Khả năng sử dụng nấm men cố định để lên men ethanol

Khả năng sử dụng nấm men cố định để lên men

ethanol

ThS. TRẦN THỊ TƯỞNG AN
KS. NGÔ LÊ HỒNG DUYÊN
Bioethanol có thể được sản xuất bằng cách lên men đường từ các vật liệu
nông nghiệp thải khác nhau. Bất kỳ hệ thống sản xuất ethanol sinh học nào
được chọn, phải chú ý đến tổng thể kinh tế và tiêu thụ năng lượng. Mục đích của
nghiên cứu này là khảo sát khả năng cố định Sacharomyces cerevisiae để sản
xuất ethanol sinh học từ vỏ ca cao. Với mục đích này, các polyme tương thích
sinh học như polyvinil (PVA), alginate được sử dụng bổ sung vào dung dịch
CaCl2 và H3BO3 để cố định nấm men. Để xác định hiệu suất cố định các nồng
độ chất mang và dung dịch được khảo sát. Nồng độ tốt để hạt gel có cấu trúc
ổn định, tế bào được cố định vẫn có thể trao đổi chất tốt là nồng độ PVA 12%
và acid boric 7% cho hiệu suất cố định lớn nhất ở cả hai loại tế bào nấm men
Saccharomyces cerevisia đạt 98%. Đây là nồng độ PVA và acid boric thích hợp để
cố định tế bào. Chất mang PVA có các đặc tính cơ lý và khả năng chịu đựng tốt.

Từ khóa: alginate, bioethanol, cố định, Sacharomyces cerevisiae, PVA.

1. Đặt vấn đề
Như chúng ta đã biết, nền kinh tế thế giới
hiện nay và trong tương lai phụ thuộc rất nhiều
vào nhiên liệu hóa thạch, mặc dù nguồn tài
nguyên này trong đó có dầu thô là tác nhân gây
ô nhiễm môi trường rất lớn và được báo động
là đang đi vào giai đoạn cạn kiệt như một sự
tất yếu khi tài nguyên tự nhiên hữu hạn bị khai
thác tối đa. Cần phải bảo vệ môi trường sống
trên trái đất được trong sạch dài lâu cũng như

cần phát triển kinh tế với một tốc độ cao và trên
quy mô rộng làm cho an ninh năng lượng toàn
cầu ngày càng bị đe dọa nghiêm trọng. Do đó,
nhiệm vụ tìm kiếm nguồn thay thế cho nhiên
liệu hóa thạch đã được đặt ra trong gần nửa thế
kỷ qua và ngày càng trở nên cấp thiết.
Bioethanol là nguồn nhiên liệu đầy hứa hẹn
trong tương lai thay thế cho nguồn nhiên liệu

hóa thạch, bởi nó là nguồn nhiên liệu có thể
tái tạo. Bioethanol thường được sản xuất bằng
nấm men tự do, tuy nhiên lên men bằng nấm
men tự do gặp một số vấn đề như thời gian lên
men dài, năng suất lên men thấp, tiêu tốn khá
nhiều năng lượng để tách nấm men sau quá
trình lên men. Để khắc phục, ta dùng phương
pháp cố định nấm men với nhiều ưu điểm như:
Tốc độ sử dụng glucose, tốc độ sinh tổng hợp
ethanol cao hơn dù diện tích bề mặt dùng để
vận chuyển chất dinh dưỡng nhỏ hơn, và khả
năng tái sử dụng nấm men cố định giúp giảm
thời gian nuôi cấy và thời gian lên men, ổn định
hoạt tính của nấm men.
Vỏ cacao là nguồn phế phẩm nông nghiệp
giàu lignocellulose nên có thể sử dụng để lên
men tạo bioethanol rất hiệu quả, tận dụng được
nguồn vỏ phế phẩm. Với sản lượng hằng năm

27
SỐ 02 NĂM 2019

KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT


TẠP CHÍ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VÀ MÔI TRƯỜNG

28

KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT
khoảng 1-2 tấn/ha, lượng vỏ thải ra là gánh nặng
rất lớn đối với môi trường. Bên cạnh đó, cây
cacao cho thu hoạch gần như quanh năm nên
nguồn cung nguyên liệu khá thuận lợi.
Trong báo cáo này trình bày quá trình thực
hiện để khảo sát lên men ethanol bằng phương
pháp cố định tế bào và ứng dụng nguồn nguyên
liệu phế phẩm nông nghiệp là vỏ trái cacao.
cứu

PVA và CaCl2 được bổ sung vào H3BO3. Tạo hạt
alginate có chứa nấm men, để tủ lạnh trong 2
tiếng để nấm men cố định bền chắc cấu trúc.
- Tiến hành khảo sát nồng độ alginate (1%,
2%, 3%, 4%): Giữ chất mang PVA nồng độ 12%,
tạo hạt trên dung dịch H3BO3 7% và CaCl2 2%.

2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên

- Tiến hành khảo sát khả năng cố định tế bào
nấm men ở nồng độ PVA (10%, 11%, 12%, 13%,

14%) và H3BO3 (5%, 6%, 7%, 8%, 9%) khác nhau.

2.1. Nguyên liệu

- Trước khi cố định: Kiểm tra mật độ tế bào
trong dịch nấm men ban đầu (môi trường SDB)

Vỏ ca cao: Thu gom từ các vùng trồng cacao
tại hợp tác xã Tiền Giang. Vỏ trái cacao vừa tách
hạt được đem rửa sạch, phơi dưới ánh nắng mặt
trời trong 1 ngày, sau đó được cắt ra thành các
mảnh nhỏ. Các mảnh nhỏ được sấy trong tủ sấy
ở nhiệt độ 70oC trong khoảng 3 ngày cho đến
khối lượng không đổi. Nguyên liệu sau khi sấy
được xay nhuyễn thành bột, bảo quản trong
hộp nhựa PE đóng kín, để ở nhiệt độ phòng.
Giống vi sinh vật được sử dụng:
Saccharomyces cerevisiae. Chủng này đã được
hoạt hóa và cấy truyền trên thạch nghiêng, bảo
quản ở 400C và được cấy truyền hai tuần một
lần để giữ giống.
Môi trường dinh dưỡng sử dụng trong
nghiên cứu: Môi trường nhân giống hoạt hóa
nấm men SBD (Saboiraud Dextrose Broth), môi
trường nuôi cấy nấm men SDA (Sabouraud
Dextrose Agar)
Hóa chất sử dụng để cố định nấm men:
Polyvinyl alcohol (PVA), Alginate, Acid boric
(H3BO3), Canxi clorua (CaCl2).
2.2. Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp bố trí thí nghiệm

Hình 1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Khảo sát nồng độ PVA và H3BO3 để cố định
tế bào S.cerevisiae
- Để tăng khả năng tạo hạt, tiến hành bổ
sung aliginate cùng tạo hạt với chất mang

Sau khi cố định: Kiểm tra mật độ tế bào
không được cố định và kiểm tra mật độ tế bào
sống trong hạt cố định bởi chất mang PVA và
H3BO3.
- Các nghiệm thức khảo sát khả năng cố
định tế bào nấm men ở các nồng độ PVA.
Bảng 1. Các nghiệm thức khảo sát khả
năng cố định tế bào của S.cerevisiae
PVA

10%

11%

12%

13%

14%

5%

NT1

NT2

NT3

NT4

NT5

6%

NT6

NT7

NT8

NT9

NT10

7%

NT11 NT12 NT13 NT14 NT15

8%

NT16 NT17 NT18 NT19 NT20

9%

NT21 NT22 NT23 NT24 NT25

H3BO3

Phương pháp Vi sinh
Phương pháp giữ giống nấm men: Tiến
hành cấy giống nấm men từ ống nghiệm gốc
sang ống môi trường thạch nghiêng SDA đã
chuẩn bị.
- Phương pháp nhân giống và hoạt hóa
giống nấm men nhằm tăng sinh khối, tăng hoạt
lực giống trước khi đưa vào lên men. Ở đề tài
này tiến hành nhân giống qua hai giai đoạn: Giai
đoạn 1 nấm men sau khi được tăng sinh trên
môi trường thạch nghiêng SDA. Khuẩn lạc được
cấy ria sang môi trường thạch đĩa. Chọn những
khuẩn lạc riêng rẽ thuần cấy vào ống nghiệm
chứa 10mL môi trường SDB. Nuôi ở 37oC trong
48 giờ. Giai đoạn 2 cho toàn bộ nấm men đã
nuôi giống ở giai đoạn 1 vào erlen có chứa
200mL môi trường SDB vô trùng, nuôi ở 37oC


trong 48 giờ. Tạo hạt alginate có chứa nấm men,
để tủ lạnh trong 2 tiếng để nấm men cố định
bền chắc cấu trúc. Dùng phương pháp đếm
khuẩn lạc xác định hiệu suất cố định tế bào.

3. Kết quả
Ảnh hưởng của nồng độ PVA: PVA có tính
đàn hồi và bền cơ học cao, khả năng cố định
tế bào tốt. Chất mang PVA có cấu trúc lỗ xốp
đặc trưng. Nhờ có cấu trúc đặc biệt mà PVA trở
thành chất mang hữu hiệu để cố định tế bào
vi sinh vật mà không làm cản trở đến quá trình
sinh trưởng và phát triển của các tế bào vi sinh
vật được cố định bên trong.

Hình 2: Hạt từ chất mang PVA-alginate cố định nấm men

Cố định lạnh đông hình thành gel với hệ
thống các lỗ xốp làm cho cơ chất và sản phẩm
phản ứng có thể thấm qua chất mang rất dễ
dàng. Tuy nhiên cố định tế bào vi sinh vật trong
điều kiện nhiệt độ thấp cũng ảnh hưởng ít
nhiều đến hoạt tính vi sinh vật.
Kết quả khảo sát mật độ tế bào được cố
định trên chất mang PVA - alginate.
Mật độ của S.cerevisia trong bình nhân
giống: 107,5 cfu/ml
v Saccharomyces cerevisia

bằng cách tạo cryogel. Acid boric (H3BO3) là
dung dịch hỗ trợ tạo hạt PVA, nồng độ acid boric
phụ thuộc vào tỷ lệ phần trăm của PVA được sử
dụng. Việc cố định tế bào phụ thuộc vào việc
tạo hạt gel, phụ thuộc vào nồng độ PVA và acid
boric, nếu nồng độ PVA và acid boric càng tăng

thì khả năng tạo hạt gel tăng, mật độ tế bào
được cố định càng cao nhờ hạt gel PVA khó bị
vỡ, có tính đàn hồi càng cao.
Nồng độ PVA 12% và acid boric 7% có hiệu
suất cố định tế bào nấm men Saccharomyces
cerevisia đạt 98%; nồng độ PVA 12% và acid
boric 5%, nồng độ PVA 13% và acid boric
7% có hiệu suất cố định tế bào nấm men
Saccharomyces cerevisia đạt 94%; nồng độ PVA
13% và acid boric 5% có hiệu suất cố định tế
bào nấm men Saccharomyces cerevisia đạt 94%.
Có thể thấy rằng nồng độ PVA càng cao thì
hiệu suất cố định tế bào càng tăng. Do nồng độ
PVA càng cao thì hạt càng chặt các lỗ xốp càng
nhỏ tế bào trôi ra càng ít. Chất mang PVA có các
đặc tính cơ lý và khả năng chịu đựng tốt hơn,
tuy nhiên nồng độ cồn sản phẩm thấp và hiệu
suất lên men không cao.
Từ những kết quả trên ta có nồng độ
PVA 12% và acid boric 7% cho hiệu suất cố
định lớn nhất ở cả hai loại tế bào nấm men
Saccharomyces cerevisia đạt 98%. Đây là nồng
độ PVA và acid boric thích hợp để cố định tế bào.
4. Kết luận
Khi khảo sát nồng độ PVA và nồng độ
acid boric để cố định nấm men Saccharomyces
ceresiviae đạt được mật độ tế bào cao nhất:
- Nồng độ chất tạo hạt PVA 12%
- Dung dịch tạo hạt acid boric 7,0% - CaCl2
2,0% là tối ưu cho quá trình cố định tế bào nấm

men./.
TÀI LIỆU THAM KHẢO

Hình 3: Hiệu suất cố định tế bào (%)

v Nhận xét:
Polyvinyl alcohol (PVA) sẽ cố định tế bào

1. Lê Văn Việt Mẫn, Bùi Thanh Huyền, Rượu lên men với
nồng độ glucose ban defferent bằng cách sử dụng nấm men cố định
trong gel alginate, Tạp chí phát triển KH & CN, tập 11, SO 12- 2008
2. Nguyễn Văn Phát (2013), Buớc đầu khảo sát tiền xử lý
và thủy phân vỏ cacao để làm nguyên liệu cho quá trình lên men
bioethanol bằng Saccharomyces cerevisiae, Khóa luận tốt nghiệp
đại học, Ðại học Cần Thơ, Việt Nam.
3. Kourkoutas, Y., Bekatorou, A., Banat, I.M., Koutionas,
A.A., Immobilization technologies and support materials suitable
in alcohol berverages production: a review, Food Microbiology,
Vol.21, 2004, 377 - 397.
4. Biofuel Production”, Industrial & Engineering Chemistry
Research, 48, 3713-3729.

29
SỐ 02 NĂM 2019

KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT