NGUYỄN THỊ LAN ANH KHẢO sát QUÁ TRÌNH sử DỤNG ALGINAT và PECTIN để tạo VI NANG ĐÔNG tụ CHỨA lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dƣợc sĩ

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ LAN ANH

KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH SỬ DỤNG
ALGINAT VÀ PECTIN ĐỂ TẠO VI
NANG ĐƠNG TỤ CHỨA
Lactobacillus acidophilus
KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2020


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ LAN ANH
Mã sinh viên: 1501020

KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH SỬ DỤNG
ALGINAT VÀ PECTIN ĐỂ TẠO VI
NANG ĐƠNG TỤ CHỨA
Lactobacillus acidophilus
KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:

Ths. Lê Ngọc Khánh
Nơi thực hiên
Bộ môn Công Nghiệp Dƣợc

HÀ NỘI - 2020


LỜI CẢM ƠN
Khóa luận đã được thực hiện và hồn thành tại tổ Vi sinh – Bộ môn Công
nghiệp Dược. Trong suốt thời gian thực hiện khóa luận, tơi đã nhận được nhiều sự
quan tâm, giúp đỡ của thầy cô, bạn bè, gia đình.
Với tất cả sự kính trọng và lịng biết ơn, tơi xin gửi lời cảm ơn đến PGS. TS.
Đàm Thanh Xuân và Ths. Lê Ngọc Khánh, những người thầy đã ln tận tình
hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi từ những ngày đầu tiên cho đến khi tơi hồn thành
khóa luận này.
Bên cạnh đó, tơi xin cảm ơn các thầy cô giáo và các anh chị kĩ thuật viên trong
bộ môn Công nghiệp Dƣợc, Bào chế và Viện Công Nghệ Dƣợc Phẩm Quốc Gia đã
tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tơi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô
giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cho tôi trong thời
gian học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ sự cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân và bạn
bè đã ln động viên, ủng hộ tơi trong q trình học tập và cuộc sống.
Hà Nội, ngày 20 tháng 06 năm 2020
Sinh viên
Nguyễn Thị Lan Anh


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CẤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
DANH MỤC CÁC BẢNG
ĐẶT VẤN ĐỀ ……………………………………………………………………..1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN………………………………………………………2

1.1. Đại cương về probiotic ..................................................................................... 2
1.1.1. Khái niệm probiotic ................................................................................... 2
1.1.2. Các chủng probiotic phổ biến .................................................................... 2
1.1.3. Các thế hệ bào chế của chế phẩm probiotic............................................... 3
1.2. Đại cương về prebiotic ..................................................................................... 4
1.2.1. Khái niệm prebiotic ................................................................................... 4
1.2.2. Tác dụng của prebiotic với sức khỏe ......................................................... 4
1.3. Lồi L. acidophilus........................................................................................... 5
1.3.1. Đặc điểm hình thái và điều kiện ni cấy ................................................. 5
1.3.2. Vai trị ........................................................................................................ 5
1.4. Khái niệm về vi nang và vi nang hóa ............................................................... 6
1.4.1. Định nghĩa.................................................................................................. 6

1.4.2. Đặc điểm của vi nang ................................................................................ 6
1.4.3. Ưu điểm của vi nang .................................................................................. 6
1.4.4. Nhược điểm của vi nang ............................................................................ 7
1.4.5. Phương pháp vi nang hóa .......................................................................... 7
1.4.6. Phương pháp tách pha đơng tụ .................................................................. 7
1.5. Một số thành phần sử dụng trong vi nang probiotic ....................................... 8

1.5.1. Pectin ......................................................................................................... 8


1.5.2. Tinh bột .................................................................................................... 10
1.5.3. Alginat ..................................................................................................... 11
1.6. Một số nghiên cứu sử dụng pectin trong bào chế thuốc ................................ 12
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU………………………………………………………….................14
2.1. Nguyên liệu và thiết bị ................................................................................... 14
2.1.1. Chủng vi sinh vật ..................................................................................... 14

2.1.2. Hóa chất ................................................................................................... 14
2.1.3. Mơi trường sử dụng trong nghiên cứu..................................................... 14
2.1.4. Thiết bị, dụng cụ ...................................................................................... 15
2.1.5. Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu ................................................ 15
2.2. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 16
2.2.1. Lựa chọn nồng độ nguyên liệu để tạo vi nang và khảo sát một số đặc tính
của vi nang tạo thành. ....................................................................................... 16
2.2.2. Theo dõi số lượng VSV và hàm ẩm của vi nang Alg-Tb-Pec trong quá trình
bảo quản ............................................................................................................ 16
2.3. Phương pháp nghiên cứu................................................................................ 17
2.3.1. Phương pháp nhân giống ......................................................................... 17
2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào.............................................. 17

2.3.3. Phương pháp vi nang hóa sử dụng kĩ thuật tách pha đông tụ .................. 17
2.3.4. Phương pháp đông khô ............................................................................ 18
2.3.5. Phương pháp xác định hàm ẩm................................................................ 18
2.3.6. Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật theo nguyên tắc pha loãng liên
tục....................................................................................................................... 18
2.3.7. Phương pháp tiệt khuẩn ........................................................................... 20
2.3.8. Phương pháp xác định hình ảnh bề mặt vi nang bằng kính lúp soi nổi Nikon
........................................................................................................................... 20


CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN................................21
3.1. Lựa chọn nồng nguyên liệu tạo vi nang và khảo sát một số đặc tính của vi nang
tạo thành ................................................................................................................ 21
3.1.1. Khảo sát nồng độ CaCl2 và pectin để tạo vi nang .................................... 21
3.1.2. Phối hợp vi nang với alginat và tinh bột .................................................. 24
3.1.3. Khảo sát các đặc tính của vi nang pectin phối hợp với alginat và tinh bột28
3.2. Theo dõi số lượng VSV và hàm ẩm của vi nang P1A3Tb10 trong quá trình bảo

quản ....................................................................................................................... 32
3.2.1. Đánh giá khả năng bao gói vi sinh vật của vi nang P1A3Tb10 .............. 32
3.2.2. Đánh giá độ ẩm của vi nang P1A3Tb10 trong quá trình bảo quản ......... 35
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT…..………………………………….38
4.1. Kết luận .......................................................................................................... 38
4.1.1. Nồng độ tạo vi nang và đặc tính của vi nang tạo thành ........................... 38

4.1.2. Theo dõi số lượng VSV và hàm ẩm của vi nang P1A3Tb10 trong quá trình
bảo quản ............................................................................................................. 38
4.2. Đề xuất ........................................................................................................... 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Alg

: Alginat

AP

: Amidated pectin

ATCC

: Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ
(American Type Culture Collection)

CFU

: Số đơn vị khuẩn lạc (Colony Forming Units)

FAO

: Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc
(Food and Agriculture Organization of the United Nations)

ISAPP

: Hiệp hội khoa học quốc tế về Probiotic và Prebiotic

HMP

: High methyl pectin

kl/tt

: Khối lượng/thể tích

LAB

: Vi khuẩn lactic (Lactic acid bacteria)

LMP

: Low methyl pectin

MRS

: Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (De Man, Rosoga and Sharpe)

MT

: Môi trường

Pec

: Pectin

SGF

: Dịch dạ dày mô phỏng (Stimulated Gastric Fluid)

Tb

: Tinh bột

VK

: Vi khuẩn

VSV

: Vi sinh vật

WHO

: Tổ chức y thế giới (World Health Organization)


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus ...............................................................5
Hình 1.2. Cấu trúc 1 đơn vị Galacturoic acid và phân tử pectin ....................................8
Hình 1.3. Mơ hình hộp trứng của pectin .......................................................................10
Hình 1.4. Cấu trúc của acid β-D-mammuronic (M) và acid α-L-guluronic (G) ..........12
Hình 3.1. Hình ảnh vi nang tạo thành với các nồng độ CaCl2 và pectin khác nhau ......22
Hình 3.2. Hình ảnh các mẫu vi nang trước đơng khơ....................................................25
Hình 3.3. Hình ảnh các mẫu vi nang dưới kính soi nổi Nikon độ phóng đại 10 lần ....25
Hình 3.4. Quá trình tạo thành gel calci alginat ..............................................................26
Hình 3.5. Hình ảnh các mẫu vi nang sau đơng khơ .......................................................27
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn hàm ẩm của các mẫu vi nang ngay sau đơng khơ ..............29
Hình 3.7. Độ rã của các mẫu vi nang trong môi trường mô phỏng dịch dạ dày pH 1,231
Hình 3.8. Khuẩn lạc của L. acidophilus bao bởi vi nang P1A3Tb10 trên môi trường
MRS thạch trước bảo quản ............................................................................................32
Hình 3.9. Khuẩn lạc của L. acidophilus bao bởi vi nang trên môi trường MRS thạch
sau 3 tháng bảo quản .....................................................................................................33
Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn số lượng tế bào L.acidophilus trong vi nang P1A3Tb10
sau đông khơ và trong q trình bảo quản .....................................................................34
Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn hàm ẩm của vi nang P1A3Tb10 sau đơng khơ và trong q
trình bảo quản ................................................................................................................36


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Một số đặc điểm chính của pectin ...................................................................9
Bảng 2.1. Nguyên liệu và hóa chất sử dụng ..................................................................14
Bảng 2.2. Các thiết bị dùng trong nghiên cứu ...............................................................15
Bảng 3.1. Khảo sát nồng độ CaCl2 và pectin đến quá trình hình thành hạt...................21
Bảng 3.2. Thể chất, hình dạng của hạt vi nang trước đông khô ....................................25
Bảng 3.3. Thể chất, hình dạng của vi nang sau đơng khơ .............................................27
Bảng 3.4. Hàm ẩm của các mẫu ngay sau khi đông khô ...............................................28
Bảng 3.5. Số lượng tế bào L. acidophilus trong vi nang P1A3Tb10 sau đơng khơ và

trong q trình bảo quản ................................................................................................33
Bảng 3.6. Hàm ẩm của vi nang P1A3Tb10 sau đơng khơ và trong q trình bảo quản35


ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay probiotic được biết đến là một nhóm các vi sinh vật sống có lợi được
tìm thấy trong hệ vi sinh đường ruột của con người, mang lại nhiều lợi ích cho con
người như: tăng cường miễn dịch, chống tại các tác nhân bệnh tật..... [2]. Tuy nhiên
nếu dùng theo đường uống, tỷ lệ sống sót của probiotic khá thấp khi đi qua dạ dày do
dễ bị tác động bất lợi của các yếu tố như pH, nhiệt độ, ánh sáng, hàm ẩm....[3]. Vi
nang hóa các probiotic với các polymer có nguồn gốc tự nhiên như alginat, chitosan,
carrageenan ... đã giúp bảo vệ probiotic khỏi tác động bất lợi khi di chuyển trong
đường tiêu hóa.
Với những lợi ích vượt trội đó, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành trong cả
nước và trên thế giới. Mỗi loại probiotic nhất định chỉ phù hợp với một hoặc một số
prebiotic nhất định. Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện xác định các synbiotic tiềm
năng trên cơ sở kết hợp prebiotic và probiotic. Một số nghiên cứu gần đây đã phối
hợp alginat với một số prebiotic như inulin, pectin..... [59] trong q trình vi nang hóa
với mục đích tăng cường số lượng vi sinh vật probiotic sống ở đại tràng. Tiếp nối các
nghiên cứu về probiotic, đề tài: “Khảo sát quá trình sử dụng alginat và pectin để
tạo vi nang đơng tụ chứa Lactobacillus acidophilus” được thực hiện với các mục
tiêu sau:
1. Lựa chọn nồng độ nguyên liệu để tạo vi nang và khảo sát một số đặc tính
của vi nang tạo thành.
2. Theo dõi số lượng VSV và hàm ẩm của vi nang Pec-Alg-Tb trong quá trình
bảo quản

1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Đại cƣơng về probiotic
1.1.1.

Khái niệm probiotic

Probiotic là thuật ngữ bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là “dành cho sự sống”,
dùng để chỉ vi khuẩn mang lại tác động có lợi cho vật chủ. Từ hàng nghìn năm
trước, con người đã biết sử dụng các chế phẩm sữa lên men với mục đích tăng
cường sức khỏe, nhưng lợi ích từ nó vẫn chưa được khám phá. Định nghĩa
probiotic hiện tại được đưa ra vào năm 2002 bởi WHO và FAO như sau: “Probiotic
là những vi sinh vật sống mà khi đưa vào cơ thể với một lượng đủ lớn sẽ đem lại
tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ”. Định nghĩa về probiotic này cũng được Hiệp
hội khoa học quốc tế về Probiotic và Prebiotic (ISAPP) áp dụng và được sử dụng
trong hầu hết các ấn phẩm khoa học.
Theo đó, tiêu chuẩn quan trọng nhất để chọn chủng vi khuẩn probiotic là phải có
khả năng sống sót qua hệ tiêu hóa và có khả năng phát triển trong ruột. Theo
WHO, vi sinh vật trong chế phẩm phải ổn định suốt quá trình bảo quản, duy trì số
lượng sống sót ở mức tối thiểu là 106 - 107 CFU/g [15].
1.1.2. Các chủng probiotic phổ biến
Không phải vi sinh vật nào cũng có thể lựa chọn để sử dụng trong chế phẩm
probiotic. Vi sinh vật trong chế phẩm probiotic phải thỏa mãn những tiêu chuẩn
khắt khe: có nguồn gốc từ người, có khả năng bám dính vào niêm mạc ruột và ngăn
vi khuẩn gây bệnh bám, chống chịu được dịch dạ dày và acid mật để đến được ruột
và tại ruột phải phóng thích tốt, sản sinh nhanh chóng để phát huy tối đa tác dụng
cân bằng hệ VSV đường ruột, thật sự có khả năng kháng được vi khuẩn gây bệnh,
được cơng nhận có tác dụng tích cực trong chữa trị và an tồn khi sử dụng
(GRAS). Các vi khuẩn có nguồn gốc từ người thuộc nhóm vi khuẩn Lactic và vi
khuẩn hội sinh khơng mang yếu tố gây bệnh như Lactiobacilus (L. acidophilus, L.
casein, L. plantarum, L. rhamnosus …..), Bifidobacterium (B. longum, B. infantis

…), Enterococcus và Streptococcus …. được sử dụng nhiều. Trong đó, chiếm đông
đảo nhất là vi khuẩn thuộc hai chi Lactobacillus và Bifidobacterium. Những vi

2


khuẩn này thường cư trú trong ruột [26], [3]. Bên cạnh những vi khuẩn cịn có nấm
men Saccharomyces cũng được xếp vào nhóm vi sinh vật probiotic [48], [49].
1.1.3. Các thế hệ bào chế của chế phẩm probiotic
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, số lượng vi sinh vật còn sống có khả năng vận
chuyển đến cơ quan đích để gây ra tác dụng có lợi là rất thấp. Hiện nay ở Việt Nam
có các dạng:
Thế hệ 1: vi sinh vật probiotic sử dụng tự nhiên, không bao, dạng bào chế
bột, cốm, đơn lồi. Vi khuẩn hầu như khơng thể sống sót khi đi qua dạ dày và dịch
mật.
Thế hệ 2: không bao, dạng bào chế nang cứng, đơn và đa lồi. Vi khuẩn
được đưa vào dưới dạng bột đóng trong nang cứng, vẫn chịu ảnh hưởng của các
yếu tố mơi trường bên ngồi và trong đường tiêu hóa khiến số lượng VSV bị suy
giảm.
Thế hệ 3: Bao tan trong ruột. Vi khuẩn chứa trong nang có lớp bảo vệ chỉ
tan trong ruột, hầu hết probiotic được xử lý với một polyme acrylic acid.
Thế hệ 4: Vi nang hóa, tan trong ruột. Phương pháp này sử dụng chất tạo
màng là các polyme có nguồn gốc tự nhiên để giúp bảo vệ tế bào vi khuẩn khỏi
môi trường xung quanh như acid cao, pH thấp, muối mật hoặc sốc nhiệt.
Thế hệ 5: Bao kép, giải phóng VSV ở ruột. Lớp bao thứ nhất- lớp trong
cùng là hệ thống pedtid/protein, phóng thích vi khuẩn căn cứ vào độ pH của mơi
trường. Nó bảo vệ vi khuẩn trong suốt q trình tiêu hóa, giúp vi khuẩn vẫn còn
sống khi đến ruột và trong điều kiện tốt vi khuẩn sẽ định cư và tăng sinh. Lớp bao
thứ hai, với hệ thống polysaccharid và hydrocolloid, giúp bảo vệ vi khuẩn chống lại
tác động của độ ẩm, nhiệt độ, áp suất ….. , làm tăng độ ổn định của vi khuẩn trong

suốt quá trình sản xuất và thời hạn sử dụng của sản phẩm [5].

3


1.2. Đại cƣơng về prebiotic
1.2.1. Khái niệm prebiotic
Khái niệm prebiotic lần đầu tiên được Gibson GR, Roberfroid MB định
nghĩa vào năm 1995 như sau: “Prebiotic là các thành phần thực phẩm khơng tiêu
hóa được, mang lại tác động có lợi cho vật chủ bằng cách kích thích chọn lọc sự
phát triển và/hoặc hoạt động của một hoặc một số lượng hạn chế các lồi vi khuẩn
trong ruột già, do đó góp phần cải thiện sức khỏe vật chủ” [25], [51], [45]. Năm
2007, các tác giả đã xem xét lại và đưa ra một khái niệm mới, trong đó prebiotic
được định nghĩa là thành phần lên men có chọn lọc, tạo ra sự thay đổi về thành
phần và/ hoặc hoạt động của vi sinh đường ruột, mang lại lợi ích cho sức khỏe vật
chủ [51], [47].
Năm 2011, WHO cũng đưa ra định nghĩa về prebiotic, được phát biểu như
sau: “Prebiotic là những thành phần thực phẩm (hầu hết là chất xơ và các
oligosaccharid khơng bị tiêu hóa bởi enzyme trong cơ thể con người) ni dưỡng
một nhóm vi sinh một chọn lọc đường ruột. Chúng kích thích sự phát triển của các
vi sinh vật có lợi hơn là các vi sinh vật gây hại” [31].
Hiện nay có một số loại carbohydrat như imulin, fructooligosaccharid
(FOS), trans-galactooligosaccharid (TOS hoặc GOS) hay lactulose đáp ứng được
các yêu cầu của prebiotic [51], [31]. Probiotic và prebiotic kết hợp tạo thành chế
phẩm synbiotic. Mục đích chính của sự kết hợp đó là cải thiện khả năng sống sót
của các vi sinh vật đường tiêu hóa [39].
1.2.2. Tác dụng của prebiotic với sức khỏe
Prebiotic có những tác dụng chính sau:
-

Ảnh hưởng đến sự thay đổi hệ vi sinh đường ruột, thúc đẩy sự phát triển của các
VSV như vi khuẩn lactic và vi khuẩn bifido [20].

-

Tăng cường miễn dịch: Các nghiên cứu chỉ ra bổ sung FOS và lactulose trong
chế độ ăn uống sẽ tăng sản xuất globulin miễn dịch niêm mạc, hạch bạch huyết
mạc treo [20].

4


-

Tác dụng trên chuyển hóa lipid: Thử nghiệm trên động vật là một vài nghiên
cứu trên người cho thấy cholesterol và chất béo trung tính trong cơ thể giảm khi
sử dụng prebiotic [20].

-

Hấp thu chất khoáng: Prebiotic giúp cải thiện lượng hấp thu canxi, magie, sắt,
kẽm…. tăng cường trao đổi khống chuyển thành xương, do đó có lợi trong
việc ngăn ngừa lỗng xương cũng như phịng tránh bệnh thiếu máu liên quan
đến chế độ ăn uống và tăng cường hấp thu vi chất dinh dưỡng [20].

1.3. Loài L. acidophilus
1.3.1. Đặc điểm hình thái và điều kiện ni cấy
L. acidophilus thuộc họ Lactobacillaceae, chi Lactobacilus, nhóm vi khuẩn lactic
(LAB), tồn tại trong đường tiêu hóa, âm đạo của người và động vật, được sử dụng
rộng rãi trong các chế phẩm probiotic [2].

L. acidophilus là trực khuẩn hình que, Gram dương, kích thước thường là 0,6 – 0,9
x 1,5 – 6,0 µm, tồn tại đơn lẻ hoặc xếp đôi hay chuỗi ngắn, khơng sinh bào tử,
khơng di động, kị khí khơng bắt buộc, phản ứng catalase âm tính. Nhiệt độ tối ưu
cho sự phát triển là 37ᵒC, tối đa trong khoảng 43- 48ᵒC, khơng phát triển trong
khoảng 20-22ᵒC, có khả năng chịu được điều kiện pH khoảng 5,0 đến 6,0 trong 2436 giờ, có khả năng chuyển hóa đường lactose tạo ra sản phẩm L (+) lactic [25].

Hình 1.1.Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus
1.3.2. Vai trị
L. acidophilus đem lại nhiều tác động có lợi đối với sức khỏe vật chủ. Khi L.
acidophilus vào trong cơ thể, chúng định cư ở ruột, cạnh tranh vị trí bám trên thành
ruột với vi khuẩn có hại, làm giảm số lượng vi khuẩn gây hại ở ruột non. L.
acidophilus có thể sinh ra acid lactic, tạo mơi trường acid yếu, môi trường này là
5


điều kiện thuận lợi cho hệ lên men đường ruột nhưng lại bất lợi cho các vi sinh vật
gây bệnh [28]. Ngồi ra, chúng cịn có thể sản xuất được các chất diệt khuẩn như
lactocidin, bacteriocin giúp ngăn cản sự xâm nhập và ức chế tăng sinh các vi khuẩn
gây bệnh. Việc sử dụng kháng sinh trong điều trị đã làm giảm một lượng lớn VSV
có lợi trong đường ruột, do đó, bổ sung L. acidophilus làm cân bằng hệ VSV
đường ruột, giúp cơ thể đề kháng với nhiễm khuẩn đường ruột, ngăn ngừa tiêu
chảy đặc biệt là tiêu chảy do kháng sinh [36]. Một số nghiên cứu đã chỉ ra tác dụng
của L. acidophilus trong việc ức chế sự phát triển của vi khuẩn Helicobacter pylori,
một trong những nguyên nhân gây bệnh viêm loét dạ dày tá tràng [35].
1.4. Khái niệm về vi nang và vi nang hóa
1.4.1. Định nghĩa
Vi nang (microcapsule) là những tiểu phân hình cầu hoặc khơng xác định, kích
thước từ 0,1µ tới 5mm (thơng thường từ 100 đến 500µ) bên trong chứa hoạt chất,
bên ngồi được bao màng mỏng polymer liên tục [24].
Vi nang hóa là cơng nghệ đóng gói chất rắn, chất lỏng và chất khí trong các viên

nang nhỏ trong đó các thành phần trên được giải phóng ở một tỉ lệ có kiểm sốt
trong một thời gian dài [45]. Trong đó, phần nhân hay chất được bẫy là các tế bào,
cơ thể vi sinh vật sống; phần vỏ là các polymer có nguồn gốc tự nhiên như gelatin,
alginate, chitosan, cellulose,…. hoặc có nguồn gốc nhân tạo như polyamid,
polystyrene,

polyacrylat,

polyacrylamide,

polyester,

polyvinyl

pyrolidon,

polyethylene glycon,… tạo nên màng mỏng, bề dày từ 0,1 đến 200µ [24], [6] để
bẫy, nhốt và bao gói các tế bào, cơ thể vi sinh vật sống.
1.4.2. Đặc điểm của vi nang
Vi nang giúp tế bào được cách ly với môi trường xung quanh, bảo vệ và làm giảm
sự tổn thương cũng như sự tổn thất số lượng tế bào vi sinh vật, bằng cách này
chúng sẽ được bảo vệ tốt hơn trong các điều kiện bất lợi như acid cao, pH thấp,
muối mật, sốc nhiệt … và chỉ giải phóng tế bào tại nơi mong muốn [55].
1.4.3. Ưu điểm của vi nang
Vi nang có khả năng tạo ra mật độ VSV lớn do đó có thể cố định một lượng lớn tế
bào sống. Phương pháp vi nang hóa giúp cải thiện cảm quan cho sản phẩm, tăng
6


khả năng chịu nhiệt, chịu acid, kéo dài thời gian sử dụng của chế phẩm, giúp quá

trình bảo quản trở nên thuận lợi hơn [6], [33], bảo vệ vi sinh vật chống lại tác nhân
bacteriophage bên ngoài, đảm bảo quá trình lên men khơng bị nhiễm tạp, hư hại
[23], [3].
1.4.4. Nhược điểm của vi nang
Đa số các nguyên liệu sử dụng trong q trình vi nang hóa như thạch, gelatin, các
loại tinh bột…. đều là những nguồn dinh dưỡng mà vi sinh vật có thể tiêu hóa
được. Điều này dẫn đến vi sinh vật được bao gói bên trong hoặc vi sinh vật tạp
nhiễm từ bên ngồi có thể tiêu hóa làm cho lớp vi nang bị rách, thủng và như vậy
hiệu quả vi nang hóa sẽ giảm đáng kể.
1.4.5. Phương pháp vi nang hóa
Có nhiều phương pháp bào chế vi nang chứa vi sinh vật probiotic. Việc lựa chọn
phương pháp chế tạo vi nang phụ thuộc vào điều kiện thực tế như độ tan, tính
tương đồng, kích thước vi nang …. [5].
Các phương pháp vi nang hóa có thể được phân loại như sau:
 Phương pháp hóa lý (bao gồm đông tụ đơn giản và phức tạp): các polymer
không tương thích, bốc hơi dung mơi, sử dụng chất lỏng siêu tới hạn …
 Phương pháp vật lý: ly tâm, bao tầng sơi, xát hạt tầng sơi, máy quay trịn, nồi
bao viên thơng thường, phun sấy…
 Phương pháp hóa học: polymer hóa (tương tác các polymer, polymer hóa về
mặt ….)
1.4.6. Phương pháp tách pha đông tụ
Nguyên tắc:
Các pha được tách ra nhờ sự thay đổi nhiệt độ, sự hóa muối hoặc khi thêm một
dung môi thứ hai vào hệ vi nang, làm thay đổi độ tan của polyme, dẫn đến hình
thành một pha mới. Lúc này hệ vi nang trở thành hai pha, một pha có nồng độ cao
nhất keo được tách ra dưới dạng nhỏ gọi là các hạt đơng tụ.
Có thể chia thành hai nhóm cơ bản:
7

a. Đơng tụ đơn giản
Là q trình loại nước của các chất keo thân nước dùng trong hệ, do đó làm
giảm độ tan của chất keo. Trong phương pháp này thường chỉ sử dụng một loại
polyme như gelatin, polyvinyl alcol, carboxymethyl cellulose …. [1].
b. Đơng tụ phức hợp
Là q trình tương tác giữa phân tử tích điện âm và tích điện dương của hai
hoặc nhiều hợp chất cao phân tử, hoặc do sự thay đổi nồng độ chất tan cao phân
tử. Các polyme càng có sự khác nhau về điểm đẳng điện càng dễ tạo thành hạt
đông tụ [5], [24], [41]. Bản chất của quá trình này là khi nhỏ dung dịch keo thân
nước vào dung dịch hóa rắn, trong đó các cation hóa trị cao khiến cho dung
dịch keo thay đổi cấu trúc, xảy ra hiện tượng đông tụ, hóa rắn tạo vi nang [52].
1.5. Một số thành phần sử dụng trong vi nang probiotic
1.5.1. Pectin
1.5.1.1. Cấu tạo
Giống như nhiều polysaccarid tự nhiên, pectin không đồng nhất về cấu trúc hóa
học và trọng lượng phân tử. Pectin chủ yếu chứa một lượng lớn poly (dgalacturonic acid) liên kết qua 1,4-α-glucosid. Pectin cũng chứa đường trung tính
như 1-ramhama ở mạch nhánh hoặc gắn với chuỗi chính [37], [53]. Trọng lượng
phân tử khoảng từ 50.000–150.000 đvC tùy thuộc vào nguồn nguyên liệu sản xuất
pectin. Các nhóm carboxyl (- COOH) có thể tồn tại dạng tự do hoặc ở dạng liên kết
este với methanol, acid acetic hoặc ở dạng muối của Na+, K+, NH4+ hoặc bị amid
hóa tạo thành các nhóm amid ( - CO=NH2) [46], [56].

Hình 1.2. Cấu trúc 1 đơn vị Galacturoic acid và phân tử pectin
8


1.5.1.2. Phân loại
Các chỉ số quan trọng trong cấu trúc phân tử pectin:
-

Chỉ số methoxy (MI): thể hiện cho phần trăm khối lượng nhóm methoxy (OCH3 ) có trong phân tử pectin

-

Chỉ số este hóa (DE): thể hiện mức độ este hóa của các phân tử acid
galacturonic trong phân tử pectin.

Dựa vào các chỉ số trên phân loại pectin thành 2 nhóm chính: HMP (High
methoxyl pectin) và LMP (Low methoxy pectin) [46], [54].
Bảng 1.1. Một số đặc điểm chính của pectin
Loại

HMP (High methoxyl pectin)

LMP (Low methoxyl pectin )

pectin
Chỉ số

DE > 50% hay MI > 7%

DE < 50% hay MI < 7%

DE/MI
Điều kiện

+ pH = 3-4

+ pH = 2-6

tạo gel

+ Nồng độ đường > 60%

+ Khơng cần sự có mặt của

+ Nồng độ pectin: 0,5 – 1%

đường, cần sự có mặt của ion
hóa trị 2 như Ca2+, Mg2+
+ Nồng độ pectin: Khơng u
cầu

Cơ chế

Dựa trên sự hình thành liên kết

Dựa trên khả năng tạo phức

hình thành

hydro liên phân tử giữa các

lồng của các phân tử acid

gel

nhóm carboxy tự do trên các

galacturonic với các ion Ca2+

phân tử pectin và giữa các nhóm
hydroxy của các phân tử nước
lân cận.
Đặc điểm

+ Phụ thuộc vào hàm lượng + Phụ thuộc vào nồng độ Ca2+

gel tạo

đường, aicd, pectin, loại pectin và chỉ số methoxyl

thành

và nhiệt độ

+ Độ đàn hồi gel có thể tạo ra

+ Lượng pectin nhiều quá mức lớn hơn so với HMP
quy định sẽ làm gel cứng.
9


+ Khi sử dụng một lượng cố
định pectin, pH, nhiệt độ càng
giảm, hàm lượng đường càng
cao thì gel càng cao.

1.5.1.3. Sự tạo gel của pectin
Các yếu tố ảnh hưởng tới đặc tính của gel là loại pectin, nồng độ của pectin, DE

(chỉ số ester hóa), DA (chỉ số amid hóa), sự thay đổi của nhóm hydroxyl, pH dung
dịch, nhiệt độ và sự có mặt của cation. Tất cả các tham số này phụ thuộc lẫn nhau.
Pectin có thể tạo gel theo nhiều cách khác nhau tùy thuộc vào loại và cấu trúc của
phân tử pectin. Gel có thể được hình thành bởi môi trường acid, bằng cách liên kết
với ion calci, hoặc bằng phản ứng hiệp đồng với alginat …. Sự tương tác của ion
calci và các nhóm carboxylat trong pectin tạo thành phức chelat dẫn tới sự hình
thành các khối phân tử lớn cịn gọi là “mơ hình hộp trứng” [14], [37].

Hình 1.3. Mơ hình hộp trứng của pectin
1.5.2. Tinh bột
Tinh bột là một polysaccharid được cấu tạo từ amylose và amylopectin. Cả hai cấu
tử này đều được cấu tạo từ α- D glucose. Các gốc glucose trong amylose kết hợp
với nhau qua liên kết α 1,4–glysosid. Amylopectin có cấu trúc phân nhánh, ngồi
liên kết α–1,4–glucosid cịn có các liên kết α–1,6–glucosid ở điểm phân nhánh. Tỉ
lệ amylose/ amylopectin trong đa số tinh bột là ¼ [17].
Tinh bột là một polysaccharid tự nhiên, có tính tương hợp sinh học với nhiều
nguyên liệu khác. Tinh bột không độc, không sinh đáp ứng miễn dịch, được sử
dụng làm tá dược độn phổ biến, giá rẻ và có thể được phân hủy bởi α- amylase
[19]. Tinh bột là một tá dược bảo vệ trong q trình đơng khơ theo cơ chế làm giảm
10


lượng tinh thể nước gắn với màng tế bào trong mẫu. Khi tạo vi nang calci alginat,
tinh bột được phối hợp như tá dược độn rắn, góp phần cải thiện thể chất của vi
nang sau đông khô, giúp tế bào ổn định hơn, cải thiện khả năng sống sót trong q
trình đơng khơ và bảo quản [19], [9], [35]. L. acidophilus khơng có khả năng tiêu
thụ tinh bột, vì vậy tinh bột có thể được lựa chọn trong vi nang hóa L. acidophilus.
1.5.3. Alginat
1.5.3.1. Tính chất
Alginat là tên gọi chung cho các muối của acid alginic, tồn tại dưới dạng anion.

Acid alginic là một polysaccharid mạch thẳng ưa nước, cấu tạo từ hai gốc acid
uronic là acid β-D-mammuronic (M) và acid α-L-guluronic (G) nối với nhau bằng
liên kết 1-4-glycosid [44].
Alginat được chiết xuất từ rong biển nâu, không độc, tương đồng sinh học cao, giá
thành rẻ nên alginat có tính thương mại nhất trong ngành thực phẩm, được sử dụng
rộng rãi, an tồn để bao gói các chất đại phân tử, tế bào [24].
1.5.3.2. Độ hòa tan, độ nhớt, sự gel hóa
Các muối kim loại hóa trị I (Na+, K+ ….), muối amoni và muối của các amin phân
tử lượng thấp của acid alginic tan được trong nước tạo dung dịch keo nhớt. Các
muối của acid alginic với các kim loại đa hóa trị (Ca2+, Ba2+ ….) khơng tan trong
nước (trừ muối Mg2+). Các muối alginat hòa tan được trong các dung mơi thân
nước như alcol, aceton ….. và hịa tan dễ dàng hơn khi đun nóng.
Độ nhớt: Natri alginat khi tan trong nước tạo thành dung dịch có độ nhớt dao động
trong khoảng từ 10-3500 cps. Độ nhớt của dung dịch alginat ảnh hưởng bởi khối
lượng phân tử trung bình, nồng độ alginat sử dụng, nhiệt độ pH và sự có mặt cả các
ion kim loại có trong dung dịch.
Sự gel hóa: Dung dịch alginat có khả năng tạo gel khi phản ứng với các ion kim
loại

11


Hình 1.4. Cấu trúc của acid β-D-mammuronic (M) và acid α-L-guluronic (G)

1.6. Một số nghiên cứu sử dụng pectin trong bào chế thuốc
Trên thế giới
Năm 2017, nhóm tác giả Aigerim Bepeyeva, Joao M.S. de Barros, Hanady
Albadran,

Aitbek

K.

Kakimov,

Zhaynagul

Kh.

Charalampopoulos, and Vitaliy V. Khutoryanskiy

Kakimova,

Dimitris

đã tiến hành bao gói

Lactobacillus casei trong vi nang pectin - chitosan với các nồng độ (1%, 2%, 3%)
và các loại pectin (khác nhau LMP, HMP và AP) [59]. Nhóm tác giả đã đánh giá
vi nang trên các tiêu chí: độ nén, đường kính và thể chất vật lí để chọn vi nang bao
gói. Kết quả cho thấy AP với nồng độ 3% có những đặc tính phù hợp nhất cho việc
bao gói Lactobacillus casei. Bên cạnh đó, khi tăng nồng độ pectin thì kích thước và
độ bền cơ học của vi nang cũng tăng và AP tạo được vi nang với độ bền cơ học lớn
hơn so với HMP ở cùng nồng độ. Vi nang AP 3% sau đó được đánh giá khả năng
bảo vệ si sinh vật trong môi trường acid dạ dày mô phỏng pH = 2, kết quả là sau 2
tiếng, khơng có sự mất vi sinh vật trong vi nang. Một số nghiên cứu trước đó [59]
chỉ ra rằng, vi nang tạo thành từ alginat - chitosan mang đến sự bảo vệ yếu hơn so
với vi nang pectin - alginat. Trong môi trường mô phỏng ruột non, ở pH = 7, vi
nang bị rã và giải phóng vi sinh vật.
Tại Việt Nam

Nguyễn Thu Quỳnh và cộng sự (2012) nghiên cứu bào chế viên nén metronidazol
giải phóng tại đại tràng bằng phương pháp bao dập tá dược bao là pectin. Kết quả
nghiên cứu cho thấy khi tăng tỉ lệ pectin, lớp vỏ bao dày lên thì thời gian tiềm tàng
tăng nhưng khơng nhiều và khó kéo dài được tới 5 giờ để viên đến được đại tràng.
12


Khi kết hợp với HPMC để bao viên, thời gian tiềm tàng của viên tăng lên đáng kể.
Công thức vỏ bao kết hợp pectin và HPMC K100M tỉ lệ 1:1, tỉ lệ lớp vỏ bao so với
viên nhân 350% có thời gian tiềm tàng là 10 giờ, đạt yêu cầu đề ra với viên nén
giải phóng tại đại tràng [46].

13


CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và thiết bị
2.1.1. Chủng vi sinh vật
Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 (Bộ mơn Cơng nghiệp Dƣợc)
2.1.2. Hóa chất
Bảng 2.1. Nguyên liệu và hóa chất sử dụng
Tên hóa chất

Nguồn gốc

Tên hóa chất

Nguồn gốc

Glucose

Trung Quốc

Natri acetat

Trung Quốc

Pepton

Ấn Độ

Natri citrat

Trung Quốc

Cao thịt

Merck Đức

Natri alginat

Ấn Độ

Cao nấm men

Merck Đức

Calci clorid

Trung Quốc

KH2 PO4

Trung Quốc

Acid acetic băng

Trung Quốc

MgSO4.7H2O

Trung Quốc

Thạch (Argar)

Việt Nam

MnSO4.4H2O

Trung Quốc

Tinh bột

Việt Nam

Natri clorid

Trung Quốc

Pectin

Triamoni citrat

Trung Quốc

Bộ môn Bào chế

2.1.3. Môi trƣờng sử dụng trong nghiên cứu
2.1.3.1. Môi trường MRS lỏng (MT1):
Thành phần

Hàm lượng

Thành phần

Hàm lượng

Glucose

20 g

Natri acetat

5g

Pepton

10 g

KH2 PO4

2g

Cao thịt

10 g

MgSO4.7H2O

0.2 g

Cao nấm men

5g

MnSO4.4H2O

0.05 g

Triamoni citrat

2g

Nước máy vừa đủ

1000 ml

pH

6,8 – 7,0

14


2.1.3.2. Môi trường MRS thạch (MT2)
MT 2 = MT 1 + thạch 2% (2 g thạch /100 ml môi trường)
2.1.4.

Thiết bị, dụng cụ

 Thiết bị
Bảng 2.2. Các thiết bị dùng trong nghiên cứu
Tên thiết bị

Nguồn gốc

Tên thiết bị

Cân kỹ thuật

Đức (Satorius)

Nồi

hấp

Nguồn gốc
tiệt Nhật (ALP)

trùng
Kính lúp soi nổi

Nhật (Nikon)

Tủ ấm CO2

Nhật (Sanyo)

Máy đo hàm ẩm

Mỹ (Ohans)

Tủ cấy vô trùng

Nhật (Sanyo)

Máy khuấy từ

Hàn Quốc (Wisd)

Tủ lạnh

Hàn Quốc (LG)

Tủ sấy

Hàn Quốc (Daihan)

Máy lắc ổn nhiệt Trung Quốc (KWF)

Máy li tâm

Đức (Satorius)

Thiết

bị

đông Đức (Christ Alpha)

khơ
 Dụng cụ
Bình nón 100, 250, 1000 ml

Pipet pasteur

Lưới vớt hạt

Pipet chia vạch

Ống đong

Pipet tips (Đầu côn)

Ống ly tâm

Pipet Eppendort

Ống nghiệm có nắp

Đĩa petri đường kính 9 cm

Cốc có mỏ
2.1.5.
-

Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu
Dung dịch alginat 6% (kl/tt): cân 6,00 g natri alginat, phân tán đều trong 100 ml
nước cất. Đem hấp tiệt trùng ở 115ᵒC trong 20 phút cho alginat đồng nhất (dd
1)

-

Dung dịch pectin 2%, tinh bột 20% (kl/tt): cân 2 g pectin, 20 g tinh bột đã hấp
tiệt trùng bằng phương pháp Tindal, phân tán đều trong 100 ml nước cất (dd 2)

-

Dung dịch pectin 1%, alginat 3%, tinh bột 10% (kl/tt): phân tán dung dịch 1 vào
dung dịch 2
15


-

Dung dịch natri citrat 2% (kl/tt): cân 2,00 g natri citrat, hoàn tan hoàn toàn
trong nước cất vừa đủ 100 ml

-

Dung dịch calci clorid 1, 2, 3% (kl/tt): cân lần lượt 1,00; 2,00; 3,00 g CaCl2
vào các bình nón khác nhau, hịa tan hồn tồn trong nước cất vừa đủ 100 ml.

-

Dung dịch NaCl 0,9% (kl/tt): cân 0,90 g NaCl, hịa tan hồn tồn trong nước cất
vừa đủ 100 ml

-

Dịch dạ dày mơ phỏng (SGF): cân 9,00 g NaCl, hịa tan hoàn toàn trong 900 ml
nước chất, điều chỉnh pH 1,2. Thêm nước cất vừa đủ 1000 ml.

2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Lựa chọn nồng độ nguyên liệu để tạo vi nang và khảo sát một số đặc tính
của vi nang tạo thành.
2.2.1.1. Khảo sát nồng độ CaCl2 và pectin để tạo vi nang
Tạo vi nang với các nồng độ CaCl2 và pectin khác nhau: từ 1% đến 3%, lựa chọn
nồng độ CaCl2 và pectin phù hợp dựa trên các tiêu chí về cảm quan
2.2.1.2. Phối hợp pectin với alginat và tinh bột
Lựa chọn công thức để tạo vi nang, đánh giá thể chất của vi nang trước và sau
đông khơ.
2.2.1.3. Khảo sát một số đặc tính của vi nang sau đông khô.
-

Độ ẩm của vi nang sau đông khô

-

Độ rã của vi nang trong môi trường giả dịch dạ dày

2.2.2. Theo dõi số lƣợng VSV và hàm ẩm của vi nang Alg-Tb-Pec trong quá trình
bảo quản
2.2.2.1. Khả năng bao gói vi sinh vật của vi nang Pec-Alg-Tb
Xác định số lượng vi sinh vật bao gói được trong vi nang đông khô
2.2.2.2. Độ ẩm của vi nang Pec-Alg-Tb trong quá trình bảo quản
Tiến hành đánh giá hàm ẩm trong thời gian bảo quản.

16