PHÂN LẬP, NHẬN DIỆN VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH VI KHUẨN NỘI SINH CÂY LÚA TRỒNG Ở TỈNH PHÚ YÊN BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG Ngành: Sinh học

ỦY BAN NHÂN DÂN TỈNH PHÚ YÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC PHÚ YÊN
-------------------

VĂN THỊ PHƢƠNG NHƢ

PHÂN LẬP, NHẬN DIỆN VÀ KHẢO SÁT
MỘT SỐ ĐẶC TÍNH VI KHUẨN NỘI SINH CÂY
LÚA TRỒNG Ở TỈNH PHÚ YÊN

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU
KHOA HỌC CẤP TRƢỜNG
Ngành: Sinh học

Phú Yên, 8/2014
1


TÓM TẮT
Vi khuẩn nội sinh thực vật được tìm thấy trong hầu hết ở các loài thực vật, chúng
cư trú ở trong mơ của thực vật và giữa chúng hình thành các mối quan hệ khác nhau như
cộng sinh tương hỗ, cộng sinh dinh dưỡng, hội sinh …có nhiều lồi vi khuẩn nội sinh
thực vật - cây lúa như Pantoea, Azospirillum, Burkholderia, ...vi khuẩn nội sinh thúc đẩy
thực vật tăng trưởng, tăng năng suất và đóng vai trị là một tác nhân điều hịa sinh học.
Ngồi ra, chúng cịn có tiềm năng loại bỏ các chất gây ô nhiễm trong đất bằng cách tăng
cường khả năng khử độc trên thực vật và làm cho đất trở nên màu mỡ thông qua chu
trình phospho và cố định đạm.
Một trăm mươi bảy dòng vi khuẩn được phân lập từ 20 mẫu lúa cao sản thu ở 3
huyện Đơng Hịa, Sơng Hinh, Tuy An và thành phố Tuy Hòa thuộc tỉnh Phú Yên. Đa số
các dịng vi khuẩn này đều có dạng hình que, gram âm và có khả năng chuyển động.
Kết quả khảo sát khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA của 115

dòng vi khuẩn cho thấy dịng L22 thuộc huyện Tuy An có khả năng tổng hợp NH4+ cao
nhất (5,61 mg/l) sau 4 ngày nuôi cấy, dịng L136 thuộc huyện Đơng Hịa có hàm lượng
lân hịa tan cao nhất (319,51 mg/l) sau 10 ngày nuôi và dịng N11 thuộc huyện Tuy An
có hàm lượng IAA cao nhất (25,63 µg/ml) sau 4 ngày ni.
Từ khóa: Cây lúa, cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA, vi khuẩn nội sinh.

2


DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT
Tiếng Việt
16S-rDNA 16S-ribosomal DNA coding gene
Blast
DNA

Basic lical alignmeht search tool
Acid deoxyribonucleic

FAO
IAA

Food and Agriculture of Organisation
Indole acetic acid

ML
NCBI

Ma Lâm
National centre for biotechnology information

Nfb
PCR
RMR
SEM

Biological nitrogen fixation
Polymerase chain reaction
Phản ứng với chuỗi polyme
Rennie medium supplemented with rice extract and malate
Scanning electron microscope
Kính hiển vi điện tử qt

3

Tổ chức nơng lương thế giới


MỞ ĐẦU
* Lí do chọn đề tài
Lúa gạo là nguồn lương thực chủ yếu trong khẩu phần dinh dưỡng cho hơn 40%
dân số thế giới. Trong năm 2012, sản lượng lúa trên thế giới đạt 729 triệu tấn [4]. Năng
suất cũng như sản lượng lúa tùy thuộc vào khí hậu, loại đất, độ ẩm và nguồn dinh dưỡng.
Cây lúa cần nhiều chất dinh dưỡng khác nhau, chủ yếu là đạm, lân và kali để tăng
trưởng, phát triển tốt và cho năng suất cao. Theo ước tính để sản xuất 1 tấn sinh khối cây
(bao gồm hạt và rơm) cần 16 - 19 kg N, 2,5 - 3,5 kg P và 19 - 25 kg K [28]. Vì vậy, để
đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng cho cây lúa người dân phải sử dụng một lượng lớn phân
bón hóa học, chủ yếu là phân đạm, lân và kali. Ở Việt Nam theo báo cáo của Cục Trồng
Trọt, năm 2012 tổng diện tích đất trồng lúa của cả nước khoảng 7,76 triệu ha, trong đó
tỉnh Phú Yên 32.710 ha.
Trước sức ép của vấn đề an ninh lương thực, người dân luôn đặt ra mục đích phải

thu nhiều sản phẩm. Song do ý thức và trình độ canh tác chưa cao nên tình trạng lạm
dụng phân bón hóa học đã xảy ra khá phổ biến. Điều này đã tác động bất lợi đến chi phí
sản xuất, đến mơi trường dẫn đến kết quả sản xuất khơng mang lại hiệu quả kinh tế và
chưa có nền sản xuất lúa bền vững. Để khắc phục những tác động bất lợi trên thì việc sử
dụng phân bón sinh học trong q trình sản xuất nói chung và sản xuất lúa nói riêng thật
sự rất có ý nghĩa.
Hiện nay, các nhà nghiên cứu đã quan tâm nhiều đến những loài vi khuẩn nội sinh
và ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong sản xuất phân bón. Vi khuẩn nội sinh có vai trị
quan trọng đối với cây trồng, chúng có những đặc tính tốt như có khả năng cố định đạm
cho cây trồng, hịa tan lân khó tan giúp cho cây trồng hấp thụ tốt chất dinh dưỡng, tổng
hợp kích thích tố sinh trưởng IAA, tăng hàm lượng các chất khoáng, tăng khả năng
kháng bệnh và giúp loại bỏ các chất gây ô nhiễm môi trường [75]. Các vi khuẩn nội sinh
tiêu biểu như Azosprillum, Herbaspirillum, Burkholderia, Pseudomonas,
Gluconacetobacter, ...
Nhiều thử nghiệm đã chứng minh việc gia tăng năng suất cây trồng do sử dụng vi
khuẩn nội sinh như Okon và Labandera -Gonzalez khi thử nghiệm ngoài đồng ở các cây
trờng được chủng vi kh̉n nợi sinh Azospirillum thì sản lượng cây trồng tăng lên 5 30%, cao hơn nhiều so với việc sử dụng phân hóa học [66]. Những thí nghiệm ở Mỹ ch o
4


thấy Azospirillum có thể thay thế được

40 kg N/ha/năm [77], ở Thái Lan , những thử

nghiệm trên bắp năm 1984-1985 cho thấy sản lượng bắp tăng 15-35% [86]. Thử nghiệm
ở lúa cho thấy loài Burkholderia vietnamiensis sau 14 ngày chủng giúp tăng khả năng
đâm chồi 33%, số lượng rễ tăng 57%, bề mặt lá tăng 30%, năng suất lúa tăng 13 - 22%
[83].
Việc phân lập, nhận diện và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây
lúa là cơ sở để tuyển chọn được vi khuẩn nội sinh có đặc tính tốt ứng dụng sản xuất phân

bón vi sinh cung cấp cho sản xuất nông nghiệp. Đặc biệt đối với cây lúa, là đối tượng cần
được nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh vì đây là loại cây lương thực chính được trồng phổ
biến ở tỉnh Phú Yên.
Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân lập, nhận
diện và khảo sát một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh cây lúa trồng trên đất ở tỉnh
Phú Yên”.
* Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập, nhận diện và khảo sát các đặc tính của các dòng vi khuẩn nội sinh cây
lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên là cở sở để tuyển chọn các dịng vi khuẩn có đặc tính
tốt như cố định đạm, hòa tan lân, sinh tổng hợp IAA để ứng dụng sản xuất phân sinh học
bón cho cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên trong tương lai.
Mặt khác, việc nghiên cứu này còn là nguồn tài liệu hỗ trợ cho sinh viên tiếp cận
với phương pháp nghiên cứu khoa học, nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh, giúp cho sinh
viên hiểu biết nhiều hơn về đặc tính của vi khuẩn nội sinh. Đồng thời các sản phẩm
nghiên cứu sẽ được chuyển giao về khoa Nông Nghiệp của trường Đại học Phú Yên để
ứng dụng.
* Nội dung nghiên cứu
+ Phân lập các dòng vi khuẩn từ rễ, thân cây lúa trên môi trường LGI, NFb và
RMR.
+ Quan sát hình thái, đo kích thước khuẩn lạc.
+ Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn
+ Nhận diện các dòng vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR
+ Khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh: cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp
IAA.
5


+ Giải trình tự một số dịng vi khuẩn phân lập được có đặc tính sinh học cao

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.Vi khuẩn nội sinh thƣ̣c vật
1.1.1. Giới thiệu về vi khuẩn nội sinh thƣ̣c vật
Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn trải qua phần lớn vòng đời trong cây trồng [69]. Từ
vùng rễ, chúng xâm nhập vào mô thực vật. Sau khi xâm nhập vào cây chủ, các vi khuẩn
nội sinh có thể tập trung tại vị ví xâm nhập hay phát tán khắp nơi trong cây đến các tế
bào bên trong, đi vào các khoảng trống gian bào hay vào trong hệ mạch [89]. Mật số của
quần thể vi khuẩn nội sinh rất biến thiên, phụ thuộc chủ yếu vào loài vi khuẩn và kiểu di
truyền của cây chủ, nhưng cũng phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của cây chủ và các
điều kiện môi trường [68].

Rễ thứ cấp
Rễ chính

Biểu bì

Nội bì
Lơng hút

Vùng vỏ

Mơ gỗ
Mơ libe
Nội bì
Vùng kéo dài rễ
Trung tâm

Nội bì

Lơng hút

Chu ln

Chóp rễ

Hình 1: Cơ chế xâm nhiễm vi khuẩn nội sinh thực vật
( />Một số nhóm vi khuẩn nội sinh khơng gây hại hay gây bệnh cho cây chủ, mà trái
lại chúng có thể thúc đẩy sự phát triển của cây trồng bằng cách sản xuất các chất kích
thích sự sinh trưởng thực vật và sự cố định đạm từ khơng khí. Hơn nữa, một số dịng vi
khuẩn nội sinh có thể giúp cây kháng lại mầm bệnh [22] và kích thích cây trồng chống
chịu với nhân tố vô sinh và hữu sinh [39].

6


1.1.2. Các nhóm vi khuẩn nội sinh thƣ̣c vật
1.1.2.1. Vi khuẩn Azospirillum
Trong những năm 1984 - 1985, người ta đã phát hiện nhiều loài của giống
Azospirillum trong vùng rễ của cỏ Kallar (Leptochloa fusca) [71]; trong đó các vi khuẩn
xâm nhập vào bên trong nhu mơ rễ có khả năng cố định đạm, hịa tan lân ở dạng khống
khó tan và các chất dinh dưỡng khác [74], sản xuất kích thích tố thực vật [85], hay kiểm
sốt các vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng [70].
1.1.2.2. Vi khuẩn Azotobacter
Năm 1966, Dưbereiner phân lập được lồi Azotobacter paspali từ các cây cỏ, chúng
có khả năng cố định đạm cộng sinh và tổng hợp IAA
1.1.2.3. Vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus
Vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus có ở nhiều loại cây hịa bản khác nhau
như bắp, lúa hoang, cỏ voi, khóm, cà rốt, củ cải đường, cải bắp và cây cà phê với các đặc
tính ưu việc như có khả năng cố định đạm, tổng hợp cả IAA và gibberellin, hịa tan kẽm
và lân khó tan [61].
1.1.2.4. Vi khuẩn Herbaspirillum

Vi khuẩn Herbaspirillum là vi khuẩn vi hiếu khí, vi khuẩn cố định đạm sống trong
rễ của nhiều cây không phải là họ đậu, bao gồm các loại cây họ lúa có giá trị kinh tế.
Hai lồi Herbaspirillum seropedicae và Herbaspirillum rubrisubalbicans đã được
tìm thấy ở cây bắp, mía đường, lúa hoang và lúa trồng. Phần lớn các lồi của
Herbaspirillum thuộc nhóm vi khuẩn nội sinh bắt buộc trong các mô thực vật. Trong
vùng rễ chúng có khả năng cố định đạm mạnh mẽ [19], ngồi ra chúng còn phát tán đến
cả những vùng ở thân và lá [20].
1.1.2.5. Vi khuẩn Klebsiella
Vi khuẩn Klebsiella có 2 lồi quan trọng là Klebsiella pneumoniae và Klebsiella
oxytoca. Có khoảng 30% các dịng của 2 lồi này có thể cố định đạm trong các điều kiện
kỵ khí [43].

7


Vi khuẩn Klebsiella oxytoca dịng SG-11 có khả năng cố định đạm từ nitơ khơng
khí và khả năng tổng hợp IAA. Ở Ấn Độ, Kumar nghiên cứu vi khuẩn K. oxytoca dịng
GR-3 thì nhận thấy chúng có mật số ở rễ là 6x106 CFUxg-1, khả năng tổng hợp IAA từ
tiền chất tryptophan là 30 μg/mg trọng lượng khô, khả năng hịa tan lân khó tan là 31,5
μg/mg trọng lượng khơ và mức độ biểu hiện hoạt tính của phức hệ nitrogenase qua phản
ứng khử acetylene là khá cao [47].
1.1.2.6. Vi khuẩn Enterobacter
Một số loài của vi khuẩn này sống ở vùng rễ hay nội sinh bên trong các mô thực vật
có khả năng cố định đạm, là vi khuẩn kích thích sự sinh trưởng thực vật. [42] đã phân lập
được loài Enterobacter intermedium từ vùng rễ của một số cây cỏ ở Triều Tiên, chúng có
khả năng hịa tan các phosphate khó tan để cung cấp cho cây theo cơ chế acid hóa bằng
cách sản xuất hợp chất 2-ketogluconic acid.
1.1.2.7. Vi khuẩn Azoarcus
Vi khuẩn Azoarcus là vi khuẩn cố định đạm, gram âm được phân lập từ cỏ Kallar.
Vi khuẩn này có trong rễ, bề mặt rễ và cả trong thân cỏ. Năm 1987, Bilal và Malik đã

phân lập được một số loại vi khuẩn Azoarcus sống trong cỏ Kallar. Người ta phát hiện
lúa mì sống trong vùng trước đây có cỏ thì có năng suất cao mà khơng cần bón nhiều
phân hóa học.
Vi khuẩn này cịn được phân lập từ rễ lúa, kích thích sự sinh trưởng của lúa. Ở
những nơi trong vùng rễ có hàm lượng oxy thấp vi khuẩn này có khả năng cố định đạm
tốt [55].
1.1.2.8. Vi khuẩn Pseudomonas
Giống Pseudomonas spp. có nhiều lồi có khả năng cố định đạm như Pseudomonas
diminuta, P. fluorescens, P. paucimobilis, P. pseudoflava, P. putida, P. stutzeri và P.
vesicularis [26]. Một số dịng vi khuẩn Pseudomonas có khả năng hịa tan lân như
Pseudomonas fluorescens, P. putida, P. Chlororaphis [24].
Một số chủng Pseudomonas như: Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens,
Pseudomonas syringae có khả năng tổng hợp chất kích thích tố tăng trưởng thực vật như:
IAA, cytokinin kích thích sự phát triển của bộ rễ cây và làm tăng khả năng hấp thụ chất
dinh dưỡng trong đất [35], một số có khả năng kháng lại một số vi sinh vật gây hại cây
trồng như: Pseudomonas jluorescens HP72 chống nấm Rhizoctionia solani, Pseudomona
8


putida chống lại vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo lá xanh ở đậu phộng
[79].
1.1.2.9. Vi khuẩn Burkholderia
Trong số 40 lồi Burkholderia, có nhiều lồi có khả năng cố định đạm như:
Burkholderia vietnamiensis, Burkholderia brasilensis, Burkholderia kururiensis,
Burkholderia tuberum, Burkholderia phymatum, Burkholderia unamae, Burkholderia
tropicalis và Burkholderia terrae [38].
Vi khuẩn Burkholderia sống cộng sinh với cây trồng và có khả năng cố định đạm,
kích thích sự sinh trưởng của cây trồng, hiện diện vùng rễ và rễ của nhiều loài cây như:
bắp, mía, cà phê [73].
Burkholderia tropicalis tìm thấy trong khóm [13]. Lồi Burkholderia vietnamiensis

tìm thấy trong rễ lúa trồng ở miền Nam Việt Nam. Thí nghiệm ở lúa cho thấy lồi
Burkholderia vietnamiensis sau 14 ngày chủng giúp tăng khả năng đâm chồi 33%, số
lượng rễ tăng 57%, bề mặt lá tăng 30%, năng suất lúa tăng 13 - 22% [83].
1.1.2.10. Các nhóm vi khuẩn nội sinh cây lúa
Bảng 1: Vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây lúa
Vị trí phân lập

Nhóm vi khuẩn

Loài vi khuẩn

Alphaproteobacteria
Thân

Methylobacterium sp.

Thân
Thân
Thân
Rễ
Rễ

Azospirillum amazonense
Azospirillum lipoferum
Azospirillum brasilense
Azospirillum irakense
Rhizobium leguminosarum
Betaproteobacteria

Thân

Thân

Herbaspirillum seropedicae
Herbaspirillum rubrisubalbicans

Rễ
Rễ

Azoarcus sp.
Azoarcus indigens

Rễ
Rễ

Burkholderia sp.
Burkholderia kururiensis
9


Gamaproteobacteria
Rễ
Hạt

Acinetobacter baumannii
Pantoea

Hạt
Hạt
Thân

Pantoea agglomerans
Pseudomonas boreopolis
Pseudomonas cepacia

Thân
Hạt
Rễ

Pseudomonas stutzeri
Klebsiella oxytoca
Klebsiella pneumoniae

Thân

Enterobacter cancerogenus

Rễ

Enterobacter cloacae

Rễ

Enterobacter ludwigii
Firmicutes

Hạt
Hạt

Bacillus subtilis
Bacillus cereus

Lá
Thân

Bacillus pumilus
Bacillus megaterium

Rễ

Staphylococcus sp.

Rễ

Clostridium sp.
Actinobacteria

Lá

Streptomyces
Bacteroidetes

Hạt
Hạt
Hạt
Lá
Rễ

Sphingomonas melonis
Sphingomonas yabuuchiae
Sphingomonas echinoides

Sphingomonas adheasiva
Sphingomonas paucimobilis

Hạt

Sphingomonas echinoides

(Nguồn: Mano [57])
1.2. Đặc điểm của vi khuẩn nội sinh thực vật
1.2.1. Qúa trì nh xâm nhập và nội sinh trong mô thƣ̣c vật của vi khuẩn nội sinh
* Nguồn gốc vi khuẩn nội sinh

10


Qua các kết quả nghiên cứu thu được từ thân , lá, hạt và rễ của Mano và Morisaki
cho rằng nguồn gốc của vi khuẩn nội sinh phải là đất vùng rễ [57]. McIncroy và Klopper
đã xác đị nh hạt giống như là nguồn của vi khuẩn nội sinh trên bắp ngọt và bông vải [58].
Vi khuẩn nội sinh từ mơi trường bên ngồi, ở vùng rễ và rễ hạt đang nảy mầm tấn cơng
vào khí khổng, vết thương. Hầu hết vi khuẩn nội sinh đều có vùng rễ. Các vi khuẩn nội
sinh rễ của lúa mì, cây bơng, ngơ có từ mơi trường đất. Nhiều vi khuẩn nội sinh khơng
chỉ tấn cơng vào rễ mà chúng cịn tấn cơng vào hạt và lá.
* Sƣ̣ di chuyển của vi khuẩn nội sinh
Theo Hallmann, thường vi khuẩn nội sinh di chuyển từ môi trường bên ngoài đến
cây chủ bằng cơ chế hóa hướng động hay ngẫu nhiên hoặc cả hai cơ chế [40].
Rễ cây tiết ra bên ngoài một số hợp

chất để vi khuẩn nội sinh tì m đến và quần tụ

trên bề mặt rễ . Vi khuẩn có í ch Pseudomonas fluorescens và Azospirillum brasilense

hướng đến rễ lúa mì do rễ lúa tổng hợp và phóng thí ch chất kí ch thí ch tổng hợp [21].
Sự tiếp xúc ngẫu nhiên rễ cây do rễ phát triển để tìm nguồn nước hay chất dinh
dưỡng cũng là cơ hội quan trọng để vi khuẩn có thể tiếp xúc với lông hút của rễ non .
* Tiếp xúc
Lectin là một hợp chất trung gian để gắn chặt vi khuẩ n nội sinh vào bề mặt rễ . Hợp
chất này rất đặc biệt thường gặp trong các trường hợp vi khuẩn nội sinh
. Vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens dòng WCS417r đến bề mặt rễ do hợp chất lipo -polysaccharide
[29].
* Xâm nhập
Theo Hallmann, có nhiều con đường để vi khuẩn xâm nhập vào bên trong mô thực
vật: Các lỗ tự nhiên như thủy khổng , lỗ khí khổng, lỗ rễ . Lỗ từ sự ma sát với đất hay vết
bệnh hay vết thương do tác động vật lý [40].
Tuy nhiên con đường quan tr ọng nhất là vi khuẩn xâm nhập vào bên trong mô thực
vật là vết thương và vi lỗ hiện diện khi hì nh thành lông hút , đây là lớp tế bào non rất dễ
xâm nhập. Vết bệnh cũng là nơi để cho vi khuẩn xâm nhập vào bên trong như vết th ương
từ tuyến trùng, vết nấm do Rhizotonia solani [53].
Ngoài ra vi khuẩn có thể tiết enzyme cellulase để phá hủy lớp tế bào biểu bì của rễ
non để xâm nhập vào bên trong thực vật như trường hợp vi khuẩn
Gluconacetobacter

11


diazotrophicus. Vi khuẩn xâm nhập và chui thẳng bên trong nhu mô rễ non và chúng vào
thẳng những tế bào rễ.
Vi khuẩn có thể xâm nhập vào rễ lúa bằng các rãnh trong các rễ ngang

, chúng tập

trung ở bên ngoài và bên trong vùng nhu mô rễ và các bó mạch rồi từ đó chúng khuếch
tán vào thân lúa, vào nhu mô lá. Mật số vi khuẩn Herbaspirillum duy trì một lượng lớn ở
thân từ 2 - 21 ngày sau khi chủng.

Hình 2. Vi khuẩn Herbaspirillum xâm nhập vào cây lúa
(Nguồn: Ando [17]).
* Sinh sản
Vi khuẩn nội sinh tiếp cận với nơi xâm nhập vào bên trong mô thực vật nhưng mật
độ tương đối thấp từ 1000 - 100.000 tế bào/mô thực vật [40] và chúng phải sinh sả n một
số lượng lớn trước khi xâm nhập vào bên trong mô thực vật . Hurek cho rằng sự phân cắt
hay sinh sản vi khuẩn Azoarcus sp. được tì m thấy bên ngoài và cả bên trong nhu mô rễ
lúa và cỏ Kallar [41].
Sau khi xâm nhập vào trong mô thực vật, vi khuẩn di chuyển đến các bó mạch gỗ
để theo nước từ rễ lên các phần khác trên cây . Vi khuẩn Pseudomonas putida VM1453
di chuyển trong các mạch gỗ và vi khuẩn Pseudomonas putida VM1450 tập trung trong
các nhu mô gỗ [33][34], vi khuẩn Azospirillum lipoferum xâm nhập vào rễ và phát triển
trong nhu mô rễ, sau đó di chuyển lên thân.
12


Theo nghiên cứu Mano cho thấy các loài phân bố trong lá , hạt và rễ . Các loài như
Bacillus pumillus, Curtobacterium sp., Methylobacterium aquaticum, Sphingomonas
yabuuchiae, ...thường gặp trong lá và hạt , chiếm trên 60% số lượng vi khuẩn nợi sinh
trong các bợ phận này [56].
1.2.2 Vai trị của vi khuẩn nội sinh
Vi khuẩn nội sinh sống trong mô thực vật, phần lớn không gây hại cho cây mà
ngược lại giúp cây phát triển tốt, khỏe mạnh nhờ các đặc tính tốt của chúng.

* Khả năng cố định đạm
Đạm là chất dinh dưỡng rất cần thiết và quan trọng cho sự phát triển của thực vật.

Trong khơng khí có rất nhiều nitơ 78% nhưng cây trồng không hấp thụ N2 trong khơng
khí. Vì vậy, sự cố định đạm sinh học do sự liên kết giữa vi khuẩn với cây trồng thật sự
rất có ý nghĩa.
Sự cố định đạm sinh học ở vi sinh vật sơ hạch, chủ yếu là ở vi khuẩn và cổ vi khuẩn
(Archaea). Nhóm vi sinh vật này có thể sống tự dưỡng hay dị dưỡng và quá trình cố định
đạm của chúng cần nguồn năng lượng, chủ yếu là nguồn carbohydrate do cây chủ cung
cấp, do đó nguồn năng lượng càng dồi dào thì sản lượng đạm cố định càng cao. Trong
quá trình cố định đạm sinh học, khâu then chốt của toàn bộ chu trình nitơ là sự khử liên
kết của N2 thành NH3 nhờ vào nguồn năng lượng ATP, sự hoạt động của phức hợp
enzyme nitrogenase và enzyme hydrogenase.
Phức hợp enzyme nitrogenase và enzyme hydrogenase biến đổi N 2 thành NH3 theo
sơ đồ sau:
N2 + 8H+ + 8e- + 16ATP + 16H2O  2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi
Ammonia được tạo ra trong chu trình tiếp tục kết hợp với chuỗi carbon để đồng hóa
thành những acid amin đầu tiên cung cấp trực tiếp cho cây trồng [45].
Nitrogenase là một phức hệ enzyme, enzyme này được điều khiển bởi hệ thống gen
nif có trong bộ genome của tế bào vi khuẩn. Enzyme nitrogenase khơng chỉ xúc tác cho
q trình khử N2 thành NH3, mà cịn có thể xúc tác khử các chất CH3CN, HCN, NH3,
N2O, C2H2, ...thành các sản phẩm tương ứng như C3H6, CH4, H2, N2, C2H4.
+ Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình cố định đạm
13


NH3 được tạo nên bởi nitrogenase được đưa đến tế bào chất của tế bào chủ và ở đây
được sử dụng để tổng hợp acid amin. Sự tổng hợp enzyme nitrogenase được điều khiển
bởi enzyme glutamate synthetase, xúc tác tổng hợp glutamin từ NH3. Nếu trong hệ thống
có ít NH3 thì glutamate synthetase kích thích tổng hợp nitrogenase, nồng độ NH3 cao thì
ức chế tổng hợp nitrogenase. Cơ chế này rất có ý nghĩa, tuy nhiên khi cung cấp NH3 dư
thừa thì nitrogenase khơng được sử dụng, vì đã có đủ NH3 [82].
Nitrogenase protein có thể bị biến tính khi tiếp xúc với oxy, chúng chỉ có thể hoạt

động trong điều kiện yếm khí.
Ngồi ra sự hoạt động của enzyme nitrogenase còn bị ảnh bởi các yếu tố khác như:
nhiệt độ, pH, ...
* Khả năng hòa tan lân khó tan
Một số vi sinh vật như vi khuẩn, nấm có khả năng chuyển hóa lân khó tan thành lân
dễ tan. Các vi khuẩn phân giải lân quan trọng nhất là Pseudomonas, Bacilllus,
Rhizobium,
Burkholderia,
Achromobacter,
Agrobacterium,
Microccocus,
Flavobacterium và Erwinia. Các vi sinh vật hòa tan lân khó tan thành dễ tan bằng cách
tiết ra acid. Các acid hữu cơ được sản xuất bởi vi khuẩn và nấm trong q trình hịa tan
lân khó tan chủ yếu là: citric, lactic, gluconic, oxalic, tartaric, acetic và 2-ketogluconic
acid [74].
Sự phân giải Ca3(PO4)2 có liên quan mật thiết với sự sản sinh acid trong quá trình
sống của vi sinh vật. Trong đó, acid carbonic rất quan trọng. Chính H2CO3 đã làm cho
Ca3(PO4)2 phân giải.
Ca3(PO4)2 + H2CO3 + H2O → Ca(PO4)2.H2O + Ca(HCO3)2
Ngồi cơ chế acid hóa, các vi khuẩn cịn có thể hịa tan lân khó tan bằng sự tạo
phức và các phản ứng trao đổi ion.
* Khả năng tổng hợp IAA
Một số loài của các giống Azospirillum, Gluconacetobacter và Pseudomonas là
những vi khuẩn cố định đạm nhưng nhờ vào khả năng tổng hợp IAA của chúng nên cũng
được xem là vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng thực vật (PGPR), góp phần làm
tăng sản lượng cây trồng [44].
Có 3 lộ trình tiêu biểu nhất cho sự biến đổi của L-tryptophan thành IAA đã được
mô tả bởi Koga [46].
14

* Đối kháng sinh học
Nhiều giống vi khuẩn nội sinh như Pseudomonas, Burkhoderia và Bacillus [50] là
những giống vi khuẩn tổng hợp ra nhiều sản phẩm thứ cấp bao gồm kháng sinh , chất hữu
cơ thơm, kháng nấm, kháng virus, kháng sâu, …
Với các đặc tí nh tốt của vi kh̉n nợi sinh , chúng có vai trị quan trọng trong ứng
dụng sản xuất nông nghiệp và bảo vệ môi trường.

1.3. Những nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn nội sinh thực vật
1.3.1. Vi khuẩn cố định đạm
Nhiều cơng trình nghiên cứu trên thế giới đã phát hiện các nhóm vi khuẩn có khả
năng cố định đạm giúp tăng năng suất cây trồng từ 15 - 54% và ứng dụng trong sản xuất
nông nghiệp [31].
Azospirillum được phân lập từ rễ lúa có khả năng cố định đạm và tiết các kích thích
tố sinh trưởng như IAA làm tăng chiều dài, thể tích và số lượng rễ, giúp cây tăng khả
năng hấp thu nước và chất khống. Vì vậy làm tăng khả năng sinh trưởng và phát triển
cũng như tăng năng suất cây trồng [65]. Nhiều thí nghiệm ở Brazil cho thấy Azospirillum
lipoferum có thể cung cấp cho cây bắp 2 kg N/ha mỗi ngày [87]. Ở Thái Lan, thí nghiệm
được tiến hành trên cây bắp (1984 - 1985) khi chủng Azospirillum làm tăng sản lượng
bắp từ 15 - 35% và làm giảm lượng phân bón từ 1/3 - 1/2 [86].
Kết quả nghiên cứu cho thấy có nhiều vi khuẩn nội sinh có vai trị quan trọng trong
sản xuất lúa, mía, lúa mì và làm giảm lượng phân đạm cần thiết trong trồng trọt. Khi sử
dụng Rhizobium bổ sung cây lúa đã tạo ra 144 kg N/ha, Burkholderia MG43 bổ sung vào
cây mía cung cấp hơn 1/2 lượng phân bón cần thiết cho cây đạt 140 kg N/ha [86].
Loài Burkholderia vietnamiensis sau 14 ngày chủng trên cây lúa giúp cây tăng khả
năng đâm chồi 33%, số lượng rễ tăng 57%, diện tích bề mặt lá tăng 30% và năng suất lúa
tăng từ 13 - 22%, lúa trồng ngoài đồng tiết kiệm được phân đạm 25 - 30 kg/ha [84].
Herbaspirillum nội sinh ở nhiều lồi cây như: mía, lúa, lúa mì, lúa mạch và các loại
ngũ cốc. Các thí nghiệm cho thấy, trong nhà kính Herbaspirillum tăng năng suất lúa
15

đáng kể 5% đạt 7,5g/cây [59]. Ngoài ra, H. seropedicae Z67 làm tăng hàm lượng N của
giống lúa chịu phèn ở rễ tăng 29 - 61% và ở thân tăng 37 - 85%. Một số nghiên cứu khác
khi chủng Herbaspirillum seropedicae cho hạt ngơ trồng trong nhà kính, sản lượng tăng
49 - 82% so với bón phân đạm.
Một thí nghiệm đặc biệt khi bổ sung 105CFU/ml của 5 dòng vi khuẩn G.
diazotrophicus, H. seropedicae, H. rubrisubalbicans, A. amazonense và Burkholderia sp.
có nguồn gốc từ cây mía, sau 40 ngày chủng vi khuẩn sinh khối cây lúa gia tăng tối đa
39% (645 g/cây) so với đối chứng không bổ sung vi khuẩn. Khi bổ sung vi khuẩn khả
năng cố định đạm đạt 30%.
Ở Việt Nam, đã sản xuất chế phẩm Azospirillum cố định đạm chủng trên cây lúa
trước khi cấy đã làm giảm lượng phân bón hóa học [8].
Khi sử dụng phân đạm vi sinh: Azospirillum, Pseudomonas, Enterobacter, ...cho
cây lúa có thể tăng năng suất 10 - 15%, tiết kiệm được 30 - 40 kg N/ha [12].
Chủng dòng vi khuẩn cố định đạm Azospirillum lipoferum lên cây lúa, khoai lang
đã làm tăng năng suất và tiết tiết kiệm được 45 kg N/ha.
Hai dòng vi khuẩn cố định đạm (Azospirillum lipoferum và Pseudomonas stutzeri)
chủng trên lúa ở dạng lỏng hoặc dạng viên kết hợp 50% phân bón hóa học thu năng suất
tương đương với nghiệm thức bón 100% phân hóa học, đồng thời hàm lượng protein
trong gạo tăng [5].
Sử dụng phân vi sinh chứa các dòng vi khuẩn Burkholderia tropicalis, Burkholderia
tropica và Pseudomonas stutzeri kết hợp 150 kg N, 60 kg P2O5 và 200 kg K2O/ha bón
cho cây khóm làm tăng kích thước, khối lượng và năng suất khóm tương đương bón 300
kg N/ha [13].
Hiện nay, ở Việt Nam đã sử dụng các vi sinh vật cố định đạm để sản xuất nhiều loài
phân vi sinh khác nhau dưới các thương phẩm: Nitragin, Rhidafo, Azotobacterin,
Azogin, Dasvila, ...và đã thử nghiệm trên phạm vi cả nước. Các thử nghiệm sử dụng
phân vi sinh azogin cho lúa năng suất hạt tăng 4 - 25% và giảm 20% phân khoáng vẫn
cho năng suất lúa cao hơn so với đối chứng.

1.3.2. Vi khuẩn hòa tan lân khó tan
Nhiều lồi vi khuẩn có khả năng hịa tan phosphate khó tan được sử dụng trong sản
xuất phân sinh học ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp như: Pseudomonas, Bacillus,
16


Rhizobium, Burkholderia, Achromobacter, Agrobacterium, Microccocus, Aereobacter,
Flavobacterium và Erwinia [36].
Kết quả thử nghiệm cho thấy khi chủng vi khuẩn hòa tan phosphate cho cây trồng
đã làm tăng hiệu quả hấp thu P đối với cây đồng thời kích thích sự phát triển.
Burkholderia cepacia có hoạt tính hịa tan phosphate khó tan đã làm tăng sản lượng cà
chua, khoai tây, hành tây, cà phê và được sử dụng làm phân sinh học sử dụng ở Cuba.
Các dòng vi khuẩn hòa tan lân Rhizobium, Pseudomonas striata và Bacillus
polymyxa khi chủng lên cây đậu xanh trồng ngoài đồng đã làm tăng khả năng hấp thu
chất dinh dưỡng, tăng sự hình thành nốt rễ, hoạt động enzyme nitrogenase, sinh khối khơ
của cây. Ngồi ra, dịng Pseudomonas putida cũng làm tăng khả năng hấp thu P và kích
thích sự phát triển của cây cải dầu [49]. Trong canh tác cà chua dòng vi khuẩn hòa tan
lân Pseudomonas sp. đã làm tăng sản lượng trái [81].
Ở cây lúa mì, khi chủng các dịng vi khuẩn hịa tan lân kết hợp với 30 -40% phân P
hóa học thì sản lượng tăng lên đáng kể so với chỉ sử dụng phân P hóa học và khi chủng
kết hợp Bradyrhizobium japonicum và vi khuẩn hòa tan lân Pseudomonas spp. sản lượng
lúa mì tăng lên 20% so với sử dụng phân hóa học [15].
Sản lượng cây trồng cũng tăng lên khi chủng Bacillus firmus, Bacillus polymyxa và
Bacillus cereus [32]. Theo kết quả nghiên cứu của Sundara dòng vi khuẩn hòa tan lân
Bacillus megaterium var phosphaticum được áp dụng trong canh tác mía đã làm tăng mật
số vi khuẩn vùng rễ và làm tăng lượng P hữu dụng cung cấp cho cây. Ngồi ra, khi kết
hợp chủng vi khuẩn với phân hóa học, vi khuẩn hòa tan lân đã làm giảm lượng phân bón
khoảng 25% so với nghiệm thức đối chứng [78].
Hạt ngô được chủng vi khuẩn Bacillus sp. giúp cho cây tăng chiều cao cây, chiều
dài rễ, trọng lượng rễ và thân một cách đáng kể và năng suất tăng hơn 30% so với không

chủng vi khuẩn [60].
Nhiều bằng chứng cho thấy hiệu quả hịa tan phosphate khó tan của vi khuẩn trong
việc tăng cường sự phát triển thực vật. Tuy nhiên, khơng phải tất cả thí nghiệm đều có
kết quả tích cực. Ví dụ một số chế phẩm Bacillus megaterium var. phosphoricum chủng
lên cây trồng đã thử nghiệm thành công ở Liên Xô cũ và Ấn Độ, nhưng không hiệu quả
trong đất tại Hoa Kỳ. Hiệu quả chủng khác nhau tùy thuộc loại đất, cây trồng và các yếu
tố môi trường [76].

17


Phân vi sinh hòa tan lân được nghiên cứu và đưa vào ứng dụng ở Việt Nam từ
những năm 90 của thế kỷ XX. Kết quả khảo nghiệm ở nhiều nơi cho thấy, phân vi sinh
hịa tan lân khó tan có thể nâng cao hiệu quả sử dụng phân lân khống 20 - 30% so với
đối chứng; đồng thời có tác dụng nâng cao năng suất cây trồng lên 5 - 15% tùy vào loại
đất và cây trồng. Kết quả thực nghiệm đã xác định việc sử dụng phân vi sinh hịa tan lân
có thể thay thế 30 -50% lượng phân lân cần bón bằng quặng phosphoric với lượng lân
tổng số tương đương mà năng suất cây trồng không thay đổi [7].
Trong nước có nhiều nghiên cứu và ứng vi khuẩn hịa tan lân khó tan, khi bổ sung
Pseudomonas spp. hịa tan lân khó tan cho cây đậu nành đã nâng cao chất lượng hạt đậu
một cách đáng kể thông qua hàm lượng protein và lipid trong hạt [1].
Sử dụng Bradyrhizobium japonicum và vi khuẩn hòa tan lân PSB Pseudomonas
spp. đã làm tăng số nốt rễ, trọng lượng khô nốt rễ, sản lượng và khả năng hấp thu chất
dinh dưỡng trong sản xuất đậu nành. Đồng thời giảm lượng phân P hóa học, giảm chi phi
phí sản xuất đậu từ 785.000 - 1000.000 VNĐ/ha [64].
Trong canh tác cà phê, khi sử dụng chế phẩm vi sinh vật hòa tan lân 50g/ha cà phê
có tác dụng tương đương 34,3 kg P2O5, đồng thời làm tăng số lượng vi sinh vật hòa tan
lân trong đất và làm tăng cường khả năng hòa tan lân trong đất từ 23 - 35% [14].
1.3.3. Vi khuẩn kích thích, điều hồ sinh trƣởng thực vật
Các kết quả nghiên cứu cho thấy, các dòng vi khuẩn sống vùng rễ hoặc nội sinh ở

thực vật - cây lúa như: Rhizobium., Azotobacter., Pantoae agglomerans, Pseudomonas
fluorescens, Bacillus subtilis và Paenibacillus ngồi khả năng cố định đạm, hịa tan lân
cịn có khả năng tiết ra các hormon sinh trưởng kích thích sự phát triển thực: IAA,
cytokinin, gibberillin, ...được ứng dụng trong sản xuất nơng nghiệp [23].
Pseudomonas ở rễ ngơ có khả năng tạo ra IAA, Loper và Schroth đã phát hiện hai
dòng Pseudomonas spp. tạo ra IAA với nồng độ cao (5-10 µg/ml). B. subtilis có khả
năng tạo ra gibberellins [51].
Malik đã sử dụng các vi khuẩn Azotobacter, Azospirilium, Acetobacter, Bacillus và
Pseudomonas giúp cây lúa nước phát triển tốt và gia tăng so với đối chứng và sự tổng
hợp IAA của những vi khuẩn này giúp rễ lúa phát triển nhiều hơn để hấp thu nhiều nước
và chất dinh dưỡng [54].
Araujo cho thấy hai dịng B. subtilis có khả năng tạo IAA có tác dụng kích thích sự
phát triển cây đậu nành, ngồi ra cịn có tác dụng kháng nấm gây bệnh cho cây [18].
18


Vi khuẩn Herbaspirillum seropedicace Z67, Herbaspirillum sp. B501, Serratia
marcescens IRBG500 và một số dòng Herbaspirillum seropedicace và Burkholderia spp.
khi chủng vào hạt và cây trồng làm tăng trọng lượng đáng kể. Sinh khối và sản lượng lúa
trồng nhà lưới tăng lên đáng kể khi chủng Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli.
Pantoea agglomerans YS19 hoạt động cố định N2, sản xuất các hormon sinh trưởng,
tăng khả năng kháng bệnh và làm tăng sinh khối [57].
Vi khuẩn Pseudomonas spp. ngồi khả năng hịa tan lân cịn có khả năng tổng hợp
IAA cho hiệu quả tích cực trên cây đậu nành [6].
Tuy nhiên ở Tỉnh Phú Yên, hiện nay chưa có một nghiên cứu nào về vi khuẩn nội
sinh ở thực vật.

CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu

* Vi khuẩn nội sinh cây lúa
2.1.2. Vật liệu và hóa chất
* Vật liệu
+ Mẫu cây lúa được thu từ các giống lúa Ma Lâm 213, Ma Lâm 216,… ở các vùng
trồng lúa thuộc huyện Đơng Hịa, Sơng Hinh, Tuy An và thành phố Tuy Hòa.
+ Cặp mồi:
Mồi xuôi: p515FPL 5’-GTGCCAGCAGCCGCGGTAA- 3’
Mồi ngược: p13B
5’-AGGCCCGGGAACGTATTCAC-3’
* Thiết bị và dụng cụ
Tủ cấy, tủ ủ, kính hiển vi, bộ micropipet, máy PCR, bộ điện di, ....
* Hóa chất
+ Hóa chất dùng để khử trùng mẫu rễ, thân của cây lúa
19


+ Ethanol (cồn) 96%, Hypochloride 1%, Hydrogen peroxide (H2O2) 3%, nước cất
vô trùng.
+ Hóa chất dùng để phân lập vi khuẩn nội sinh
- Hóa chất dùng để phân lập vi khuẩn nội sinh trên mơi trường LGI [25].
- Hóa chất dùng để phân lập vi khuẩn nội sinh trên môi trường Nfb [48].
- Hóa chất dùng để phân lập vi khuẩn nội sinh trên môi trường RMR [30].
+ Hóa chất để nhuộm gram: Crytal violet, Iod, Fushin, cồn 70%.
+ Hóa chất của mơi trƣờng ni vi khuẩn để trích DNA (Phụ lục)
Mơi trường LB lỏng ni vi khuẩn để trích DNA
+ Hóa chất dùng để tinh sạch DNA của vi khuẩn (Phụ lục)
+ Hóa chất dùng để PCR và điện di sản phẩm PCR (Phụ lục)
+ Hóa chất xác định khả năng cố định đạm và đo lƣợng ammonium
- Phenol, Nitroprusside, Sodium hypochloride, NaOH, EDTA, dung dịch chuẩn
NH4+ (1mg/l)

+ Hóa chất đánh giá khả năng hòa tan lân khó tan và đo lƣợng PO4+ Hóa chất đánh giá khả năng tổng hợp IAA
- Thuốc thử H2SO4, FeCl3 và IAA
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
+ Phƣơng pháp thu thập, xử lý mẫu và phân lập các dòng vi khuẩn
* Thu thập và xử lý mẫu:
+ Thu mẫu: Thu 20 mẫu lúa thuộc các giống lúa ML 213, ML 216, ML 202, ML 42, .... từ cây lúa nước được trồng phổ biến trên các vùng đất (đặc biệt là vùng đất ít bón
phân đạm hóa học) ở huyện Đơng Hịa, Sơng Hinh, Tuy An và thành phố Tuy Hòa. Chọn
mẫu lúa đang ở giai đoạn tăng trưởng mạnh. Thu toàn bộ cây, đưa về phịng thí nghiệm,
sau đó rửa thật sạch đất bám ở rễ, thân và lá; sau đó cắt rời rễ và thân cây ra, nếu như
chưa thí nghiệm, mẫu sẽ trữ ở tủ lạnh [từ 10oC đến 18oC].
+ Xử lý mẫu: Để loại trừ các vi sinh vật có khả năng còn bám ở bề mặt, mẫu sau khi
thu thập được tiến hành xử lý như sau: rửa sạch phần thân, rễ dưới vòi nước mạnh; tiếp
tục rửa lại bằng nước cất vô trùng rồi cắt rễ và thân thành những đoạn nhỏ 1-2 cm, làm
khô mẫu bằng giấy hút ẩm; sau đó lần lượt khử trùng mẫu (rễ, thân) bằng cồn 96% trong
3 phút, hypochloride 1% trong 3 phút, hydrogen peroxide 3% (H2O2) trong 3 phút và rửa
lại với nước cất vô trùng 4 lần để tẩy rửa các loại hóa chất cịn thừa.
20


Để kiểm tra khả năng các vi sinh vật còn sót lại trên bề mặt mẫu sau khi khử trùng,
lấy 200 μl nước cất vô trùng đã rửa mẫu ở lần thứ 4 chủng lên các đĩa môi trường
Tryptone - Yeast extract - glucose - agar và ủ ở 300C, nếu sau 24 giờ ủ các đĩa môi
trường này không có sự xuất hiện các khuẩn lạc thì các mẫu đã khử trùng đạt yêu cầu.
* Phân lập vi khuẩn nội sinh từ rễ và thân của cây Lúa:
- Chọn các mẫu rễ, thân đã khử trùng đạt yêu cầu cho vào các ống nghiệm chứa 10
ml nước cất vô trùng, dùng đủa thủy tinh đã khử trùng trên đèn cồn nghiền mịn mẫu.
- Lấy 500 μl dịch nghiền của rễ, thân lần lượt cho vào các ống nghiệm chứa 3 ml
môi trường LGI, Nfb và RMR bán đặc (semi - solid) rồi đem ủ ở 300C trong 2-4 ngày,
mỗi nghiệm thức [bao gồm rễ, thân] được lặp lại 3 lần.
- Sau 2-3 ngày nuôi, quan sát thấy các ống nghiệm chứa các môi trường bán đặc

LGI, Nfb và RMR đã chủng dịch trích của mẫu xuất hiện một lớp màng mỏng (pellicle)
cách mặt môi trường nuôi khoảng 2-5 mm chỉ thị có sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh.
- Lấy một ít vi khuẩn từ các màng mỏng này của các môi trường bán đặc LGI, Nfb
và RMR lần lượt cấy chuyển sang các đĩa môi trường LGI, Nfb và RMR đặc
(solid)[tương ứng] để tách ròng các khuẩn lạc.
- Sau vài lần cấy chuyển trên các môi trường đặc, chọn các khuẩn lạc rời và đều
nằm trên đường cấy quan sát dưới kính hiển vi. Khi thấy vi khuẩn đã rịng thì cấy chuyển
sang ống nghiệm chứa mơi trường đặc tương ứng để trữ ở 40C và được xem như là một
dòng (isolate).
* Quan sát hình thái, đo kích thƣớc khuẩn lạc
- Khi cấy chuyển vi khuẩn trên đĩa môi trường phân lập đặc đồng thời tiến hành đo
kích thước và quan sát hình thái các dạng khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình
dạng, độ nổi và dạng bìa khuẩn lạc bằng mắt thường. Tuy nhiên, đối với những khuẩn lạc
có kích thước q nhỏ thì sử dụng kính lúp để quan sát.
- Các khuẩn lạc được đo kích thước bằng thước centimet (cm).
* Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn
Sau khi phân lập và tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát hình dạng và sự chuyển
động của vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng
đại 400.
21


* Phƣơng pháp nhuộm gram
* Tinh sạch DNA của các dòng vi khuẩn đã phân lập [63].
* Nhận diện các dòng vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR
+ Các đoạn mồi dùng để nhận diện vi khuẩn nội sinh
Để nhận diện vi khuẩn nội sinh trong cây, sử dụng cặp mồi được thiết kế với trình
tự như sau [89]:
Mồi xuôi: p515FPL 5’-GTGCCAGCAGCCGCGGTAA- 3’
Mồi ngược: p13B 5’-AGGCCCGGGAACGTATTCAC-3’

+ Phản ứng PCR
Sau khi tinh sạch DNA, tiến hành chạy phản ứng PCR bằng máy PCR Perkin Elmer
PE 9700 (Hoa Kỳ) với 2 đoạn mồi chuyên nêu trên.

+ Điện di sản phẩm PCR trên agarose gel
Các sản phẩm sau khi được khuếch đại bằng phản ứng PCR, tiếp tục đem điện di trên
agarose gel 1,2% bằng bộ điện di một chiều Embi-Tec (Hoa Kỳ) có bổ sung thêm
ethidium bromide (EtBr).
- Quan sát các băng (band) DNA trên gel bằng hệ thống chụp hình gel Bio-Rad UV
2000 (Hoa Kỳ) để nhận diện các dòng vi khuẩn bằng cách quan sát các băng xuất hiện
trên gel, so sánh kích thước sản phẩm PCR với thang DNA chuẩn để xác định các dòng
vi khuẩn nội sinh đã phân lập với độ lớn của DNA khoảng 900 bp.
* Khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh cây lúa
+ Định lƣợng đạm
Các dòng vi khuẩn được bố trí trong ống falcon 50 ml chứa 20 ml môi trường BurK
lỏng không đạm [67], các ống này khử trùng ướt 1210C trong 20 phút và chủng 1 ml dịch
vi khuẩn (mật số 108 tế bào/ml), mỗi dòng vi khuẩn lặp lại 3 lần, với đối chứng khơng có
vi khuẩn. Các ống falcon đặt trên máy lắc 200 vòng/phút và ở nhiệt độ 30 0C. Mẫu thu tại
thời điểm 4 ngày sau khi chủng vi khuẩn, sau đó mẫu được ly tâm 1200 vòng/phút và hút
0,5 ml phần bên trên và tiến hành đo lượng NH4+ bằng phương pháp so màu ở bước sóng
640 nm.
22


* Định lƣợng lân hòa tan
Các dòng vi khuẩn được bố trí trong ống falcon 50 ml chứa 20 ml môi trường
NBRIP lỏng [62], các ống này khử trùng ướt 1210C trong 20 phút và chủng 1ml dịch vi
khuẩn (mật số 108 tế bào/ml), mỗi dòng vi khuẩn lặp lại 3 lần, với đối chứng khơng có vi
khuẩn. Các ống falcon đặt trên máy lắc 200 vòng/phút và ở nhiệt độ 300C. Mẫu thu tại
thời điểm 10 ngày sau khi chủng vi khuẩn, sau đó mẫu được ly tâm 1200 vòng/phút và

hút 0,5 ml phần bên trên và tiến hành đo lượng P2O5 bằng phương pháp so màu (Oniani)
ở bước sóng 880 nm [62].
* Định lƣợng IAA
Các dịng vi khuẩn được bố trí trong tuýp 2 ml chứa 1 ml mơi trường LGI [25] có
bổ sung 100 mg/l trytophan, các ống này khử trùng ướt 1210C trong 20 phút và chủng
300 µl dịch vi khuẩn (mật số 108 tế bào/ml), mỗi dòng vi khuẩn lặp lại 3 lần, với đối
chứng khơng có vi khuẩn. Các tp được ủ trong tối và ở nhiệt độ 30 0C. Mẫu thu tại thời
điểm 4 ngày sau khi chủng vi khuẩn, sau đó mẫu được ly tâm 1200 vòng/phút và hút 0,5
ml phần bên trên định lượng IAA bằng thuốc thử Salkowsky và đo bằng phương pháp so
màu ở bước sóng 530 nm [37].
* Giải trình tự đọan 16S-rDNA của một số dòng vi khuẩn nội sinh có đặc tính sinh
học cao
- Chọn một số dịng vi khuẩn phân lập được trên mơi trường LGI, NFb và RMR để
chạy PCR với mồi p515FPL-p13B có độ lớn DNA khoảng 900 bp.
- Sản phẩm PCR cho vào máy giải trình tự ABI 3130
- Đọc kết quả
Dùng chương trình BLAST N để so sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA của các dịng
vi khuẩn với trình tự đoạn 16S rDNA của các dịng vi khuẩn có trong ngân hàng dữ liệu
NCBI (National Center for Biotechnology Information) có địa chỉ:
hoặc EBI (European Bioinformatics Institute) có địa chỉ web
là: .
* Xử lý số liệu: Phần mềm Minitab 16

23


CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn
Qua quá trình phân lập từ thân và rễ của 20 mẫu lúa thu được ở 3 huyện Đơng Hịa,
Sơng Hinh, Tuy An và thành phố Tuy Hịa thuộc tỉnh Phú Yên trên các môi trường nuôi

cấy LGI, Nfb và RMR đã thu được 117 dòng vi khuẩn. Trong đó, có 44 dịng phân lập
trên mơi trường LGI, 38 dịng phân lập trên mơi trường Nfb và 35 dịng phân lập được
trên mơi trường RMR.
Trong số 117 dịng vi khuẩn đã phân lập, số dòng vi khuẩn phân lập từ rễ là 67
dịng (24 dịng ở mơi trường LGI; 22 dịng ở mơi trường Nfb và 21 dịng mơi trường
RMR) chiếm tỷ lệ 57,26%. Số dịng phân lập từ thân là 50 dịng (20 dịng ở mơi trường
LGI; 16 dịng ở mơi trường Nfb; 14 dịng ở mơi trường RMR) chiếm tỷ lệ 42,74%. Kết
quả này cho thấy vi khuẩn tập trung ở rễ nhiều hơn thân. Kết quả phân lập được trình bày
ở bảng 2, 3 và 4.
Bảng 2: Nguồn gốc của các dòng vi khuẩn đƣợc phân lập trên mơi trƣờng LGI
TT
1
2

Dịng vi khuẩn
L 12
L 13

Giống lúa
ML 49
ML 49

Vị trí phân lập
Thân
Rễ

24

Địa điểm thu mẫu
Tuy An

Tuy An


3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
TT
24
25
26
27
28

29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41

L 14
L 15
L 16
L 17
L 18
L 19
L 20
L 21
L 22
L 23
L 127
L 128
L 129
L 130
L 131
L 132

L 133
L 134
L 135
L 136
L 142
Dòng vi khuẩn
L 143
L 144
L 145
L 146
L 147
L 148
L 149
L 150
L 151
L 163
L 164
L 165
L 166
L 167
L 168
L 169
L 170
L 171

ML 68
ML 68
ML 202
ML 202
ML 49

ML 68
ML 49
ML 202
ML 202
ML 49
ML 48
ML 68
ML 68
ML 48
ML 48
ML 48
DH 1356
DH 1356
ML 48
ML 213
ML 213
Giống lúa
ML 213
ML 213
IIR 17494
ML 216
ML 213
ML 213
ML 216
IR 17494
ML 213
ML 213
ML 213
ML 202
ML 48

ML 48
ML 213
ML 213
ML 48
ML 48

Thân
Thân
Thân
Rễ
Thân
Rễ
Rễ
Rễ
Rễ
Rễ
Thân
Thân
Thân
Rễ
Rễ
Rễ
Rễ
Rễ
Rễ
Rễ
Rễ
Vị trí phân lập
Rễ
Thân

Rễ
Rễ
Thân
Thân
Thân
Thân
Rễ
Rễ
Rễ
Rễ
Thân
Thân
Thân
Thân
Thân
Thân

25

Tuy An
Tuy An
Tuy An
Tuy An
Tuy An
Tuy An
Tuy An
Tuy An
Tuy An
Tuy An
Sông Hinh

Sông Hinh
Sông Hinh
Sông Hinh
Sông Hinh
Sông Hinh
Sơng Hinh
Sơng Hinh
Sơng Hinh
Đơng Hịa
Đơng Hịa
Địa điểm thu mẫu
Đơng Hịa
Đơng Hịa
Đơng Hịa
Đơng Hịa
Đơng Hịa
Đơng Hịa
Đơng Hịa
Đơng Hịa
Đơng Hịa
Tuy Hịa
Tuy Hịa
Tuy Hòa
Tuy Hòa
Tuy Hòa
Tuy Hòa
Tuy Hòa
Tuy Hòa
Tuy Hòa