Nghiên cứu quy trình sản xuất γ-Aminobutyric axit (GABA) từ dịch cám gạo bằng Lactobacillus : Luận văn ThS. Sinh học: 60 42 01 14

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

LÝ THỊ KIM TUYẾN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT γ-AMINOBUTYRIC AXIT TỪ
DỊCH CÁM GẠO BẰNG LACTOBACILLUS

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2014


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

LÝ THỊ KIM TUYẾN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT γ-AMINOBUTYRIC AXIT TỪ
DỊCH CÁM GẠO BẰNG LACTOBACILLUS

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số : 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. TRỊNH TẤT CƢỜNG

Hà Nội - 2014


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Trịnh Tất Cường là
người thầy đã hướng dẫn, giúp đỡ tận tình, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn
thành luận văn này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô đã giảng dạy tại khoa Sinh học làm
cơ sở cho tôi thực hiện tốt luận văn này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu của tập thể cán bộ, các
anh, chị và các bạn trong Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và
Protein – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN.
Cuối cùng tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn động
viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Hà Nội ngày 27 tháng 10 năm 2014

Học viên

Lý Thị Kim Tuyến

i


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................3
1.1.

Gama-Aminobutyric axit (GABA) ..................................................................3

1.2.

Cấu trúc và hình dạng của GABA ...................................................................3

1.3.

Quá trình tổng hợp và chức năng của GABA trong não ..................................4

1.4.

Enzym tổng hợp GABA ...................................................................................5

1.5.

Thụ thể GABA .................................................................................................6

1.6.

Sản xuất GABA từ vi sinh vật .........................................................................7

1.7.

Cơ chất tham gia sản xuất GABA ....................................................................9

1.8.

Thực phẩm chức năng GABA........................................................................10

1.8.1. Cám gạo - nguồn nguyên liệu tạo thực phẩm chức năng chứa GABA ......10
1.8.2. Nghiên cứu về GABA ở Việt Nam ............................................................10

1.9.

Đánh giá hoạt tính sinh học GABA thông qua thụ thể ..................................11

CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .............................................14
2.1.

NGUYÊN LIỆU .............................................................................................14

2.1.1. Vi sinh vật ..................................................................................................14
2.1.2. Các mẫu cám gạo .......................................................................................14
2.1.3. Các dòng tế bào ..........................................................................................14
2.1.4. Máy móc và dụng cụ ..................................................................................14
2.1.5. Các hóa chất, nguyên liệu khác ..................................................................14
2.2.

PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................................................15

2.2.1. Xây dựng quy trình lên men sản xuất GABA từ dịch cám gạo ...................15
2.2.1.1. Nuôi cấy và bảo quản chủng KC1 .......................................................15
2.2.1.2. Kiểm tra khả năng sinh GABA của chủng KC1 .................................16
2.2.1.3. Đánh giá chất lƣợng cám gạo .............................................................16
2.2.1.4. Xác định hoạt tính của glutamate decacboxylase trong cám gạo .......19
2.2.1.5. Xác định glutamic axit bằng phƣơng pháp sắc ký bản mỏng (TLC)....19

ii


2.2.1.6. Định lƣợng glutamic acid bằng phƣơng pháp so màu..........................19
2.2.1.7. Chiết xuất glutamic acid trong cám gạo bằng phƣơng pháp nƣớc sôi 20

2.2.1.8. Xác định GABA bằng phƣơng pháp sắc ký bản mỏng (TLC) [41]......20
2.2.1.9. Định lƣợng GABA bằng phƣơng pháp so màu [57] ...........................21
2.2.1.10. Xác định nguồn vô cơ và hữu cơ thích hợp lên men ..........................22
2.2.1.11. Tìm các điều kiện lên men thích hợp trên môi trƣờng dịch cám gạo .23
2.2.2. Tinh chế GABA [31] ..................................................................................24
2.2.2.1. Khử màu ..............................................................................................24
2.2.2.2. Khử muối ............................................................................................24
2.2.2.3. Chạy sắc ký trao đổi ion......................................................................24
2.2.2.4. Kết tinh GABA ...................................................................................25
2.2.3. Đánh giá hoạt tính GABA ..........................................................................25
2.2.3.1. Nuôi tế bào WSS-1 và tế bào PC12 ....................................................25
2.2.3.2. Đánh giá khả năng sống chết của tế bào .............................................26
2.2.3.3. Xác định GABA bằng phƣơng pháp HPLC [42] ................................26
2.2.3.4. Đánh giá hoạt tính GABA dựa vào sự thay đổi màu iot [49] .............26
2.2.3.5. Định lƣợng GABA dựa vào sự thay đổi màu iot ................................27
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................29
3.1.

Quy trình lên men sản xuất GABA từ dịch cám gạo .....................................29

3.1.1. Khả năng sinh GABA của chủng KC1.......................................................29
3.1.2. Các chỉ tiêu chất lƣợng và an toàn thực phẩm của cám gạo ......................29
3.1.3. Đánh giá hoạt động của GAD trong cám gạo..............................................30
3.1.4. Xác định thành phần và lựa chọn nguyên liệu cám gạo ..............................31
3.1.4.1. Xác định định tính glutamic acid trong hai mẫu cám gạo ....................31
3.1.4.2. Định lƣợng glutamic acid trong hai mẫu cám gạo ...............................32
3.1.5. Lƣợng glutamic acid thu đƣợc bằng phƣơng pháp nƣớc sôi ......................34
3.1.6. Đƣờng chuẩn GABA xác định hàm lƣợng GABA bằng phƣơng pháp so
màu............................................................................................................................35

iii


3.1.7. Nguồn vô cơ và hữu cơ thích hợp lên men ................................................36
3.1.8. Các điều kiện lên men thích hợp trên môi trƣờng dịch cám gạo ...............40
3.1.8.1. pH thích hợp cho lên men ....................................................................40
3.1.8.2. Nhiệt độ thích hợp cho lên men. ..........................................................41
3.1.8.3. Thời gian thích hợp cho lên men .........................................................42
3.1.8.4. Tỉ lệ ôxy thích hợp cho lên men ..........................................................43
3.1.9. Sơ đồ quy trình lên men từ dịch chiết cám gạo ..........................................45
3.2.

Đánh giá hoạt tính của GABA bằng phƣơng pháp sắc ký bản mỏng ............46

3.3.

Đánh giá hoạt tính của GABA .......................................................................47

3.3.1. Đánh giá khả năng sống chết của tế bào PC12 ..........................................47
3.3.2. Xác định GABA bằng HPLC .....................................................................48
3.3.3. Đánh giá hoạt tính sinh học của GABA thông qua thụ thể ........................52
3.3.3.1. Nuôi cấy tế bào WSS-1 .......................................................................52
3.3.3.2. Đánh giá hoạt tính GABA thông qua sự bắt màu Iot trên dòng tế bào
WSS-1................................................................................................................53
3.3.3.3. Định lƣợng GABA dựa vào sự thay đổi màu iot .................................54

iv


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

GABA

Axit gamma-amino butylric

GABA-T

GABA transaminase

GAD

L-glutamate decarboxylase

HTS

Phƣơng pháp sàng lọc High throughput
screening

KC1

Chủng Lactobacillus plantarum KLEPT

ml

milliliter

mM

millimolar

MRS

De Man, Rogosa, Sharpe

MSG

Monosodium glutamate

OD

Mật độ quang học

PLP

Pyridoxalphosphate

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

TLC

Thin layer chromatography

TPCN

Thực phẩm chức năng

v

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1. Cấu trúc của GABA.......................................................................................4
Hình 2. Con đƣờng tổng hợp và phân hủy của GABA...............................................5
Hình 3: Mô hình cấu trúc của thụ thể GABAA...........................................................6
Hình 4: Mô hình cấu trúc của thụ thể GABAB............................................................7
Hình 5: Hoạt động của thụ thể trƣớc và sau khi gắn kết với GABA..........................7
Hình 6: Kết quả chạy sắc ký TCL đối với dịch lên men trên môi trƣờng MRS........29
Hình 7: Hoạt tính GAD trong cám gạo đƣợc xác định thông qua MSG...................31
Hình 8: Kết quả xác định glutamic acid trong cám gạo bằng TLC...........................32
Hình 9: Đƣờng chuẩn glutamic acid.........................................................................33
Hình 10: Hiệu quả nhiệt độ và thời gian đối với quá trình thủy phân glutamic acid từ
cám gạo.....................................................................................................................35
Hình 11: Đƣờng chuẩn GABA..................................................................................36
Hình 12: Hiệu quả của NaCl trên quá trình phát triển tế bào và sản xuất GABA...37
Hình 13: Ảnh hƣởng của pH tới quá trình sản xuất GABA trong quá trình lên men
dịch chiết cám gạo.....................................................................................................41
Hình 14: Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới quá trình sản xuất GABA trong quá trình lên
men dịch chiết cám gạo.............................................................................................42
Hình 15: Ảnh hƣởng của thời gian tới quá trình sản xuất GABA trong quá trình lên
men dịch chiết cám gạo.............................................................................................43
Hình 16: Ảnh hƣởng của ôxy tới quá trình sản xuất GABA trong quá trình lên men
dịch chiết cám gạo.....................................................................................................44
Hình 17: Sơ đồ quy trình lên men cám gạo...............................................................45
Hình 18: Sản phẩm GABA sau đông khô (A), sau tinh chế (B)...............................46
Hình 19: Kiểm tra GABA bằng TLC........................................................................46

vi

Hình 20: Khả năng bảo vệ tế bào PC12 của dịch lên men chủng Lactobacillusplantarum KLEPT.....................................................................................................48
Hình 21: Sắc ký đồ của GABA chuẩn......................................................................49
Hình 22: Xây dựng đƣờng chuẩn GABA qua HPLC...............................................49
Hình 23: Chạy sắc ký HPLC mẫu dịch lên men.......................................................50
Hình 24: Chạy các phân đoạn tách chiết bằng sắc ký cột.........................................51
Hình 25: Đƣa mẫu GABA tinh sạch vào đƣờng chuẩn để xác định độ tinh sạch của
mẫu............................................................................................................................52
Hình 26: Ảnh chụp từ máy ảnh dƣới kính soi nổi sau 24 giờ nuôi cấy tế bào WSS-1
(A), sau 48 giờ (B)....................................................................................................53
Hình 27: Kết quả thay đổi OD của Iot dựa vào thay đổi nồng độ của GABA lên
men............................................................................................................................54
Hình 28: Đƣờng chuẩn giữa nồng độ GABA và mật độ quang tại bƣớc sóng
405nm........................................................................................................................55

vii


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1: Thành phần môi trƣờng MRS.........................................................................15
Bảng 2: Chỉ tiêu chất lƣợng của hai mẫu cám gạo....................................................30
Bảng 4: Giá trị glutamic acid của các mẫu cám gạo....................................................33
Bảng 5: Lƣợng GABA và mật độ tế bào phụ thuộc vào nguồn Cacbon.....................38
Bảng 6: Lƣợng GABA và mật độ tế bào phụ thuộc vào nguồn Nitơ.........................39
Bảng 7: Tỉ lệ MSG (%) ảnh hƣởng tới hiệu suất tạo GABA trong hai loại môi
trƣờng........................................................................................................................40
Bảng 8: Hàm lƣợng GABA trong dịch lên men theo hai phƣơng pháp đo...............55

viii

MỞ ĐẦU
γ-Aminobutyric axit (GABA) là một axít amin có chức năng quan trọng trong
hệ thống thần kinh. GABA thực hiện vai trò cơ bản trong quá trình truyền tín hiệu
thần kinh qua khe xináp và giữ liên lạc các tế bào với nhau trong hệ thống thần kinh
trung ƣơng. Ngoài ra, GABA đã đƣợc biết có hiệu quả điều hòa một số rối loạn thần
kinh giống nhƣ bệnh Parkinson, Huntington và bệnh Alzheimer. Chính vì GABA có
những chức năng sinh lý quan trọng nên rất nhiều công trình nghiên cứu trọng tâm
vào sự phát triển GABA thành thực phẩm chức năng. Hiện nay, quá trình sản xuất
GABA có rất nhiều con đƣờng khác nhau chẳng hạn: tách chiết từ các loại ngũ cốc,
tạo điều kiện tối ƣu để hạt gạo nảy mầm, hoặc lên men đậu tƣơng bằng vi sinh vật.
Trong đó, quá trình sản xuất GABA bằng lên men vi sinh vật (vi khuẩn, nấm) đang
đƣợc ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả cao trên thế giới. Đặc biệt, vi khuẩn axít
lactic đã đƣợc ứng dụng để lên men cho hàm lƣợng lớn GABA từ thực phẩm truyền
thống và đã tối ƣu quá trình sản xuất GABA khi sử dụng vi khuẩn lactic axit đối với
mục tiêu công nghiệp.
Tại Việt Nam, có thể nói chƣa có công nghệ chế biến GABA có khả năng
hƣớng tới quy mô công nghiệp. Mặc dù, một số công trình nghiên cứu về sản xuất
GABA đã đƣợc nghiên cứu nhƣng vẫn chƣa có sản phẩm GABA bán ra thị trƣờng.
Ngoài ra cho tới nay vẫn chƣa có một công trình nghiên cứu nào ứng dụng vi khuẩn
Lactobacillus lên men từ dịch cám gạo để sản xuất GABA có hoạt tính kích thích
miễn dịch ổn định ở Việt Nam.
Hiện nay, hƣớng nghiên cứu ứng dụng các chất có nguồn gốc tự nhiên để làm
thực phẩm chức năng bắt đầu xuất hiện ở Việt Nam. Thực tế, khi một sản phẩm có
thể tiếp cận đƣợc trên thị trƣờng thì sản phẩm phải đảm bảo về chất lƣợng và giá
thành. Để giải quyết hai vấn đề lớn này, hƣớng nghiên cứu của đề tài là chọn một
nguồn nguyên liệu rẻ tiền và sẵn có nhất ở trong nƣớc mà vẫn cung cấp đƣợc đầy đủ
các thành phần cơ bản để có thể lên men đƣợc GABA có hiệu suất cao.
Về chất lƣợng sản phẩm, nhóm nghiên cứu đề tài đã sử dụng chất chỉ thị chỉ ra
đƣợc sự thay đổi kênh ion clorua để kiểm tra hoạt tính của tế bào.

1


Xuất phát từ cơ sở khoa học thực tiễn trên chúng tôi tiến hành đề tài:
“ Nghiên cứu quy trình sản xuất γ-Aminobutyric axit (GABA) từ dịch cám gạo
bằng Lactobacillus”
Nghiên cứu thực hiện nhằm các mục tiêu:
+ Xây dựng quy trình lên men phù hợp để sản xuất GABA từ dịch cám gạo bằng
chủng Lactobacillus plantarum KLEPT đạt hiệu suất cao 10 lít/ mẻ.
+ Đánh giá hoạt tính GABA thông qua thụ thể GABA.

2


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Gama-Aminobutyric axit (GABA)
GABA là một axít amin có trong tự nhiên, ở thực vật bậc cao nhƣ khoai tây,
đậu tƣơng, lúa, gạo lứt còn nguyên phôi.
Trong cơ thể, GABA đƣợc phát hiện trong hệ thống thần kinh trung ƣơng vào
khoảng năm 1950 bởi Eugene Roberts nhƣng đến năm 1960, GABA mới đƣợc đề
xuất là chất dẫn truyền thần kinh ức chế trong cơ thể. Ngoài não, GABA cũng có
mặt trong tế bào B tuyến tụy, buồng trứng, tinh hoàn, ống tiêu hóa. GABA có chức
năng quan trọng trong hệ thống thần kinh [5]. Hoạt động của GABA cùng với
glutamate và aspartate thực hiện phần lớn hoạt động thông qua khe xináp trong hệ
thống thần kinh trung ƣơng [20, 51].
Một số vai trò của GABA với sức khỏe của con ngƣời:
- Giảm bớt trạng thái căng thẳng và bất an, giúp ngủ ngon và ngủ sâu hơn.
- Điều trị mất tự chủ tạm thời: có mối quan hệ giữa việc thiếu GABA và
hiện tƣợng mất tự chủ hành vi của một số bệnh nhân. Trong những trƣờng hợp này,

bổ sung thêm GABA có thể ngăn ngừa sự vô hiệu hóa hoạt động các tế bào thần
kinh tại não bộ, tránh khỏi sự mất tự chủ của bệnh nhân.
- Stress – tình trạng tâm lý căng thẳng có thể làm gia tăng sự đau nhức. Nhƣ
một chất dẫn tự nhiên có chức năng giảm stress, GABA có thể giảm bớt tình trạng
đau nhức kéo dài khi giảm các dấu hiệu lo lắng có liên quan đến đau nhức giúp cho
chúng ta bớt cảm giác về sự đau nhức đó.
- Giảm trầm cảm.
- Việc sử dụng các loại thuốc an thần làm giảm lƣợng GABA trong cơ thể
và là một trong các nguyên nhân gây ra hiện tƣợng hoảng loạn.
- GABA cũng đƣợc coi là có thể điều trị đƣợc trạng thái rối loạn tâm lý
trƣớc thời kỳ kinh nguyệt (PMS - premenstrual syndrome) đối với phụ nữ.
1.2. Cấu trúc và hình dạng của GABA
GABA có cấu trúc gồm 4 cacbon. Nhóm cacbon cho proton và nhóm amin
nhận proton (hình 1). Hình dạng của GABA phụ thuộc nhiều vào điều kiện của môi

3


trƣờng. Ở trạng thái khí, GABA cuộn lại nhiều lần để tạo ra sức hút điện tích giữa
hai nhóm chức năng amin và cacbon. Theo tính toán hóa học để phá vỡ cấu trúc này
cần một năng lƣợng khoảng 50 kcal/mol. Ở trạng thái rắn, GABA luôn có hình dạng
mạch thẳng. Dƣới dạng mạch thẳng, GABA luôn có cấu trúc hình học trans ở nhóm
amin cuối và dạng cis ở nhóm cacbon kết thúc. Cấu trúc này sẽ giúp cho phân tử
GABA liên kết dễ dàng với các phân tử GABA khác. Ở trạng thái lỏng, GABA tồn
tại ở nhiều dạng cấu trúc khác nhau bao gồm dạng gấp khúc, dạng mạch thẳng.
Chính nhờ khả năng tồn tại ở nhiều dạng cấu trúc khác nhau này tạo cho GABA có
nhiều chức năng sinh học quan trọng [20, 22].

Hình 1: Cấu trúc của GABA [58]
1.3. Quá trình tổng hợp và chức năng của GABA trong não

GABA tham gia vào nhiều quá trình của hệ thống thần kinh trung ƣơng. Chẳng
hạn nhƣ liên quan đến tâm trạng lo âu, trầm cảm… Bởi vì, GABA không thể xuyên
qua đƣợc hàng rào để vào trong não. Do vậy, GABA đƣợc tổng hợp trong não bằng
con đƣờng trao đổi chất đƣợc biết là “GABA shunt” (hình 2). Giai đoạn cuối của
con đƣờng này sinh ra GABA thông qua quá trình chuyển hóa L-glutamate bằng sự
phân cắt của enzym glutamic acid decarboxylase (GAD) nhờ kích thích truyền tín
hiệu thần kinh [20, 22].
Khi lƣợng GABA đƣợc sinh ra vƣợt quá ngƣỡng từ tín hiệu tế bào thần kinh sẽ
đƣợc một enzym gọi là gamma-aminobutyric acid transaminase (GABA-T) làm
giảm bớt [20]. Mặc dù, GABA-T có thể tham gia tổng hợp GABA từ semialdehyde
succinic nhƣng vai trò cơ bản của enzyme này là phá hủy GABA. Ngoài ra, những
chất ức chế hoạt động của GABA-T cũng làm sinh ra một lƣợng lớn GABA ở trong
não [20]. Hơn nữa, quá trình tạo GABA của GAD cần có sự tham gia của vitamin

4


B6 hay còn đƣợc gọi là pyridoxal-5’-phophate đƣợc xem nhƣ một cofactor [32].
Cofactor này mang semialdehyde succinic tạo thành GABA ở trong não.

Hình 2: Con đƣờng tổng hợp và phân hủy của GABA (GABA shunt) [40]
GABA đảm bảo duy trì hoạt động bình thƣờng của não bộ đặc biệt là các
neuron thần kinh. GABA đóng vai trò chính trong việc giảm bớt sự hoạt động của
các neuron thần kinh và ức chế sự lan truyền của các tế bào dẫn truyền tín hiệu.
GABA ngăn cản các tín hiệu căng thẳng và bất an đến vùng thần kinh trung ƣơng
bằng việc chiếm giữ hoặc khống chế các vùng tiếp nhận tin của các tế bào này [20].
Do vậy, GABA giúp cho thƣ giãn thần kinh và cải thiện đƣợc tinh thần. Cho tới
nay, nhiều công trình nghiên cứu khoa học đã công bố GABA giúp cho con ngƣời
có giấc ngủ ngon và sâu, cải thiện khả năng mất tự chủ tạm thời, đau nhức kéo dài,
rối loạn tăng động thiếu chú ý hay bệnh trầm cảm, trạng thái tâm lý trƣớc thời kỳ

kinh nguyệt [16, 33, 43, 46, 50, 55, 54].
1.4. Enzym tổng hợp GABA
L-glutamate decarboxylase (GAD) là enzym xúc tác phản ứng tổng hợp
GABA từ Glutamate khi loại đi một phân tử CO2. GAD tồn tại dƣới hai dạng đồng
phân là GAD65 và GAD67 theo khối lƣợng phân tử của chúng (lần lƣợt là 65 và 67
kDa). Chúng đƣợc mã hóa bởi hai gen độc lập nằm trên hai nhiễm sắc thể số 2 và số
10 ở ngƣời, gen GAD65 nằm trên NST số 10 và gen GAD67 nằm trên NST số 2
[20, 40]. GAD67 là một enzym phân bố khắp các tế bào thần kinh GABAergic
trong cơ thể. Ngƣợc lại, GAD65 chủ yếu đƣợc tìm thấy ở tận cùng các dây thần

5


kinh và nó có thể đƣợc neo trên màng của các túi chất dẫn truyền thần kinh. Hoạt
động của enzym GAD cần một cofactor là pyridoxal phosphate (PLP) [52].
1.5. Thụ thể GABA
Thụ thể GABA bao gồm: thụ thể GABAA là phần phức hệ mang kênh ion và vị
trí gắn kết với phối tử; thụ thể GABAB thuộc họ thụ thể protein G có nhiệm vụ mở
kênh ion thông qua truyền thông tin nội bào qua protein G [20, 39].
Thụ thể GABAA là một phân tử lớn có 5 tiểu đơn vị protein. Tất cả các tiểu
đơn vị này đều có đoạn cuối là N ở phần bên ngoài tế bào, tiếp đến là 4 đoạn xuyên
màng, ở đoạn xuyên màng 3 và 4 có một đoạn loop lớn, cuối cùng là đoạn cuối C
ngắn. Các tiểu đơn vị protein này tổ hợp bằng những con đƣờng khác nhau và đƣợc
sắp xếp tạo ra một lõi cho phép kênh Cl- đi qua (Hình 3). GABAA có vai trò cơ bản
trong điều khiển các biểu hiện lo âu và ảnh hƣởng tới trí nhớ ở não. Các tế bào thần
kinh sản xuất ra GABA đƣợc gọi là các thần kinh GABAergic và hoạt động chính
trong quá trình ức chế ở các động vật có xƣơng sống trong giai đoạn trƣởng thành
[39]. 17-20% neuron thần kinh là GABAergic và hầu hết các hoạt tính sinh lý của
GABA đƣợc tạo thành thông qua thụ thể GABAA. Trong động vật có xƣơng sống,
GABA hoạt động ở các khe xináp trong não bằng liên kết với thụ thể GABA xuyên

màng tế bào thần kinh. Quá trình liên kết này sẽ dẫn tới mở kênh ion để cho phép
kênh ion mang điện tích âm Cl- đi vào trong tế bào hoặc kênh ion mang điện tích
dƣơng ra ngoài tế bào. Quá trình này sẽ tạo ra điện thế âm ở trên màng tế bào dẫn
tới vị trí này thƣờng xuyên ở trạng thái phân cực rất mạnh [20].

Hình 3: Mô hình cấu trúc của thụ thể GABAA [59]

6


Thụ thể GABAB có hai tiểu đơn vị là GABAB1 và GABAB2 (Hình 4). GABAB1
có vai trò nhận dạng phối tử bên ngoài tế bào còn GABAB2 có nhiệm vụ ở trên
màng tế bào và truyền tín hiệu. Thụ thể GABAB đƣợc ứng dụng nhƣ là đích để tìm
các loại thuốc trong điều trị dƣợc học và liên quan đến vai trò truyền tín hiệu về
khứu giác, đồng hóa, tái sản xuất, phát triển, tăng hocmon và tín hiệu trầm cảm
[20].

Hình 4: Mô hình cấu trúc của thụ thể GABAB [59]

Hình 5: Hoạt động của thụ thể trƣớc và sau khi gắn kết với GABA [52]
1.6. Sản xuất GABA từ vi sinh vật
Hiện nay, quá trình sản xuất GABA có rất nhiều con đƣờng khác nhau chẳng
hạn: quá trình khử cacbon của axít glutamic nhờ phân cắt của GAD [11, 8], tách
chiết từ các loại ngũ cốc [24, 27], tạo điều kiện tối ƣu để hạt gạo nảy mầm cho hàm
lƣợng GABA gần 15,8 g/100 g gạo [36], kích thích GAD trong mầm gạo để có thể

7


chuyển hóa GABA đạt hiệu suất là 29 g/100 g mầm gạo [36] hoặc lên men đậu

tƣơng bằng vi sinh vật [9, 11, 37, 55]. Công nghệ sử dụng các vi sinh vật đặc biệt vi
khuẩn lactic là một phƣơng pháp tốt để sản xuất GABA [11, 19, 21, 26, 28, 42, 45,
47, 53].
Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn đã đƣợc rất nhiều nghiên cứu gần đây
chứng minh có khả năng sản xuất GABA [24]. Bởi vì, vi khuẩn lactic có những hoạt
tính sinh lý đặc biệt và có thể xem nhƣ khá an toàn trong quá trình sử dụng vào mục
đích chăm sóc sức khỏe cho con ngƣời [10, 15, 23, 29, 30, 34]. Do vậy, GABA
đƣợc sản xuất từ vi khuẩn lactic có bản chất từ tự nhiên và an toàn cho sức khỏe
nhƣ làm tăng lƣợng GABA trong nƣớc ép dâu [8]. Nhiều sản phẩm đƣợc làm tăng
hàm lƣợng GABA bằng sử dụng những GABA sản xuất từ vi khuẩn lactic đƣợc
phân lập từ sản phẩm của bơ [45], sữa đậu nành [37], kimchi [12], phophat [35] và
những sản phẩm lên men từ cá [26]. Một vài chủng sản xuất GABA đã đƣợc chứng
minh có tiềm năng sản xuất GABA ở quy mô lên men với thể tích lớn [28]. Chẳng
hạn, chủng Lactobacillus brevis NCL 912 phân lập từ paocai Trung Quốc [32] đã
thu đƣợc nồng độ GABA trong dịch lên men tối ƣu là 1005,8 mM. Leuconostoc
NC5 phân lập từ sản phẩm lên men của tôm Malaysia cho nồng độ GABA là gần
800 mM [6]. Đặc biệt, chủng Latobacillus sakei B2-16 đƣợc phân lập từ kim chi
Hàn Quốc đã có khả năng lên men GABA từ dịch chiết cám gạo với nồng độ 660
mM [28]. Việc sàng lọc vi khuẩn lactic dựa vào khả năng tổng hợp GABA có thể
mở ra một triển vọng mới về quá trình sản xuất GABA.
Ngoài ra, một số vi sinh vật khác cũng có khả năng sinh GABA đã đƣợc ứng
dụng chẳng hạn nhƣ vi khuẩn kỵ khí đã sản xuất GABA trong các loại chè nhƣ chè
mầm tƣơi, chè đen, chè Gabaron, chè olong, chè xanh [5].
Lactobacillus (viết tắt là Lb) là một chi trong nhóm vi khuẩn lactic, là những
trực khuẩn không sinh bào tử thuộc nhóm vi khuẩn gram dƣơng. Trình tự gen
GAD đƣợc tìm thấy trong Lactobacillus brevis [38], Lactobacillus plantarum,
Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus [48], Lactobacillus paracasei [25], và
Lactococcus lactis subsp. Lactis [34].

8

Trong các thập kỉ qua, các nghiên cứu cơ bản mở ra một lĩnh vực nghiên cứu
mới đối với các chất có hoạt tính sinh học hoặc các hợp chất hữu cơ có nguồn gốc
từ thực phẩm.Việc sử dụng các chủng trên trong lên men tổng hợp GABA đã đƣợc
nghiên cứu rộng rãi và ứng dụng trong thực tế. Hiện nay, việc lên men
Lactobacillus plantarum để tổng hợp GABA từ các nguồn nguyên liệu dƣ thừa của
nông nghiệp đang là một hƣớng mới đầy tiềm năng. Hoạt động của GAD trong
Lactobacillus plantarum giúp bảo vệ vi khuẩn chống lại pH thấp của môi trƣờng.
Sau khi hấp thụ L-glutamate từ các transpoter đặc hiệu, GAD sẽ xúc tác phản ứng
decarboxyl hóa L-glutamate trong tế bào chất, dẫn đến tiêu thụ một proton trong tế
bào, kết quả làm tăng độ pH của tế bào chất và tăng pH ngoại bào do chuyển đổi
L-glutamate thành GABA kiềm hơn [25, 14].
1.7. Cơ chất tham gia sản xuất GABA
Monosodium glutamate (MSG) đƣợc xem nhƣ là một cơ chất trong quá trình
sản xuất Axit gamma-aminobutyric (GABA) bằng vi khuẩn lactic [28]. MSG là một
dạng muối của glutamic axit. MSG trong tự nhiên sinh ra từ amino axit mà đƣợc tìm
thấy trong đa số các thực phẩm. Đặc biệt các thực phẩm chứa hàm lƣợng protein
cao chẳng hạn nhƣ bơ, sữa, thịt, cá và nhiều loại rau khác nhau. Trong thực phẩm
thƣờng sử dụng MSG để tạo ra vị đã đƣợc biết tới khoảng 1200 năm về trƣớc. Với
vị đặc biệt của MSG đã có tên là “ Unami” trong ngƣời dân Nhật Bản. Nó đã có mặt
trên thị trƣờng cách đây hơn 100 năm. Nhiều loại thực phẩm đã tăng thêm hƣơng vị
bằng cho thêm MSG với hàm lƣợng cao. Trong sữa của các bà mẹ thì hàm lƣợng
MSG chiếm tỉ lệ cao nhất so với các axit amino. MSG trong một số loại thuốc cao
cấp đã chứng minh có thể hoạt hóa tế bào thần kinh ở chuột cống mới sinh. Tuy
nhiên, quá trình hoạt hóa tế bào thần kinh đã không xảy ra trong thực phẩm có
MSG. Ngoài ra, dựa vào vô số những chứng minh khoa học cũng đã công bố MSG
là một gia vị thực phẩm không gây nguy hại đến sức khỏe con ngƣời mà nó có vai
trò nhƣ một phân tử truyền tín hiệu không chỉ ở trong thần kinh mà còn ở một số
các mô khác. Tuy nhiên, nếu quá trình tích lũy MSG vƣợt quá ngƣỡng trong các khe

xináp của tế bào thần kinh sẽ liên kết tạo ra những độc tố dẫn tới phá hỏng hoặc làm

9


tổn thƣơng tới tế bào. Hơn nữa, MSG đã có nhiều công bố là gây độc cho tế bào
thần kinh ở trẻ em dƣới 5 tuổi. Bởi vậy, sử dụng MSG nhƣ là một cơ chất cho quá
trình chuyển hóa thành GABA là một điều đáng đƣợc quan tâm [60].
1.8. Thực phẩm chức năng GABA
Hiện nay, thực phẩm chức năng (TPCN) GABA đã có mặt khá phổ biến trên
thị trƣờng nƣớc ngoài với các dạng sản phẩm khác nhau chẳng hạn nhƣ: dƣới dạng
đồ uống, thực phẩm, kem, dạng viên, trong kẹo... Ở Việt Nam, thực phẩm chức
năng GABA đã có bán trên thị trƣờng. Tuy nhiên, tất các sản phẩm GABA đều vẫn
là nhập khẩu [58].
1.8.1. Cám gạo - nguồn nguyên liệu tạo thực phẩm chức năng chứa GABA
Trong cám gạo có chứa nhiều chất quan trọng nhƣ: vitamin E, vitamin B1, B3,
B6, ma-giê, man-gan, sắt, GAD và chất xơ mà thành phần chủ yếu là các
polysaccharide [1, 7, 12, 13, 11]. Cám gạo còn đƣợc chứng minh có thể làm giảm
nguy cơ ung thƣ, giảm cholesterol và tốt cho hệ tim mạch của phụ nữ sau mãn kinh.
Đồng thời, với chất xơ trong cám gạo giúp chống lại bệnh xơ vữa động mạnh, giảm
nguy cơ mắc bệnh tim và bệnh tiểu đƣờng. Mặc dù vậy, cám gạo không thể là thực
phẩm cho con ngƣời vì không cho vị giác ngon nên không thể ăn hàng ngày với một
lƣợng lớn cho mục đích tăng cƣờng hệ miễn dịch. Chính vì vậy, đã có một số công
trình nghiên cứu cám gạo nhƣ là một nguồn sản xuất GABA. Tuy nhiên, với những
điều kiện tối ƣu để làm tăng cƣờng quá trình hoạt động của GAD trong cám gạo thì
cũng chỉ cho hàm lƣợng GABA là 29 g/100 g cám gạo [36]. Ngoài ra, một công bố
gần đây của nhóm nghiên cứu Hàn Quốc đã sử dụng Lactobacillus để lên men dịch
cám gạo đã cho hiệu suất lên men GABA là 660 mM trong dịch lên men từ 1 kg
cám gạo đã đƣợc bổ sung thêm 10 lít nƣớc và 12% MSG tƣơng đƣơng với 679
g/1kg cám gạo [28].

1.8.2. Nghiên cứu về GABA ở Việt Nam
Tại Việt Nam, cho đến nay đã có một số công trình nghiên cứu về GABA nhƣ
tách chiết GABA từ đậu tƣơng hoặc dự án cấp nhà nƣớc năm 2007 về nghiên cứu

10


công nghệ sản xuất một số thực phẩm chức năng giàu GABA phòng chống bệnh
nhân ung thƣ do Viện Công nghệ Thực phẩm chủ trì. Tuy nhiên, khả năng ứng dụng
sản xuất ở mức quy mô công nghiệp vẫn chƣa hiệu quả vì sử dụng nguồn nguyên
liệu đắt tiền do đó giá thành còn cao. Hơn nữa, sản phẩm tạo ra để ứng dụng vào
thực phẩm chức năng đang còn hạn chế về phƣơng pháp kiểm tra hoạt tính sinh học.
Trong khi đó, một số công ty dƣợc của Trung Quốc đang bán GABA với giá chỉ
khoảng 400.000 đồng/kg. Tuy nhiên, cho tới nay vẫn chƣa có một công trình nghiên
cứu nào sử dụng cám gạo nhƣ một nguồn nguyên liệu chính trong quá trình sản xuất
GABA. Trong khi đó, nguồn nguyên liệu lên men từ cám gạo trong nƣớc rất dồi
dào, giá thành thấp và gần nhƣ chỉ sử dụng để làm thức ăn gia súc. Do vậy, đây là
một trong những lý do chính giúp cho quá trình sản xuất GABA có giá thành thấp.
1.9. Đánh giá hoạt tính sinh học GABA thông qua thụ thể
Trong cơ thể, tế bào có rất nhiều quá trình sinh hóa thiết yếu cho sự sống và
hoạt động chức năng đƣợc điều hòa bởi các chất dẫn truyền thần kinh và nhiều phân
tử “tín hiệu” khác. Sự điều hòa bởi những chất nhƣ vậy đƣợc thực hiện thông qua
các tƣơng tác giữa các phân tử có nguồn gốc tự nhiên này với các thụ thể gắn trên
màng tế bào (các thụ thể liên kết màng tế bào) hoặc có mặt trong tế bào chất (thụ
thể hòa tan) hoặc trong nhân tế bào (thụ thể nhân tế bào). Trong các loại thụ thể của
cơ thể, thụ thể GABA thuộc họ thụ thể G protein là những thụ thể màng tế bào, có
những phân tử nhận dạng cấu tử ở bên ngoài tế bào và kích hoạt những con đƣờng
truyền tín hiệu ở bên trong tế bào. Thụ thể GABA đƣợc biết tới có khả năng chi
phối nhiều loại bệnh và cũng là đích chữa bệnh của gần 30% các loại thuốc y học
hiện đại hiện nay có mặt trên thị trƣờng. Trong các chƣơng trình sàng lọc nhanh các

hợp chất có hoạt tính sinh học dựa trên các protein thụ thể, đƣợc tiến hành phân tích
sự tƣơng tác trực tiếp của hàng loạt các hợp chất mới (hoặc có nguồn gốc tổng hợp,
hoặc có nguồn gốc tự nhiên) với các protein thụ thể đích đƣợc quan tâm nghiên cứu.
Từ kết quả phân tích này, các hợp chất có hoạt tính tƣơng tác đặc hiệu với các thụ
thể đích mạnh thƣờng đƣợc xem là các hợp chất có hoạt tính sinh học tiềm năng, và
tiếp tục đƣợc đƣa vào các chƣơng trình đánh giá hoạt tính sinh học của chúng ở cấp

11


độ tế bào hoặc cơ thể. Trong thực tế, các phép thử sinh học tƣơng tác với các
protein thụ thể đã là một bƣớc ngoặt về mặt công nghệ trong việc phát hiện và thiết
kế các hợp chất có hoạt tính sinh học tiềm năng mới, đặc biệt là cung cấp các thông
tin về mối quan hệ “hoạt tính sinh học - cấu trúc hóa học” của các hợp chất. Các
phƣơng pháp tƣơng tác thụ thể cho phép đánh giá, phân tích một lƣợng rất nhỏ một
hợp chất hoặc dịch chiết mới (chỉ cần ở hàm lƣợng thấp từ 5 mg đến 10 mg) về khả
năng tƣơng tác trực tiếp của chúng với các mục tiêu dƣợc lý ở cấp phân tử [59].
Các phƣơng pháp đang đƣợc sử dụng rộng rãi ở nƣớc ta đều dựa trên cơ sở sử
dụng các chất gắn phóng xạ theo nguyên tắc đánh giá cạnh tranh. Các phƣơng pháp
này có các ƣu điểm là tính đặc hiệu và độ nhạy cao, đồng thời không làm thay đổi ái
lực tƣơng tác giữa các chất gắn với protein thụ thể, nhƣng cũng bộc lộ nhiều hạn
chế chẳng hạn nhƣ: nguy cơ phơi nhiễm phóng xạ và ảnh hƣởng đến sức khỏe, cộng
đồng và môi trƣờng xung quanh, cần chi phí cao cho thiết kế và xây dựng phòng thí
nghiệm đảm bảo an toàn phóng xạ, trang thiết bị phân tích phóng xạ và nguyên vật
liệu có giá thành cao. Hiện nay, một phƣơng pháp khác không sử dụng đồng vị
phóng xạ đó là dùng chất gắn đặc hiệu huỳnh quang bởi fluorescein trên mô hình ở
thụ thể đích. Phƣơng pháp này đã đƣợc sử dụng khá phổ biến trên thế giới và có độ
chính xác cao. Với phƣơng pháp này, thì hoàn toàn có thể tiếp cận đƣợc một
phƣơng pháp sàng lọc mới hiện đang sử dụng rất nhiều ở trên thế giới là High
throughput screening. Đây là một quá trình thí nghiệm khoa học đặc biệt đƣợc sử

dụng trong khám phá ra các loại thuốc và liên quan tới lĩnh vực sinh học và hóa
học. High throughput screening cho phép nhà nghiên cứu đánh giá nhanh hàng triệu
điều kiện về kiểm tra dƣợc học di truyền, hóa học. Thông qua quá trình này có thể
nhận dạng nhanh các hợp chất có hoạt tính, kháng thể và gen tham gia điều khiển
con đƣờng phân tử sinh học cụ thể. Những kết quả của phƣơng pháp này sẽ giúp
cho quá trình khởi đầu tạo ra những loại thuốc mới và hiểu quá trình tƣơng tác hoặc
vai trò của quá trình sinh hóa trong sinh học .Trong hoàn cảnh hiện nay của Việt
Nam, để phát triển phƣơng pháp đánh dấu phóng xạ là rất khó khăn. Do vậy, việc
phát triển phƣơng pháp đánh dấu huỳnh quang hoặc đánh giá các tín hiệu thứ cấp

12


khi thụ thể hoạt động sinh ra hoàn toàn có thể phát triển và ứng dụng đƣợc trong
điều kiện thực tế của Việt Nam hiện nay [17].
Bên cạnh đó, xây dựng các hệ thống sàng lọc đơn giản hóa và tự động cần
đƣợc thiết lập trong các phòng thí nghiệm và tránh việc sử dụng các chất phóng xạ.
Hơn nữa, các hệ thống sàng lọc này sẽ cho phép phân biệt chức năng đơn giản giữa
các chất chủ vận, các chất đối vận và có khả năng ứng dụng cho phần lớn các thụ
thể. Do vậy, phƣơng pháp sàng lọc chức năng đối với thụ thể GABA đã phát triển
gần đây dựa vào quá trình thay đổi kênh Cl- bên trong tế bào khi thụ thể này liên kết
với GABA. Từ quá trình thay đổi kênh Cl- sẽ bắt mầu với Iot. Do vậy, việc đánh giá
tín hiệu thay đổi màu Iot có thể bắt đƣợc bằng bƣớc sóng hấp phụ 405 nm. Phƣơng
pháp sàng lọc này có thể thực hiện trong những đĩa microplate với số lƣợng giếng là
96, 384, 1536, 3456. [17]. Đây là một phƣơng pháp đƣợc chúng tôi lựa chọn xây
dựng để đánh giá hoạt tính và định lƣợng GABA trong đề tài nghiên cứu.

13

CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1. Vi sinh vật
Chủng Lactobacillus plantarum KLEPT (KC1) đƣợc cung cấp bởi Phòng Thí
nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein - Trƣờng Đại học Khoa học Tự
nhiên.
2.1.2. Các mẫu cám gạo
Cám gạo Thái Bình (giống lúa BC15) và cám gạo Đồng bằng sông Cửu Long
(giống lúa OM4900) mua trực tiếp từ ngƣời nông dân sau khi xay xát, để nguội và
đóng gói.
2.1.3. Các dòng tế bào
Dòng tế bào WSS-1 có vectơ tái tổ hợp thụ thể GABA mua từ ATTC của Mỹ.
Dòng tế bào P12 là dòng tế bào thần kinh chuột nhắt trắng Swiss đƣợc cung
cấp bởi Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein - Trƣờng Đại
học Khoa học Tự nhiên.
2.1.4. Máy móc và dụng cụ
Máy đo OD, máy đo pH, máy khuấy từ, máy ly tâm, tủ hút, tủ đẩy, máy đọc
đĩa ELISA, máy lắc ổn nhiệt, máy đông khô, HPLC (Simazu) cùng nhiều thiết bị
khác của phòng enzym học và phân tích hoạt tính sinh học.
2.1.5. Các hóa chất, nguyên liệu khác
Agar, peptone, cao nấm men, glucose, cao thịt, CH3COONa, Tri ammonium
citrate, MgSO4, Monosodium glutamate (MSG), Tween, CaCO3, Sucrose, Borate,
2-mercaptoethanol, butanol, axít acetic, ninhydrin, methanol, acetonitrile, LaCl3,
o-phthaldialdehyd, 1-butanol, K+pyrophosphate, ß-Nicotinamide adenine, NaCl,
dinucleotide phosphate hydrate, GABASE, α-ketoglutarate, NaI, GABA chuẩn,
kháng sinh (Sigma, Mỹ). DNAzol® Direct (invitrogen, Mỹ), GFX PCR, Gel Band
Purification Kit (Amersham Biosciences). CellTiter 96® Aqueous One Solution
Cell Proliferation Assay, Promega, Mỹ), Triton X-100, citrate, malate, Tripsin,

14

2-morpholinoethanesulfonic (MES), Pyridoxal 5-phosphate (PLP), succinate, axít
trichloroacetic (TCA), triethylamine, phenylisothiocyanate (Sigma, Mỹ). Fetal
bovine serum (FBS), môi trƣờng DMEM, (Invitrogen, Mỹ).
Sắc ký bản mỏng TLC (Meck), Ống Falcon các loại (50 ml, 15 ml), đĩa ELISA
96 giếng, đĩa nuôi tế bào 24 giếng, đĩa nuôi tế bào 12 giếng, điã petri vô trùng nuôi
cấy vi khuẩn và nuôi cấy tế bào (Corning, Mỹ). Bình nghiêng nuôi cấy tế bào, đầu
côn các loại (1 ml; 0,2 ml) và các ống eppendorf các loại (0,5 ml; 1,5 ml), pipet tiệt
trùng dùng trong nuôi cấy tế bào (1 ml, 5 ml, 10 ml, 50 ml), Bình thủy tinh duran
các loại (Inovagen, Mỹ). Màng lọc vi khuẩn (Sigma, Đức).
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xây dựng quy trình lên men sản xuất GABA từ dịch cám gạo
2.2.1.1. Nuôi cấy và bảo quản chủng KC1
Bảng 1: Thành phần môi trƣờng MRS
Công thức

gram/ lít

Peptone

10

Cao thịt

10

Cao nấm men

5

Glucose

20

Tween

1giọt

Dipotassium hydrogen phosphate

2

CH3COONa

5

Triammonium citrate

2

MgSO4

0,1

MnSO4

0,05

Agar

10

15