Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro trong nhân giống lan Phi điệp tím Hoà Bình (Dendrobium anosmum Lindley)

Công nghệ sinh học & Giống cây trồng

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO TRONG NHÂN GIỐNG LAN
PHI ĐIỆP TÍM HOÀ BÌNH (Dendrobium anosmum Lindley)
Đỗ Quỳnh Liên1, Đoàn Thị Thu Hương1, Nguyễn Văn Việt1, Vũ Tiến Hưng1
1

Trường Đại học Lâm nghiệp

TÓM TẮT
Phi điệp tím Hòa Bình (Dendrobium anosmum Lindley) là loài lan quý, có giá trị kinh tế cao, hoa mọc thành
từng chùm buông xuống với nhiều hoa nhỏ màu tím và có hương thơm dễ chịu. Nhân giống in vitro Phi điệp
tím Hòa Bình đã được nghiên cứu thành công. Kết quả chỉ ra, sát khuẩn bề mặt quả lan bằng ethanol 70% trong
2 phút, sau đó khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong 10 phút và nuôi cấy mẫu hạt trên môi trường dinh
dưỡng cơ bản MS, đã cho tỷ lệ mẫu sạch là 94,6%, tỷ lệ mẫu phát sinh thể chồi là 93,3% với thời gian phát sinh
chồi là 23 ngày. Cảm ứng tạo đa chồi trên môi trường bổ sung 0,8 mg/l BAP, 0,2 mg/l NAA, 0,5 mg/l Kinetin,
100 g/l khoai tây nghiền, 100 ml/l nước dừa, 30 g/l sucrose, 6,5 g/l agar cho tỷ lệ tạo cụm chồi là 96,8%, hệ số
nhân chồi là 13,7 lần. Chồi ra rễ 94,3%, số rễ trung bình 3,5 rễ/cây và chiều dài rễ trung bình 3,0 cm khi nuôi
trên môi trường MS bổ sung 0,2 mg/l IBA, 0,3 mg/l NAA, 100 g/l khoai tây nghiền, 20 g/l sucrose sau 5 tuần.
Khi cây có chiều cao lớn hơn 4 cm, có khoảng 3 - 4 rễ đem bình cây ra huấn luyện ở điều kiện ánh sáng tán xạ
trong 10 ngày, sau đó đưa cây ra trồng trên giá thể, tỷ lệ sống đạt 98,03% sau 6 tuần ra ngôi.
Từ khóa: Cụm chồi, Dendrobium anosmum Lindley, nuôi cấy in vitro, Phi điệp tím Hòa Bình.

1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, hoa cây cảnh không những đóng
vai trò quan trọng trong đời sống tinh thần mà
còn làm đẹp cho cảnh quan môi trường. Hoa
lan là một trong những loại hoa được ưa
chuộng vì hình dáng đẹp, màu sắc tươi sáng,
kích thước đa dạng. Trong đó, Phi điệp tím
Hòa Bình (Dendrobium annosmum Lindley), là

giống hoa quý trong rừng nhiệt đới được nhiều
người ưa chuộng không chỉ bởi khuôn bông
đẹp, cây sai hoa mà còn đẹp cả về màu sắc lẫn
hình dáng.
Hoa Phi điệp tím Hòa Bình có cánh to hơn,
có màu đậm hơn và có hương thơm đặc biệt
hơn hoa Phi điệp ở khu vực phân bố khác.
Ngoài giá trị làm cảnh phi điệp có thể làm
thuốc để điều trị nhiều bệnh về da, suy nhược
thần kinh và tăng cường sức đề kháng cho cơ
thể. Mặc dù vậy, khả năng tái sinh cây từ hạt
Phi điệp tím Hoà Bình rất kém, vì hạt lan không
nhũ, trong tự nhiên hạt muốn nảy mầm phải có
sự xuất hiện của nấm cộng sinh Rhiroctonia nên
khả năng tự tái sinh từ hạt là rất kém. Ngoài ra,
nhân giống hoa lan bằng con đường sinh dưỡng
thường rất hạn chế, hệ số nhân giống thấp và ảnh
hưởng lớn tới cây mẹ (Nguyễn Quỳnh Trang và
cộng sự, 2013).

Để đáp ứng nhu cầu của thị trường cây giống
cần khắc phục các tồn tại trên. Bằng công nghệ
nhân giống tiên tiến - nuôi cấy in vitro, với hệ số
nhân giống từ một quả lan là rất lớn (Trần Văn
Minh, 2001). Do đó, ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy
in vitro trong nhân giống hoa lan từ phôi hạt
trong ống nghiệm đã mang lại hiệu quả cao.
Trên thế giới cũng như ở Việt Nam có nhiều
nghiên cứu về nhân giống in vitro cây
Dendrobium đã được thực hiện (Jaime A et al.,

2015; Lita S et al., 2012; Sana A et al., 2011;
Nguyễn Văn Kết và cộng sự, 2010; Nguyễn
Thị Sơn và cộng sự, 2012; Vũ Kim Dung và
cộng sự, 2016, Nguyễn Văn Việt, 2017). Tuy
nhiên, các nghiên cứu về nhân giống loài lan
trên mới chỉ tập trung vào kỹ thuật nhân nhanh.
Bài báo công bố kết quả nhân giống in vitro lan
Phi điệp tím Hòa Bình đạt hiệu quả cao, góp
phần vào công tác bảo tồn nguồn gen loài lan có
giá trị thẩm mỹ cao này.
2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu: Quả lan Phi điệp tím Hòa Bình có
tuổi chín sinh lý 90%, thu thập tại gia đình ông
Bùi Huy Toàn - xã Tử Nê, huyện Tân Lạc, tỉnh
Hòa Bình.
Hóa chất dùng để khử trùng mẫu là dung

TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 6 - 2019

9


Công nghệ sinh học & Giống cây trồng
dịch HgCl2 0,1%; NaClO 6%.
Các loại vật liệu và hóa chất dùng trong
nuôi cấy mô tế bào là loại thông dụng dùng cho
nghiên cứu trong phòng thí nghiệm.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu chung

Bố trí thí nghiệm theo phương pháp sinh học
thực nghiệm, lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp có dung
lượng mẫu lớn (n ≥ 30), số liệu thu thập sau 5 tuần.
Điều kiện nuôi cấy: Chiếu sáng bằng giàn đèn
neon cường độ 2000 đến 3000 lux, 14 giờ/ngày;
nhiệt độ phòng nuôi 24 ± 20C. Môi trường nuôi
cấy được chuẩn độ pH = 5,8; khử trùng môi
trường ở 1180C, áp suất 1 atm trong 18 phút.
2.2.2. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của kỹ thuật khử
trùng đến tạo mẫu sạch và tái sinh thể chồi.
Quả lan được làm sạch, sau đó sát khuẩn
bằng ethanol 70% trong 2 phút. Khử trùng mẫu
bằng dung dịch HgCl2 0,1% (5 - 15 phút) hoặc
NaClO 6% (15 - 25 phút). Tách vỏ quả, trải hạt
lên môi trường nuôi cấy khởi động là môi
trường dinh dưỡng cơ bản MS bổ sung thêm 30
g/l sucrose, 6,5 g/l agar. Thống kê số mẫu sạch,
số mẫu nảy mầm và thời gian nảy mầm.
Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ chất
điều hòa sinh trưởng đến nhân nhanh thể chồi.
Dùng môi trường dinh dưỡng cơ bản MS bổ
sung (0,2 đến 1,0 mg/l) BAP, (0,3 đến 0,4 mg/l)
Kinetin và 0,2 mg/l NAA; 30 g/l sucrose, 6,5
g/l agar, 100 g/l khoai tây nghiền, 100 ml/l
nước dừa. Thống kê số thể chồi tạo ra, quan sát
đặc điểm hình thái thể chồi sau 6 tuần nuôi cấy.
Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của môi trường
dinh dưỡng đến nhân nhanh chồi.
Thí nghiệm này sử dụng các môi trường

dinh dưỡng cơ bản: Knops, MS, WPM bổ sung
0,1 mg/l BAP, 30 g/l sucrose, 6,5 g/l agar, 100
g/l khoai tây nghiền, 100 ml/l nước dừa. Thống
kê số chồi tạo ra/mẫu cấy, đặc điểm chồi sau 6
tuần nuôi cấy.
Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của nồng độ chất
điều hòa sinh trưởng đến nhân nhanh chồi.
10

Dùng môi trường dinh dưỡng phù hợp nhất
ở thí nghiệm 3, bổ sung BAP (0,2 đến 2,0 mg/l),
Kinetin (0,1 đến 1,5 mg/l) và 0,2 mg/l NAA;
30 g/l sucrose, 6,5 g/l agar, 100 g/l khoai tây
nghiền, 100 ml/l nước dừa. Thống kê số chồi
tạo ra/mẫu cấy, đặc điểm chồi sau 6 tuần nuôi
cấy.
Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của chất điều hòa
sinh trưởng đến khả năng ra rễ.
Dùng môi trường dinh dưỡng cơ bản MS bổ
sung IBA (0,1 đến 0,4 mg/l), NAA (0,2 đến 0,4
mg/l), 20 g/l sucrose, 6,5 g/l agar, 100 g/l khoai
tây nghiền, 100 ml/l nước dừa. Thống kê số
rễ/cây, đo chiều dài rễ sau 5 tuần nuôi cấy.
Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của thời gian huấn
luyện đến tỷ lệ sống và chất lượng cây giống.
Bình nuôi có cây hoàn chỉnh đưa ra ngoài
ánh sáng tán xạ để huấn luyện với thời gian
khác nhau (0, 7; 10; 14 ngày) trước khi ra ngôi.
Sau 6 tuần theo dõi, thống kê số mẫu sống, đặc
điểm sinh trưởng của cây.

2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu
Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê
sinh học ứng dụng các phần mềm đã lập trình
trên máy tính điện tử như Excel và SPSS 20.1.
2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí
nghiệm Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công
nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học
Lâm nghiệp.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tạo mẫu sạch và tái sinh thể chồi in
vitro
Trong quy trình kỹ thuật nhân giống cây
trồng bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, tỷ lệ
mẫu sạch có khả năng tái sinh chồi có ý nghĩa
rất quan trọng đối với các bước tiếp theo. Việc
xác định công thức khử trùng tối ưu để nâng
cao hiệu quả tạo mẫu sạch in vitro và khả năng
nẩy mầm của mẫu sạch. Môi trường nuôi cấy là
môi trường khoáng cơ bản MS bổ sung 30 g/l
sucrose, 6,5 g/l agar. Kết quả nghiên cứu được
trình bày ở bảng 1.

TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 6 - 2019


Công nghệ sinh học & Giống cây trồng
Bảng 1. Ảnh hưởng của hóa chất và thời gian khử trùng đến tạo mẫu sạch và nảy mầm
Loại
hóa chất

HgCl2
0,1%
NaClO
6%

Thời gian
(phút)
5
10
15
15
20
25
Sig

Tỷ lệ mẫu sạch
(%)
73,3
94,6
100
76,7
91,1
100
0,0013

Từ kết quả thu được (Bảng 1) cho biết, khi
dùng dung dịch HgCl2 0,1% với thời gian khử
trùng 5 đến 15 phút hoặc dung dịch NaClO 6%
với thời gian 15 đến 25 phút, tỷ lệ mẫu sạch
tương đối cao, đạt giá trị từ 73,3 đến 100%

(Hình 1a). Trong đó, ảnh hưởng của từng loại
hóa chất đến hiệu quả khử trùng là rõ rệt với
thời gian khử trùng khác nhau. Khi tăng thời
gian khử trùng thì tỷ lệ mẫu sạch đều tăng,
nhưng tỷ lệ mẫu nảy mầm có xu hướng giảm, tỷ
lệ nảy mầm đạt 70 đến 93,3% chứng tỏ hóa chất
khử trùng có thể làm sạch mẫu nhưng đều là
chất rất độc, nếu khử trùng lâu hóa chất sẽ ngấm
vào mô thực vật sẽ làm hỏng hoặc gây độc, do
đó hạt không thể nảy mầm (Lita S. et al., 2012).
Kết quả trên tương ứng với công bố của Nguyễn
Văn Việt và cộng sự (2016) khi sử dụng hóa
chất HgCl2 0,1% khử trùng mẫu quả Quế lan
hương trong 15 phút, đạt tỷ lệ mẫu sạch 94,33%,
tỷ lệ mẫu nảy mầm là 88,67% sau 40 ngày nuôi
cấy. Với công bố của Vũ Kim Dung và cộng sự
(2016) cho kết quả khả quan hơn khi khử trùng

Tỷ lệ mẫu
nảy mầm (%)
73,1
93,3
76,7
76,3
89,7
70,0
0,0001

Thời gian nẩy mầm
(ngày)

20,5
23,5
25,0
20,5
22,0
23,5

quả lan Hoàng thảo ý thảo ba mầu bằng HgCl2
0,1% trong 10 phút (lần 1: 7 phút; lần 2: 3 phút),
tỷ lệ tạo mẫu sạch đạt 96,67%, tỷ lệ mẫu nảy
mầm đạt 90%. Căn cứ vào kết quả ở bảng 1, có
thể chọn dung dịch HgCl2 0,1%, để khử trùng
mẫu với thời gian 10 phút hoặc NaClO 6% khử
trùng mẫu trong 20 phút là phù hợp. Kết quả
phân tích thống kê cũng cho thấy tỷ lệ mẫu sạch
và tỷ lệ nảy mầm tại các công thức thí nghiệm là
sự sai khác có ý nghĩa (Sig < 0,05).
3.2. Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh
trưởng đến khả năng nhân nhanh thể chồi
Thể chồi tái sinh từ hạt lan trong môi trường
nuôi cấy khởi động được cấy chuyển sang môi
trường nhân nhanh thể chồi. Thí nghiệm được
bố trí gồm 8 công thức có sử dụng các chất điều
hòa sinh trưởng thực vật với nồng độ khác nhau
và 1 công thức đối chứng không bổ sung chất
điều hòa sinh trưởng thực vật. Sau 6 tuần theo
dõi và thu thập số liệu về hệ số tạo thể chồi, đặc
điểm thể chồi. Kết quả được trình bày ở bảng 2.

Bảng 2. Ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh thể chồi (sau 6 tuần nuôi cấy)

Chất ĐHST (mg/l)
Hệ số nhân thể chồi
Đặc điểm thể chồi
(lần)
BAP
Kinetin
NAA
4,0
+
0,2
0,4
0,1
8,2
+
0,5
0,4
0,1
10,3
++
0,7
0,4
0,1
10,5
++
1,0
0,4
0,1
9,9
++
0,2

0,3
0,1
9,8
+
0,5
0,3
0,1
13,8
+++
0,7
0,3
0,1
11,3
+++
1,0
0,3
0,1
10,2
++
Sig
0,0001
Ghi chú: +: chồi nhỏ, ngắn, màu xanh nhạt; ++: chồi trung bình, kích thước không đồng đều;
+++: chồi mập, màu xanh đậm, đồng đều.
CT
TN
ĐC
TC1
TC2
TC3
TC4

TC5
TC6
TC7
TC8

TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 6 - 2019

11


Công nghệ sinh học & Giống cây trồng
Kết quả cho thấy (Bảng 2), nuôi cấy thể chồi
trên môi trường MS có bổ sung các chất điều
hòa sinh trưởng thực vật khác nhau có ảnh
hưởng rõ rệt đến quá trình tạo thể chồi in vitro.
Ở công thức đối chứng không bổ sung chất điều
hòa sinh trưởng thực vật, hệ số nhân thể chồi
thấp (4,0 lần), chất lượng thể chồi kém, kích
thước nhỏ. Đặc biệt công thức TC6 đã cho hệ số
tạo thể chồi cao nhất, đạt 13,8 lần (Hình 1b) và
thể chồi mập, màu xanh. Hệ số tạo thể chồi lan
Phi điệp tím trên môi trường MS bổ sung 0,5
mg/l BAP, 0,3 mg/l Kinetin, 0,1 mg/l NAA cao
hơn so với công bố của Nguyễn Thị Sơn và
cộng sự (2012) khi nhân nhanh thể chồi lan
Hoàng thảo long nhãn (Dendrobium

fimbriatum) trong 8 tuần chỉ đạt 4,63 lần. Kết
quả phân tích thống kê cũng cho thấy sự khác
biệt về hệ số nhân thể chối giữa các công thức

thí nghiệm là có ý nghĩa (Sig < 0,05).
3.3. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng
đến khả năng nhân nhanh chồi
Môi trường khoáng cơ bản cung cấp dinh
dưỡng cho cây và có thể quyết định tới khả
năng nhân nhanh chồi. Tuy vậy, mỗi loài cây
sẽ thích hợp với mỗi loại môi trường khoáng
nhất định. Trong thí nghiệm này, sử dụng 3 loại
môi trường nuôi cấy với các môi trường
khoáng cơ bản khác nhau (MS, WPM, Knops).
Kết quả nghiên cứu được trình bày tại bảng 3.

Bảng 3. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng nhân nhanh chồi (sau 6 tuần nuôi cấy)
CT
TN

Môi trường
dinh dưỡng

Tỷ lệ tạo
cụm chồi (%)

Hệ số nhân chồi
(lần)

D1

MS

77,1

7,6

D2
D3

Knops
WPM
Sig

71,4
72,2
0,0001

7,1
6,9
0,0001

Kết quả cho thấy (Bảng 3), tỷ lệ tạo cụm
chồi tương đối cao (71,4 đến 77,1%), số chồi
trung bình/mẫu đạt giá trị 6,9 đến 7,6
chồi/mẫu. Trong đó, môi trường khoáng cơ bản
MS có khả năng tái sinh chồi cao nhất với tỷ lệ
tạo cụm chồi là 77,1%, đây là môi trường thích
hợp cho tái sinh chồi. Chất lượng chồi nuôi cấy
trên môi trường MS cũng khá tốt, phát triển
nhanh và chồi mập, màu xanh đậm, số chồi
nhiều (7,6 chồi/cụm). Kết quả trên có phần
khiêm tốn hơn so với công bố của Vũ Kim
Dung và cộng sự (2016), khi nhân nhanh

Hoàng thảo ý thảo ba mầu trên môi trường MS
với kết quả là 100% mẫu tạo cụm chồi, nhưng
hệ số nhân chỉ đạt 5,61 chồi/cụm. Theo công
bố của Nguyễn Văn Việt (2016), khi nhân
nhanh Hoàng thảo vôi trên môi trường MS cho
kết quả là 87,6% mẫu tạo cụm chồi, số chồi
trung bình đạt 5,6 chồi/cụm. Kết quả phân tích
thống kê cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa tỷ lệ
tái sinh chồi ở các môi trường cơ bản khác
nhau là có ý nghĩa (Sig < 0,05).
12

Chất lượng chồi
Chồi mập, xanh lá
Chồi mập, ít, xanh đậm
Chồi mập, xanh đậm.

3.4. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh
trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi.
Việc bổ sung phối hợp Kinetin, BAP và NAA,
làm cho hệ số nhân của chồi tăng lên rõ rệt.
Các chất này thường được sử dụng để kích
thích sự phân hóa, sinh trưởng và phát triển
chồi của mẫu cấy in vitro. Tác dụng chủ yếu
của chúng là kích thích sự phân chia mạnh mẽ
của tế bào, đặc biệt ảnh hưởng rất lớn đến sự
hình thành và phân hóa chồi (Nguyễn Văn Kết
và cộng sự, 2010).
3.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ BAP và NAA
đến khả năng nhân nhanh chồi

Một số công trình nghiên cứu đã công bố về
nhân giống chi lan Dendrobium của các tác giả,
cho thấy chất điều hòa sinh trưởng BAP, NAA
ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ mẫu tái sinh chồi
(Sana và cộng sự, 2011). Trong thí nghiệm này
đã sử dụng môi trường khoáng cơ bản là MS
bổ sung (0,2 đến 2,0 mg/l) BAP và 0,2 mg/l
NAA. Kết quả được trình bày tại bảng 4.

TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 6 - 2019


Công nghệ sinh học & Giống cây trồng
Bảng 4. Ảnh hưởng của nồng độ BAP và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi (sau 6 tuần nuôi cấy)
Chất ĐHST (mg/l)
CT
Tỷ lệ tạo
Hệ số nhân chồi
Chất lượng chồi
BAP
TN
cụm chồi (%)
(lần)
NAA
0
0
ĐC
40,1
3,1
+

0,2
0,2
++
NC1
66,8
4,9
0,4
++
NC2
76,7
5,7
0,2
NC3

0,6

0,2

83,3

8,2

NC4

0,8

0,2

86,7

9,4

+++
+++

NC5

1,0

0,2

81,8

8,5

++

NC6

1,5

0,2

82,2

7,6

++

NC7

2,0

0,2

75,3

7,1

++

0,003
0,0012
Sig
Ghi chú: +: Chồi mảnh, yếu, lá xanh; ++: Chồi thấp, gầy, yếu, lá xanh; +++: Chồi cao, mập, lá xanh đậm.

Kết quả tại bảng 3 cho thấy ở tất cả các công
thức thí nghiệm có bổ sung chất điều hòa sinh
trưởng, tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi đều đạt giá trị
cao (66,8 đến 86,7%), trong đó công thức thí
nghiệm NC4 (bổ sung 0,8 mg/l BAP, 0,2 mg/l
NAA) cho kết quả tốt nhất, với tỷ lệ mẫu tạo
cụm chồi đạt 86,7%, số chồi TB/mẫu đạt 9,4
chồi, chất lượng chồi tốt, mập, đồng đều, màu
xanh đậm. Kết quả trên tương ứng với công bố
của Nguyễn Văn Việt (2016) khi nhân nhanh
Hoàng thảo vôi trên môi trường MS bổ sung
0,5 mg/l BAP và 0,3 mg/l NAA, cho kết quả là

90% mẫu tạo cụm chồi, số chồi trung bình/mẫu

đạt 9,6 chồi. Kết quả phân tích thống kê cho thấy
sự khác biệt rõ rệt về khả năng nhân nhanh chồi
giữa các công thức thí nghiệm (Sig < 0,05).
3.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP, Kinetin
và NAA đến nhân nhanh chồi
Xác định ảnh hưởng của tổ hợp các chất
điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh
chồi, thí nghiệm được bố trí với môi trường
khoáng cơ bản MS bổ sung BAP, Kinetin và
NAA có nồng độ khác nhau. Kết quả nghiên
cứu được trình bày ở bảng 5.

Bảng 5. Ảnh hưởng của nồng độ BAP, Kinetin và NAA đến nhân nhanh chồi (sau 6 tuần nuôi cấy)
Chất ĐHST (mg/l)
CT
Tỷ lệ tạo
Hệ số nhân chồi
Chất lượng chồi
TN
cụm chồi (%)
(lần)
BAP
Kinetin
NAA
ĐC
0
0
0
40,3
3,0

+
NN1
0,8
0,1
0,2
88,3
9,6
++
NN2
0,3
91,7
10,1
+++
0,8
0,2
NN3
0,5
96,8
13,7
+++
0,8
0,2
NN4
0,7
89,0
12,4
+++
0,8
0,2
NN5

0,9
86,3
9,6
++
0,8
0,2
NN6
1,1
84,5
8,9
++
0,8
0,2
NN7
1,5
81,7
8,2
++
0,8
0,2
Sig
0,0001
0,0001
Ghi chú: +: Chồi mảnh, yếu, lá xanh; ++: Chồi thấp, gầy, yếu, lá xanh; +++: Chồi cao, mập, lá xanh đậm.

Kết quả ở bảng 5 cho thấy, khi bổ sung đồng
thời BAP, NAA và Kinetin vào môi trường
nuôi cấy, ở các công thức thí nghiệm cho tỷ lệ
tạo cụm chồi đều cao. Với giá trị tỷ lệ tạo cụm
chồi đạt 81,7% đến 96,8%, số chồi trung

bình/mẫu đạt từ 8,2 đến 13,3. Đặc biệt là công
thức NN3 đạt giá trị cao nhất, tỷ lệ tạo cụm
chồi, số chồi trung bình của mỗi mẫu lần lượt
là 96,8% và 13,3 chồi/cụm (Hình 1c, d, e). Kết
quả trên tương ứng với kết quả nhân giống lan

TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 6 - 2019

13


Công nghệ sinh học & Giống cây trồng
Hoàng thảo vôi (Tỷ lệ tạo cụm chồi 96,7%,
12,3 chồi/cụm) của tác giả Nguyễn văn Việt
(2017). Theo công bố của Vũ Kim Dung và
cộng sự (2016) về nhân nhanh lan Hoàng thảo
ý thảo ba mầu cũng cho kết quả 96,67% tạo
cụm chồi, số chồi tạo ra 9,53 chồi/cụm. Như
vậy, có thể chọn môi trường nhân nhanh Phi
Điệp tím Hoà Bình là môi trường dinh dưỡng cơ
bản MS bổ sung 0,8 mg/l BAP, 0,5 mg/l Kinetin
và 0,2 mg/l NAA. Kết quả phân tích thống kê
cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa các công thức
thí nghiệm về hệ số nhân chồi (Sig < 0,05).

3.5. Ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa
sinh trưởng đến khả năng ra rễ
Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh in vitro là khâu quan
trọng trước khi cho cây ra ngoài huấn luyện.

Thí nghiệm được tiến hành với việc cấy chuyển
chồi lan đủ tiêu chuẩn (chồi đạt 3 - 4 cm, mập,
lá xanh) vào môi trường khoáng cơ bản MS bổ
sung (0,1 đến 0,4 mg/l) IBA, (0,2 đến 0,4 mg/l)
NAA, 20 g/l sucrose, 6,5 g/l agar, 100 g/l khoai
tây nghiền, 100 ml/l nước dừa. Kết quả thí
nghiệm được trình bày ở bảng 6.

Bảng 6. Ảnh hưởng của nồng độ IBA và NAA tới khả năng ra rễ (sau 5 tuần nuôi cấy)
Chất ĐHST (mg/l)
Số rễ
Chiều dài
CT
Tỷ lệ chồi
trung bình/cây trung bình/rễ
Chỉ số ra rễ
TN
ra rễ (%)
IBA
NAA
(rễ)
(cm)
ĐC
34,3
2,1
1,6
3,4
RR1

0,2

-

67,3

3,2

2,3

7,4

RR2

0,3

-

72,0

3,3

2,5

8,3

RR3

0,4

81,0

3,1

2,4

7,4

RR4

-

0,2

71,3

3,3

2,2

7,3

RR5

-

0,3

83,3

3,4

2,8

9,5

RR6

0,4

79,5

3,2

2,7

8,6

RR7

0,1

0,2

86,7

3,4

2,9

9,9

RR8

0,2

0,3

94,3

3,5

3,0

10,5

RR9

0,3

0,4

90,3

3,6

2,7

9,7

0,0023

0,0001

0,0001

Sig

Kết quả tại bảng 6 cho thấy, ở các công thức
thí nghiệm chỉ bổ sung một chất điều hoà sinh
trưởng thực vật (IBA hoặc NAA) cho tỷ lệ ra rễ
thấp. Môi trường bổ sung 0,2 đến 0,4 mg/l
IBA, tỷ lệ ra rễ đạt 67,3 đến 81% và chỉ số ra
rễ đạt 7,4 đến 8,3. Với các công thức môi
trường bổ sung 0,2 đến 0,4 mg/l NAA, tỷ lệ ra
rễ và chỉ số ra rễ cao nhất lần lượt là 83,3% và
9,5%. Các công thức môi trường bổ sung phối
hợp hai chất ĐHST là (0,1 đến 0,3) mg/l IBA
và (0,2 đến 0,4 mg/l) NAA, cho kết quả cao
hơn so với bổ sung một trong hai chất trên, cụ
thể là ở công thức RR8, mới môi trường dinh
dưỡng cơ bản MS bổ sung 0,2 mg/l IBA và 0,3
mg/l NAA cho kết quả cao nhất về tỷ lệ chồi ra
rễ và chỉ số ra rễ lần lượt là 94,3% và 10,5
(Hình 1f, 1h). Kết quả đạt được cũng tương tự
14

như của tác giả Vũ Kim Dung và cộng sự
(2016) đã dùng môi trường khoáng MS bổ
sung NAA 0,3 mg/l, IBA 0,2 mg/l nghiên
cứu ra rễ đối với lan Hoàng thảo ý thảo ba

mầu, tỷ lệ ra rễ đạt 93,33%. Tác giả Nguyễn
Văn Việt (2017) đã nghiên cứu môi trường ra
rễ đối với lan Hoàng thảo kèn trên môi
trường khoáng cơ bản Knops bổ sung NAA
0,3 mg/l, IBA 0,1 mg/l cho tỷ lệ chồi ra rễ
cao nhất đạt 100%, số rễ TB/cây 4,8 và chiều
dài TB/rễ đạt 3,6 cm, chỉ số ra rễ 17,3. Kết
quả phân tích thống kê cho thấy, nồng độ chất
điều hoà sinh trưởng thực vật khác nhau ảnh
hưởng rõ rệt tới khả năng ra rễ của Phi điệp tím
Hoà Bình (Sig < 0,05).
3.6. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện
đến tỷ lệ sống và chất lượng cây giống

TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 6 - 2019


Công nghệ sinh học & Giống cây trồng
Khi cây có chiều cao lớn hơn 4,5 cm, có
khoảng 4 rễ, cây cứng cáp, tiến hành đem bình
cây ra huấn luyện ở điều kiện ánh sáng tán xạ.
Thí nghiệm này, được được bố trí với 4 công

thức khác nhau về thời gian, sau huấn luyện cây
con được đem ra trồng trên giá thể hỗn hợp là
dương xỉ và xơ dừa đã qua xử lý. Kết quả nghiên
cứu được trình bày ở bảng 7.

Bảng 7. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chất lượng cây khi ra ngôi (sau 6 tuần ra ngôi)
CTTN

TG huấn luyện (ngày)
Số mẫu
Tỷ lệ sống (%)
Đặc điểm cây
ĐC

0

91

54,05

+

TG1

7

92

79,14

++

TG2

10

91

98,03

+++

TG3

14

91

97,70

+++

0,0025

Sig

Ghi chú: +) Cây nhỏ, thân yếu, rễ bám giá thể kém; ++) Cây cao, lá xanh đậm, cây cứng cáp, rễ bám giá thể tốt;
+++) Cây to, khỏe, lá xanh đậm, rễ bám giá thể tốt và xuất hiện rễ mới, tăng chiều cao cây.

Kết quả thu được (Bảng 7), cho thấy tỷ lệ
sống ít có sai khác rõ rệt giữa công thức đối
chứng (Không huấn luyện) với các công thức
còn lại nhưng cây con có trải qua huấn luyện
khả năng thích ứng với môi trường tự nhiên tốt

hơn. Thời gian huấn luyện 10 ngày, tỷ lệ sống
của cây khi trồng ra giá thể đạt 98,03% (Hình
1g). Kết quả phân tích thống kê cho thấy, Sig <

0,05, chứng tỏ có sự khác biệt rõ rệt về tỷ lệ
sống giữa các công thức thí nghiệm.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

Hình 1. Hình ảnh cây lan Phi điệp tím Hòa Bình qua các giai đoạn nuôi cấy
Ghi chú: a) Tạo mẫu sạch và tái sinh thể chồi; b) Nhân nhanh thể chồi; c) Cụm chồi ở NN2; d) Cụm chồi ở NN3;
e) Cụm chồi ở NN4; f) Cây lan hoàn chỉnh ở RR6; g) Cây lan đã huấn luyện; h) Cây lan hoàn chỉnh.

4. KẾT LUẬN
Nghiên cứu nhân giống Phi điệp tím Hoà
bình đã đạt được một số kết quả sau:
- Khử trùng mẫu bằng dung dịch HgCl2
0,1% trong 10 phút đạt tỷ lệ sạch 94,6%, tỷ lệ
tạo thể chồi là 93,3%;
- Nhân nhanh chồi trên môi trường khoáng MS

bổ sung 0,8 mg/l BAP, 0,2 mg/l NAA, 0,5 mg/l
Kinetin, 30 g/l sucrose, 6,5 g/l agar, 100 g/l khoai
tây nghiền, 100 ml/l nước dừa. Tỷ lệ tạo cụm chồi

là 96,8% và hệ số nhân chồi đạt 13,7 lần;
- Ra rễ - tạo cây hoàn chỉnh trên môi trường
khoáng MS bổ sung 0,2 mg/l IBA và 0,3 mg/l
NAA, 100 mg/l khoai tây nghiền, 20 g/l
sucrose, 6,5 g/l agar. Đạt tỷ lệ ra rễ 93,3%, số
rễ trung bình là 3,5 rễ/cây, chiều dài rễ trung
bình là 3,0 cm, chỉ số rễ 10,5;
- Huấn luyện 10 ngày dưới ánh sáng tán xạ,
sau đó đưa cây ra trồng trên giá thể, tỷ lệ sống
đạt 98,03% sau 6 tuần theo dõi.

TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 6 - 2019

15


Công nghệ sinh học & Giống cây trồng
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Jaime A, Teixeira D.S, Jean C.C, Judit D, Songjun
Z (2015). Dendrobium micropropagation a review. Plant
Cell Rep, 34: 671- 704.
2. Lita S and Lestari S.P (2012). In vitro propagation
of Dendrobium and phalaenopsis through tissue culture
for conservation. Agrivita, 34 (2): 115-126.
3. Nguyễn Quỳnh Trang, Vũ Thị Huệ, Khuất Thị Hải
Ninh, Nguyễn Thị Thơ (2013). Nhân giống in vitro lan

Phi điệp tím (Dendrobium anosmum). Tạp chí Khoa học
và Công nghệ Lâm nghiệp, 3 (1): 16-21.
4. Nguyễn Thị Sơn, Nguyễn Thị Lý Anh, Vũ Ngọc
Lan, Trần Thế Mai (2012). Nhân giống in vitro loài
lan Hoàng thảo long nhãn (Dendrobium fimbriatum).
Tạp chí Khoa học và Phát triển, 2 (10): 263-271.
5. Nguyễn Văn Kết và Nguyễn Văn Vinh (2010).
Nghiên cứu khả năng nhân giống loài Lan Hoàng thảo
sáp (Dendrobium crepidatum) in vitro. Tạp chí Khoa
học và Công nghệ, 48 (5): 89 – 95.
6. Nguyễn Văn Việt, Bùi Văn Thắng, Nguyễn Thị
Hường, Nguyễn Thị Thu Hằng (2016). Ứng dụng kỹ
thuật nuôi cấy in vitro trong nhân giống Quế lan hương
(Aerides odorata). Tạp chí Khoa học & Công nghệ Lâm

nghiệp, 6: 162-169.
7. Nguyễn Văn Việt (2017). Ứng dụng kỹ thuật
nuôi cấy in vitro trong nhân giống lan Hoàng thảo vôi
(Dendrobium cretaceum). Tạp chí Khoa học Công
nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 6 (79): 55-58.
8. Nguyễn Văn Việt (2017). Ứng dụng kỹ thuật
nuôi cấy in vitro trong nhân giống lan Hoàng thảo kèn
(Dendrobium lituiflorum). Tạp chí Khoa học & Công
nghệ Lâm nghiệp, 4: 39-45.
9. Sana A, Touqeer A, Ishfaq A.H, Mehwish (2011).
In vitro propagation of Orchid (Dendrobium nobile) var,
Emma white. African Journal of Biotechnology, 10 (16):
3097-3103.
10. Trần Văn Minh và Nguyễn Văn Uyển (2001).
Vi nhân giống phong lan nhóm Dendrobium trên quy

mô công nghiệp. Tạp chí Khoa học Công nghệ, 1: 1-9.
11. Vũ Kim Dung, Nguyễn Văn Việt, Bùi Văn
Thắng (2016). Nhân giống lan Hoàng thảo ý thảo ba
màu (Dendrobium gratiosissimum) bằng kỹ thuật nuôi
cấy in vitro. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Lâm
nghiệp, 6: 156-161.
12. Vũ Ngọc Lan và Nguyễn Thị Lý Anh (2013).
Nhân giống in vitro loài lan bản địa Dendrobium nobile.
Tạp chí Khoa học và Phát triển, 11 (7): 917-925.

USING IN VITRO CULTURE TECHNIQUE IN PROPAGATION OF
Dendrobium anosmum Lindley
Do Quynh Lien1, Doan Thi Thu Huong1, Nguyen Van Viet1, Vu Tien Hung1
1

Vietnam National University of Forestry

SUMMARY
Dendrobium anosmum Lindley is a valuable orchid, high economic value, flowers grow into drops, with many
small purple flowers and a pleasant scent. Micropropagation of Dendrobium anosmum by in vitro cultural
technique has been successfully studied. The results showed that the optimal method for bud sterilization was
soaked in ethanol 70% for 2 minutes, by HgCl2 0.1% solution for 10 minutes and then culturing the sample
with MS medium provided the proportion of reached survival rate was 94.6% and the protocorm rate was
93.3% after 23 dates being cultured. Forming multi-buds induction in MS medium with
6-benzylaminopurine (BAP) 0.8 mg/l, Kinetin 0.5 mg/l, α-naphthaleneacetic acid (NAA) 0.2 mg/l, coconut
water 100 ml/l, potatoes extract 100 ml/l, sucrose 30g/l, the buds developed rapidly and were green, the
coefficient of formed buds was hightest (13.7 time) after 6 weeks. The rooted shoots 94.3% the average
number of roots was 3.5 per individual and the average length of roots was 3.0 cm when cultured in MS
medium supplemented with IBA 0.2 mg/l, NAA 0.3 mg/l, and potatoes 100 g/l, sucrose 20 g/l after 5 weeks.
Shoots which had more than 4 cm height and about 3 to 4 roots can be trained outside in nature 10 days and

then will be washed agar and be transplanted into suitable bases, survival rate was 98.03% after 6 weeks.
Keywords: Dendrobium anosmum Lindley, in vitro, knops, micropropagation, protocorm.

16

Ngày nhận bài

: 16/9/2019

Ngày phản biện

: 18/10/2019

Ngày quyết định đăng

: 25/10/2019

TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 6 - 2019