ứng dụng vi sinh vật sản xuất các chất tạo màu

MỤC LỤC
1. Tổng quan về vi sinh vật sản xuất các chất tạo màu....................................................2
2. Nguồn màu từ nấm men..............................................................................................6
2.1.

Tổng quan về nấm men sản xuất các chất tạo màu...............................................6

2.2.

Yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo màu của nấm men........................................7

2.3.

Cơ chế sinh tổng hợp sắc tố carotenoid ở vi sinh vật..........................................10

2.4.

Phương pháp trích chiết màu từ tế bào nấm men................................................14

2.4.1.

Phương pháp hóa học...................................................................................14

2.4.2.

Phương pháp vật lý:.....................................................................................15

3. Nguồn màu từ tảo......................................................................................................15
3.1.

Dunaliella...........................................................................................................16

3.2.

Spirulina.............................................................................................................18

3.3.

Chlorella.............................................................................................................19

3.4.

Porphyridium......................................................................................................21

3.5.

Vi tảo Scenedesmus............................................................................................22

3.6.

Haematococcus...................................................................................................22

4. Nguồn màu từ vi khuẩn.............................................................................................23
5. Nguồn màu từ nấm mốc............................................................................................27
5.1.

β-carotene...........................................................................................................27

5.2.

Màu vàng Riboflavin (vitamin B2).....................................................................28

5.3.

Phẩm màu Monascus..........................................................................................29

1


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Nấm men Rhodotorula sp...................................................................................3
Hình 1.2. Khuẩn lạc Rh. mucilaginosa...............................................................................3
Hình 1.3. Tảo đỏ................................................................................................................4
Hình 1.4. Tảo spirulina Nhật Bản.......................................................................................4
Hình 1.5. Eremothrcium ashbyii........................................................................................4
Hình 1.6. Flavobacterium akiainvivens..............................................................................5
Hình 1.7. Brevibacterium

.....................................................................................5

Hình 2.1. Nấm men Rhodotorula sp...................................................................................6
Hình 2.2. Tế bào nấm men Rhodotorula glutinis...............................................................6
Hình 2.3.Con đường sinh tổng hợp carotenoid.................................................................11
Hình 2.4. Các phản ứng dehydro hóa trong quá trình sinh tổng hợp carotenoid...............12
Hình 2.5. Tổng hợp carotenoid có vòng từ lycopene........................................................13
Hình 2.6. Một số nghiên cứu về sinh tổng hợp carotenoid từ nấm men Rhodototula.......13
Hình 3.1. Tảo D.salina ở Hồ Nước Mặn Lớn (Great Salt Lake) quan sát dưới kính hiển vi
......................................................................................................................................... 17
Hình 3.2. Tảo Spirulina....................................................................................................18
Hình 3.3. Tảo Chlorella dưới kính hiển vi........................................................................19
Hình 3.4. Porphyridium dưới kính hiển vi........................................................................21

Hình 3.5. Vi tảo Scenedesmus..........................................................................................22
Hình 3.6. Haematococcus pluvialis..................................................................................23
Hình 4.1. Janthinobacterium lividum...............................................................................25

2


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Nguồn C để sản xuất -carotene đối với Rhodotorula rubra, Rhodotorula
glutinis, Rhodotorula lactose..............................................................................................8
Bảng 3.1. Thành phần hóa học của Chlorella..................................................................20
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của các nguồn cacbon khác nhau lên sự sinh trưởng và tạo màu của
Gordonia jacobaea........................................................................................................... 24

3


1. Tổng quan về vi sinh vật sản xuất các chất tạo màu
Các nguồn màu từ vi sinh vật khá đa dạng và phong phú, có thể được lấy từ các
nguồn như vi khuẩn, nầm men, nấm mốc hay một số loại tảo.
Trong các nhóm màu chủ yếu ở vi sinh vật đến nay thì phát hiện chủ yếu là nhóm
carotenoid.
Carotenoid là nhóm chất màu hòa tan trong chất béo có trong lục lạp, trong quả và
rau có màu da cam, màu vàng và màu đỏ. Carotenoid có trong nội bào của một số loài vi
sinh vật như vi khuẩn, nấm men, nấm mốc, tảo.
Nấm men Rhodotorula còn được gọi là nấm men sinh sắc tố carotenoid, là một
trong rất ít các giống nấm men có khả năng tổng hợp tích lũy một lượng lớn sắc tố
carotenoid trong đó chủ yếu là β–carotene, torulene, torulahodin…. Nấm men
Rhodotorula là nhóm sinh vật ưa ấm, khoảng nhiệt độ hoạt động từ 20 OC– 40OC. Chúng
phân bố rộng rãi khắp nơi trong đất, không khí, trên các vỏ lá cây như táo, dưa hấu, dâu

tây.

Hình 1.1. Nấm men Rhodotorula sp.

Hình 1.2. Khuẩn lạc Rh. mucilaginosa

Tảo là một nhóm lớn và đa dạng, bao gồm các sinh vật thông thường là tự dưỡng,
gồm một hay nhiều tế bào có cấu tạo đơn giản, có màu khác nhau, luôn luôn có chất diệp
lục nhưng chưa có rễ, thân, lá. Hầu hết tảo sống trong nước. Đây là những sinh vật mà
vách thân chứa xenluloza, là những sinh vật tự dưỡng vì chứa diệp lục, quang hợp nhờ
ánh sáng và CO2.
Tảo đỏ là những sinh vật quang tự dưỡng thuộc ngành Rhodophyta. Phần lớn các
loài rong đều thuộc nhóm này. Các thành viên trong ngành có đặc điểm chung là màu đỏ
4


tươi hoặc tía. Màu sắc của chúng là do các hạt sắc tố phycobilin tạo thành. Phycobilin là
sắc tố đặc trưng cho tảo đỏ và vi khuẩn lam. Người ta cho rằng lục lạp của tảo đỏ có
nguồn gốc từ vi khuẩn lam cộng sinh với tảo mà thành. Lạp lục trong tế bào tảo đỏ có
phycobilin, chlorophyl a, carotene và xanthophyll.

Hình 1.3. Tảo đỏ
Tảo xoắn spirulina chứa các sắc tố cryptoxanthine và β -caroten màu vàng/cam mà
từ đó vitamin A có thể được tạo ra. Sắc tố hữu hình nhất trong tảo xoắn spirulina là diệp
lục, một phân tử màu xanh phổ biến ở thực vật, sắc tố làm cho tảo xoắn spirulina có màu
xanh đặc trưng của nó là phycocyanin.

Hình 1.4. Tảo spirulina Nhật Bản

Có thể thu nhận nguồn màu từ nấm mốc như Neuspora crassa, Penicillium

sclerotiorum,… Hiện nay trên thế giới nấm Neuspora crassa,… đang được nuôi để thu
nhận nguồn β – carotene. Màu vàng Riboflavin được tổng hợp từ nấm mốc
Eremothrcium ashbyii.
5


Hình 1.5. Eremothrcium ashbyii.
Một vài loài vi khuẩn cũng tạo được màu carotenoid như giống Brevibacterium
(tạo canthaxanthin), Flavobacterium (tạo zeaxanthin). Người ta có thể thu nhận các
carotenoid từ Gordonia jacobaea trên các nguồn cacbon khác nhau.

Hình 1.6. Flavobacterium akiainvivens

Hình 1.7. Brevibacterium

2. Nguồn màu từ nấm men
2.1. Tổng quan về nấm men sản xuất các chất tạo màu
Các nấm men có thể tạo màu carotenoid là nấm men Rhodotorula, Cryptococus và
Sporobomyces,… Riboflavin được tổng hợp từ nấm men Saccharomyces cerevisiae (nâm
men bánh mì), nấm men bia.

6


Hình 2.1. Nấm men Rhodotorula sp
Có một số nấm men lúc bình thường thì không tạo màu nhưng nếu được nuối cấy
trong môi trường đặc biệt thì cũng có thể tạo màu như Shizosaccharomyces pombe,
Sacchromycodes ludwigii, Saccharomyces carlbergensis và Saccharomyces cerevisiae khi
nuôi cấy trong môi trường chứa 100 -150 DL-methionine và D-biotin. Tuy vậy, màu tạo
ra không thuộc nhóm carotenoid.

Hiệu suất tạo màu ở những chủng nấm men dại thường không cao so với những
chủng đột biến, như chủng đột biến Rhodotorula glutinis NCIM 3353 sinh ra lượng
-carotene nhiều gấp 76 lần so với chủng ban đầu.

Hình 2.2. Tế bào nấm men Rhodotorula glutinis
2.2. Yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo màu của nấm men
Môi trường nuôi cấy phải giúp vi sinh vật tạo ra lượng sinh khối lớn, lượng màu
carotenoid cao, dễ trích chiết. Môi trường phải gồm nguồn C, N, muối khoáng và trong
một số trường hợp cần thêm một số chất kích thích để tạo màu.
a. Nguồn C
-

Glycerol thích hợp cho loài Rhodotorula rubra tạo -carotene, torulahodin.
Glucose,

maltose,

saccharose

và

raffinose

thích

hợp

cho

loài

7


Sporobolomyces roseu. Môi trường nuôi cấy cần bổ sung 0.2% succinate
natri. Saccharose còn dùng để tạo lượng lớn torulene cho loài Rhodotorula
rubra.
-

Phenol, resorcinol và acid kojic với nồng độ thích hợp sẽ kích thích tạo
-carotene với Rhodotorula sp. No100. Loài Rhodotorula fragaria còn có
thể sử dụng 1-propanol hay 1-butanol làm nguồn cung cấp cacbon.

-

Hydrocacbon dầu mỏ cũng được dùng cho một số loài nấm men phân lập từ
đất chứa dầu như Rhodotorula glutinis, Rhodotorula fragaria. Môi trường
khoáng như parafin lỏng cũng được sử dụng cho chủng Rhodotorula
mucilaginosa. Khi có bổ sung vitamin.

-

Rhodotorula glutinis cho hiệu suất sinh khối tế bào cao nhất và lượng
carotenoid cũng đạt 360/100g skk nếu lượng đường được thay thế bằng
dịch chiết nước cà rốt 10-20%. Tương tự như thế đối với Rhodotorula
gracilis.

Lượng sinh khối và hàm lượng carotenoid phụ thuộc nhiều vào nguồn cacbon theo
bảng sau.
Bảng 2.1. Nguồn C để sản xuất -carotene đối với Rhodotorula rubra, Rhodotorula
glutinis, Rhodotorula lactosa

Nguồn cacbon
Saccharose

Nồng độ (g/L)

Sinh khối (g/Ldlm)

-carotene (mg/g skk)

20,0

10,0-12,0

1,7
8


Xylose

22,5

10,0

1,0

Glycerol

21,5

11,0

2,7

Acetate

28,0

9,5

2,4

b. Nguồn Nitơ
Nấm men có thể sử dụng nguồn nitơ vô cơ hoặc hữu cơ. Hiệu suất tạo từng loại
carotenoid sẽ thay đổi tùy vào nguồn nitơ. Ví dụ histidin tạo ra lượng lớn torularhodin,
asparagine tạo -carotene, NH4NO3 tạo -carotene. Tỷ lệ sử dụng C:N tạo màu là 50:1.
Glycine, valine, proline, asparagine, acid glutamic, arginin cùng với glucose sẽ
giúp cho loài Sporobolomyces roseus sinh tổng hợp lượng sinh khối và carotenoid cao.
Ngược lại muối NH4 và K2NO3 lại không thích hợp cho chủng này. Acid glutamic và
leucine lại thích hợp cho loài Rhodotorula gracilis.
Nấm men cũng sinh trưởng tốt và tổng hợp được nhiều carotenoid trên các môi
trường chứa muối amon, tốt nhất là (NH4)2HPO4, NH4NO3 lại không thích hợp.
c. Ánh sáng
Ánh sáng không những ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp carotenoid mà còn
ảnh hưởng đến sự tồn tại của tế bào vi sinh vật vì một số loài vi sinh vật rất nhạy cảm với
ánh sáng, với bức xạ có cường độ cao, thành tế bào bị phá vỡ dẫn tới tế bào bị phá hủy.
Tế bào nào có chứa nhiều carotenoid sẽ được bảo vệ tốt hơn do tính chất chống oxy hóa
của chúng.
Ánh sáng mạnh kích thích sự tạo thành carotenoid trong Rhodotorula gracilis,
Rhodotorula rubra. Tỷ lệ -carotene/torulene sẽ tăng từ 1.67 trong bóng tối đến 2.29 trong
ánh sáng. -carotene sẽ chuyển sang torularhodin trong tế bào nấm men Rhodotorula

glutilis, Sporobolomyces pararoseus, Sporobolomyces roseus. Ánh sáng yếu sẽ tăng
cường quá trình sinh tổng hợp các carotene như -carotene, -carotene, -carotene. Vi khuẩn
cũng không cần ánh sáng khi tổng hợp màu carotenoid.
d. Không khí
9


Tất cả các loài nấm men tạo carotenoid đều là hiếu khí bắt buộc. Muốn vi sinh vật
phát triển sinh khối tốt và tạo lượng màu cao thì cần phải cung cấp oxy liên tục trong quá
trình nuôi cấy.
e. Nhiệt độ
Nhiệt độ nuôi cấy ít ảnh hưởng đến tổng lượng carotenoid sinh tổng hợp được
trong tế bào nấm men, nhưng lại làm thay đổi rõ rệt tỷ lệ các hợp chất carotenoid taoh
thành và sự thay đổi này còn tùy thuộc vào loại nấm men.
Ở 5oC, hai chủng Rhodotorula glutilis 48 – 23T và 48 – 23W tạo màu vàng với
thành phần -carotene và -carotene chiếm khoảng 92-96%. Ở 25 oC chúng tạo màu hồng,
thành phần màu lúc này chỉ có 43-47% -carotene và -carotene, còn lại là torularhodin,
torulene.
Rhodotorula peneues lại cho kết quả ngược lại. Ở 25 oC tổng lượng màu đạt
9mg/100g skk, lượng -carotene chiếm 93% và lycopene chiếm 3%. Ở 5 oC tổng lượng
màu chỉ đạt 1mg/100g skk, -carotene cũng giảm xuống 66%, lycopene tăng 13%.
f. Thời gian nuôi cấy
Thời gian nuôi cấy thay đổi tùy theo loài nấm men và mục đích thu sinh khối hay
carotenoid. Với môi trường có glucose và (NH 4)2SO4, sinh khối nấm men
Sporobolomyces roseus đạt cực đại sau 4 ngày, quá trình tạo carotenoid diễn ra rất chậm
và chỉ đạt cực đại sau 26 ngày.
Tế bào Rhodotorula gracilis trẻ chứa tỷ lệ -carotene và torulene cao, khi già lượng
torularhodin lại tăng lên.
Rhodotorula pallida tạo màu -carotene cùng với quá trình sinh trưởng, nên nồng
độ đạt cực đại rất sớm, khoảng sau 4 ngày, sau đó nồng độ màu giảm dần. Sau 9 ngày

lượng màu giảm khoảng 25%.
g. Các chất ức chế tạo carotenoid
Có rất nhiều tác nhân hóa học dùng trong việc nghiên cứu sự hình thành
carotenoid trong nấm men.

10


-ionone: nồng độ 250mg/L ức chế sự hình thành carotenoid của Rhodotorula
rubra. Khi được bổ sung vào canh trường nấm men đã trưởng thành -ionone phá hủy
torularhodin và -carotene.
Diphenilamine: có tác dụng ức chế sự chuyển đổi từ carotene sang hợp chất no cao
hơn. Với nồng độ thấp, (10-3M) ức chế sự hình thành carotenoid của nấm men
Rhodotorula gracilis trong khi quá trình tích lũy chất béo và sự sinh trưởng không bị ức
chế. Tùy vào môi trường nuôi cấy mà tác của diphenilamine khác nhau. Chỉ có các dẫn
xuất diphenyl bất đối xứng mới ức chế được việc sinh tổng hợp carotenoid ở
Rhodotorula gracilis.
Vitamin B2 ở nồng độ thấp lại là chất ức chế của diphenilamine. Nếu trong môi
trường nuôi cấy nấm men Rhodotorula gracilis mà có riboflavin cùng với diphenilamine
thì tác dụng của diphenilamine sẽ bị cản trở, thậm chí còn kích thích tổng hợp carotenoid
thay vì ức chế.
2.3. Cơ chế sinh tổng hợp sắc tố carotenoid ở vi sinh vật
Toàn bộ quá trình sinh tổng hợp sắc tố carotenoid của nấm men có thể chia thành 3
giai đoạn: giai đoạn cảm ứng ánh sáng (tối thiểu 12 giờ), giai đoạn tổng hợp enzyme –
giai đoạn này xảy ra trong tối và giai đoạn tổng hợp carotenoid phụ thuốc vào ánh sáng.
Điều này phù hợp với nghiên cứu của Kocková-Kratochvílova và cộng sự là màu của
nấm men sinh sắc tố tăng lên rất nhiều so với màu của các giống nấm men trắng khi sống
ở vùng có tia cực tím mạnh. Tuy nhiên, ở cường độ bức xạ quá cao, các sắc tố carotenoid
không có khả năng che chở cho cơ thể sinh vật.
-

Giai đoạn đầu tiên hình thành các tiền terpennoid gồm 5 cacbon ban đầu.

-

Giai đoạn hai là giai đoạn hình thành các hợp chất C40.

-

Giai đoạn cuối cùng là thay đổi chuỗi C40 trong hệ thống các carotenoid.

Có nhiều hệ enzyme khác nhau được sửa dụng vào giai đoạn cuối của quá trình
tổng hợp sterol và carotenoid, chúng có chung con đường là thông qua farrnesyl
pyrophosphate. Giống Rhodotorula thông qua tổng hợp acid mevalonic phù hợp với sự
hình thành carotene của nấm men và tương tự với con đường tổng hợp carotene của các
vi sinh vật sinh sắc tố carotenoid khác (Scharf và Simpson, 1968).
11


Carotenoid là một loại hợp chất isoprenoid được sinh tổng hợp từ acetyl
coemzyme-A qua acid mevalonic. Giai đoạn tạo các carotenoid bắt đầu với sự tạo thành
hợp chất C40 đầu tiên, pyotene, từ hai phân tử geranylgeranyl diphosphate (GGDP).

Hình 2.3.Con đường sinh tổng hợp carotenoid

Phyotene tạo thành ở dạng đồng phân 15C, có 3 nối đôi liên hoepj, không có màu,
sẽ chuyển hóa tiếp tục bằng những phản ứng dehydro hóa, tạo sản phẩm cuối cùng là
lycopene.

12

Hình 2.4. Các phản ứng dehydro hóa trong quá trình sinh tổng hợp carotenoid

Sau cùng, lycopene tiếp tục đóng vòng ở một hoặc hai đầu tạo ra các sản phẩm
carotene như -carotene, -carotene (đơn vòng), -carotene, -carotene, -carotene (hai vòng).

13


Hình 2.5. Tổng hợp carotenoid có vòng từ lycopene
Hình 2.6. Một số nghiên cứu về sinh tổng hợp carotenoid từ nấm men Rhodototula

2.4. Phương pháp trích chiết màu từ tế bào nấm men
Việc trích chiết màu từ tế bào vi sinh vật nói chung khó hơn so với động thực vật.
Trong các loại vi sinh vật thì nấm men là khó chiết màu nhất vì khó phá vỡ được lớp vỏ
tế bào nấm men.
14


Với một số môi trường nuôi cấy, vài loại nấm men tạo khuẩn lạc nhờn, rất khó
chiết màu. Có 3 cách phá hủy tế bào thu nhận màu từ sinh khối nấm men:
-

Phương pháp hóa học

-

Phương pháp vật lý

Phương pháp sinh học: Nguyên tắc là dùng enzyme thủy phân lớp vỏ của nấm
men.
2.4.1. Phương pháp hóa học
Có các phương pháp sau:
-

Xử lý sinh khối nấm men bằng KOH đậm đặc, chiết màu bằng
KOH/methanol và benzen, lắc trong 1-1,5h, thay benzen mới. Phương pháp
nay không tốt lắm vì chỉ thích hợp với một số loài nấm men và khoog chiết
được các màu acid như torularhodin.

-

Xử lý sinh khối nấm men bằng HCl 6N ở nhiệt độ 80 – 100 oC. Thời gian
đun là yếu tố quan trọng nhất. Đun lâu thì mất màu. Đun ở nhiệt độ thấp thì
không phá được vỏ tế bào, sau này người ta cả tiến bằng cách dùng HCl
1.2N. Dung môi dùng trong các phương pháp này là aceton, là dung môi
hòa tan tốt nhiều loại màu nhưng đối với -carotene thì khả năng hòa tan vào
trong aceton kém nên hiệu suất chiết không cao.

Một phương pháp phá thành tế bào khác bằng HF (Nhật, 1988). Cho sinh khối
nấm men tiếp xúc trực tiếp với HF khan ở 0 oC trong thời gian 5 phút, thành tế bào bị phá
hủy trong khi các thành phần màu không giảm.
Khi nuôi cấy trên những môi trường đặc biệt như môi trường Villoutreix ta có thể
chiết trực tiếp toàn bộ màu của nấm men Rhodotorula mucilaginosa bằng hỗn hợp
aceton: methanol (3:1).

2.4.2. Phương pháp vật lý:
Phương pháp nghiền cơ học để phá vỡ lớp vỏ tế bào. Ưu điểm của phương pháp
này là không phá hủy màu, hiệu suất trích chiết cao. Tuy nhiên, nhược điểm của phương

pháp này là thời gian nghiền lâu, hao tốn dung môi. Các nhà nghiên cứu đã và đang từng
15


bước cải thiện các điều kiện, thiết bị nhằm giảm thời gian và nâng cao hiệu suất chiết
màu. Tác nhân nghiền là bột thủy tinh, cát thạch anh đường kính khoảng 120m dùng tăng
lực ma sát xé rách vỏ tế bào. Để tăng cường hiệu suất chiết màu có thể làm lạnh khối
nghiền bằng nước đá hoặc dùng khí trơ để giảm tổn thất màu vì phản ứng oxy hóa và
tránh thất thoát dung môi.
Ngoài ra còn có các phương pháp vật lý khác như nghiền với áp suất cao cũng làm
tăng hiệu suất chiết màu hoặc phương pháp dùng khí nito, làm lạnh CO2.
3. Nguồn màu từ tảo
Tảo là nhóm cơ thể quang hợp có số lượng loài rất lớn. Tuy nhiên chỉ có 50 loài vi
tảo và một số loài tảo biển có kích thước lớn được nghiên cứu chi tiết liên quan tới trao
đổi chất và thành phần hóa học. Phần lớn các loài vi tảo đang được nuôi trồng đại trà
thuộc hai ngành tảo lam và tảo lục. Một số loài tảo có ý nghĩa kinh tế đang được khai
thác thuộc ngành tảo đỏ (Rhodophyta), tảo nâu (Phaeophyta) và tảo lục (Chlorophyta).
Sắc tố quang hợp ở tảo có 3 nhóm chính là Chlorophyl, Carotenoid và Phycobilin.
Trong đó carotenoid là nhóm lớn các sắc tố của cơ thể sống, có khoảng 640 loại, đa phần
các sắc tố này quyết định màu sắc vàng, da cam, đỏ của sinh vật. Carotenoid của tảo đa
dạng hơn so với thực vật bật cao. Ở tảo lam Spirulina carotenoid gồm nhiều sắc tố khác
nhau như oscilaxanthin, myxoxanthophyl, zeaxanthin, hydroechinenon, β-carotene,
epoxy- β-carotene, β-cryptoxanthin, echineon. Trong đó, β-carotene có tỷ lệ cao nhất.
Trong tế bào có nhiều dạng xanthophyl. Thực vật bật cao và tảo lục giống nhau là
đều chứa lutein với hàm lượng cao. Rhodophyceae và Cryptophyceae cũng chứa nhiều
lutein. Tảo lam thì chứ nhiều myxoxanthophyl và myxoxanthin.
Phycobilin ( các sắc tố hấp thụ ánh sáng xanh, vàng, da cam) tập trung chủ yếu ở
tảo lam và tảo đỏ. Hai loại phycobilin điển hình là R-phycoerithin ở tảo đỏ
Rhodophyceae và C-phycocyanin ở tảo lam Cyanobacteriaceae. Phycobiliprotein là các
sắc tố hòa tan trong nước có cấu trúc tert-pyrol.

Sự thích ứng sáng – tối ở tảo đơn bào đặc trưng bởi sự thay đổi hàm lượng sắc tố
nội bào.
16


Sự thích màu của một số tảo lam được biểu thị bằng sự thay đổi sinh tổng hợp
phycobiliprotein và carotenoid. Chẳng hạn như tế bào Lyngbya plectonema, Phormidium
sp. Sinh trưởng dưới ánh sáng đỏ có hàm lượng carotenoid cao gấp đôi do tăng hàm
lượng β-carotene và zeaxanthin và so với nuôi dưới ánh sáng trong cùng điều kiện thí
nghiệm.
Phổ chịu mặn của tảo rất rộng. Để phản ứng với nồng độ muối NaCl cao, thiếu
đạm và nhiệt độ cao, tảo Dunaliella bradawl tích lũy cả glycerol và β-carotene (glycerol
là chất điều hòa thẩm thấu, đặc trưng ở tảo Dunaliella, hàm lượng tăng tỷ lệ thuận với
nồng độ NaCl môi trường). Hàm lượng β-carotene trong trường hợp này có thể tích lũy
tới 8% TLK. Chính vì vậy mà vi tảo Dunaliella được sử dụng như một đối tượng chính để
sản xuất đại trà thu β-carotene. Hiện nay, Australia là nước có sản phẩm β-carotene
thương mại lớn nhất thu nhận từ Dunaliella.
3.1. Dunaliella
Chi Dunaliella thuộc ngành Chlorophyta và bao gồm một số loài tảo lục đơn bào
có khả năng thích nghi với độ mặn cao. Về mặt hình thái, tế bào Dunaliella có 2 roi, có
dạng oval, cầu, elip, trứng.
Chi Dunaliella phân bố khá rộng: trong nước ngọt (D. flagellate, D. chlordata, D.
lateralis, D. pauper), trong nước lợ và hơi mặn (D. tertiolecta, D.bioculata, D.
primolecta), trong nước rất mặn (D.salina, D.minut, D.parva, D.viridis). Và cả trong cát
mặn (D.terricola). Dunaliella thích nghi với biên độ pH rộng từ 1 (D.acidophila) đến 11
(D.salina).
Chi Dunaliella có 2 loài được nghiên cứu kỹ hơn cả là Dunaliella salina và
Dunaliella tertiolecta. Thành phần hóa học của D.tertiolecta như sau: protein 50%TLK,
cacbonhydrate 20% TLK, lipid 8% TLK. Bên cạnh hàm lượng carotenoid cao, các loài
thuộc chi Dunaliella còn chứa nhiều vitamin như thiamin, pyridoxine, riboflavin, acid

nicotinic, biotin và tocopherol.
Đặc điểm đặc trưng của Dunaliella là lạp thể của chúng có khả năng tích lũy một
lượng lớn β-carotene. D.salina là loài có hàm lượng β-carotene cao nhất trong các loài tảo
được biết đến. Tùy theo hàm lượng β-carotene tích lũy mà các tế bào có thể có màu lục
17


hoặc vàng, đỏ sẫm. Trong các hồ nước rất mặn,tế bào Dunaliella thường có màu đỏ sẫm
chính do việc tích lũy các loại sắc tố này.

Hình 3.1. Tảo D.salina ở Hồ Nước Mặn Lớn (Great Salt Lake) quan sát dưới kính
hiển vi
Trong số các loài của Dunaliella đã biết hiện nay thì có 2 loài đang được khai thác
β-carotene và glycerol là D.salina và D.bardawil. β-carotene là nguồn vitamin A cũng như
các chất màu thực phẩm quý giá cho con người. Những nghiên cứu mới đây cho thấy βcarotene đóng vai trò ngăn ngừa sự phát triển bệnh ung thư ở người.
Năng suất β-carotene có thể được nâng cao thông qua 2 phương pháp sau:
-

Sản xuất kiểu 2 pha: trong pha 1 người ta tập trung cho tăng trưởng sinh
khối ở nồng độ muối thấp (15%) và nồng độ các chất dinh dưỡng tối ưu.
Trong pha 2 tảo được đưa vào môi trường có nồng độ muối cao hơn và dinh
dưỡng thấp hơn để tích lũy β-carotene.

-

Sản xuất theo mẻ hoặc liên tục ở nồng độ muối dưới ngưỡng tối ưu cho
sinh trưởng và tích lũy β-carotene, nhưng thu được sinh khối cao nhất nếu
tính theo thời gian. Phương pháp này được ứng dụng trong nuôi quảng canh
tại Australia.

3.2. Spirulina
Spirulina là loài tảo lam đa bào, dạng sợi, thuộc bộ Oscillatoriales. Spirulina nổi
được trên bề mặt dịch lỏng nhờ sự có mặt của các không bào khí cùng với dạng xoắn của

18


sợi. Chiều dài sợi từ 50-500µm, chiều rộng từ 3-8µm. Hiện nay có hai loài chính được
mô tả là S. platensis và S. maxima.
Chi Spirulina gồm một số loài được nuôi trồng để lấy sinh khối như Spirulina
platensis, Spirulina maxima. Spirulina có nhiều ưu điểm nên được quan tâm nghiên cứu
sử dụng nhiều nhất trong số các loài vi khuẩn lam và vi tảo. Các đặc điểm đáng lưu ý của
Spirulina:

Hình 3.2. Tảo Spirulina
-

Cơ thể dạng sợi đa bào, có dạng xoắn lò xo, sống tự nhiên ở môi trường
nước giàu NaHCO3.

-

Vòng đời ngắn đơn giản: 1 ngày trong điều kiện tối ưu của phòng thí
nghiệm, 3-5 ngày trong điều kiện bán tự nhiên phụ thuộc vào thơi tiết. Vì
vậy có thể thu hoạch tảo quanh năm.

-

Sinh sống trong môi trường nước cho phép ta dễ dàng tạo điều kiện nuôi tối
ưu để thu sinh khối đậm đặc.

-

Hiệu suất sử dụng năng lượng mặt trời cao.

-

Năng suất tính trên đơn vị diện tích nuôi trồng cao.

-

Spirulina có xu hướng nỗi lên mặt nước và tụ tập sinh khối lại, kích thước
của chúng lớn, dài 0,25-0,5mm, nên dễ dàng thu hoạch bằng cách vớt, lọc.
19


-

Spirulina là chi tảo phân bố rộng trong đất, nước ngọt ,nước lợ, nước mặn
và suối nước nóng. pH tối ưu cho sinh trưởng của Spirulina là 8.8- 10.3.
Đây là ưu thế giúp cho Spirulina ít bị lây nhiếm bởi các loại tảo khác.
Trong điều kiện phòng thí nghiệm, sinh trưởng của Spirulina đạt điều kiện
tối ưu 35-370C.

-

Spirulina rất giàu sắc tố. Chlorophyl a chiếm 0.8% TLK, carotenoid tổng số
khoảng 0.3-0.5% TLK.

-

Đặc điểm nổi bật ở Spirulina là hàm lượng protein cao cùng với thành phần
acid amin khá cân bằng. Spirulina giàu vitamin, đặc biệt là vitamin nhóm
B. Các lipid chủ yếu của Spirulina là mono, di-galactosyldiglycerid và
phosphatidyglycerol. Phân đoạn lipid không phân cực chủ yếu là các acid
béo tự do, còn các nhóm lipid phân cực gồm phosphatidyglycerol, digalactosyldiglycerid và tetragalactosyldiglycerid.

3.3. Chlorella
Thuộc ngành tảo lục, tế bào hình cầu hoặc hình oval. Tốc độ tăng trưởng nhanh,
sinh sản vô tính, tế bào phân chia tạo thành 4,8 hoặc 16 tự bào tử.

Hình 3.3. Tảo Chlorella dưới kính hiển vi
Chlorella là tảo đơn bào, kích thước rất nhỏ khoảng 0,1µm. Chlorella sống phân
bố khắp nơi, là chi tảo được nghiên cứu kĩ nhất. Hầu hết các loài của Chlorella đều là các
cơ thể tự dưỡng, chỉ có một số loài sinh trưởng trong bóng tối và sử dụng các nguồn
carbon hữu cơ như glucose, acetate,…
Một số loài của Chlorella: Chl. elipsoidea,Chl. vulgaris, Chl. pyẻnoidosa.
Thành phần hóa học của tế bào Chlorella tùy thuộc vào tốc độ sử dụng dinh dưỡng
trong quá trình phát triển.
20


Bảng 3.1. Thành phần hóa học của Chlorella
Thành phần(%

Hàm lượng

Thành phần

Hàm lượng

TLK)
Protein tổng số
Lipid
Sterin
Xanthophyl
Chlorella b
Tro
Vitamin C
Vitamin B6
Vitamin B12
Acid nicotinic

40 – 60%
10 – 15%
0,1 – 0,5%
3,6 – 6,6%
0,58%
10 – 34%
0,3 – 0,6 mg/g
2,3 mg/100g
7 – 9 mg/100g
145/100g

Glucid
Sterol
Β-carotene
Chlorella a
Acid nucleic
Vitamin B1

Vitamin K
Vitamin B2
Niacin

25 – 35%
0,1 – 0,2%
0,16%
2,2%
6,00%
18 mg/g
6 mg/g
3,5 mg/100g
25 mg/100g

3.4. Porphyridium
Porphyridium thuộc chi Porphyridiaceace, ngành tảo đỏ Rhodophyta. Tế bào
không có thành, chứa nhiều polysaccharide.

Hình 3.4. Porphyridium dưới kính hiển vi

21


Giá trị dinh dưỡng và thương mại của Porphyridium ở chỗ chúng được coi là
nguồn polysaccharide, acid béo và các sắc tố phycocyanin, phycoerythrin.Sắc tố Bphycoerythrin (B-PE) trong P.cruentum đạt tới hàm lượng 5-10% TLK.
Porphyridium sinh trưởng ở nhiệt độ tối thích 21-26°C. Tế bào chịu được lượng
muối cao gấp 2 lần lượng muối trong nước biển. pH tối ưu cho sinh trưởng là 7,5.
Porphyridium được nuôi trồng đại trà ngoài trời trong các bể như kiểu nuôi trồng
Spirulina và Chlorella. Có 2 kiểu bể phản ứng dung cho nuôi Porphyridium:
Cố định tế bào Porphyridium trong uerthan. Sau khi cố định các tế bào trải qua 3

giai đoạn sinh lí sau:
-

Giai đoạn thích ứng kéo dài vài ngày: tảo được cung cấp đầy đủ dưỡng chất
nhưng gần như không có quang hợp và huỳnh quang.

-

Giai đoạn phát triển: tế bào sống sót phân chia tích cực làm đầy thể tích vật
liệu cố định, sinh trưởng mạnh ở pha logarit và quang hợp mạnh.

-

Giai đoạn ổn định: tế bào không phân chia lien tục, quang hợp ở mức thấp.

Nuôi trồng đại trà Porphyridium trong hệ thống ống thủy tinh hoặc nhựa trong.
Dịch tảo được tuần hoàn qua cột nạp CO2 tự động. Quá trình sản xuất được tự động hóa
cao cho năng suất khoảng 70 tấn/ha/năm.
3.5. Vi tảo Scenedesmus

Hình 3.5. Vi tảo Scenedesmus
Scenedesmus thuộc họ Scenedesaceae, ngành Chlrophyta. Các loài thuộc chi này
phân bố rộng rãi trong đất và nước ngọt. Các tế bào hình trụ có đầu vuốt nhọn, liên kết

22


với nhau tạo thành từng nhóm 4, 8 hoặc đôi khi 16 tế bào. Trong Scenedesmus cũng có
các sắc tố sau (mg/kg khối lượng khô):
-

Riboflavin: 7,34

-

Β-carotene: 45,58

-

Carotenoid tổng số: 394,65

3.6. Haematococcus
Haematococcus

pluvialis

là

đại

diện

của

chi

Haematococcus

(ngành

Chlorophytal). Là vi tảo nước ngọt có chu trình sống tương đối phức tạp: từ tế bào bất
động (aplanospore) chuyển sang tế bào vận động màu đỏ nhạt với hai roi. Sau khi mất
roi, các tế bào này có màu đỏ đạm hơn và lại chuyển sang tế bào bất động.

Hình 3.6. Haematococcus pluvialis
Sản phẩm trao đổi chất quý giá của Haematococcus pluvialis là asthaxanthin – là
một loại carotenoid dùng trong thực phẩm với giá bán khoảng 3500 đô la Úc/kg.
Asthaxanthin được tách chiết trong giai đoạn tảo ở thời kỳ aplanospore. Tảo sinh trưởng
tối ưu trong pH 7-8. Hãng Microbio Resources Ins. Nuôi trồng đại trà tảo Haematococcus
pluvialis ở quy mô 500m3. Trước khi thu hoạch, tế bào tảo chuyển sang dạng aplanospore
để tăng tỷ lệ asthaxanthin trong sinh khối.
4. Nguồn màu từ vi khuẩn
Các chất màu được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm, vải, sơn, mỹ phẩm, dược
phẩm và nhựa. Tuy nhiên, các ứng dụng công nghiệp không kiểm soát được của các chất
23


màu tổng hợp có thể dẫn đến nghiêm trọng nguy hiểm cho sức khỏe con người và một
thảm họa môi trường tiềm ẩn. Do đó, bắt buộc phải tìm một sắc tố thay thế có thể phân
hủy sinh học và giảm tối thiểu chi phí sản xuất . Sắc tố tự nhiên có thể phân hủy sinh học
và có thể thu được từ nhiều các nguồn tài nguyên như thực vật, vi sinh vật, động vật và
khoáng chất. Trong số này, sắc tố thu được từ động vật, thực vật và nguồn nấm có thể ít
bị ảnh hưởng do khai thác cấu trúc phức tạp của các mô mang sắc tố hoặc khó khăn để
thu hoạch sắc tố vì nó thường được hình thành trong các điểm phát triển quan trọng trong
vòng đời phức tạp. Trong số các vi sinh vật tạo sắc tố, vi khuẩn cung cấp một số lợi thế
dựa trên tính linh hoạt của nó, vòng đời ngắn và kỹ thuật nhân giống đơn giản.
Một vài loài vi khuẩn cũng tạo được màu carotenoid như giống Brevibacterium
( tạo canthaxanthin), Flavobacterium (tạo zeaxathin). Gần đây bằng kỹ thuật gen người ta
đã thu được carotenoid từ loài vi khuẩn Escherichia mà trước đó nó không có khả năng
tạo màu.

Người cũng có thể thu nhận các carotenoid từ Gordonia jacobaea trên các nguồn
cacbon khác nhau.
Giống Xanthomonas có thể thu màu xanthomonadin, một nhóm màu vàng tan
trong nước, là hợp chất aryl-polyene chứa nhóm brom. Các vi khuẩn này thường được
phân lập từ mô cây và đất. Đã có nhiều nghiên cứu về màu của X.albilineans,
X.arboricola, X.campestris, X.fragariae, X.hyacnthi, X.axonopodis, X.ampelia… Vai trò
sinh học của các xanthomonadin là giúp tế bào vi khuẩn chống lại sự phá hủy của ánh
sáng có mặt oxy.
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của các nguồn cacbon khác nhau lên sự sinh trưởng và tạo
màu của Gordonia jacobaea
Carbon source

Mg d.w/ml

Total carot

Glycerol
D-Fructose
D-Raffinose
D-Glucose
L-Arabinose
Xylose

liquid culture
12.2
6.3
1
3.2
2.9
3.9

(µg/g d.w.)
61.8
75.56
113
227
24.14
24.87
24


Tại Nhật cách đây khoảng 10 năm Kojima đã khám phá ra và phân lập vi khuẩn
Janthinobacterium lividum từ sợi tơ ẩm, gần đây National Institute of Sericultural and
Entomological đã nghiên cứu giống vi khuẩn Janthinobacterium lividum. Loài vi khuẩn
này sản xuất một lượng lớn các màu xanh tím trong các môi trường có chứa acid amin,
chẳng hạn như môi trường Wakimoto, môi trường King B, môi trường peptone agar, môi
trường agar dịch chiết từ tơ…

Hình 4.1. Janthinobacterium lividum
Sau nuôi cấy tế bào vi khuẩn được chiết bằng tetrahydrofuran, dịch chiết được cô
ở áp suất thấp và được phân tách bằng sắc ký, sau đó tái kết tinh, và hai thành phần màu
được phân tách. Màu chiết được xác định là hỗn hợp của violacein và deoxyviolacein.
Các màu này không những sử dụng để nhuộm các sợi tự nhiên như là lụa, cotton, len mà
còn nhuộm cả những sợi tổng hợp như nylon, vinylon tạo những tone màu rất tốt và bền.
Độ bền màu được khảo sát theo các thử nghiệm về giặt rửa, nước nóng, xông và chà xát,
nó chỉ không bền với ánh sáng mặt trời. Tuy nhiên bởi vì màu này có khả năng sản xuất
hàng loạt, nếu những khiếm khuyết này được khắc phục thì đây là loại thuốc nhuộm đầy
hứa hẹn. Thêm vào đó, các chất màu này thể hiện một hoạt tính kháng nấm như nấm gây
25