Nghiên cứu quá trình thủy phân tinh bột bởi mucoraceae trong sản xuất rượu truyền thống việt nam​

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LÊ THỊ QUYÊN

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN TINH BỘT
BỞI MUCORACEAE TRONG SẢN XUẤT RƯỢU
TRUYỀN THỐNG VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LÊ THỊ QUYÊN

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN TINH BỘT
BỞI MUCORACEAE TRONG SẢN XUẤT RƯỢU
TRUYỀN THỐNG VIỆT NAM
Chuyên ngành: Vi Sinh Vật Học
Mã số: 8420101.07
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS Vũ Nguyên Thành
PGS.TS Bùi Thị Việt Hà

Hà Nội - 2019

LỜI CẢM ƠN
Luận văn Thạc sĩ này được em thực hiện tại Trung tâm Vi sinh vật Công
nghiệp – Viện Công nghiệp thực phẩm, để có được những kết quả này em xin chân
thành cảm ơn Thầy PGS.TS Vũ Nguyên Thành và Cô PGS.TS Bùi Thị Việt Hà những người thầy đã luôn tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, tạo mọi điều kiện giúp em
thực hiện luận văn.
Để có được nền tảng kiến thức khoa học tốt, phục vụ trong nghiên cứu này em
xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự
nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã luôn tận tình truyền đạt kiến thức, chỉ bảo cho em
trong suốt thời gian sinh viên và học viên cao học. Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm
ơn tới các anh chị cán bộ tại Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp - Viện Công nghiệp
Thực phẩm đã luôn giúp đỡ, chia sẻ kinh nghiệp, hỗ trợ kỹ thuật trong suốt thời gian
qua.
Cuối cùng, em xin dành lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân và
bạn bè, những người luôn động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất để em yên tâm
học tập và nghiên cứu khoa học.
Hà Nội, ngày 11 tháng 12 năm 2019
Học viên
Lê Thị Quyên

i


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. iv
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... v
DANH SÁCH KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT..................................................... vi

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN..................................................................................... 3
1.1. Giới thiệu về rượu truyền thống ........................................................................... 3
1.1.1. Men rượu ........................................................................................................... 3
1.1.2. Các giai đoạn lên men rượu .............................................................................. 5
1.2 Giới thiệu về họ Mucoraceae ................................................................................ 9
1.3. Tình hình nghiên cứu về rượu truyền thống Việt Nam ...................................... 11
1.4. Giới thiệu về sắc kí khí kết nối khối phổ (GCMS) ............................................ 12
1.5. Ứng dụng phương pháp HS-SPME GCMS trong phân tích các hợp chất tạo
hương của đồ uống .................................................................................................... 13
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 16
2.1. Đối tượng ........................................................................................................... 16
2.2. Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị máy móc ........................................................ 16
2.2.1. Hóa chất .......................................................................................................... 16
2.2.2. Dụng cụ và trang thiết bị, máy móc ................................................................ 17
2.3. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................... 17
2.3.1. Phương pháp phân lập .................................................................................... 17
2.3.2. Làm sạch và giữ giống .................................................................................... 17
2.3.3. Chụp ảnh hình thái khuẩn lạc, tế bào ............................................................. 18
2.3.4. Phương pháp tách chiết DNA tế bào nấm mốc, nấm men, giả men ............... 18
2.3.5. Phương pháp tinh chế DNA ............................................................................ 18
2.3.6. Phương pháp tiến hành phản ứng PCR fingerprinting ................................... 19
2.3.7. Phương pháp điện di ....................................................................................... 20
2.3.8. Nhuộm gel và đọc kết quả ............................................................................... 20
2.3.9. Phương pháp phân loại nấm dựa vào đọc trình tự rDNA .............................. 20

ii


2.3.10. Phân tích hoạt lực enzyme amylase từ các chủng mốc ................................. 21

2.3.11 Kiểm tra khả năng chịu nhiệt của các chủng mốc đại diện ........................... 23
2.3.12. Kiểm tra sự thủy phân tinh bột của một số nhóm mốc khi có đường............ 23
2.3.13. Lên men rượu từ các chủng mốc và men thuần chọn lọc.............................. 24
2.3.14. Đo độ cồn bằng sôi kế ................................................................................... 25
2.3.15. Phân tích phổ hương của các mẫu rượu gạo chưng cất bằng máy sắc ký khí
kết nối khối phổ GCMS. ............................................................................................ 26
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................. 28
3.1. Kết quả phân lập vi nấm từ 15 bánh men........................................................... 28
3.2. Kết quả hình thái khuẩn lạc, tế bào. ................................................................... 28
3.3. Phân nhóm bằng kỹ thuật PCR-fingerprinting và định danh chủng nấm đại diện
dựa vào phân tích trình tự rDNA .............................................................................. 34
3.4. Phân tích hoạt lực enzyme amylase bằng DNS ................................................. 39
3.5. Kiểm tra khả năng chịu nhiệt của các chủng mốc đại diện ................................ 43
3.6. Kết quả sự thủy phân tinh bột của một số nhóm mốc khi có đường.................. 45
3.7. Kết quả lên men rượu từ các chủng nấm mốc và nấm men thuần. .................... 47
3.8.Phân nhóm mẫu rượu dựa trên kết quả các hợp chất bay hơi trong các mẫu rượu
thu thập và các mẫu sử dụng chủng thuần. ............................................................... 49
KẾT LUẬN .............................................................................................................. 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 55
PHỤ LỤC ................................................................................................................. 59

iii


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Các loại giống khởi động để lên men đồ uống có cồn ở Châu Á ................. 4
Bảng 2.1. Tỷ lệ bổ sung giống ở mỗi mẫu lên men ............................................................25
Bảng 3.1. Kết quả phân nhóm các chủng bằng fingerprinting và đọc trình tự các chủng
đại diện ...................................................................................................................... 36

Bảng 3.2. Hoạt lực enzyme amylase của các chủng mốc thuần ............................... 39
Bảng 3.3. Kích cỡ khuẩn lạc trên môi trường tinh bột 1% ở các nhiệt độ ................ 44
Bảng 3.4. Kết quả đo độ cồn của dịch lên men rượu từ các chủng thuần và 15 mẫu
bánh men ................................................................................................................... 47
Bảng 3.5. Các nhóm hợp chất xuất hiện trong các mẫu rượu ................................... 50

iv


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Một quy trình truyền thống làm men rượu ở Việt Nam ..............................5
Hình 1.2. Quá trình thủy phân tinh bột bởi các enzyme amylase ...............................6
Hình 1.3. Sơ đồ tóm tắt quy trình lên men rượu .........................................................9
Hình 1.4 Sơ đồ cấu tạo của GC-MS ..........................................................................13
Hình 1.5. Sơ đồ tách chiết hợp chất bay hơi bằng HS-SPME GCMS ......................14
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc và tế bào của các nhóm nấm đại diện .......................32
Hình 3.2. Phổ băng DNA fingerprinting ...................................................................35
Hình 3.3. Hoạt lực enzyme amylase của các chủng nấm mốc (IU/ml).....................42
Hình 3.4. Đường kính khuẩn lạc nấm mốc trên môi trường tinh bột 1% ở các nhiệt
độ...............................................................................................................................45
Hình 3.5. Kết quả thủy phân tinh bột trong môi trường có đường của các chủng
mốc............................................................................................................................46
Hình 3.6. Các nhóm rượu khác nhau từ 32 mẫu rượu………………………..…….51

v


DANH SÁCH KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
°C: độ celsius

CNTP: Công nghiệp Thực phẩm
dNTP: deoxyribonucleotide triphosphate.
h: hour (giờ)
ITS: Internal transcribed spacer
PCR: Polymerase chain reaction
rDNA: ribosomal DNA
rpm: round per minute (vòng/phút)
TTVSVCN: Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp
HS-SPME GCMS: headspace-solid phase microextraction gas chromatography
mass spectrometer

vi


MỞ ĐẦU
Rượu truyền thống là loại đồ uống có cồn, xuất hiện từ rất lâu đời và được sử
dùng rộng rãi trong nhân dân. Chúng thường được sản xuất theo quy mô hộ gia đình
và có hương vị đa dạng của từng vùng miền như rượu Làng Vân (tỉnh Bắc Giang), rượu
Kim Sơn (tỉnh Ninh Bình), rượu Bàu Đá (tỉnh Bình Định). Để tạo nên sự khác biệt đó
có nhiều yếu tố như nguyên liệu, cách thức nấu, và đặc biệt là sự biến đổi của hệ vi
sinh vật trong bánh men. Việc sử dụng bánh men với phức hệ vi sinh quá đa dạng
thường gây khó khăn trong quá trình kiểm soát chất lượng sản phẩm rượu, vì vậy việc
nghiên cứu sâu về chủng giống sẽ rất cần thiết. Các loại rượu trên thế giới đều cho thấy
loài Saccharomyces cerevisiae đóng vai trò chủ đạo trong lên men rượu, tuy nhiên nấm
mốc thì khác biệt hơn, với mỗi loại rượu thì loài nấm mốc là khác nhau như khi nói tới
rượu Sake của Nhật Bản thì đều biết đến loài Aspergillus oryzae, khi nhắc tới rượu
Hong Qu ở Trung Quốc thì đều biết đến loài Monascus purpureus, thế nhưng ở Việt
Nam vẫn chưa có nghiên cứu nào chỉ ra loài nấm mốc nào đóng vai trò chủ đạo trong
lên men rượu truyền thống Việt Nam.
Trong lên men rượu truyền thống Việt Nam hầu hết các nhóm chủng được tìm

thấy thuộc họ Mucoraceae có khả năng thủy phân cơ chất giàu tinh bột thành đường
nhưng chưa được nghiên cứu kỹ về đặc tính liên quan tới đường hóa. Các nghiên cứu
trước đây liên quan tới men rượu thì chủ yếu về tính đa dạng vi sinh vật của bánh men
và lựa chọn các chủng nấm mốc có hoạt lực enzyme cao, chủng nấm men có khả năng
lên men rượu tốt để làm bánh men. Vì vậy, luận văn này được thực hiện nhằm đánh
giá đặc tính thủy phân tinh bột của các chủng nấm mốc thuộc họ Mucoraceae phân lập
từ bánh men rượu từ đó biết được chủng nào đóng vai trò quan trọng trong giai đoạn
đường hóa và bước đầu thử nghiệm sử dụng chủng mốc thuần kết hợp với chủng nấm
men thuần làm giống khởi động nhằm mục đích so sánh phổ hương rượu với các dòng
rượu truyền thống để từ đó biết được loài nấm mốc nào đóng vai trò quan trọng trong
lên men rượu truyền thống Việt Nam. Việc sử dụng chủng thuần cũng như phương
pháp phân tích sắc kí khí kết nối khối phổ (GCMS) để nghiên cứu hương rượu cũng là
những tính mới của luận văn.
Để thực hiện mục tiêu đề tài đã nêu, các nội dung chính sau đã được thực hiện:

1


- Phân lập vi nấm từ men rượu truyền thống Việt Nam
- Phân nhóm vi nấm bằng PCR-fingerprinting và định tên chủng đại diện bằng
giải trình tự rDNA
- Đánh giá hoạt tính amylase của nấm mốc thuộc họ Mucoraceae
- Đánh giá khả năng thủy phân tinh bột các chủng mốc thuộc họ Mucoraceae
trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau.
- Đánh giá khả năng thủy phân tinh bột của Mucoraceae trong môi trường
đường.
- Thử nghiệm sử dụng chủng thuần khiết làm giống khởi động, phân tích các
hợp chất bay hơi của dịch chưng cất sau lên men và so sánh với các sản phẩm rượu
truyền thống khác.

2


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu về rượu truyền thống
Đồ uống có cồn như bia, rượu là những sản phẩm lên men phổ biến và đóng
vai trò quan trọng trong đời sống tinh thần và văn hóa của con người. Ở Việt Nam,
rượu gạo đã có từ rất lâu đời, cho đến nay nó vẫn là thức uống phổ biến và chiếm 80%
trong tổng số các loại đồ uống có cồn. Tùy thuộc vào từng địa phương mà thành phần
và quy trình sản xuất rượu có sự khác nhau, do đó rượu được sản xuất có tên địa phương
khác nhau. như rượu Làng Vân (tỉnh Bắc Giang), rượu Kim Sơn (tỉnh Ninh Bình), rượu
Kiên Lao (tỉnh Nam Định), rượu Bàu Đá (tỉnh Bình Định), rượu Gò Đen (tỉnh Long
An). Tuy nhiên, phương thức sản xuất chung đều dựa vào quá trình biến đổi hóa sinh
của hệ vi sinh vật trong men rượu [8].
1.1.1. Men rượu
Việc chuẩn bị và sử dụng men rượu như là nguồn cung cấp vi sinh vật trong
sản xuất rượu gạo là rất quan trọng. Thông thường, giống khởi động cho lên men
rượu gồm 3 thành phần vi sinh cơ bản là: nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. Trong đó,
nhóm nấm mốc chủ yếu sinh enzyme amylase để đường hóa tinh bột thành các phân
tử đường khử như glucose, maltose, hay n-dextrin dài hơn. Sau đó, lượng đường này
được nấm men chuyển hóa thành ethanol vì vậy chất lượng của các sản phẩm cuối
cùng phụ thuộc chủ yếu vào hoạt động của các vi sinh vật này. Một trong những cách
tiếp cận để cải thiện sản xuất rượu là thiết lập các điều kiện tối ưu cho quá trình đường
hóa và lên men đồng thời với nuôi cấy hỗn hợp vi sinh vật sinh enzyme thủy phân
tinh bột và lên men ethanol [8].
Như được liệt kê trong Bảng 1.1, các loài mốc chính trong các loại giống khởi
động truyền thống ở Châu Á là Rhizopus spp. và Mucor spp. Nhóm nấm men phổ
biến là Saccharomyces cerevisiae, Hansenula spp., và Candida spp., còn loài giả nấm
men phổ biến là Saccharomycopsis fibuligera.

3


Bảng 1. 1. Các loại giống khởi động để lên men đồ uống có cồn ở Châu Á
Sản
phẩm

Đất nước

Bakhar

Ấn Độ

Mốc và men
Mucor spp., Rhizopus spp., Saccharomyces cerevisiae
Mucor spp., Rhizopus spp.,, Candida spp.,

Bubud

Philippines

Saccharomycopsis fibuligera, Saccharomyces cerevisiae,
Torulopsis spp.

Chu
Lookpang
Men
rượu
Murcha

Trung Quốc

Thái Lan
Việt Nam

Nepal

Aspergillus oryzae, Rhizopus spp., Saccharomyces
cerevisiae
Mucor spp., Chlamydomucor oryzae, Candida spp.,
Saccharomyces cerevisiae
Mucor spp., Rhizopus spp., Aspergillus spp.,
Saccharomyces cerevisiae, Saccharomycopsis fibuligera
Rhizopus spp., Mucor spp., Saccharomyces cerevisiae,
Saccharomycopsis fibuligera.
Aspergillus oryzae, Rhizopus spp., A.niger, Penicillium

Nurock

Hàn Quốc

spp., Mucor spp., Hansenula anomala, Pichia anomala,
Saccharom yces cerevisiae
Mucor spp., Rhizopus spp., Aspergillus spp., Penicillium

Ragi

Indonesia

spp., Candida spp., Saccharom yces cerevisiae,
Saccharomycopsis fibuligera , Hansenula spp.,
Rhodotorula spp.

Tapai

Malaysia

Rhizopus spp., Saccharomycopsis fibuligera

Các thành phần để làm viên men thường là bột gạo, bột sắn hoặc kết hợp cả
bột gạo và bột sắn- Các loại bột đó có thể được trộn với một số loại thảo mộc, những
thành phần bổ sung này được cho là có vai trò trong việc ức chế sự sinh trưởng của
các vi sinh vật tạp nhiễm. Tỷ lệ giữa bột nghiền với các loại thảo mộc thường là 14:1
theo khối lượng. Sau đó, nước được thêm vào để tạo độ ẩm tương đối cho khối bột là
55-60%, và trộn đều với bột men từ những mẻ trước. Những viên men được nặn hình
tròn với đường kính 4 cm, dày 1 cm. Các khay bánh men được ủ trong điều kiện nhiệt

4


độ phòng 28-32 ºC trong 2-5 ngày và được hong khô bởi gió hoặc ánh sáng mặt trời
[8].

Bột gạo

Bột men

Bột thuốc bắc

Nước

Khối bột
với 50-60%
hàm ẩm

Nặn viên
men tròn

ủ 2-5 ngày

Hong khô

Hình 1. 1. Một quy trình truyền thống làm men rượu ở Việt Nam
1.1.2. Các giai đoạn lên men rượu
Có 2 giai đoạn chính trong lên men sản xuất rượu đó là: Giai đoạn đường hóa
và giai đoạn lên men rượu
1.1.2.1. Giai đoạn 1- Giai đoạn đường hóa
Gạo sau khi được nấu chín sẽ được tãi ra khay, vải sạch để nguội đến nhiệt độ
30-35°C thì rắc bột bánh men vào với tỉ lệ bột bánh men so với gạo là 1-5% theo khối
lượng. Trộn đều bột bánh men và ủ khoảng 3 ngày để vi sinh vật sinh amylase thủy
phân tinh bột thành đường trong điều kiện hiếu khí [8].
1.1.2.1.1. Đặc điểm của enzyme amylase
Amylase có thể được tổng hợp từ một số loại nấm mốc, nấm men, vi khuẩn và
xạ khuẩn; Tuy nhiên, nấm mốc được biết đến nhiều nhất vì tính phổ biến và ổn định

5


của enzyme này. Có 3 loại amylase là α-amylases, β-amylases và γ-amylase, (αglucosidase) mỗi loại cắt các vị trí khác nhau. Hình 1.2. minh họa vị trí thủy phân

liên kết của 3 loại enzyme này.

Hình 1. 2. Quá trình thủy phân tinh bột bởi các enzyme amylase
a. α- amylase
α-amylases có khả năng cắt liên kết α,1-4 glycoside ở phía trong của mạch
amylose và amylopectin. Enzyme này được tìm thấy ở rất nhiều loài vi sinh vật, nó
cắt ở các vị trí ngẫu nhiên dọc chuỗi tinh bột, cuối cùng tạo ra glucose, maltose, ndextrin. α-amylases có xu hướng hoạt động nhanh hơn β-amylase bởi nó có thể thủy
phân nhiều vị trí của cơ chất. Loại enzyme này được tìm thấy nấm Ascomycetes và
Basidiomycetes, vi khuẩn Bacillus, nước bọt và tuyến tụy ở người [22].
Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylases là quá trình đa giai đoạn:
Giai đoạn 1 (giai đoạn dextrin hóa): Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân
tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ nhớt của hồ tinh bột
giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh) [2].
Giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): Các dextrin phân tử thấp ở giai đoạn 1 bị
thủy phân tiếp tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine. Các chất này bị
thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide. Dưới tác
dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7
gốc glucose [2].

6


Giai đoạn 3: Các polyglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch
polyglucose ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose, maltotriose và maltose
và glucose. Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành
maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường αamylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp không cho màu
với Iodine. Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó. Vì
vậy, người ta thường gọi loại amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch
hóa.[2]
b. β-amylase

β-amylase hay exoamylase có khả năng cắt liên kết α,1-4 glycoside và α,1-6
glycoside. Chúng thủy phân glucose ở phía ngoài của mạch amylose và amylopectin [23].
β-amylase là một enzyme ngoại bào. Tiến trình phân giải bắt đầu từ đầu không
khử của các nhánh ngoài cùng cơ chất. β-amylase phân cắt các liên kết α-1,4glucoside
nhưng khi gặp liên kết α-1,4 glucoside đứng kế cận liên kết α-1,6 glucoside thì nó sẽ
ngừng tác dụng. Phần polysaccharide còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiều
liên kết α-1,6 glucoside và được gọi là β-dextrin [2].
c. γ-amylase
γ-amylase cắt liên kết α(1-6) và α(1-4) glycoside ở đầu không khử của amylose
và amylopectin, tạo ra glucose. Đa số Enzyme này có hoạt lực cao nhất ở vùng PH
3,5-5,5 và nhiệt độ 50ºC. Nó bền với acid hơn α-amylase nhưng kém bền hơn trong
rượu, aceton [22].
1.1.1.2.2. Đặc điểm của vi nấm trong giai đoạn đường hóa
Quá trình đường hóa tinh bột sẽ cho ra maltose, glucose để sản xuất ethanol
có nguồn gốc từ các quá trình lên men. Thủy phân tinh bột bằng phương pháp enzyme
có nhiều ưu điểm so với phương pháp hóa học, như hoạt động trong điều kiện pH và
nhiệt độ vừa phải, ngăn ngừa ăn mòn thiết bị và các bước trung hòa tiếp theo. Enzyme
có tính đặc hiệu cơ chất, loại bỏ sự hình thành các sản phẩm phụ không mong muốn
như thường được xuất hiện trong quá trình thủy phân axit [26].
1.1.2.2. Giai đoạn 2- Giai đoạn lên men rượu.

7


Nhóm nấm men thường phân lập được từ bánh men là Saccharomyces
cerevisiae, Pichia anomala, Candida tropicalis trong đó Saccharomyces cerevisiae
được cho là đóng vai trò chính, phát triển trong điều kiện ít oxy, lên men chuyển hóa
đường thành ethanol. Ethanol là sản phẩm chính ở giai đoạn này, khi nồng độ cao
trong dịch lên men sẽ ức chế màng sinh chất, thay đổi tính bán thấm tế bào nấm men
và các vi sinh vật khác. Thực tế sản xuất cho thấy giai đoạn ủ cho lên men phụ thuộc

vào thời tiết, vào những ngày nóng, giai đoạn ủ thường ngắn. Ví dụ như ở vùng Đồng
bằng Sông Cửu Long ở miền Nam Việt Nam, nhiệt độ trung bình 30-33ºC, thời gian
ủ cho giai đoạn 1 là 2-3 ngày, giai đoạn 2 là 3-4 ngày [8].
+ Lên men rắn là phương pháp thường được sử dụng ở các vùng núi cao.
Nguyên liệu cho sản xuất rượu ở những vùng này thường là ngô và sắn. Ngô và sắn
sau quá trình đường hóa trở nên ngọt và mềm, sau đó được thêm nước. Quá trình lên
men diễn ra trong 5-7 ngày và sau đó đem đi chưng cất [3].
+ Lên men lỏng thường được sử dụng ở các làng nghề dưới đồng bằng. Gạo,
sau quá trình đường hóa trở nên mền ngọt và được bổ sung nước theo tỉ lệ 1:1. Lên
men tiếp trong 3-5 ngày. Vào mùa hè nhiệt độ cao thì thời gian lên men thường ngắn
hơn mùa đông [3].
Sản phẩm sau lên men rượu gạo.
Đối với rượu không chưng cất, dịch lên men sau khi kết thúc giai đoạn 2 sẽ
được lọc lấy dịch trong chứa glucose, ethanol, và các chất hòa tan khác, với những
loại rượu không chưng cất độ cồn chỉ khoảng 7-10% (v/v), và rượu sẽ không bảo
quản được lâu. Để giải quyết vấn đề này, người sản xuất sẽ tăng hàm lượng cồn bằng
cách hoặc bổ sung đường vào sau giai đoạn 1 hoặc bổ sung cồn vào sau giai đoạn 2,
như vậy vừa đáp ứng được nhu cầu khách hang vừa kéo dài tuổi thọ cho sản phẩm
[3].
Đối với rượu chưng cất, sử dụng thiết bị chưng cất có nguyên lý hoạt động
như hình dưới, gồm 3 phần cơ bản là: khoang đun, hệ thống làm mát, và khoang chứa
rượu chưng cất. Thông thường, mẫu rượu đầu có nồng độ cồn cao có thể lên đến 65%
(v/v) sau giai đoạn chưng cất đầu tiên, và khoảng 25-30% (v/v) cho mẫu rượu sau
[3].

8


Hình 1. 3. Sơ đồ tóm tắt quy trình lên men rượu
1.2 Giới thiệu về họ Mucoraceae

Họ Mucoraceae là họ nấm thuộc bộ Mucorales, đặc trưng bởi hệ sợi không
vách ngăn. Một số chi có thể kể đến bao gồm Absidia, Apophysomyces, Mucor,
Rhizomucor, và Rhizopus.Theo ước tính năm 2008, họ này bao gồm 25 chi và 129
loài [15]. Sau đây là một số loài thuộc chi Rhizopus và Mucor thường xuất hiện ở
bánh men rượu.
a. Rhizopus oryzae
Rhizopus oryzae là thành viên của chi Rhizopus, thuộc họ Mucoraceae. Hệ thống
phân loại Rhizopus oryzae không đơn giản. Những nghiên cứu gần đây về Mucorales
dựa trên trình tự ITS đã đưa ra các tên loài đồng nghĩa sau: Amylomyces rouxii,
Rhizopus achlamydosporus, R. arrhizus, R. boreas, R. delemar, R. chiuniang, R.
javanicus, R. oryzae, R. maydis, R. niveus, R. peka, R. tonkinensis [26]. Mặc dù nhiều
chủng nấm mốc trong bánh men đều có khả năng thủy phân tinh bột gạo nhưng
Rhizopus oryzae (hay Amylomyces rouxii được biết đến là chủng điển hình nhất, được
mô tả đầu tiên bởi Calmette năm 1982). Ông coi chủng này đóng vai trò quan trọng

9


trong quá trình thủy phân tinh bột gạo. Khi sử dụng nấm mốc thuần chủng này và nấm
men thương phẩm ông có thể thu 340 g cồn đặc từ 1000 g gạo thay vì 180 g khi sử
dụng bánh men. Ngoài ra, nấm này cũng được sử dụng trong nghiên cứu tạo bánh men
để sản xuất rượu gạo từ gạo nếp cẩm [1]. Bên cạnh đó, R. oryzae cũng là loài phổ biến
và chiếm ưu thế được phát hiện ở Yao Qu, và ở một số Hồng Qu. Nó cũng được tìm
thấy ở một số giống khởi động khác với khả năng sinh amylase mạnh, đóng góp lớn
cho sản xuất rượu [23]. Nghiên cứu trước còn chỉ ra rằng R. oryzae cũng có thể tạo ra
các hợp chất dễ bay hơi trong quá trình lên men, chẳng hạn như ethanol, 2-methyl-1butanol và 3- methyl-1-butanol [4].
b. Rhizopus microsporus
Rhizopus microsporus là nhóm nấm thuộc chi Rhizopus, họ Mucoraceae phổ
biến thứ hai khi phân lập từ bánh men [6]. Các enzyme thủy phân từ các loài Rhizopus
hoạt động tối ưu trong điều kiện pH 4.0-5.5. Nhóm Rhizopus microsporus có khả

năng chịu nhiệt độ cao, chủng Rhizopus microsporus var. rhizopodiformis có thể sinh
trưởng ở 50°C và sinh amylase tối ưu ở 45°C [7]. Rhizopus microsporus var.
chinensis CICIM-CU F0088 cũng cho thấy khả năng phát triển ở 40°C, và tiết ra các
amylase ở nhiệt độ cao hơn Rhizopus oryzae [17].
Các chủng R. microsporus có thể sinh độc tố rhizoxins, nhưng bản thân nó
không tạo ra mà được tạo bởi vi khuẩn Burkholderia chúng sống bên trong tế bào
nấm. Một nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi khuẩn này đã từng được tìm thấy ở chủng
Rhizopus microsporus CBS 111563, được phân lập từ sufu. Một lượng đáng kể
rhizoxins được phát hiện trong sản phẩm cuối cùng [7]. Tuy nhiên vẫn chưa biết rõ
rằng Rhizopus microsporus từ bánh men có độc tố không.
c. Mucor indicus
Các chủng Mucor indicus thuộc nhóm này thường khuẩn lạc có màu vàng đậm
đặc trưng, có nhiệt độ tăng trưởng tối đa 42ºC. Bào tử có màu vàng nhạt, sợi liên tục
phân nhánh, với các nhánh dài. Túi bào tử có màu vàng đến nâu, đường kính lên tới
75 µm, với các màng khác nhau. Cuống gần hình cầu, cao tới 40 µm. Bào tử có vách
trơn, gần cầu tới elip, và có đường kính 4-5 µm. Có nhiều Chlamydospores, đặc biệt

10


là trong ánh sáng. Bào tử tiếp hợp zygospores có màu đen, hình cầu, có đường kính
lên tới 100 µm [14].
M. indicus có khả năng sinh ethanol từ nhiều nguồn đường khác nhau như
glucose, mannose, fructose, hay galactose. Chúng cũng có khả năng lên men xylose
thành ethanol nhưng chỉ trong điều kiện hiếu khí hoặc vi hiếu khí. Sản lượng ethanol
sau lên men từ xylose xấp xỉ lượng ethanol do Pichia stipites lên men (Pichia stipites
được biết đến là loài sản xuất ethanol tốt nhất từ xylose). Tuy nhiên, nhiều chủng nấm
này không có khả năng lên men đường sucrose, vì vậy M. indicus không thể thay thế
S. cerevisiae để lên men ethanol từ cơ chất chứa sucrose [14].
M. indicus là loài nấm mốc lên men ethanol khá hiệu quả và có thể sinh ra

ethanol 5% khi sinh trưởng trong môi trường chứa glucose. Bên cạnh đó, một nghiên
cứu khác chỉ ra rằng hoạt lực amylase của M. indicus dường như rất thấp hoặc không
có khi sinh trưởng trong môi trường gạo [14].
d. Mucor circinelloides
Trong số nấm thuộc chi Mucor tìm thấy trong bánh men, Mucor circinelloides
là loài cũng khá phổ biến. Tuy nhiên khả năng thủy phân tinh bột của chúng kém
[12]. Chúng là loài dị hình giới tính và có thể phát triển giống nấm mốc và nấm men.
Bên cạnh khả năng thủy phân tinh bột, chúng còn có khả năng thủy phân cellulose
[14].
1.3. Tình hình nghiên cứu về rượu truyền thống Việt Nam
Các nghiên cứu về lên men rượu truyền thống của Việt Nam có thể được phân
loại thành hai nhóm chính: (i) tính đa dạng vi sinh vật của bánh men và (ii) lựa chọn
các chủng nấm mốc có hoạt lực enzyme cao, chủng nấm men có khả năng lên men
rượu tốt để làm bánh men, cải tiến quy trình [25].
Hệ vi sinh của bánh men đã được nghiên cứu khá rõ, mỗi gam bánh men chứa
103-106 CFU mốc, 103-107 CFU men, và 103-106 CFU vi khuẩn lactic. Bánh men chứa
hệ vi sinh vật tương đối ổn định, bao gồm các loài mốc Rhizopus microsporus, Mucor
indicus, Mucor circinelloides, loài giả men Saccharomycopsis fibuligera, loài nấm
men Hyphopichia burtonii, Saccharomyces cerevisiae, Issatchenkia orientalis,

11


Pichia anomala, Candida tropicalis, Pichia ranongensis, Clavispora lusitaniae,
Pediococcus pentosaceus, và các loài vi khuẩn Lactbacillus plantarum, Lactobacillus
brevis, Weissella confusa, Weissella paramesenteroides. Nó được kết luận rằng hệ vi
sinh trong bánh men tương tự như ragi và các dạng men Châu Á khác. Tuy nhiên, để
có một cái nhìn rõ hơn về đặc tính thủy phân tinh bột của các nhóm chủng vi nấm
xuất hiện phổ biến trong bánh men rượu Việt Nam thì vẫn chưa có nghiên cứu nào
được thực hiện trước đó.

Bên cạnh đó, khi đã chọn các chủng nấm tốt để tạo men rượu cải tiến từ chủng
thuần thì rượu sau khi chưng cất chỉ được đánh giá bằng cảm quan mà ít có phân tích
phổ hương rõ bằng sắc kí khí [9] nên nghiên cứu này sẽ phân tích các hợp chất bay
hơi trong các mẫu rượu sử dụng chủng thuần và so sánh với các sản phẩm rượu truyền
gạo truyền thống.
1.4. Phân tích hợp chất bay hơi
1.4.1. Giới thiệu về sắc kí khí kết nối khối phổ (GCMS)
Sắc kí khí kết nối khối phổ (GCMS) gồm 2 phần chính là GC và MS, trong đó
GC (Gas Chromatography) là loại sắc kí có pha động là khí mang, thường là các khí
trơ như heli, nitơ hay hydro, còn pha tĩnh là một lớp dịch mỏng hoặc polymer bên
trong cột. Mẫu được chạy qua cột bởi dòng khí mang. Các thành phần của mẫu được
tách nhau ra khi đi qua cột dưới một chu trình nhiệt độ từ thấp tới cao. Còn MS (Mass
Spectrometer) là detector khối phổ cho GC, các chất khí sau khi đi qua cột sẽ sang
MS và bị bắn phá thành các mảnh có khối lượng khác nhau, mỗi chất khí có một danh
sách các mảnh khác nhau, dựa vào thông tin khối lượng trên điện tích m/z, sau đó
chất này được so sánh với thư viện phổ để biết tên chất [11].
Sắc kí khí kết nối khối phổ là một phương pháp phân tích kết hợp cả đặc trưng
của sắc kí khí và khối phổ để định tính các hợp chất trong mẫu. GC có thể tách hợp
chất bay hơi và bán bay hơi nhưng không thể định danh chúng. MS có thể cung cấp
thông tin cấu trúc chi tiết cho hầu hết các hợp chất và định danh chúng nhưng MS lại
không tách được chúng khỏi mẫu [16]. Sơ đồ cấu tạo được trình bày ở hình 1.4.

12


Hình 1.4 Sơ đồ cấu tạo của GC-MS
1.4.2. Ứng dụng phương pháp HS-SPME GCMS trong phân tích các hợp chất
tạo hương của đồ uống
Hương rượu được hình thành bởi nhiều hợp chất dễ bay hơi và nó đặc trưng
cho từng sản phẩm. Thông thường nồng độ các chất này rất thấp và có ngưỡng cảm

giác phát hiện rất thấp (giữa ng/L và µg/L). Để phân tích hương rượu cần cô đặc các
chất bay hơi trước khi thực hiện phân tích sắc ký khí. Một số phương pháp chuẩn bị
mẫu để phân tích đã được biết đến như chưng cất, tách chiết pha lỏng (liquid-liquid
extraction, LLE), tách chiết pha rắn (solid phase extraction, SPE), tách chiết khoảng
trống (dynamic headspace extraction) và vi tách chiết pha rắn-khoảng trống
(headspace-solid phase microextraction, HS-SPME) [28].
HS-SPME

GCMS

(Headspace-Solid

Phase

Microextraction

Gas

Chromatography Mass Spectrometer) được gọi là phương pháp vi tách chiết pha rắnkhoảng trống kết hợp với sắc kí khí kết nối với khối phổ trong đó ở bước đầu tiên,
pha tĩnh của sợi fiber sẽ hấp phụ các hợp chất hữu cơ ở không gian đầu phía trên mẫu
chất lỏng. Sau một khoảng thời gian xác định, sợi được kéo vào bên trong kim để bảo
vệ. Tiếp theo, kim được đưa vào injector, và sợi được đẩy ra. Dưới ảnh hưởng của
nhiệt độ cao, các hợp chất được giữ lại trong pha tĩnh được giải hấp rồi nhờ dòng khí
mang định lượng trên cột sắc ký [28].
Ưu điểm của SPME như sau: là thiết bị cầm tay, sử dụng đơn giản, chi phí
tương đối thấp, độ nhạy cao, kích thước nhỏ và loại bỏ dung môi; tính năng quan
trọng nhất là thời gian chuẩn bị mẫu tương đối ngắn trước khi phân tích. Tuy nhiên,

13

so với các kỹ thuật khác, SPME có nhiều nhược điểm, ví dụ như sự xuống cấp một
phần của pha tĩnh trong quá trình giải hấp nhiệt ở nhiệt độ cao ảnh hưởng tới khả
năng hấp phụ và tuổi thọ sợi fiber.

Hình 1.5. Sơ đồ tách chiết hợp chất bay hơi bằng HS-SPME GCMS
SPME được phát triển vào những năm 1990 bởi Pawliszyn và cộng sự, mỗi
năm có hàng ngàn bài báo khai thác các khía cạnh khác nhau của phương pháp này
và ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau được công bố (phân tích hóa học, phân tích
sinh học, khoa học thực phẩm, khoa học môi trường, khoa học dược và y). Kỹ thuật
chiết mẫu này đã được mô tả là nhanh, đơn giản, không sử dụng dung môi, và phù
hợp cho việc chiết số lượng lớn các hợp chất dễ bay hơi và bán bay hơi từ dung dịch.
Ngoài ra, SPME chỉ cần lượng mẫu nhỏ, kết hợp với sắc ký khí khối phổ (GC/MS)
với độ nhạy cao. Vì những ưu điểm này, nó đã được sử dụng để nghiên cứu hương
của nhiều loại trái cây, rau quả, đồ uống và rượu [28].
Bằng cách sử dụng phương pháp GCMS để đánh giá định tính hoặc định lượng
những khác biệt này, ngoài các kỹ thuật cảm quan, các nhà phân tích có thể thu được
nhiều thông tin về sản phẩm của họ. Các đặc tính cảm quan độc đáo của các sản phẩm
rượu chưng cất thường là do sự khác biệt nhỏ giữa các hợp chất dễ bay hơi [21].
Nghiên cứu trước đây sử dụng phương pháp này để định tính và bán định lượng các
hợp chất bay hơi trong mẫu rượu chưng cất sử dụng bánh men rượu truyền thống

14


Trung Quốc xác định được 118 hợp chất chủ thuộc 5 nhóm chính là ester (32), alcohol
(22), acid (23), aldehyde (9) và ketone (15) [11]. Các nhóm này cũng xuất hiện ở sản
phẩm makgeolli của Hàn Quốc, ngoài ra còn xuất hiện têm nhóm phenol và terpene
[13]. Đối với sản phẩm rượu của Combodia, phân tích 5 nhóm rượu từ các nhóm bánh
men tương ứng xác định được 25 hợp chất bao gồm ester, alcohol, acid, aldehyde,

and ketone. Trong đó nhóm xuất hiện nhiều nhất là alcohol (chiếm 93% tổng các hợp
chất tạo hương) điển hình như 2-methylbutan-1-ol, 3-methylbutan-1-ol, butane-2,3diol, 2-phenylethan-1-ol [18].
Ngoài rượu và các hợp chất tạo hương, đôi khi có khí tạp như khí lưu huỳnh
và có thể dẫn đến mùi hoặc hương vị lạ cho sản phẩm. Bởi vì ngay cả tỷ lệ nhỏ (ppb)
của các hợp chất lưu huỳnh có thể ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm. Phần lớn các
chất gây ô nhiễm này có mặt trong pha khí, đòi hỏi phải có hệ thống lấy mẫu và phân
tích pha khí. Sắc ký khí (GC) là một công cụ mạnh mẽ trong việc phân tích các sản
phẩm đồ uống có cồn. Các hợp chất tạo hương có xu hướng dễ bay hơi trong tự nhiên,
đáp ứng một trong những yêu cầu chính của GC [21].

15


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng
Trong nghiên cứu này, 15 mẫu bánh men (ký hiệu từ MQ1-MQ15) từ các tỉnh
Ninh Bình, Tuyên Quang, Thái Bình, Hà Nội, Nam Định, Hà Nam, Hưng Yên, Bắc
Giang đã được thu thập và tiến hành thí nghiệm. Danh sách các mẫu bánh men với
những thông tin cụ thể được trình bày trong phần phụ lục S1.
Ngoài ra, một số chủng nấm đã định danh thuộc bộ sưu tập giống của Viện
Công nghiệp Thực phẩm cũng được sử dụng phục vụ nghiên cứu bao gồm::
Rhizopus oryzae BMM 111, R. oryzae BMM 131, R. oryzae BMM 1015,
Saccharomyces cerevisiae BMQ 467: được dùng làm 3 mẫu rượu từ 1 chủng thuần
mốc với 1 chủng thuần men
Saccharomycopsis fibuligera BMQ 908: bổ sung vào mẫu lên men sử dụng 1
chủng nấm mốc R.oryzae và 1 chủng nấm men S. cerevisiae để so sánh với mẫu không
bổ sung chủng này.
Aspergillus oryzae CNTP 5026 : dùng làm mẫu đối chứng trong thí nghiệm
kiểm tra khả năng thủy phân tinh bột trong môi trường đường.

2.2. Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị máy móc
2.2.1. Hóa chất
Hóa chất dùng trong nuôi cấy:
Agar (Việt Nam), Malt (Đan Mạch), Glucose, Yeast extract (Ấn Độ), Malt
extract (Ấn Độ), Peptone (Ấn Độ).
Hóa chất dùng cho PCR
Enzyme Taq DNA Polymease

Thermo Scientific (Mỹ)

dNTPs

Thermo Scientific (Mỹ)

Mồi cho phản ứng PCR

Thermo Scientific (Mỹ)

Thang DNA mẫu dùng trong điện di

Thermo Scientific (Mỹ)

Agarose dùng trong điện di

Biobasic (Tây Ban Nha)

Ethidium Bromide

Pharmacia-Biotech (Mỹ)

16


2.2.2. Dụng cụ và trang thiết bị, máy móc
Máy móc, thiết bị: bộ điện di ngang, box cấy (Bioblock Scientific, Pháp), cân
điện tử (Precisa, Thụy Điển), kính hiển vi quang học (Eclipse E600-Nikon, Nhật), lò
vi sóng (LG, Hàn Quốc), hệ thống soi và chụp ảnh gel điện di (Syngene), máy đo pH
(Toledo - Anh), máy lắc ổn nhiệt, máy ly tâm cao tốc (Heraeus – Sepatech), máy
PCR, nồi hấp thanh trùng (Himayatoko, Nhật), tủ lạnh giữ giống (Electrolux, Thụy
Điển), tủ nuôi cấy (Sanyo,Nhật), máy phá tế bào (Mini Beadbeater, Biospec
Products), máy đông khô (VirTis Freeze Dryers 2.0)
Dụng cụ: Đĩa Petri, pipette tự động các loại, ống Falcon, ống nghiệm, ống
Eppendorf, ống đong, đèn cồn, bình tam giác (loại từ 20-1000), bình Schott, que
cấy,....
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp phân lập
Sử dụng phương pháp pha loãng mẫu để phân lập nấm mốc, nấm men, giả men
trong bánh men:
Quy trình phân lập như sau:
-

Bước 1: Nghiền mịn các mẫu bánh men trong các túi riêng

-

Bước 2: Cân 3 gam mẫu bánh men đã nghiền với 27 g dung dịch NaCl 0.9% (đã
hấp) trong ống falcon 50 ml, vortex đều.

-

Bước 3: Pha loãng theo hệ số 10 đến nồng độ 10-6

-

Bước 4: Sau đó hút 100 µl dịch pha loãng của từng nồng độ chang trên đĩa thạch
Malt 2°Bx rồi nuôi trong điều kiện hiếu khí trong tủ 30°C.

-

Bước 5: Từ sau 24 giờ, tiến hành quan sát các khuẩn lạc khác nhau. Chọn lấy
các khuẩn lạc đại diện tiến hành làm sạch và giữ giống.

2.3.2. Làm sạch và giữ giống
Lấy một ít sinh khối cần làm sạch và cấy lên đĩa Petri chứa môi trường Malt
2ºBx, sau đó đem nuôi ở nhiệt độ 30ºC trong 2-3 ngày. Khi thấy nấm đã mọc mà
không thấy xuất hiện khuẩn lạc khác lạ thì lấy một ít sinh khối và cấy giữ giống vào
trong ống nghiệm nút xoáy chứa môi trường Malt 4ºBx. Đem các ống nghiệm nuôi
cấy ở nhiệt độ 30ºC khoảng 2 ngày, sau đó cất giữ trong tủ mát. Trường hợp khuẩn
lạc nào chưa sạch (có khuẩn lạc lạ) thì phải làm sạch lại như cách trên.

17