Phân lập, tuyển chọn nấm men chịu nhiệt và đánh giá khả năng lên men rượu vang trái giác (Cayratia trifolia) ở Đồng bằng sông Cửu Long

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

ĐOÀN THỊ KIỀU TIÊN

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN NẤM MEN
CHỊU NHIỆT VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG LÊN MEN
RƯỢU VANG TRÁI GIÁC (Cayratia trifolia)
Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

LUẬN ÁN NGHIÊN CỨU SINH
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ NGÀNH: 62 42 02 01

2020


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN.................................................................................................... i
TÓM TẮT ......................................................................................................... ii
ABSTRACT ..................................................................................................... iii
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................ iv
MỤC LỤC ........................................................................................................ v
DANH SÁCH BẢNG .................................................................................... viii
DANH SÁCH HÌNH ........................................................................................ x
CÁC TỪ VIẾT TẮT ...................................................................................... xii
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU ............................................................................. 1
1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu đề tài ............................................................................................. 2
1.3 Nội dung nghiên cứu.................................................................................... 2

1.4 Ý nghĩa của luận án ..................................................................................... 3
1.5 Những điểm mới của luận án ....................................................................... 3
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ........................................................ 4
2.1 Rượu vang ................................................................................................... 4
2.1.1 Giới thiệu về rượu vang ............................................................................ 4
2.1.2 Nguyên liệu làm rượu vang.......................................................................5
2.1.3 Hệ vi sinh vật trong lên men rượu vang ................................................... 6
2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ........................................... 8
2.1.5 Rượu vang đối với sức khoe con người .................................................. 11
2.2 Nấm men .................................................................................................... 11
2.2.1 Đặc điểm của nấm men ........................................................................... 12
2.2.2 Đặc điểm nuôi cấy .................................................................................. 13
2.2.3 Đặc tính lên men .................................................................................... 15
2.2.4 Nấm men chịu nhiệt ................................................................................ 15
2.3 Cây giác (Cayratia trifolia (L.) Domin) ................................................... 21
2.3.1 Phân loại khoa học .................................................................................. 21
2.3.2 Đặc tính và điều kiện tự nhiên ............................................................... 21
2.3.3 Thành phần hóa học ............................................................................... 22
2.3.4 Hoạt tính sinh học .................................................................................. 23

v


2.3.5 Công dụng của cây giác ......................................................................... 34
2.4 Tình hình nghiên cứu ở trong và ngoài nước............................................. 34
2.4.1 Thế giới ................................................................................................... 34
2.4.2 Trong nước ............................................................................................. 37
2.5 Một số khảo sát thực tế trong phạm vi nghiên cứu của luận án ............... 38
2.5.1 Sản lượng trái giác ở ĐBSCL ................................................................ 38
2.5.2 Thực tế sản xuất nấm men thương mại tại Công ty Saf - Viet .............. 40

CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..... 42
3.1 Phương tiện nghiên cứu ............................................................................. 42
3.1.1 Thời gian và địa điểm ............................................................................. 42
3.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất ...................................................................... 44
3.2 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 45
3.2.1 Thu thập, đánh giá đặc điểm của trái giác .............................................. 46
3.2.2 Phân lập các chủng nấm men từ trái giác tự nhiên và xác định các đặc
điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa ..................................................................... 50
3.2.3 Tuyển chọn, định danh và xác định mối quan hệ các chủng nấm men
chịu nhiệt, chịu cồn và có khả năng lên men rượu vang trái giác tốt. ............. 56
3.2.4 Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho quá trình lên men rượu vang trái
giác ................................................................................................................... 59
3.3 Xử lý số liệu ............................................................................................... 61
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 62
4.1 Nội dung 1: Đặc điểm của trái giác ở ĐBSCL .......................................... 62
4.1.1 Đặc điểm hình dạng, kích thước ............................................................. 62
4.1.2 Đặc điểm các chỉ tiêu hóa lý của dịch trái giác ...................................... 63
4.1.3 Hàm lượng polyphenol và khả năng kháng oxy hóa của trái giác……. 67
4.2 Nội dung 2: Phân lập các chủng nấm men từ trái giác tự nhiên và xác định
các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa ........................................................ 72
4.2.1 Phân lập các chủng nấm men từ trái giác tự nhiên ................................. 72
4.2.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của các chủng nấm men .............. 74
4.2.3 Đặc điểm nảy chồi của các chủng nấm men phân lập ............................ 79
4.2.4 Đặc điểm hình thành bào tử của các chủng nấm men phân lập .............. 81
4.2.5 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng nấm men phân lập ............... 81
4.3 Nội dung 3: Tuyển chọn, định danh và xác định mối quan hệ các chủng
nấm men chịu nhiệt, chịu cồn, có khả năng lên men rượu vang trái giác tốt ..86
vi

4.3.1 Khả năng chịu nhiệt của các chủng nấm men ........................................ 86
4.3.2 Khả năng chịu ethanol của những chủng nấm men chịu nhiệt
......................................................................................................................... 88
4.3.3 Tuyển chọn những chủng nấm có khả năng lên men rượu vang ............ 90
4.3.4 Lên men rượu vang trái giác ................................................................... 97
4.4 Nội dung 4: Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho quá trình lên men rượu
vang trái giác .................................................................................................. 109
4.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên men và pH ................................. 109
4.4.2 Ảnh hưởng của mật số giống chủng, độ Brix và thời gian lên men đến
quá trình lên men rượu vang trái giác ............................................................ 112
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT................................................. 121
5.1 Kết luận .................................................................................................... 121
5.2 Đề xuất ..................................................................................................... 122
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ................................ 124
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................... 126
PHỤ LỤC

vii


DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1. Phân loại khoa học của dây giác ....................................................... 4
Bảng 2.2. Một số vi sinh vật làm hỏng và giảm chất lượng rượu .................... 7
Bảng 2.3. Sự hiện diện và ứng dụng của nấm men trong một số thực phẩm,
thức uống có cồn và sản phẩm lên men ........................................................... 15
Bảng 2.4. Những chủng nấm men được khảo sát có khả năng phát triển và sản
sinh ethanol ở nhiệt độ 37ºC đến 45ºC ............................................................ 18
Bảng 2.5. Phân loại khoa học của cây giác ..................................................... 21
Bảng 2.6. Đặc điểm sản phẩm nấm men của công ty Saf - Viet .................... 40
Bảng 3.1. Địa điểm thu mẫu trái giác sử dụng trong phân lập nấm men ........ 42

Bảng 3.2. Thành phần môi trường YPD ......................................................... 45
Bảng 3.3. Thành phần môi trường YPD agar .................................................. 45
Bảng 3.4. Thành phần môi trường Chistensen urea broth ............................... 46
Bảng 3.5. Thành phần môi trường Gelatin ...................................................... 46
Bảng 4.1. Đặc điểm của 2 dạng trái giác ở vùng ĐBSCL ............................... 62
Bảng 4.2. pH, ºBrix, hàm lượng đường tổng, đường khử của dịch trái giác ... 63
Bảng 4.3. Hàm lượng polyphenol và khả năng kháng oxy hóa của trái giác .. 67
Bảng 4.4. Khả năng khử gốc tự do của Vitamin C ở nồng độ 2-12 µg/mL .... 71
Bảng 4.5. Các chủng nấm men phân lập ở đợt 1 ............................................. 72
Bảng 4.6. Các chủng nấm men phân lập ở đợt 2 ............................................. 73
Bảng 4.7.Các chủng nấm men phân lập ở đợt 3 .............................................. 73
Bảng 4.8. Đặc điểm, hình thái của các chủng nấm men đại diện ở 7 nhóm .... 76
Bảng 4.9. Sự phân bố của hình thái của các chủng nấm men ......................... 78
Bảng 4.10. Kết quả phân loại sơ bộ 151 chủng nấm men dựa trên đặc điểm
hình thái, sinh lý, sinh hóa ............................................................................... 82
Bảng 4.11. Tổng hợp số lượng các chủng nấm men phát triển ở các mức nhiệt
độ...................................................................................................................... 87
Bảng 4.12. Tổng hợp khả năng phát triển của 141 chủng nấm men trong môi
trường có nồng độ ethanol khác nhau .............................................................. 89
Bảng 4.13. Chiều cao cột khí trung bình (mm) trong chuông Durham khi lên
men dịch glucose 2% ....................................................................................... 91
viii


Bảng 4.14. Chiều cao cột khí trung bình (mm) trong chuông Durham khi lên
men dịch trái giác ............................................................................................. 94
Bảng 4.15. Khả năng lên men rượu vang trái giác của các chủng nấm men ... 97
Bảng 4.16. Đặc điểm của 30 chủng nấm men ở 37°C ................................... 102
Bảng 4.17. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và kết quả giải tình tự ......104
Bảng 4.18. Kết quả xác định tên loài 30 chủng nấm men được tuyển chọn . 106

Bảng 4.19. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến quá trình lên men ............... 110
Bảng 4.20. Ảnh hưởng của mật số giống chủng, oBrix và thời gian lên men 112
Bảng 4.21. Hàm lượng polyphenol và khả năng oxy hóa trước và sau khi lên
men rượu vang trái giác ................................................................................. 117
Bảng 4.22. Kết quả đánh giá các chỉ tiêu hóa học rượu trái giác .................. 118
Bảng 4.23. Đánh giá cảm quan rượu vang trái giác ......................................119

ix


DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1: Các bào quan của tế bào nấm men Candida boidiniicell ................ 12
Hình 2.2: Đường cong sinh trưởng của vi sinh vật trong môi trường ............ 14
Hình 2.3: Quá trình chuyển hóa glucose trong tế bào nấm men .................... 35
Hình 2.4: Kluyveromyces marxianus ............................................................... 19
Hình 2.5: Saccharomyces cerevisiae ............................................................... 20
Hình 2.6: Candida albicans ............................................................................. 20
Hình 2.7: Trái, dây và hoa Cayratia trifolia .................................................... 21
Hình 2.8: Một số hợp chất hóa học trong dây giác: -sitosterol (1) ................ 24
Hình 2.9: Sự hình thành các gốc tự do ............................................................26
Hình 2.10: Tác dụng bảo vệ tế bào của polyphenol dưới tác dụng của gốc tự
do...................................................................................................................... 27
Hình 2.11: Các hợp chất acid phenolic điển hình trong thực phẩm ................ 29
Hình 2.12: Các cấu trúc cơ bản của các flavonoid .......................................... 30
Hình 2.13: Các nhóm anthocyanidin chính ..................................................... 31
Hình 2.14: Cấu trúc hóa học kháng oxy hóa của terpenoid ............................. 32
Hình 2.15: Một số polyphenol quan trọng khác .............................................. 33
Hình 2.16: Thu gom trái giác chín ở ấp 4 xã Khánh Thuận ........................... 39
Hình 2.17: Trái giác được trồng ở huyện U Minh Thượng tỉnh Kiên Giang .. 39

Hình 2.18: Đoàn đến làm việc tại Công ty Saf-Viet ........................................ 40
Hình 3.1: Trái giác chín ................................................................................... 42
Hình 3.2: Biểu đồ đường chuẩn khảo sát hàm lượng đường tổng số .............. 47
Hình 3.3: Biểu đồ đường chuẩn khảo sát hàm lượng đường khử .................... 48
Hình 3.4: Biểu đồ đường chuẩn khảo sát hàm lượng polyphenol tổng số ...... 49
Hình 3.5: Sơ đồ quy trình nuôi tăng sinh nấm men từ trái giác....................... 51
Hình 3.6: Sơ đồ quy trình cấy trãi mẫu nấm men ............................................ 52
Hình 3.7: Bố trí thí nghiệm khả năng lên men đường saccharose ................... 53
Hình 3.8: Khả năng phân giải urea của các chủng nấm men........................... 54
x


Hình 3.9: Khả năng phân giải gelatine của những chủng nấm men ................ 55
Hình 3.10: Chu kỳ nhiệt PCR ......................................................................... 58
Hình 4.1: Hình dạng tế bào của 7 nhóm nấm men .......................................... 75
Hình 4.2: Hình thức nảy chồi của 7 nhóm nấm men ....................................... 80
Hình 4.3: Sự phát triển của các chủng nấm men ở các nhiệt độ khác nhau .... 87
Hình 4.4: Sự phát triển của một số chủng nấm men trong môi trường ........... 89
có nồng độ ethanol khác nhau ......................................................................... 89
Hình 4.5: Mối quan hệ phát sinh loài của 30 chủng nấm men ...................... 108
Hình 4.6: Biểu đồ mặt đáp ứng thể hiện sự tương quan giữa nồng độ đường
và thời gian lên men đến quá trình lên men ................................................... 115
Hình 4.7: Biểu đồ đường mức thể hiện sự tương quan giữa ngày và mật số
giống chủng đến quá trình lên men dịch trái giác .......................................... 115
Hình 4.8: Biểu đồ cảm quan rượu trái giác, sản phẩm rượu trái giác ............ 120

xi


CÁC TỪ VIẾT TẮT

ADP

Adenosine Diphosphate

ATP

Adenosine Triphosphate

DPPH

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

ĐBSCL

Đồng bằng sông Cửu Long

QCVN

Quy chuẩn Việt Nam

RNA

Acid ribonucleic

QCVN

Quy chuẩn Việt Nam

YPD

Yeast extract – Pepton – D-glucose

GAE

Acid gallic equivalent

TPC

Total pholyphenol content

MIC

nồng độ ức chế tối thiểu

Glu

Glucose

Sac

Saccharose

Mal

Maltose

KG

Kiên Giang

AG

An Giang

ĐT

Đồng Tháp

BT

Bến Tre

TV

Trà Vinh

BL

Bạc Liêu

TG

Tiền Giang

LA

Long An

CM

Cà Mau

CT

Cần Thơ

VL

Vĩnh Long

HG

Hậu Giang

ST

Sóc Trăng

xii


CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Dây giác (Cayratia trifolia) là một loại dây leo thân gỗ mọc hoang dại trong
trảng cỏ và rừng thưa ở các nước như Trung Quốc, Việt Nam, Lào, Campuchia,
Thái Lan, Myanma, Indonesia, Malaysia. Ở Việt Nam dây giác mọc hoang dại
dọc các hàng rào, bụi từ các tỉnh miền Trung đến các tỉnh miền Nam. Vùng
ĐBSCL, dây giác có hầu hết ở tất cả các tỉnh, thành phố, đặc biệt dây giác là loài
thực vật rất phong phú trên đất U Minh (Phạm Hoàng Hộ, 2000 và Võ Văn Chi,
2004) với sản lượng trái giác thu hoạch khoảng 70 đến 80 tấn mỗi mùa. Trái giác

được dùng phổ biến như gia vị trong các món ăn vì hương vị đặc biệt và những
tác dụng dược học của trái giác đối với cơ thể con người. Trên thế giới, những
nghiên cứu cho thấy trong thành phần dây giác có chứa các hợp chất có hoạt tính
sinh học cao như phenolic acids, flavonoid, stilbenes, anthocyanidin,… (Tsao,
2010). Theo Gupta, 2007, các bộ phận dây giác có chứa dầu sáp màu vàng,
steroids, terpenoids, flavonoid, tannins, stilbenes, acid hidrocyanic.
Rượu vang có lịch sử hàng ngàn năm, được sản xuất đầu tiên ở các nước
Châu Âu. Ngày nay, các sản phẩm rượu vang đã và đang được nghiên cứu để đa
dạng hóa về chủng loại, cải tiến về chất lượng, năng suất lẫn quy mô nhằm đáp
ứng nhu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng. Theo truyền thống, rượu vang
được sản xuất từ nho chín, sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae để nâng
cao hiệu quả lên men (Bùi Ái, 2005). Trong quá trình lên men rượu vang, một
trong những yếu tố quan trọng nhất chính là nguồn nấm men. Đối với nấm men,
nhiệt độ có ảnh hưởng quan trọng đến quá trình chuyển hóa đường thành ethanol
(Lương Đức Phẩm, 2006). Hiện nay, nhiệt độ trái đất đang ấm dần lên do hiện
tượng biến đổi khí hậu. Nhiệt độ tăng cao sẽ ảnh hưởng đến khả năng lên men
của nấm men trong quá trình sản xuất rượu vang cũng như cần phải tiêu tốn một
phần năng lượng để giữ ổn định nhiệt độ cho các hệ thống lên men (Limtong et
al., 2007; Yuangsaard et al., 2013). Vì vậy, việc lựa chọn nấm men chịu nhiệt để
lên men rượu là một giải pháp hữu hiệu mang lại nhiều lợi ích đáng kể như tận
dụng được nhiệt độ cao để lên men và giảm chi phí đầu tư cho thiết bị làm mát, từ
đó tạo ra nhiều lợi ích kinh tế trong sản xuất (Roehr, 2001; Limtong et al., 2007).
Bên cạnh đó, việc phân lập và định danh các chủng nấm men cũng góp phần làm
phong phú thêm sự hiểu biết về đa dạng sinh học vi sinh vật. Đồng thời, có thể

1


tiến tới việc sản xuất giống thuần chủng cung cấp cho các cơ sở sản xuất rượu
vang.

Như vậy, trái giác chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao, có hương
vị và màu sắc đặc trưng nên có thể được sử dụng như nguồn nguyên liệu trong lên
men rượu vang. Đồng thời, việc ứng dụng chủng nấm men chịu nhiệt mang lại
hiệu quả cho quá trình lên men trong điều kiện trái đất đang ấm dần lên. Từ đó
cho thấy đề tài phân lập, tuyển chọn nấm men chịu nhiệt và đánh giá khả năng lên
men rượu vang trái giác (Cayratia trifolia) ở ĐBSCL được thực hiện như một yêu
cầu cần thiết.
1.2 Mục tiêu đề tài
1.2.1 Mục tiêu chung
Cung cấp các dữ liệu về trái giác và đề xuất một giải pháp cho quá trình lên
men rượu vang trái giác giúp giải quyết vấn đề ấm dần lên của trái đất do sự gia
tăng nhiệt độ. Qua đó, người dân ở khu vực có thể vận dụng để thích nghi nhanh
với sự biến đổi khí hậu của khu vực và khai thác giá trị nguồn trái giác có trong
thiên nhiên để tăng thêm thu nhập.
1.2.2 Mục tiêu cụ thể
Xác định đặc điểm và giá trị của nguyên liệu trái giác ở ĐBSCL; phân lập,
tuyển chọn và xác định mối quan hệ di truyền của các chủng nấm men chịu nhiệt
và đánh giá khả năng lên men rượu vang trái giác (Cayratia trifolia) sử dụng
chủng nấm men chịu nhiệt được tuyển chọn từ trái giác. Khảo sát điều kiện thích
hợp cho quá trình lên men rượu vang trái giác sử dụng chủng nấm men chịu nhiệt,
tạo ra sản phẩm rượu vang trái giác có tính đặc trưng về màu sắc, hương vị, đạt
các chỉ tiêu chất lượng theo quy định, đặc biệt là khả năng kháng oxy hóa.
1.3 Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Thu thập và đánh giá một số đặc điểm hóa lý và đặc tính kháng
oxy hóa của nguyên liệu trái giác vùng ĐBSCL.
Nội dung 2: Phân lập nấm men từ trái giác tự nhiên ở 13 tỉnh, thành phố
vùng ĐBSCL và xác định các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của các chủng
nấm men phân lập được.
Nội dung 3: Tuyển chọn chủng nấm men chịu nhiệt, chịu cồn và có khả năng lên
men rượu vang trái giác tốt, định danh và xác định mối quan hệ di truyền các chủng nấm

men được tuyển chọn bằng phương pháp sinh học phân tử.

2


Nội dung 4: Nghiên cứu các nhân tố ảnh hưởng và điều kiện thích hợp cho quá
trình lên men rượu vang trái giác sử dụng chủng nấm men chịu nhiệt tốt nhất được tuyển
chọn; phân tích, kiểm nghiệm chất lượng của sản phẩm.

1.4 Ý nghĩa của luận án
Luận án đã khẳng định được giá trị của nguồn nguyên liệu trái giác vùng
ĐBSCL, cung cấp dữ liệu tin cậy về hàm lượng polyphenol và khả năng kháng
oxy hóa. Dữ liệu này có thể dùng làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm
khai thác giá trị của nguồn trái giác tồn tại trong thiên nhiên, góp phần làm tăng
thêm thu nhập của người dân trong khu vực.
Luận án đã cung cấp bộ giống nấm men được phân lập từ trái giác tự nhiên,
góp phần làm phong phú sự hiểu biết về đa dạng sinh học vi sinh vật. Nghiên cứu
này có thể làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo về đặc tính sinh học và khả
năng ứng dụng của bộ giống nấm men.
Luận án cũng đã tuyển chọn được các chủng nấm men chịu nhiệt có khả
năng lên men rượu tốt và đã ứng dụng vào quy trình lên men rượu vang trái giác
ở nhiệt độ cao. Nghiên cứu này mở ra triển vọng sản xuất rượu vang ổn định
trong điều kiện nhiệt độ trái đất ngày càng tăng cao. Đề tài này có ý nghĩa ứng
dụng thực tế tốt, đã đề xuất giải pháp lên men trái giác ở nhiệt độ cao.
1.5 Những điểm mới của luận án
- Xác định trái giác có chứa hàm lượng polyphenol từ 0,47 đến 1,54 mg
GAE/mL và có khả năng kháng oxy hóa từ 16,60 đến 82,86%.
- Phân lập được 151 chủng nấm men từ trái giác tự nhiên vùng ĐBSCL
thuộc giống Saccharomyces, Candida, Clavispora, Pichia và Hanseniaspora.
- Xác định có 30 chủng nấm men tự nhiên trên trái giác có khả năng chịu

nhiệt từ 37 đến 45ºC, có khả năng phát triển trong môi trường có nồng độ ethanol
từ 9 - 12% và lên men dịch trái giác sinh hàm lượng ethanol từ 6% (v/v) trở lên.
- Tuyển chọn được chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae HG1.3 có
khả năng chịu nhiệt đến 43ºC, lên men rượu trái giác ở nhiệt độ 35ºC với pH
thích hợp là 4,5, 20 ºBrix, mật số giống chủng 105 tế bào/mL. Sau 6 ngày lên men
hàm lượng ethanol đạt 11,68% (v/v). Sản phẩm rượu vang trái giác chứa hàm
lượng polyphenol 0,6 mg GAE/mL, khả năng kháng oxy hóa là 57,3% và có tính
đặc trưng về màu sắc, hương vị.
3


CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Rượu vang
2.1.1 Giới thiệu về rượu vang
Rượu vang là loại đồ uống có độ cồn nhẹ, có giá trị dinh dưỡng cao, được
lên men từ trái cây không qua quá trình chưng cất. Rượu vang được tàng trữ hàng
chục năm, thậm chí hàng trăm năm nên rượu có hương vị đặc trưng và hấp dẫn
người tiêu dùng (Lê Văn Nhượng và Nguyễn Văn Cách, 2009). Rượu vang vốn
có nguồn gốc từ quả nho nên có tên gọi là “Vin” hoặc “Wine” (Lương Đức Phẩm,
2009). Việc sản xuất rượu vang đã được con người biết từ thời Ai Cập cổ đại, ban
đầu được tiến hành bằng cách ép lấy dịch quả nho, sau đó lên men hoàn toàn tự
nhiên trong các hang đá và sau một thời gian thì thu được loại đồ uống có độ cồn
thấp, có hương vị thơm ngon rất quyến rũ.
Thành phần hóa học của rượu vang rất phức tạp, có những chất hiện diện
với lượng tương đối lớn có thể xác định được, nhưng cũng có những chất chiếm
một tỷ lệ rất thấp như chất thơm, acid bay hơi,… Thông thường rượu vang có
chứa 85 - 89% nước, khoảng 10 - 14% ethanol, dưới 1% acid và hàng trăm loại
chất tạo hương khác nhau ở nồng độ rất thấp. Nồng độ ethanol có trong rượu
vang ở mức có thể tiêu diệt đa số các loại vi sinh vật gây bệnh (Phạm Văn Ty,
2007). Thành phần hóa học của rượu vang được trình bày trong Bảng 2.1.

Bảng 2.1. Thành phần hóa học của rượu vang trái cây
Thành phần

Khối lượng (g/L)

Nước

818-890

Rượu etylic

80-144

Đường tổng số

62-132

Chất hòa tan không phải đường

18-30

Acid (tính ra acid malic)

5-7

Acid bay hơi

0,65- 1,1

Tro

1,8- 2,9

(Nguồn: Vũ Công Hậu, 2004)
Nhìn chung, thành phần rượu vang gồm nước, cồn, đường, acid tổng số,
acid bay hơi, vitamin, chất tạo mùi thơm, polyphenol, tro và các muối khoáng,…
(Bruce, 1999). Ethanol là thành phần quan trọng trong rượu vang. Ethanol có
4


được do lên men từ dịch trái cây nên là loại rượu tinh khiết, có mùi thơm, vị ngọt
giống như đường. Đường trong rượu vang chủ yếu là fructose, glucose, galactose,
có thể bổ sung thêm đường saccharose. Sau khi lên men, toàn bộ đường bị thủy
phân thành đường khử. Rượu vang còn nhiều đường khử, đặc biệt khi hàm lượng
ethanol thấp dễ bị vi khuẩn kỵ khí và hiếu khí phân giải đường, chuyển thành acid
lactic, giấm làm rượu bị mất mùi vị. Acid là một thành phần quan trọng của rượu
vang, hàm lượng acid tổng số 4-5 g/L, pH khoảng 2,9-3,9. Acid hữu cơ có tác
dụng ngăn cản hoạt động của các vi khuẩn làm hỏng rượu như acid tatric, malic,
citric, oxalic,… Mặt khác, một số acid nếu hiện diện với hàm lượng cao trong
rượu sẽ làm thay đổi mùi vị của rượu như acid acetic, formic, propionic,
butyric,…. Tro và các chất muối có nhiều trong rượu vang quả, phổ biến nhất là
P, S, K, Na, Ca, Mg, Si, Fe, Mn, Fl2,Cl2, Br2, I2, Al,…. Mặc dù hiện diện với
lượng rất thấp, nhưng có tác dụng làm tăng hương vị của rượu, tăng giá trị dinh
dưỡng. Chất tạo hương thơm trong nguyên liệu trái cây thường bị phân hủy, tuy
nhiên, nấm men có khả năng sinh ra một số chất có mùi thơm đặc trưng cho từng
loại trái cây. Rượu vang giàu vitamin nhờ vào quá trình lên men điều chỉnh lại
thành phần vitamin của trái, một phần vitamin có được là do nấm men tổng hợp.
Polyphenol là hợp chất phức tạp có trong trái, gồm nhiều chất khác nhau như acid
benzoic, acid cyamic, flavol làm cho rượu có màu hồng, anthocyan tạo màu đỏ
cho rượu, tạo vị chát và có khả năng ức chế các loại vi khuẩn có hại phát triển.

2.1.2 Nguyên liệu làm rượu vang
Nguyên liệu để làm rượu vang đầu tiên là trái nho. Chất lượng rượu vang
chịu ảnh hưởng trực tiếp bởi chất lượng nho, nhiều giống nho quý đang được
trồng và nhiều quốc gia đã sản xuất hàng nghìn loại rượu vang có hương, vị khác
nhau mang những nét đặc trưng riêng của từng quốc gia, từng khu vực thậm chí
từng hãng sản xuất. Với nhu cầu rượu vang tăng nhanh, nhiều nguyên liệu làm
rượu vang ngày càng đã và đang được mở rộng. Một số loại quả có đường khác
như dâu, mơ, điều, sherry, táo, lê, dứa, vải thiều, chuối, mận ... được nghiên cứu
làm nguyên liệu để sản xuất rượu vang và được thị trường chấp nhận (Lê Văn
Nhượng và Nguyễn Văn Cách, 2009).
Theo Vũ Công Hậu (2004), nguyên liệu là một yếu tố rất quan trọng trong
sản xuất rượu vang. Các tiêu chuẩn chọn trái cây dùng trong chế biến rượu vang
cần có hàm lượng đường tổng số trong nước trái cao, độ Brix phải từ 20 - 22, đối
với trái có độ Brix thấp cần điều chỉnh bằng cách bổ sung thêm đường. Hàm
lượng acid hữu cơ tương đối cao, pH thấp (2,8 - 3,8). Thành phần của nước quả
5


thích hợp với hoạt động của nấm men với một lượng tối thiểu các chất sau: acid
amin, vitamin, muối khoáng thực hiện vai trò xúc tác với một lượng rất nhỏ,
polyphenol - tanin làm cho rượu có màu sắc hấp dẫn và đóng góp vào việc ức chế
hoạt động của vi khuẩn có hại.
2.1.3 Hệ vi sinh vật trong lên men rượu vang
Hiện nay trên thế giới người ta sản xuất rượu vang theo hai phương pháp:
lên men bằng vi sinh vật tự nhiên và lên men bằng vi sinh vật thuần chủng.
2.1.3.1 Lên men rượu vang bằng vi sinh vật tự nhiên
Ở những nước có nghề sản xuất rượu vang truyền thống sử dụng vi sinh vật
tự nhiên có ở trái nho. Việc sử dụng vi sinh vật tự nhiên để sản xuất rượu vang có
ưu điểm là không cần giống vi sinh vật thuần chủng, do đó không đòi hỏi kỹ thuật
cao, không cần đầu tư quá nhiều cho quá trình sản xuất. Sản phẩm khá khác biệt

vì quá trình tích lũy hương cho sản phẩm không chỉ lấy từ nguồn trái cây mà còn
được tạo ra bởi nấm men vi sinh vật tự nhiên trên trái nho và theo vào quá trình
lên men.
Bên cạnh những ưu điểm thì việc sử dụng vi sinh vật tự nhiên cũng có
những bất lợi là chất lượng sản phẩm thường không ổn định vì không kiểm soát
được chất lượng giống vi sinh vật ban đầu cho quá trình lên men. Trên thế giới,
những cơ sở sản xuất rượu vang hay ở quy mô gia đình có truyền thống sản xuất
rượu vang nổi tiếng vẫn sử dụng vi sinh vật tự nhiên để thực hiện quá trình lên
men. Tuy nhiên, chất lượng sản phẩm của phụ thuộc rất nhiều vào kinh nghiệm
khi lựa chọn nguyên liệu, phối trộn nguyên liệu. Những nghiên cứu của các nhà
khoa học cho thấy, hệ vi sinh vật tự nhiên trong sản xuất theo phương pháp này
có 76 - 90% là nấm sợi, 9 - 22% là nấm men, số còn lại là xạ khuẩn và ít vi
khuẩn. Dịch nước nho có pH thấp từ 2,7 - 3,8 thường không thích hợp cho vi
khuẩn phát triển. Đây là điều rất thuận lợi cho việc sử dụng vi sinh vật tự nhiên
trong sản xuất (Nguyễn Đức Lượng, 2002).
2.1.3.2 Lên men rượu vang bằng vi sinh vật thuần chủng
Công đoạn quan trọng nhất trong sản xuất rượu vang là quá trình lên men.
Quá trình lên men được chia làm hai giai đoạn là giai đoạn lên men chính và giai
đoạn lên men phụ. Cả hai giai đoạn lên men này, vi sinh vật đóng vai trò quan
trọng nhất là nấm men. Nấm men tham gia chủ yếu vào quá trình lên men trước

6


tiên là phải tạo thành ethanol. Như vậy, yêu cầu của quá trình lên men trước tiên
là phải tạo được ethanol từ đường, kế đó là tạo hương và lắng trong.
Sản phẩm rượu vang là sản phẩm lên men không qua chưng cất, do đó yêu
cầu về độ trong rất quan trọng. Về lý thuyết, vi sinh vật sử dụng trong quá trình
lên men rượu vang giống như trong quá trình lên men bia (bao gồm lên men cồn,
khả năng lắng nhanh, chịu nhiệt độ thấp), còn phải có khả năng tạo hương

(Nguyễn Đức Lượng, 2002).
2.1.3.3 Các vi sinh vật ảnh hưởng đến chất lượng rượu vang
Dịch đường lên men không chỉ là môi trường dinh dưỡng tốt cho nấm men
mà còn cho các vi sinh vật khác. Trong nước, không khí, nguồn nguyên liệu tham
gia vào thành phần môi trường luôn có một lượng vi sinh vật gây hại cho quá
trình lên men rượu. Các vi sinh vật lẫn vào dịch đường sẽ chuyển hóa đường
thành các sản phẩm khác làm giảm hiệu suất lên men và chất lượng của rượu
(Bảng 2.2) (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2007).
Bảng 2.2. Một số vi sinh vật làm hỏng và giảm chất lượng rượu
Vi sinh vật

Hiệu ứng gây hư hỏng

Nấm men nội sinh

Tạo ra nhiều ethyl acetate (200 mg/L) và methylbutyl
acetate.
Tạo màng trên bề mặt và làm hỏng hương vị

Nấm men
bên ngoài

Zygosaccharomyces bailii

Gây đục rượu và mất hương vị

Brettanomyces spp.

Gây đục rượu, làm rượu có mùi acid và mùi hôi khó
chịu

Sinh khí CO2 nên có thể gây nổ chai vang

Schizosaccharide pombe

Gây đục rượu trong quá trình trữ rượu

Saccharomyces cerevisiae

Tái lên men đường còn sót lại

Vi khuẩn acetic

Tạo mùi giấm

Gluconobacter oxydans

Sinh ra khí ester và acid

Acetobacter acetic
Vi khuẩn

Làm quánh nhớt trong rượu vang

Acetobacter pasteurianus
Vi khuẩn lactic

Gây mùi hồi, làm quánh nhớt trong rượu, tạo vị
mannitol và vị đắng, sinh diacetyl và phân hủy acid
tartaric

7


Vi sinh vật

Hiệu ứng gây hư hỏng

Clostridium spp.

Tạo mùi acid n-butyric

Bacillus spp.

Phát triển trong rượu vang và sinh acid

Actinomyces spp.

Tạo mùi đất ẩm

Streptomyces spp.
Bactiariophages

Ngăn cản lên men malolactic

Tạo mùi đất ẩm (do nấm mốc phát triển trong thùng
Nấm mốc
gỗ đựng rượu hoặc nút chai vang (nút gỗ)) trong quá
trình trữ rượu.
(Nguồn: Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2007)

2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
2.1.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nấm men thông thường rất nhạy cảm với nhiệt độ cao, ở 36oC nấm men bắt
đầu bị ức chế. Trong môi trường lỏng, ở nhiệt độ 40-50oC, nấm men hầu như
ngưng hoạt động và chết sau 1 giờ 30 phút; ở nhiệt độ 60-65oC, nấm men sẽ chết
sau 5 phút. Trong môi trường khô (W=13%), nấm men chịu nhiệt tốt hơn, có thể
chịu đến 85-105oC. Nhiệt độ càng cao, sự lên men càng hạn chế, hàm lượng
ethanol càng thấp, lượng đường còn lại trong rượu càng nhiều, nồng độ đường
cao có thể gây ra sự ngừng quá trình lên men (Bùi Ái, 2003). Nhiệt độ tối ưu cho
nấm men rượu vang phát triển là 25-28oC (Casellas, 2005). Khi quá trình lên men
diễn ra ở nhiệt độ thấp sẽ kéo dài thời gian hơn, nhưng lên men ở nhiệt độ cao
quá sẽ ảnh hưởng đến mùi vị của sản phẩm, hoạt tính của nấm men bị giảm mạnh,
dễ bị nhiễm lactic và nấm men hoang dại. Ngoài ra, khi lên men ở nhiệt độ cao, sẽ
tạo nhiều ester aldehyde và tổn thất rượu theo CO2 tăng (Nguyễn Đình Thưởng và
Nguyễn Thanh Hằng, 2007)
2.1.4.2 Ảnh hưởng của pH
Nấm men có thể phát triển trong môi trường có pH=2,0-8,0 nhưng trong
điều kiện lên men rượu, pH thích hợp để nấm men phát triển hoạt động chuyển
hóa đường thành ethanol là 4,0-4,5; vi khuẩn bắt đầu phát triển tốt ở pH=4,2 và
cao hơn. Vì vậy trong quá trình được thực hiện lên men giới hạn pH=3,8-4,0 để
ngăn ngừa hiện tượng nhiễm khuẩn. Tuy nhiên, trong thực tế có những loại vi
khuẩn thích nghi dần với pH thấp nên ngoài việc ứng dụng điều chỉnh pH thích
hợp, cần kết hợp sử dụng chất sát trùng. Khi pH=8,0 thì nấm men phát triển rất
kém, ngược lại vi khuẩn phát triển mạnh. Ở pH=3,8, nấm men phát triển mạnh thì
8


hầu như vi khuẩn ít phát triển. pH thích hợp cho sự phát triển và hoạt động của
nấm men không cố định, pH tùy thuộc vào nhiều yếu tố như chủng nấm men,
thành phần môi trường lên men, điều kiện lên men,… Để tạo pH thích hợp trong

môi trường nuôi cấy nấm men (kể cả lên men) có thể bổ sung vào môi trường bất
cứ một loại acid nào, miễn là anion của acid không gây ảnh hưởng đến hoạt động
của nấm men (Nguyễn Công Hà, 2000).
2.1.4.3 Ảnh hưởng của oxy
Hầu hết các chủng nấm men trong lên men rượu vang là vi sinh vật kỵ khí
không bắt buộc. Khi trong môi trường đủ lượng oxy, hoạt động sinh sản của nấm
men mạnh mẽ hơn, vì vậy lượng sinh khối tăng lên nhanh và trở thành sản phẩm
chủ yếu trong môi trường lên men. Còn trong trường hợp thiếu oxy (kỵ khí), nấm
men sử dụng phần oxy hòa tan trong môi trường để sinh trưởng và lên men, tạo ra
sản phẩm chủ yếu là ethanol. Trong quá trình lên men, ở giai đoạn đầu nấm men
cần lượng oxy cao nhất để đáp ứng nhu cầu sinh sản, phát triển tăng sinh khối.
Nếu có giai đoạn nhân giống thì cũng cần phải cung cấp oxy bằng cách lắc hoặc
sục khí (Lương Đức Phẩm, 1998).
2.1.4.4 Ảnh hưởng của nồng độ dịch đường
Đường là cơ chất của quá trình lên men nên ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất
lên men. Nồng độ đường thích hợp để lên men rượu khoảng 22-25 oBrix. Khi
nồng độ dịch đường quá cao, tế bào nấm men sẽ bị co nguyên sinh và chết, làm
hiệu suất lên men rượu thấp. Nếu nồng độ đường thấp cũng sẽ làm giảm năng
suất lên men, mất nhiều thời gian (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng,
2007). Trong dịch quả tự nhiên thường có hàm lượng đường không giống nhau do
đó cần bổ sung thêm đường saccharose. Phần lớn các loại nấm men hoạt động
bình thường trong môi trường có hàm lượng đường dưới 20%. Một số chủng nấm
men hoạt động ở môi trường có độ đường cao hơn. Khi nhân giống thường dùng
môi trường có đường thấp dưới 10% (Lương Đức Phẩm, 1998).
2.1.4.5 Ảnh hưởng của mật số tế bào nấm men
Số lượng tế bào nấm men cho vào dịch lên men có ảnh hưởng đến quá trình
lên men. Nếu số lượng tế bào nấm men cho vào thích hợp thì quá trình lên men
diễn ra tốt, hiệu suất thu hồi cao và chất lượng sản phẩm tốt hơn. Ngược lại,
lượng nấm men cho vào ít thì tốc độ lên men chậm, sinh khối tế bào nấm men
thấp tạo điều kiện cho nấm men phát triển, hạn chế quá trình lên men kỵ khí. Nếu

số lượng nhiều thì môi trường dịch men không đủ cho nấm men phát triển, sản
9


phẩm sinh ra mùi lạ, đồng thời gây lãng phí nấm men giống (Nguyễn Công Hà,
2000).
2.1.4.6 Ảnh hưởng của thời gian lên men
Thời gian lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhiệt độ, nồng độ dịch
đường lên men, chủng nấm men. Quá trình lên men bao gồm lên men chính và
lên men phụ. Thời gian lên men tính từ lúc cấy men giống vào môi trường lên
men. Sự lên men thật sự kết thúc khi nấm men hết khả năng chuyển hóa đường
thành rượu và CO2. Ở nhiệt độ trung bình từ 25-28oC nếu pH khác nhau thì thời
gian lên men khác nhau, nhiệt độ này thích hợp cho nấm men phát triển, thời gian
lên men kéo dài từ 15-20 ngày. Ở nhiệt độ cao 40-50oC, quá trình lên men bị
dừng, tế bào nấm men chết dần (Trần Minh Tâm, 2000).
2.1.4.7 Ảnh hưởng của ánh sáng
Ánh sáng là yếu tố ức chế hoạt động của nấm men. Đặc biệt các tia cực tím
trong ánh sáng giết chết tế bào nấm men, vì vậy quá trình lên men có sựu phụ
thuộc vào thời tiết của từng mùa.
2.1.4.8 Ảnh hưởng của acid hữu cơ
Nấm men rượu vang có thể bảo vệ được hoạt tính ở 10-20 g/L acid tự do
(acid tartric, acid malic, acid citric,…). Chúng có thể hoạt động tốt trong môi
trường có 8-10 g/L acid (vi khuẩn bị ức chế). Hoạt động của vi khuẩn acetic có
ảnh hưởng lớn đến quá trình lên men rượu vang, pH<2,6 thì vi khuẩn acetic
không phát triển được, pH từ 3,5-4,5 là tối ưu cho vi khuẩn acetic. Các vi khuẩn
khác có pH tối ưu là 7,0. Vì vậy, môi trường dịch quả càng chua thì càng hạn chế
hoạt động của nhiều vi khuẩn.
2.1.4.9 Ảnh hưởng của hàm lượng ethanol
Sản phẩm chủ yếu của quá trình lên men kỵ khí là ethanol. Ethanol ức chế
hoạt động sống của tế bào nấm men, tuy nhiên các chủng khác nhau thì có mức

độ ức chế khác nhau. Khả năng chịu đựng ethanol của nấm mốc và vi khuẩn thì
kém hơn nấm men. Mặc dù ethanol là sản phẩm chính của lên men rượu từ
đường, nhưng ở một nồng độ nào đó thì ethanol sẽ ức chế quá trình lên men
(Casey và Inglede, 1986). Trong quá trình lên men còn có các sản phẩm phụ như
acid hữu cơ, aldehyde, acid octanoic và decanoic. Các sản phẩm phụ này sẽ kết
hợp với ethanol do nấm men sản xuất gây ức chế sự phát triển của nấm men.

10


Ethanol cũng gây ức chế và làm biến tính enzyme glycolytic, ức chế glucose,
maltose, amonium và sự vận chuyển amino acid (Navarro và Finck, 1982).
2.1.4.10 Ảnh hưởng của CO2
Hàm lượng CO2 hình thành trong quá trình lên men thường gây hạn chế sự
sinh sản của nấm men rượu vang. Theo nghiên cứu của Miuler Thaurrau, khi hàm
lượng CO2 trong rượu vang đạt đến 0,25% trọng lượng thì nấm men sinh sản
chậm, khi hàm lượng CO2 trong rượu vang đạt đến 1,5% trọng lượng thì nấm men
không sinh sản được nữa. Với hàm lượng như trên, ở nhiệt độ 15ºC, áp suất 7,7
atm nấm men vẫn hoạt động tốt và tiếp tục lên men kỵ khí.
2.1.5 Rượu vang đối với sức khỏe con người
Rượu vang là loại thức uống duy nhất có chứa cả ethanol và chất kháng oxy
hoá. Sự cùng tồn tại của ethanol và chất kháng oxy hóa trong rượu vang có tác
dụng quan trọng đối với sức khỏe của con người. Không giống như nhiều hệ
thống khác, các chất kháng oxy hoá trong rượu vang được bảo vệ khi được đưa
vào cơ thể bằng những quá trình giống nhau mà cơ thể người sử dụng để giải độc
ethanol. Trong gan và một số cơ quan khác, NAD+ và acohol dehydrogenase
(ADH) chuyển ethanol thành acetaldehyde và aldehyde dehydrogenase, sau đó
chuyển acetaldehyde thành acetate, tạo sản phẩm là NADH (Bullock, 1990).
NADH sau đó có thể phục hồi các chất kháng oxy hoá đã qua sử dụng bằng cách
phân hủy chúng, tái tạo lại NAD+, do đó cần giải độc nhiều ethanol hơn. Hầu hết

các loại rượu vang có chứa khoảng 12% ethanol (v/v), một lượng tương đương
chất kháng oxy hóa được tạo ra trong quá trình giải độc ethanol.
Theo Bruce et al., (1999) cho rằng những vấn đề liên quan đến sức khoẻ của
sự tồn tại cả chất kháng oxy hóa và ethanol trong rượu là: thứ nhất các chất kháng
oxy hoá được phục hồi , giảm đi sự hình thành các chất oxy hóa, do đó ngăn ngừa
các quá trình oxy hóa và phá hủy các mô; thứ hai chất kháng oxy hoá có trong
trạng thái phân hủy của chúng; thứ ba nồng độ NADH quá mức, được tạo ra bởi
quá trình giải độc ethanol sẽ được hạ xuống do đó giảm đi quá trình phân hủy của
các hệ thống khác. Đây là những đặc tính duy nhất của rượu vang mà ở những đồ
uống khác không có.
2.2 Nấm men
Thuật ngữ nấm men (yeast) là tên chung để chỉ nhóm vi nấm thường có cấu
tạo đơn bào và thường sinh sôi nảy nở bằng phương pháp nẩy chồi (budding).
11


Nấm men được định nghĩa là những loại nấm có cấu tạo đơn bào, sinh sản vô tính
bằng cách nảy chồi. Nấm men có thể được tìm thấy ở nhiều môi trường khác
nhau như nước, không khí, đất, .... Nấm men thường có khả năng phát triển ở pH
thấp và hoạt động trong môi trường nước để giảm hoặc ức chế sự phát triển của vi
khuẩn (Kurtzman et al., 2011).
2.2.1 Đặc điểm của nấm men
2.2.1.1 Hình dạng và kích thước
Về hình dạng: nấm men có rất nhiều hình dạng khác nhau như hình cầu,
hình trứng, hình oval, hình thoi, hình bầu dục, hình elip, hình ống, hình elip dài,
… (Nguyễn Lân Dũng và ctv., 2008). Chẳng hạn như S. cerevisiae có hình tròn,
hình trứng, S. ellipdoideus có hình elip, S. apicultus có hình quả chanh, hoặc S.
ludwigii có hình chai hay Pichia có hình ống dài. Hình dạng tế bào nấm men có
thể thay đổi, phụ thuộc vào tuổi tế bào, điều kiện môi trường, điều kiện nuôi cấy.
Một số loài không chỉ nảy chồi mà các tế bào nối lại với nhau tạo thành khuẩn ty

giả như Candida albicans và hình thành khuẩn ty thật như Eremothecium
gossypii (Kurtzman và Piškur, 2006).
Về kích thước: nấm men có nhiều hình dạng khác nhau nên kích thước nấm
men cũng khác nhau tùy thuộc vào giai đoạn phát triển và điều kiện nuôi cấy.
Theo Nguyễn Lân Dũng (1999), kích thước chiều dài trung bình của nấm men
giao động từ 4,5-21µm, kích thước chiều rộng trung bình của nấm men giao động
từ 2,5-10µm, chẳng hạn như Saccharomyces có kích thước khoảng 6-8µm x 56µm (Cao Ngọc Điệp, 2005).
2.2.1.2 Cấu tạo của tế bào nấm men
Tế bào nấm men có cấu tạo gồm: thành tế bào, màng tế bào chất, tế bào chất
và nhân tế bào (Hình 2.1).
M : Ty thể
N : Nhân
P : Peroxisome
V : Không bào
: Chồi non
: Lưới nội chất
Hình 2.1: Các bào quan của tế bào nấm men Candida boidiniicell
dưới kính hiển vi điện tử sau khi được nhuộm KMnO4
(Nguồn: Van der Klei và Veenhuis, 2007)

12


Thành tế bào dày khoảng 25 nm (chiếm 25% khối lượng khô) được cấu tạo
từ nhiều thành phần khác nhau. Lớp ngoài cùng là lipoprotein, lớp giữa được cấu
tạo từ mannoprotein, lớp trong cùng chủ yếu là glucan (60% trọng lượng tế bào).
Ngoài ra, còn một số ít thành phần phụ như kitin, volutin (Nguyễn Lân Dũng,
1999). Màng tế bào chất dày khoảng 7-8µm, được cấu tạo chủ yếu là protein,
chiếm 50% trọng lượng khô, còn lại là lipid chiếm 40% và polysaccharide
(Nguyễn Lân Dũng, 1999). Tế bào chất ở thể keo, có độ nhớt cao, có cấu trúc

không đầu nhất, chứa tất cả các cấu trúc cơ bản của tế bào như không bào, ty thể,
ribosome, mạng nội chất, các chất dự trữ và các thể vùi của hợp chất lipid và
hydratcarbon tự nhiên trong nội bào. Không bào chứa đầy dịch tế bào, bên ngoài
được bao bọc bởi một lớp màng không bào (tonoplaste). Hình dạng không bào có
thể thay đổi tùy theo tuổi và trạng thái sinh lý của tế bào. Không bào là nơi chứa
đựng các protease. Ty thể có vai trò cung cấp năng lượng cho tế bào hoạt động.
Cấu tạo của ty thể được chia thành 2 màng, màng ngoài chia thành 3 lớp, màng
trong có vách cũng chia thành 3 lớp. Khoảng cách giữa các lớp là nơi xảy ra
những phản ứng tạo ATP. Lưới nội chất bao gồm hàng dãy màng kép có gai cong
dày. Một số màng có kết hợp với ribosome. Mạng lưới này còn được gọi là thể
golgi hay bộ máy golgi. Mặc dù mạng lưới nội chất của nấm men cũng như ở các
vi sinh vật khác, có tham gia vào các hoạt động của tế bào, nhưng mối quan hệ
giữa mạng lưới này với các cơ quan nội bào khác vẫn chưa được biết rõ ràng.
Ribosome tham gia mọi quá trình tổng hợp các chất trong cơ thể và tồn tại hai
loại: loại 80S (gồm hạt 60S + 40S) tồn tại tự do; loại 70S (gồm 50S + 40S) liên
kết với cấu trúc màng. Loại này thể hiện khả năng tổng hợp mạnh. Volutin
thường thấy trong không bào. Nó không phải là thành phần cấu trúc của tế bào,
chỉ thấy xuất hiện ở điều kiện đặc biệt khi nuôi cấy trên môi trường giàu hydrate
carbon và phosphate vô cơ. Số lượng volutin còn phụ thuộc vào tỷ lệ C và N, sự
có mặt của S, vitamin và pH trong môi trường. Nhân tế bào là nhân thật, có sự
phân hóa, kết cấu hoàn chỉnh và ổn định, chứa DNA và RNA. Nhân được bao bọc
bởi một lớp màng (Hình 2.1), bên trong là lớp dịch nhân, bên trong là hạch nhân
hay nhân con, nhân nấm men có chứa protein và acid nucleic (Lương Đức Phẩm,
1998).
2.2.2 Đặc điểm nuôi cấy
Trong quá trình nuôi cấy, điều kiện dinh dưỡng đầy đủ, tế bào nấm men
tăng nhanh về kích thước và đồng thời sinh khối được tích lũy nhiều. Các nấm
men sinh sản bằng phương pháp nhân đôi thường cho một lượng sinh khối rất lớn
13

sau một thời gian ngắn. Để xác định số lượng tế bào nấm men phát triển theo thời
gian, hiện nay người ta dùng nhiều phương pháp khác nhau như xác định số
lượng tế bào bằng phương pháp đếm trực tiếp trên kính hiển vi hay gián tiếp trên
mặt thạch (phương pháp đếm sống), đo độ đục của tế bào trong dung dịch nuôi
cấy trên cơ sở xây dựng một đồ thị chuẩn của mật độ tế bào.

Hình 2.2: Đường cong sinh trưởng của vi sinh vật trong môi trường
I: giai đoạn tiềm phát; II: giai đoạn logarit; III: giai đoạn ổn định; IV: giai đoạn suy vong
(Nguồn: Lương Đức Phẩm, 2009)

Quá trình sinh trưởng của nấm men trong dịch lên men tĩnh chia làm 4 giai
đoạn (Hình 2.2). Ở giai đoạn tiềm phát, nấm men mới được cấy vào môi trường,
sinh khối tăng chưa nhiều nên vận tốc sinh trưởng coi như bằng không. Bước vào
giai đoạn logarit, nấm men phát triển rất nhanh, sinh khối tăng ào ạt, kèm theo sự
thay đổi mạnh mẽ của dịch lên men. Đến giai đoạn ổn định, số lượng tế bào nấm
men không tăng nữa, mật độ quần thể là tối đa, có nghĩa là số lượng tế bào sinh ra
bằng số lượng tế bào chết. Ở giai đoạn suy vong, tế bào chết tăng dần, tế bào sống
giảm dần, già đi, kích thước nhỏ lại và biến dạng (Lương Đức Phẩm, 2009).
Việc nuôi cấy nấm trên môi trường đặc hiệu khiến chúng hình thành toàn bộ
cấu trúc, hình thái đặc trưng là biện pháp hữu hiệu cho việc phân loại nấm
(Guarro, 1999). Bên cạnh đó, phương pháp sinh học phân tử phân loại sinh vật
bằng phân loại đặc điểm gen ở mức độ phân tử, tức là phân loại bằng các dẫn liệu
so sánh hóa sinh các phân tử lớn như protein, DNA (deoxyribonucleic acid),
RNA (ribonucleic acid) (Nguyễn Anh Diệp và ctv., 2007). Nhiều nghiên cứu đã
dùng trình tự đoạn gen rRNA để xác định các loài nấm khác nhau như các loài
của Aspergillus (Henry et al., 2000), các loài của Canida, Saccharomyces
cerevsiae, Geotrichium candidum, Trichophyton beherendi và Cryptococus
neoformans (Korabecna, 2007) và các loài nấm hoại sinh gỗ (Prwitt et al., 2008).
14

2.2.3 Đặc tính lên men
Sự phân giải hydratcarbon trong điều kiện kỵ khí được gọi là quá trình lên
men. Lên men là quá trình oxy hoá khử cơ chất mà kết quả là một phần cơ chất bị
khử còn một phần khác thì bị oxy hoá. Sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men
ngoài CO2 còn có cả những hợp chất carbon chưa được oxy hoá hoàn toàn (như
rượu, acid hữu cơ, keton, aldehyde) (Nguyễn Lân Dũng, 1999). Căn cứ vào
những sản phẩm chủ yếu hoặc đặc trưng được hình thành trong môi trường mà
người ta chia ra các hình thức lên men: lên men ethanol, lên men lactic, lên men
propanol, lên men acid formic, lên men butanol, lên men acetic, lên men tạo
thành metan,… (Nguyễn Thành Đạt, 1986).
Nấm men được ứng dụng từ khoa học, thực phẩm, y tế đến công nghiệp. Đồ
uống lên men và thực phẩm được sản xuất thông qua các hoạt động của nấm men
đã sớm đóng góp nổi bật cho sự tiến bộ trên toàn thế giới và phát triển bền vững
của xã hội loài người (Legras et al., 2007, Ulber và Soyez, 2004). Các nhà khảo
cổ đã tìm thấy bằng chứng rằng đồ uống lên men được sản xuất bởi nấm men
được tiêu thụ trong thời kỳ đồ đá mới (8500 - 4000 năm trước công nguyên) tại
Trung Quốc, Iran, Ai Cập và các khu vực khác của thế giới (Cavalieri et al.,
2003; Mc. Govern 2003; Mc. Govern et al., 1997 và 2004; Ulber và Soyez,
2004). Đặc biệt, trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm việc ứng dụng nấm men
trong công nghiệp truyền thống có vai trò chính trong nhiều quá trình lên men
thực phẩm như bia, rượu vang, rượu sake, rượu chưng cất, bánh mì, pho mát và
các thực phẩm lên men khác. Mặt khác, nấm men còn được ứng dụng để sản xuất
nhiên liệu ethanol, protein đơn bào, thức ăn gia súc, các enzym công nghiệp và
các chất chuyển hoá có khối lượng phân tử nhỏ. Một số sản phẩm ứng dụng của
từng chủng nấm men cụ thể được liệt kê trong Bảng 2.3 (Jacobson và Jolly,
1989).
Bảng 2.3. Sự hiện diện và ứng dụng của nấm men trong một số thực phẩm,
thức uống có cồn và sản phẩm lên men

Sản phẩm, ứng dụng

Nấm men

Rượu, bia

Saccharomyces cerevisiae

Bánh mì và bột nhão bánh mì

S. cerevisiae, S. exiguus, S. rosei

D-Arabitol (chất làm ngọt)

Candida diddensiae

Chất tạo nhũ tương

C. lipolytica

15


Sản phẩm, ứng dụng

Nấm men

Thức ăn gia cầm và cá

Phaffia rhodozyma

Lactose và sữa lên men

C. pseudotropicalis, Kluyveromyces fragilis, K.
lactis

Lên men bia lager

S. carlsbergensis

Mannitol (chất hút ẩm)

Torulopsis manitofaciens

Shoyu, Miso

Zygosaccharomyces rouxii

Lên men rượu vang

S. cerevisiae

Xylitol (chất làm ngọt)

T. candida

Lên men D-xylose

C. shehatae, Pachysolen tannophilus, Pichia
stipitis, Pichia segobiensis

(Nguồn: Jacobson và Jolly, 1989)

Lên men rượu là một quá trình sinh hoá phức tạp, đòi hỏi có sự tham gia của
nấm men hoặc một số vi sinh vật khác. Trong quá trình lên men rượu, đường
được biến đổi thành ethanol và CO2 (Hình 2.3). Quá trình lên men rượu kèm theo
sự hình thành các sản phẩm đồng thời giải phóng ra năng lượng (Nguyễn Thành
Đạt, 1986). Phương trình tóm tắt quá trình lên men:
C6H12O6

2C2H5OH + 2CO2 + 113,4 KJ

Quá trình lên men ethanol diễn ra khá phức tạp gồm 13 giai đoạn (giai đoạn
quá trình đường phân và quá trình chuyển pyruvate thành ethanol), mỗi giai đoạn
được đặc trưng bằng một phản ứng hoá sinh với một enzyme xúc tác (Hình 2.3).
Tốc độ của quá trình lên men có thể quan sát được bằng cách theo dõi sự thay đổi
của hàm lượng đường trong dịch lên men, quan sát bằng cách theo dõi sự thay đổi
lượng rượu và CO2 tạo thành cũng như sự thay đổi trị số của dịch lên men. Quá
trình lên men chia thành 3 thời kỳ chính. Thời kỳ đầu khoảng 60 giờ kể từ khi cho
nấm men tiếp xúc với dịch lên men, thời kỳ này sự lên men xảy ra chậm, đường
lên men không đáng kể. Thời kỳ thứ hai: thời kỳ lên men chính, thời kỳ này
chiếm khoảng 60 -120 giờ sau thời kỳ đầu. Sự phát triển của nấm men và sự lên
men sau mỗi giờ tăng nhanh đáng kể và đạt đến trị số cực đại. Đây là thời kỳ biến
đổi sâu sắc các thành phần của dịch lên men. Ở điều kiện lên men bình thường,
mỗi giờ nồng độ đường trong dịch lên men sẽ giảm đi khoảng 1oBrix tùy theo loại
16