng kháng mọt cao.


1. Xác định gene cần tách:
- Xác định tính trạng quan tâm.
- Xác định gen quy định tính trạng đó trong các báo cáo khoa học.
- Tìm kiếm 1 số gen mã hóa protein quan tâm trên ngân hàng dữ liệu.

Các bước
tiến hành

2.Thiết kế mồi:
- Align các trình tự mã hóa 1 protein bằng Clustal Omega
- Xác định vùng bảo thủ (mồi được thiết kế sẽ nằm trong vùng bảo thủ
này)
- Thiết kế mồi: sử dụng các chương trình như: Primer Blast, Primer3Plus,
Primer3.

3.Kiểm tra mồi: Sử dụng PCR ảo SMS
Xem xét đoạn kết quả sau khi chạy SMS xem có tương đương (kích
thước,... ) với đoạn mà định nhân lên không, rồi cho vào Blast của NCBI
để xem nó có là gen mã hóa tính trạng cần nghiên cứu không.

4.Phân tích cấu trúc 3D, dự đoán sản phẩm tách dòng và biểu hiện protein
5.Xây dựng phương án tách dòng gen.


Truy cập cơ sở dữ liệu NCBI
 theo link nhập từ khóa "Defensin
Zea may".

1.Xác định
gen cần
tách


Lựa chọn (ít nhất) 3 trình tự gen defensin thực vật quan tâm
trên cây ngô.

1.Xác định
gen cần
tách


1.Xác định
gen cần
tách

Nhấn vào FASTA, thu được
trình tự nucleotit của các
đoạn gen đã lựa chọn, sao
chép vào file word dưới
dạng FASTA


Nhấn vào ''GenBank" để đọc, tìm hiểu thông tin cơ bản của đối
tượng cần nghiên cứu như ngày công bố, nơi thực hiện, nguồn
gốc, tác giả,..dựa trên các bài báo; có thể căn cứ vào đó để chọn
đoạn gen làm khuôn.

1.Xác định
gen cần
tách


Truy cập phần mềm Clustal Omega theo link: 
so sánh độ
tương đồng giữa các gen đã chọn và tìm ra vùng bảo thủ
để thiết kế mồi.
Giao diện của Clustal Omega:

1.Xác định 
gen cần tách


Đưa các trình tự nu vừa thu được từ NCBI vào ô bên dưới, thiết lập
các thông số mong muốn và nhấn vào ô "Submit" để ra kết quả.

1.Xác định 
gen cần tách


*Kết quả sau khi so
sánh:

1.Xác định 
gen cần tách

*Lựa chọn vùng bảo thủ
là vùng có nhiều dấu
sao
=> sử dụng làm vùng
thiết kế mồi.
*Từ kết quả, nhận
thấy gen  HG792392.1 c
hứa nhiều
trình tự bảo thủ, độ dài
hợp lí, là một gen ngô ở
Sơn La, nên có
khả năng tương đồng
cao với gen ngô lai ở
Việt Nam cần nghiên
cứu.


Điều kiện mồi:

2.Thiết kế

mồi

• Độ dài: 18-24 bp
• Nhiệt độ bắt mồi của 2 nhiệt không lệch quá nhau 5 độ C
• Tỉ lệ GC: 40-60%. Tối ưu là 50-55%
• 5 nu cuối cùng đầu 3’ cần có ít nhất 2G hoặc 2C
• Hạn chế khả năng tự bắt cặp của mồi và bắt cặp mồi với
nhau: hạn chế các đoạn lặp hoặc những đoạn từ 4 nu trùng
nhau trở lên.
=>Chọn trình tự mồi trên khuôn gen  HG792392.1 (giống
ngô Sơn La)
• Forward primer: 32-53
• Reverse primer: 152-173


Truy cập phần mềm Primer Blast theo link:
thiết kế
mồi cho phản ứng PCR

Đoạ
n ge
nd
kh u ù ng l à
m
ôn

2.Thiết kế 
mồi

m ồi

ế
k
t
ế
u thi ngược
n
í
r
t
ồi
Vị
và m

i
ộ dà
đ
n
hạ
Giới
 
Nhiệt độ

xuôi


Sau khi set up các thông số, nhấn vào ô "Get Primer để
chạy chương trình.

2.Thiết kế 
mồi

Sau khi chạy chương trình, thu được 4 cặp mồi:

2.Thiết
kế mồi

Dựa vào các tiêu chí chọn mồi, chọn cặp mồi số 1 
-Forward primer: TCCTCGTCCTCATGCTCCTC
-Reverse primer:  CGGTCTGGCACACGTTGG


Truy cập phần mềm PCR Test theo link:
/>wAR3EKOp97MhS3l0DisH_XyQNg8GZWJp-UIDT6efgShXRd83wTwT7p3zjJ0k
  để thực hiện PCR đối với đoạn gen của HG792392.1 với cặp mồi số
1 vừa chọn.

Gen
HG7
923
92.1

3.Kiểm tra
mồi

uôi
Mồi x

Mồi n
gược

Nhấn Submit để ra kết quả


Kết quả sau khi chạy PCR ảo
Nhận xét: đoạn kết quả trên có kích thước gần tương đương với đoạn
gen định nhân lên.
=>Đoạn bảo thủ chọn tương đối phù hợp.

3.Kiểm tra
mồi


Đối chiếu lên Blast:
/>Chọn Nucleotide => Protein

3.Kiểm tra
 mồi


3.Kiểm tra
mồi


Thu được kết quả:

3.Kiểm tra 
mồi

*Lựa chọn protein tương đồng cao nhất với mục tiêu: CEJ09690.1 

FASTA: > CEJ09690.1 D efensin protein [Zea m ays]
M APSRRM A APVLVLM LLPVATELG TTKVAEARH CLSQ SH RFKG LCM SSN N C
AN VCQ TEN FG G ECKAEG ATRKCFCKKIC\
*Chọn vào mục Accession để xem một số thông tin protein.


4. Phân tích
cấu trúc 3D,
dự đoán sản
phẩm tách
dòng và biểu
hiện
protein

Truy cập link: dự đoán chức
năng của protein
=>Vào mục Blast, nhập vào trình tự PCR ảo


Chọn protein có độ tương đồng cao rồi vào mục Funtion:

4. Phân tích
 cấu trúc 3D,
dự đoán sản
phẩm tách
dòng và biểu
hiện
protein

Truy cập link: tìm vị trí 
=> Nhập vào trình tự protein thu được kết quả:

4. Phân tích 
cấu trúc 3D,
dự đoán sản
phẩm tách dò
ng
và biểu hiện
protein


Truy cập trang Blast của protein trên NCBI để tìm cấu
trúc không gian 3 chiều.

4.Phân tích
cấu trúc 3D,
dự đoán sản
phẩm tách dòn
g và biểu hiện
protein

Ta thấy region name của protein này là "Gamma-thionin"


Tra trong Structure với từ khóa ''Gamma-thionin"

4.Phân tích 
cấu trúc 3D,
dự đoán sản

phẩm tách
dòng và biểu
hiện protein