XÂY DỰNG GIÁ THỊ THAM CHIẾU CHO xét NGHIỆM SÀNG lọc rối LOẠN CHUYỂN hóa bẩm SINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

ĐỖ THỊ LOAN

XÂY DỰNG GIÁ THỊ THAM CHIẾU
CHO XÉT NGHIỆM SÀNG LỌC RỐI LOẠN
CHUYỂN HÓA BẨM SINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
KHÓA 2015 - 2019


HÀ NỘI - 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

ĐỖ THỊ LOAN

XÂY DỰNG GIÁ THỊ THAM CHIẾU
CHO XÉT NGHIỆM SÀNG LỌC RỐI LOẠN
CHUYỂN HÓA BẨM SINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
KHÓA 2015 - 2019

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1.TS. Trần Thị Chi Mai
2.CN.Trịnh Thị Phương Dung


HÀ NỘI - 2019

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới TS. Trần Thị Chi
Mai – Trưởng khoa Kỹ thuật Y học, trường Đại học Y Hà Nội và cô Trịnh
Thị Phương Dung giảng viên bộ môn Hóa sinh lâm sàng – khoa kỹ thuật y
học, trường Đại học Y Hà Nội đã luôn tận tình hướng dẫn nghiên cứu, giảng
giải kiến thức và tạo điều kiện tốt nhất giúp em hoàn thành khóa luận.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô, các anh chị nhân
viên trong khoa Xét nghiệm Sinh hóa Bệnh viện Nhi Trung ương đã nhiệt tình
hướng dẫn, giải đáp mọi thắc mắc để em có thể thực hiện tốt nhất khóa luận.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, Phòng Quản lý đào tạo
đại học, Bộ môn Sinh Hóa, Khoa Kỹ thuật y học, trường Đại Học Y Hà Nội
đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian em học tập ở trường.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới cha mẹ, những người đã sinh
thành, nuôi dưỡng em, cùng người thân, bạn bè đã luôn ở bên động viên, chia
sẻ, giúp đỡ em trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận.
Dù đã rất cố gắng để thực hiện khóa luận một cách hoàn chỉnh nhất,
nhưng do mới lần đầu tiên thực hiện nghiên cứu cũng như kiến thức còn hạn
chế nên khóa luận của em chắc hẳn vẫn còn có những thiếu sót. Em rất mong
nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của thầy cô và các bạn để khóa
luận được hoàn thiện hơn.

Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Đỗ Thị Loan


LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan tất cả số liệu trong khóa luận này là trung thực và
chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác.
Em xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về những cam kết này.
Hà Nội, tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Đỗ Thị Loan


MỤC LỤC
Lời cảm ơn
Lời cam đoan
Danh mục từ viết tắt
Danh mục hình vẽ
Danh mục bảng

ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................3
1.1.Bệnh rối loạn chuyển hóa bẩm sinh.........................................................3
1.1.1 Nguyên nhân.....................................................................................3
1.1.2 Phân loại...........................................................................................3
1.1.3 Các triệu chứng lâm sàng của rối loạn chuyển hóa bẩm sinh...........5

1.1.4 Chẩn đoán.........................................................................................6
1.1.5 Điều trị..............................................................................................7
1.2.Thiết lập khoảng tham chiếu...................................................................8
1.2.1 Khoảng tham chiếu và thuật ngữ liên quan......................................8
1.2.2 Xác định khoảng tham chiếu.............................................................9
1.2.3 Lựa chọn đối tượng tham chiếu......................................................10
1.2.4 Kiểm tra giá trị tham chiếu và loại bỏ giá trị ngoại lai...................12
1.2.5 Xử lý thống kê dữ liệu....................................................................13
1.2.6 Xác nhận khoảng tham chiếu..........................................................14
1.3.Tình hình nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam..............................15
1.3.1. Trên thế giới...................................................................................15
1.3.2.Tại Việt Nam...................................................................................16
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP....................................17
2.1. Đối tượng nghiên cứu...........................................................................17
2.2. Hóa chất, thuốc thử, trang thiết bị dùng trong nghiên cứu...................17


2.2.1. Hóa chất thuốc thử.........................................................................17
2.2.2. Trang thiết bị..................................................................................17
2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu........................................................18
2.4. Phương pháp.........................................................................................18
2.4.1. Thiết kế nghiên cứu........................................................................18
2.4.2. Nguyên lý kỹ thuật khối phổ kép...................................................18
2.5. Nội dung nghiên cứu............................................................................19
2.5.1. Sơ đồ nghiên cứu...........................................................................19
2.5.4. Kết luận và lập hồ sơ.....................................................................22
2.3. Đạo đức nghiên cứu..............................................................................23
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ...............................................................................24
3.1. Kết quả khoảng tham chiếu của các acid amin.....................................24
3.2. Kết quả khoảng tham chiếu của acylcarnitine......................................27

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN............................................................................30
KẾT LUẬN....................................................................................................35
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Ala
Arg
Asp
C0
C10
C10:1
C10:2
C12
C12:1
C14
C14:1
C14:2
C14OH
C16
C16:1
C16:1OH
C16:OH
C18
C18
C18
C18:1
C18:1OH
C2
C3

C4
C5
C5:1
C6
C6DC
C8
C8:1
CI
Cit
Glu
Gly
KTC

Alanine
Arginine
Acid aspartic
Free carnitine
Decanoylcarnitine
Decenoylcarnitine
Decadienoylcarnitine
Dodecanoylcarnitine
Dodecenoylcarnitine
Tetradecanoylcarnitine
Tetradecenoylcarnitine
Tetradecadienoylcarnitine
3-Hydroxy-tetradecanoylcarnitine
Hexadecanoylcarnitine
Hexadecenoylcarnitine
3-Hydroxy-hexadecenoylcarnitine
3-Hydroxy-hexadecanoylcarnitine

Octadecanoylcarnitine
Octadecadienoylcarnitine
3-Hydroxy-octadecanoylcarnitine
Octadecenoylcarnitine
3-Hydroxy-octadecenoylcarnitine
Acetylcarnitine
Propionylcarnitine
Butyrylcarnitine
Isovalerylcarnitine
Tyglylcarnitine
Hexanoylcarnitine
Adipylcarnitine
Octanoylcarnitine
Octenoylcarnitine
Khoảng tin cậy
Citruline
Acid Glutamic
Glycine
Khoảng tham chiếu


Leu
Lys
Met
MS/MS
Orn
Phe
Pro
Ser
Tyr

Val

Leucine
Lysine
Methionine
Máy khối phổ đôi
Ornithine
Phenylalanine
Proline
Serine
Tyrosine
Valine


DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 3.1: Sự phân bố mức độ Alanin..............................................................24
Hình 3.2: Giá trị - tần số của Ala....................................................................25
Hình 3.3: Sự phân bố mức độ C14..................................................................27
DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Kiểm nghiệm tính chuẩn của Alanin...............................................25
Bảng 3.2: Kết quả khoảng tham chiếu của các acid amin..............................26
Bảng 3.3: Kiểm nghiệm tính chuẩn của C14..................................................27
Bảng 3.4: Giá trị - tần số của C14..................................................................28
Bảng 3.5: Kết quả khoảng tham chiếu của các acylcarnitine..........................29
Bảng 4.1: So sánh nồng độ acid amin của trẻ sơ sinh Việt Nam trong nghiên
cứu này và nghiên cứu của Colombia.............................................32
Bảng 4.2: So sánh nồng độ acylcarnitine của trẻ sơ sinh Việt Nam trong
nghiên cứu này với nghiên cứu của Colombia................................33

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Khi một hiệu năng của phương pháp được chấp nhận, đặc tính cuối
cùng được nghiên cứu trong quá trình thẩm định phương pháp là đánh giá xây
dựng khoảng tham chiếu để hỗ trợ việc diễn giải kết quả xét nghiệm của bệnh
nhân [1]. Để đưa ra các chẩn đoán y học hoặc các đánh giá y học khác, phòng
xét nghiệm luôn phải so sánh kết quả đo hoặc quan sát được từ một người
(thường là bệnh nhân) với khoảng tham chiếu, từ quá trình so sánh để đưa ra
các quyết định [2]. Khoảng tham chiếu sinh học được định nghĩa theo tiêu
chuẩn quốc gia TCVN ISO 15189:2014 là khoảng xác định của phân bố các
giá trị lấy từ tổng thể chuẩn sinh học. Hiện nay một số phòng xét nghiệm
không tiến hành xây dựng khoảng tham chiếu sinh học hay thậm chí không
tiến hành xác nhận khoảng tham chiếu.Việc cung cấp khoảng tham chiếu đáng
tin cậy là một nhiệm vụ quan trọng đối với các phòng thí nghiệm lâm sàng và
các nhà nghiên cứu.
Rối loạn chuyển hóa bẩm sinh là bệnh di truyền, do đột biến gen gây
nên làm thiếu hụt các enzym hậu quả là không chuyển hóa được các chất dinh
dưỡng [3]. Theo các báo cáo từ khoa Nội tiết – Chuyển hóa – Di truyền Bệnh
viện Nhi trung ương trong vài năm gần đây, tần suất mắc bệnh khoảng 1/5000
trẻ sinh ra, trong đó tỷ lệ tử vong lên đến 48% . Có trên 1000 bệnh lý rối loạn
chuyển hóa khác nhau, tỷ lệ mới mắc 1/500 [4]. Bệnh rối loạn chuyển hóa là
một gánh nặng với bản thân người bệnh, gia đình và xã hội. Việc điều trị đòi
hỏi thời gian dài và còn tùy thuộc vào mức độ nặng nhẹ của bệnh. Bệnh có
thể biểu hiện ở bất cứ lứa tuổi nào, từ giai đoạn sơ sinh cho đến khi trưởng
thành. Nhiều bệnh rối loạn chuyển hóa bẩm sinh không có triệu chứng rõ ràng
ở giai đoạn sơ sinh, rất khó phát hiện và chẩn đoán, đến khi xuất hiện các
triệu chứng lâm sàng và kết quả xét nghiệm rõ ràng thì đã muộn, bệnh tiến
triển rất nhanh và tỷ lệ tử vong cao đặc biệt đối với những bệnh có liên quan

2

đến chức năng của hệ thần kinh trung ương. Có nhiều bệnh nhân mắc rối loạn
chuyển hóa bẩm sinh nhưng không được chẩn đoán xác định sớm đã dẫn đến
những di chứng nặng nề. Do đó sàng lọc trẻ sơ sinh là rất quan trọng, nhằm
phát hiện sớm các rối loạn chuyển hóa ảnh hưởng đến nội tiết, sức khỏe, sự
phát triển thể chất tâm thần của trẻ. Từ đó đưa ra những phương pháp điều trị
sớm nhất giảm thiểu những em bé bị chậm phát triển về thể lực, trí tuệ và
nhiều bệnh lý khác. Một vài bệnh lý nếu được phát hiện sớm và điều trị ngay
trong vòng 2 tuần đầu sau sinh thì khả năng phục hồi và phát triển bình
thường rất cao.
Khoa Sinh hoá, Bệnh viện Nhi trung ương triển khai kỹ thuật sàng lọc
các bệnh rối loạn chuyển hoá bẩm sinh bằng phương pháp khối phổ đôi. Việc
xây dựng khoảng tham chiếu cho các thông số của xét nghiệm này sao cho
đặc hiệu với kỹ thuật, phù hợp với quần thể trẻ sơ sinh Việt Nam là thực sự
cần thiết, giúp phân tích kết quả sàng lọc chính xác. Do đó, chúng tôi tiến
hành đề tài với mục tiêu: xây dựng giá trị tham chiếu của trẻ sơ sinh cho xét
nghiệm sàng lọc rối loạn chuyển hóa bẩm sinh.


3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.Bệnh rối loạn chuyển hóa bẩm sinh
1.1.1 Nguyên nhân.
Rối loạn bẩm sinh của quá trình trao đổi chất tạo thành một nhóm lớn
các bệnh di truyền liên quan đến rối loạn chuyển hóa bẩm sinh. Những người

bị rối loạn chuyển hóa bẩm sinh có ít nhất một gen khiếm khuyết dẫn đến
thiếu hụt enzym. Hầu hết những khiếm khuyết gen bẩm sinh là do có cả hai
bố mẹ đều mang gen bệnh truyền cho [3]. Đứa trẻ thừa hưởng hai bản sao gen
khiếm khuyết không thể sản xuất đủ enzym hiệu quả. Tỷ lệ mắc rối loạn
chuyển hóa bẩm sinh có thể lên đến 1/1500 trẻ sinh ra [4]. Có hàng trăm rối
loạn chuyển hóa di truyền khác nhau, và các triệu chứng, phương pháp điều
trị, tiên lượng của chúng rất khác nhau.
1.1.2 Phân loại.
Theo truyền thống, các bệnh rối loạn chuyển hóa bẩm sinh được phân
loại thành 4 nhóm là: rối loạn chuyển hóa carbohydrate, rối loạn chuyển hóa
acid amin, rối loạn chuyển hóa acid hữa cơ và rối loạn lưu trữ thể tiêu bào [5].
Trong những thập kỉ gần đây hàng trăm rối loạn chuyển hóa di truyền đã được
xác định và những rối loạn mới tiếp tục được phát hiện. Một số rối loạn
chuyển hóa di truyền phổ biến và quan trọng hơn bao gồm: [6]
- Rối loạn chuyển hóa carbohydrate:
 Rối loạn lưu trữ glycogen: là tập hợp các bệnh với các vấn đề về
lưu trữ glucid.
 Bệnh thiếu enzym G6PD
 Bệnh Galactosemia: không có khả năng chuyển hóa đường
galactose do thiếu enzym.


4

- Rối loạn chuyển hóa acid amin:
 Bệnh Phenylketon niệu (PKU): đột biến gen PAH dẫn đến thiếu
hụt enzyme phenylalanine hydroxylase, là enzyme chuyển đổi
phenylalanine thành tyrosine [8]. Từ đó nồng độ acid amin
phenylalanine trong máu tăng cao.
 Bệnh nước tiểu mùi đường cháy (Maple syrup urine disease):

thiếu hụt phức hợp acid alpha-keto dehydrogenase dẫn đến sự
tích tụ các acid amin (leucine, isoleucine, valine) trong cơ thể [9].
- Rối loạn peroxisomal: chức năng enzym bên trong peroxisomes kém
có thể dẫn đến sự tích tụ các sản phẩm độc hại của quá trình trao đổi
chất. Rối loạn peroxisomal bao gồm:
 Hội chứng Zellweger: đột biến gen PEX mã hóa cho protein
peroxin làm chức năng của peroxisome bị suy yếu [10].
 Adrenoleukodystrophy: do đột biến gen ABCD1 làm giảm tổng
hợp adrenoleukodystrophy protein, protein vận chuyển acid béo
chuỗi dài vào peroxisom.
- Rối loạn chuyển hóa steroid:
 Tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh: tuyến thượng thận không
thể sản xuất hai hormone cortisol và aldosterone theo đúng nhu
cầu bình thường của trẻ.
- Rối loạn ty thể: các vấn đề bên trọng ty thể dẫn đến tổn thương cơ
bắp.
- Rối loạn chuyển hóa acid hữu cơ: methylmalonic acidemia và
propionic acidemia.
- Rối loạn chu trình ure: thiếu hụt ornithine transcarbamylase và
citrullinemia.


5

- Rối loạn lưu trữ thể tiêu bào: Sự thiếu hụt enzym khác nhau bên
trong lysosome có thể dẫn đến sự tích tụ các chất độc hại, gây ra các
rối loạn chuyển hóa bao gồm:
 Hội chứng Hurler: không sản xuất enzyme lysomal alpha-Liduronidase [7].
 Bệnh Niemann-Pick: đột biến gen SMPD1 làm thiếu hụt enzyme
lysosomal acid sprialomyelinase [7].

 Bệnh Tay-Sachs: đột biến gen HEXA dẫn đến thiếu hụt enzyme
beta-hexosaminidase A [7].
 Bệnh Gaucher: đột biến gen GBA làm thiếu hụt enzyme
glucocerebrosidase [7].
 Bệnh Fabry: thiếu hụt enzyme alpha galactosidase [7].
 Bệnh Krabbe: đột biến gen GALC dẫn đến thiếu hụt enzyme
galactosylceramidase [7].
1.1.3 Các triệu chứng lâm sàng của rối loạn chuyển hóa bẩm sinh.
Các triệu chứng rất khác nhau tùy thuộc vào vấn đề trao đổi chất gặp
phải. Một số triệu chứng bao gồm [11], [27]:
- Ăn kém, đau bụng, nôn.
- Không tăng trưởng phát triển, giảm cân.
- Vàng da, gan to, suy gan.
- Cơ quan sinh dục mơ hồ, dậy thì muộn hoặc dậy thì quá sớm.
- Co giật, mất trí nhớ, bệnh não, đột quỵ.
- Điếc, mù, đau agnosia.
- Đặc điểm khuôn mặt bất thường, dị tật bẩm sinh.
- Tăng thông khí, suy hô hấp.
- Hành vi bất thường, trầm cảm, rối loạn tâm thần.


6

- Đau khớp, yếu cơ, chuột rút.
- Suy giáp, suy tuyến thượng thận, suy sinh dục, đái tháo đường.
Các triệu chứng này có thể đến đột ngột hoặc tiến triển chậm. Các triệu
chứng có thể xuất hiện sau khi dùng một số thực phẩm, thuốc, mất nước, bệnh
nhẹ, hoặc một số yếu tố khác. Các triệu chứng có thể xuất hiện trong vòng
một vài tuần sau khi sinh trong nhiều điều kiện nhưng cũng có thể mất nhiều
năm để các triệu chứng phát triển.

1.1.4 Chẩn đoán.
Hiện nay, hầu hết các bệnh rối loạn chuyển hóa bẩm sinh đều có thể
phát hiện bằng các xét nghiệm sàng lọc sơ sinh, hoặc sàng lọc sơ sinh mở
rộng sử dụng phương pháp phổ khối đôi [12]. Máy khối phổ đôi (Tandem MS/MS) là một công nghệ cho phép phát hiện và nhận dạng đồng thời nhiều
chất phân tích với độ nhạy, độ chính xác và độ đặc hiệu cao. Dựa trên các đặc
tính này, MS/MS đã được kết hợp như một công cụ chẩn đoán sàng lọc rối
loạn chuyển hóa bẩm sinh [13] có khả năng phát hiện hơn 50 bệnh khác nhau
trong một lần xét nghiệm [14]. Phương pháp sàng lọc rối loạn chuyển hóa
bẩm sinh bằng MS/MS lần đầu tiên được thực hiện bởi Millington và cộng sự
[15], [16] sau đó được tối ưu hóa hơn nữa và áp dụng cho sàng lọc chuyển
hóa sơ sinh bởi nhiều tác giả khác nhau [17], [18]. MS/MS hiện thay thế các
kỹ thuật sàng lọc truyền thống thường phân tích các dấu ấn sinh học riêng lẻ
cho từng bệnh. Hiện nay, MS/MS thường xuyên được sử dụng trong các nước
phát triển như Hoa Kỳ, Canada, Đức và Tây Ban Nha [19-22], và ở các nước
Mỹ Latinh như Mexico, Brazil và Costa Rica [23-25].
Nếu một rối loạn chuyển hóa bẩm sinh không được phát hiện ngay sau
khi sinh, nó thường không được chẩn đoán cho đến khi các triệu chứng xuất
hiện. Một khi các triệu chứng phát triển, xét nghiệm máu hoặc phân tích


7

đột biến gen có thể chẩn đoán được hầu hết các rối loạn chuyển hóa di
truyền [26].
1.1.5 Điều trị.
Hiện nay, phương pháp điều trị các rối loạn chuyển hóa bẩm sinh còn
rất hạn chế. Các khiếm khuyết di truyền trên gen gây ra tình trạng này hầu
như không thể sửa chữa bằng công nghệ hiện tại. Thay vào đó, phương pháp
điều trị là cố gắng giải quyết vấn đề với sự trao đổi chất. [27]
Phương pháp điều trị rối loạn chuyển hóa tuân theo một số nguyên tắc

chung: [27]
- Giảm hoặc loại bỏ lượng thức ăn hoặc thuốc không thể chuyển hóa
đúng cách.
- Thay thế enzym hoặc hóa chất khác khi bị thiếu hoặc không hoạt
động, để khôi phục sự trao đổi chất gần với mức bình thường nhất
có thể.
- Loại bỏ các sản phẩm độc hại của quá trình trao đổi chất tích lũy do
rối loạn chuyển hóa.
Điều trị có thể bao gồm các biện pháp như: [27]
- Chế độ ăn uống đặc biệt loại bỏ một số chất dinh dưỡng:
Ví dụ: giảm protein trong chế độ ăn uống vẫn là phương pháp điều
trị chính cho bệnh phenylketon niệu và các rối loạn axit amin khác.
- Dùng thay thể enzym, hoặc các chất bổ sung khác hỗ trợ quá trình
trao đổi chất.
Ví dụ: uống bột bắp nhiều lần trong ngày giúp ngăn ngừa những người
mắc bệnh lưu trữ glycogen khỏi bị hạ đường huyết nghiêm trọng.
- Xử lý máu bằng hóa chất để giải độc, loại bỏ các sản phẩm độc hại
của quá trình trao đổi chất.


8

1.2.Thiết lập khoảng tham chiếu.
1.2.1 Khoảng tham chiếu và thuật ngữ liên quan.
Khoảng tham chiếu (reference interval) (KTC) theo CLSI EP28-A3
được định nghĩa là khoảng giữa, bao gồm 2 giới hạn: giới hạn tham chiếu trên
và giới hạn tham chiếu dưới [2]. Khoảng tham chiếu ước tính bao gồm 95%
các giá trị trong quần thể từ các đối tượng tham chiếu được chọn. Xây dựng
KTC là quá trình bao gồm các bước từ lựa chọn cá thể tham chiếu tới chi tiết
về phương pháp phân tích và chọn lựa, xử lý số liệu [2].

Việc chuyển đổi khoảng tham chiếu là một quá trình điều chỉnh theo
KTC đã được thiết lập trước đó cho phù hợp với một phương pháp phân tích
mới hoặc một cơ sở mới [2].
Xác nhận (hoặc thẩm định) KTC là quá trình được đảm bảo với độ tin
cậy hợp lý, sử dụng một số lượng tương đối nhỏ cá thể tham chiếu (thường là
20) khi khoảng tham chiếu đã được xây dựng ở nơi khác hoặc chuyển đổi từ
nghiên cứu khác, để có thể được sử dụng tại cơ sở của mình [2].
Phân phối tham chiếu (reference distribution): phân phối của các giá
trị tham chiếu. Giả thuyết về phân bố của quần thể tham chiếu có thể được
thực hiện bằng cách sử dụng phân phối tham chiếu của nhóm mẫu tham chiếu
và phương pháp thống kê phù hợp [2].
Cá thể tham chiếu ( reference individual): một cá thể được chọn để
kiểm tra trên cơ sở các tiêu chí được xác định rõ. Điều quan trọng là phải xác
định tình trạng sức khỏe của người được lựa chọn [2].
Giới hạn tham chiếu (reference limit): một giá trị xác định từ phân
phối tham chiếu và được sử dụng cho mục đích mô tả. Giới hạn tham chiếu là
một phân đoạn đã xác định của giá trị tham chiếu nhỏ hơn hoặc bằng, lớn hơn
hoặc bằng với giới hạn dưới hoặc giới hạn trên tương ứng. Đối với hầu hết


9

các xét nghiệm, giới hạn tham chiếu trên và dưới được ước tính tương ứng là
bách phân vị thứ 2.5 và 97.5 của các kết quả xét nghiệm [2].
Quần thể tham chiếu (reference population): là một nhóm bao gồm
các cá thể tham chiếu [2].
Nhóm mẫu tham chiếu (reference sample group): số lượng người đủ
lớn được chọn lựa đại diện cho quần thể tham chiếu [2].
Giá trị tham chiếu (reference value): là tất cả các giá trị (kết quả xét
nghiệm) của cá thể tham chiếu trong nhóm mẫu tham chiếu [2].

1.2.2 Xác định khoảng tham chiếu.
Việc xây dựng giá trị tham chiếu và ước tính khoảng tham chiếu cho
một xét nghiệm cần được tiến hành với một quy trình rất rõ ràng. CLSI
EP28-A3 đã xây dựng quy trình thiết lập KTC áp dụng đối với một xét
nghiệm mới cho một nhóm cá thể khác nhau hoặc cho một phương pháp phân
tích mới có độ nhạy và độ đặc hiệu hơn so với phương pháp trước đây.
Theo Cerioti và cộng sự, bốn tiêu chí phải được xem xét trong thẩm
định của bất kỳ nghiên cứu về khoảng tham chiếu nào bao gồm :


10

- Lựa chọn cá nhân tham chiếu
- Thiết kế nghiên cứu
- Chất lượng phân tích của dữ liệu
- Xử lý thống kê dữ liệu
Việc xây dựng KTC chịu ảnh hưởng của nhiều biến, tuy nhiên hai biến
quan trọng cụ thể là phương pháp phân tích được sử dụng và quần thể mà từ
đó cá thể tham chiếu được lựa chọn [2].
Thực tế cho thấy, nghiên cứu xác định khoảng tham chiếu yêu cầu
nguồn lực, thời gian, chi phí khá lớn do vậy CLSI đề xuất trường hợp thẩm
định các nghiên cứu giá trị tham chiếu đã tồn tại, tốt hơn là tiến hành chuyển
đổi khoảng tham chiếu mà không cần tiến hành xây dựng mới. Việc chuyển
đổi chỉ có thể được chấp nhận nếu quần thể kiểm tra, toàn bộ phương pháp, từ
chuẩn bị người kiểm tra tới phương pháp đo là giống nhau hoặc so sánh tương
đương [2]. Chuyển đổi khoảng tham chiếu là quá trình để xác minh một
khoảng tham chiếu đã được thiết lập trước đó sang một phương pháp phân
tích mới hoặc đến một vị trí mới. Miễn là các nhà sản xuất tạo và cung cấp giá
trị tham chiếu đầy đủ và phù hợp thì các giá trị tham chiếu này sẽ được chấp

nhận.[2].
1.2.3 Lựa chọn đối tượng tham chiếu.
Có được một nhóm mẫu tham chiếu lớn bao gồm các đối tượng tham
chiếu được coi là liên quan đến vấn đề sức khỏe từ quần thể tham chiếu là
bước đầu tiên trong quy trình thiết lập khoảng tham chiếu. Nhóm mẫu phải bao
gồm tất cả những người khỏe mạnh, những người không bị rối loạn chuyển
hóa, không mắc các bệnh lý làm ảnh hưởng đến xét nghiệm xây dựng khoảng
tham chiếu. Theo hướng dẫn của CLSI, việc đánh giá sức khỏe cho một cá
nhân trước khi cho là đối tượng tham chiếu có thể bao gồm nhiều bài kiểm tra
khác nhau như xem lịch sử khám bệnh và các xét nghiệm cận lâm sàng.


11

CLSI đề xuất hai kỹ thuật lấy mẫu để chọn đối tượng tham chiếu: trực
tiếp và gián tiếp.
Kỹ thuật lấy mẫu trực tiếp là chọn các cá thể tham chiếu từ một quần
thể tham chiếu bằng các tiêu chí cụ thể, được xác định rõ. Nó được gọi là
một ưu tiên nếu các tiêu chí được áp dụng trước khi các mẫu được thu thập
và phân tích. Nếu các tiêu chí áp dụng sau khi thu thập mẫu thì được gọi là
hậu nghiệm.
Trong kỹ thuật lấy mẫu gián tiếp, các giá trị trong phòng thí nghiệm từ
cơ sở dữ liệu có sẵn được thiết lập cho các mục đích khác được sử dụng để
ước tính khoảng tham chiếu. Kỹ thuật lấy mẫu gián tiếp dựa trên giả định
quan sát thấy rằng hầu hết các kết quả cần đều xuất hiện. Do đó, kỹ thuật này
có lẽ thích hợp sử dụng dữ liệu từ những người tương đối khỏe mạnh như
người hiến máu, bệnh nhân trải qua thủ tục phẫu thuật nhỏ. Mặc dù kỹ thuật
tương đối đơn giản và rẻ tiền, tuy nhiên người ta phải cân nhắc cẩn thận hơn
để không bao gồm một số lượng lớn các giá trị từ các cá nhân không lành
mạnh xuất hiện trong cơ sở dữ liệu dẫn đến kết quả sai lệch [2], [28]

Trên thực tế, có thể bất tiện khi sử dụng kỹ thuật lấy mẫu trực tiếp để
lấy mẫu từ các đối tượng khỏe mạnh, đặc biệt là trong nhi khoa. Ngoài ra mỗi
nghiên cứu khoảng tham chiếu yêu cầu tối thiểu n = (100 / P) – 1 trong đó P là
tỷ lệ phần trăm cách nhau để phân biệt giữa hai phần trăm phân phối. Ví dụ:
số lượng đối tượng cần thiết với độ tin cậy 95% n = (100 / 2.5) – 1 = 39. Theo
Reed gợi ý rằng tối thiểu cần 120 giá trị đo mỗi giá trị từ một cá thể tham
chiếu với độ tin cậy 90%, với độ tin cậy 95% tối thiểu cần 146 giá trị đo, độ
tin cậy 99% tối thiểu cần 210 giá trị. Linnet cho rằng cỡ mẫu lên tới 700 đối
với dữ liệu phân bố lệch. Tuy nhiên thông thường cỡ mẫu tối thiểu là 120 với
điều kiện không có giữ liệu nào bị loại bỏ. Thêm nữa, cần phân tách khoảng
tham chiếu thành các phân lớp khác nhau (ví dụ như giới, tuổi). Mỗi khoảng


12

tham chiếu như vậy cần được dựa theo khuyến cáo về số lượng mẫu cũng cần
tối thiểu là 120 mẫu. Trường hợp các giá trị tham chiếu của phân lớp trong
một số quần thể nhất định như sơ sinh, trẻ con, người già, có thể khó hoặc
không thể có đủ số lượng mẫu yêu cầu. Bất kể với số lượng giá trị nào thu
được, dữ liệu vẫn cần phải phân tích theo phương pháp phi tham số. Phương
pháp Roburst cũng có thể được sử dụng trong trường hợp này.
Như vậy, phương pháp để xây dựng khoảng tham chiếu, hình dạng
phân bố của quần thể tham chiếu (chuẩn hay lệch), độ không đảm bảo chấp
nhận được của giới hạn tham chiếu, tất cả sẽ ảnh hưởng đến số lượng mẫu
tham chiếu. Tiêu chuẩn chung cho việc xác định cỡ mẫu là khoảng rộng
của 90% độ tin cậy (CI) nhỏ hơn 0.2 lần độ rộng của khoảng tham chiếu.
Nếu khoảng rộng của CI không được chấp nhận cần phải thu thập thêm
mẫu tham chiếu.
1.2.4 Kiểm tra giá trị tham chiếu và loại bỏ giá trị ngoại lai.
- Định nghĩa về Outliers: Một giả thuyết quan trọng được đặt ra trong

việc ước tính giới hạn tham chiếu là dãy giá trị tham chiếu đo được đại diện là
một bộ giá trị đồng nhất. Tuy nhiên có một vài giá trị phát sinh từ quần thể
khác (outlier). Những dữ liệu như vậy nằm giữa dãy số liệu, khó có thể phát
hiện ra trừ khi người thực hiện phân tích biết rằng các giá trị đo đại diện cho
các phân tích không điển hình hoặc là kết quả của lỗi quy trình hoặc số học.
Bởi vậy bước đầu tiên trong quá trình phân tích dữ liệu là kiểm tra trực quan
tần số phân bố. Có nhiều phương pháp thống kê để phát hiện giá trị ngoại lai
(outlier). Đa số các phương pháp này đều dựa trên giả định là quần thể phân
bố chuẩn.
- Phát hiện và xử lí với các giá trị ngoại lai: [2], [29], [30]
+ Phương pháp D/R được đề xuất bởi Dixon. D là giá trị tuyệt đối của
chênh lệch giữa giá trị nghi ngờ ngoại lệ và giá trị tiếp theo. R là toàn bộ


13

phạm vi của các quan sát (bao gồm cả các cực trị). Sau đó, tỷ lệ D/R được
ước tính và giá trị ngưỡng chính xác là giá trị 1/3. Nếu nó lớn hơn 1/3, ngoại
lệ sẽ bị xóa. Tuy nhiên, quy tắc này không nhạy cảm lắm khi có nhiều hơn
một ngoại lệ xuất hiện ở cùng một phía với phân phối.
+ Phương pháp Tukey là một phương pháp tinh vi để xác định các ngoại
lệ trong phạm vi liên vùng (Interquartile range - IQR). Giá trị IQR được tính
bằng Q3 – Q1 trong khi Q1 là tứ phân vị thứ nhất Q1 = 25*(n+1) /100 và Q3
là tứ phân vị thứ ba Q3 = 75*(n+1)/100. Các giá trị ở các mức thấp hơn ranh
giới dưới = Q1 – 1,5 IQR và lớn hơn ranh giới trên = Q3 + 1,5 IQR được xác
định là các ngoại lệ và bị loại bỏ.
- Các thử nghiệm về tính quy chuẩn của phân phối cơ sở dữ liệu: [31], [32]
Các thử nghiệm này so sánh các giá trị trong nhóm mẫu với một tập
hợp điểm được phân phối bình thường với cùng độ lệch chuẩn và trung bình.
Phân phối là chuẩn nếu thử nghiệm không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).

Có hai thử nghiệm thường được sử dụng để phát hiện phân phối trong phần
mềm SPSS.
+ Thử nghiệm Kolmogorov-Smirnov là một hàm phân phối theo kinh
nghiệm, trong đó hàm phân phối tích lũy lý thuyết của phân phối thử nghiệm
trái ngược với hàm phân phối theo kinh nghiệm của dữ liệu.
+ Thử nghiệm Shapiro-Wilk dựa trên mối tương quan giữa dữ liệu và
điểm số bình thường tương ứng. Nó tốt hơn so với thử nghiệm KolmogorovSmirnov nhưng số lượng mẫu tối đa được đề nghị là 50.
1.2.5 Xử lý thống kê dữ liệu
Tùy thuộc vào số lượng đối tượng tham chiếu, cũng như sự phân phối
các giá trị tham chiếu, CLSI đã hướng dẫn ba phương pháp khác nhau để xác
định khoảng tham chiếu:


14

- Phương pháp tham số: Nó giả định rằng các giá trị quan sát tuân theo
phân phối xác suất Gaussian – phân phối chuẩn. Giá trị trung bình

và độ

lệch chuẩn SD được tính toán sau đó khoảng tham chiếu được xác định là

- Phương pháp phi tham số: Phương pháp ước lượng phi tham số không
đưa ra giả định cụ thể về phân phối xác suất của các giá trị tham chiếu quan
sát được. Giới hạn tham chiếu được xác định bằng cách sử dụng thống kê thứ
tự tăng dần. Giới hạn tham chiếu thông thường được xác định bằng cách tính
thứ hạng cho phân vị thứ 2,5 và 97,5 [2]
X2,5 = 0.025 (n + 1)
X97,5 = 0.975 (n + 1)
Với n biểu thị số lượng quan sát trong một tập hợp dữ liệu tham chiếu

trong đó 95% khoảng tham chiếu được tính toán.
- Phương pháp trung gian: phương pháp này không yêu cầu nhiều quan
sát như phương pháp phi tham số và nó cũng không yêu cầu các giá trị tuân theo
phân phối Gaussian. Phương pháp này có dạng tương tự như tham số ngoại trừ,
đo vị trí và độ lan truyền thay vì trung bình và độ lệch chuẩn của mẫu. Điều đó
có nghĩa là trọng số được dành cho các giá trị trung tâm của phân phối nhiều hơn
so với các giá trị ở xa để tính các khoảng tham chiếu [33].
1.2.6 Xác nhận khoảng tham chiếu
Xác nhận một khoảng tham chiếu là quá trình sử dụng một số lượng
nhỏ các cá thể tham chiếu (thường là n = 20) để đảm bảo với độ tin cậy hợp lý
rằng một khoảng tham chiếu có thể được sử dụng cục bộ.


15

Có 2 cách để xác nhận theo thực tế: [2]
- Nếu trước đây, một phòng xét nghiệm đã thiết lập một khoảng tham
chiếu cho quần thể của phòng xét nghiệm đó, thì phòng xét nghiệm có thể xác
minh khoảng tham chiếu đó bằng cách chuyển, sử dụng tài liệu CL0/ NCCLS
EP098. Một lợi thế lớn của cách này là không cần phải thu thập các mẫu từ các
cá thể tham chiếu. Người ta có thể sử dụng các mẫu bệnh nhân hiện có, ngay cả
từ các đối tượng không được biết là khỏe mạnh, do đó vượt qua một trong
những trở ngại chính trong các nghiên cứu xây dựng khoảng tham chiếu.
- Một phòng xét nghiệm có thể xác nhận một khoảng tham chiếu, được
thiết lập bằng các kỹ thuật nghiêm ngặt hơn ở nơi khác, bằng cách thu thập ít
nhất 20 mẫu từ các cá thể tham chiếu đủ điều kiện. Như đã lưu ý với dữ liệu
từ các mẫu này trong tay, người ta có thể thực hiện một thử nghiệm nhị thức
đơn giản hoặc người ta có thể áp dụng các thử nghiệm tinh vi hơn để đạt được
độ nhạy và độ đặc hiệu tốt hơn.
Tuy nhiên, dù chọn phương pháp nào, điểm quan trọng là, chỉ có 20 mẫu

từ các cá thể tham chiếu, một phòng thí nghiệm có thể xác minh hợp lý khả
năng áp dụng của một khoảng tham chiếu cho dân số và phương pháp riêng
của mình.
1.3.Tình hình nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam
1.3.1. Trên thế giới
Khoảng tham chiếu hiện nay là vấn đề được quan tâm của nhiều đại
hội, hội thảo được tổ chức trên toàn thế giới. Sự khởi đầu của các nghiên cứu
về khoảng tham chiếu bắt đầu sớm trong giai đoạn từ năm 1965 đến năm
1980. Đến nay tiến trình này kéo theo 4 phong trào và nó sẽ liên tục phát
triển. Đặc biệt, xây dựng khoảng tham chiếu nhi khoa là một trong những
nhiệm vụ khó khăn nhất. Cho đến nay mới có rất ít các nghiên cứu về xây
dựng KTC ở trẻ sơ sinh cho xét nghiệm sàng lọc chuyển hóa bẩm sinh do