Khảo Sát Một Số Marker Phân Tử Dùng Trong Chọn Giống Lúa Kháng Rầy Nâu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC




LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHẢO SÁT MỘT SỐ MARKER PHÂN TỬ
DÙNG TRONG CHỌN GIỐNG LÚA KHÁNG RẦY NÂU

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
TRẦN THỊ XUÂN MAI
VIỆN NC&PT CNSH

SINH VIÊN THỰC HIỆN
LÝ TIẾN
MSSV: 3064485
LỚP CÔNG NGHỆ SINH HỌC K32

Cần Thơ, Tháng 5/2010


PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

Trần Thị Xuân Mai

Lý Tiến

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………

Cần Thơ, ngày

tháng

năm 2010

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG


LỜI CẢM TẠ
Để hoàn thành tốt đề tài luận văn tốt nghiệp bên cạnh sự nổ lực hết sức mình của
bản thân tôi còn nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của các thầy cô và bạn bè cũng như
người thân. Bởi vậy trên trang đầu tiên của luận văn tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành
nhất đến:
- Cô Trần Thị Xuân Mai là người đã hướng dẫn tôi tận tình trong suốt thời gian
thực hiện đề tài về mặt lý thuyết cũng như thực tập.
- Cô Nguyễn Thị Liên và Cô Nguyễn Thị Pha đã tận tình giúp đỡ và chỉ dẫn tôi
trong thời gian làm đề tài ở phòng thí nghiệm.

- Thầy Nguyễn Hữu Hiệp và quí thầy cô đã nhiệt tình giảng dạy, truyền đạt kinh
nghiệm quý báu trong suốt thời gian tôi học tập và rèn luyện tại trường.
- Toàn thể Ban giám đốc, cán bộ Viện NC & PT Công nghệ Sinh học đã hết lòng
quan tâm và tạo đều kiện thuận lợi trong thời gian tôi học tập và thực tập tại Viện.
- Bên cạnh đó xin ơn chị Lê Thị Xã, anh Trang Minh Phương đã hướng dẫn tôi
trong thời gian học việc tại phòng thí nghiệm.
- Tất cả các bạn lớp Công nghệ Sinh học K32, đặc biệt các bạn trong phòng thí
nghiệm Công nghệ gen Thực vật đã hỗ trợ tôi trong lúc thực hiện đề tài.
Tôi xin đặc biệt gửi lời cảm ơn đến cha mẹ vì những gì cha mẹ đã cho tôi.

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!


TÓM TẮT
Rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal.) là côn trùng gây hại lớn nhất đối với cây lúa
ở nước ta cũng như các nước khác. Do đó ứng dụng marker phân tử để xác định các
gen kháng rầy nâu nhằm chọn tạo các giống lúa có khả năng kháng rầy nâu nhằm làm
đa dạng nguồn giống lúa trồng hiện nay. Khảo sát 6 marker phân tử RM13, RM190,
RM270, B43, S4019A, 7312.T4 thông qua kỹ thuật PCR và phân tích sản phẩm PCR
trên gel agarose. Kết quả cho thấy marker RM13, RM270, B43, S4019A, 712.T4 cho
ra kết quả đơn hình (có kích thước bằng nhau). Đối với marker RM190 sau khi phân
tích sản phẩm PCR trên gel agarose 3% cho thấy có sự đa hình giữa các mẫu. Điều đó
chứng tỏ marker RM190 liên kết với gen kháng rầy nâu, có 13 giống lúa đã được kiểm
tra với marker RM190, trong đó các giống OM6377, NV1, HĐ1, MTL645, MTL500,
MTL480, MTL495 có kích thước khoảng 130bp là giống thể hiện tính kháng rầy và
các giống TN1, MTL633, MTL567, MTL560, MTL547 và MTL110 có kích thước
khoảng 120bp là mẫu thể hiện tính nhiễm rầy.
Từ khóa: Rầy nâu, marker phân tử, BHP (Brown Plant Hopper).

i

MỤC LỤC
TÓM TẮT ................................................................................................................... i
MỤC LỤC.................................................................................................................. ii
DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................. v
DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................. vi
CÁC TỪ VIẾT TẮT................................................................................................. vii
CHƯƠNG 1 – GIỚI THIỆU ........................................................................................1
CHƯƠNG 2 – LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU.....................................................................3
2.1. Sơ lược về cây lúa .............................................................................................3
2.1.1. Nguồn gốc...................................................................................................3
2.1.2. Phân loại......................................................................................................4
2.2. Sơ lược về rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal.)....................................................5
2.2.1. Tập quán sinh sống và cách gây hại .............................................................5
2.2.2. Đặc điểm gây hại.........................................................................................6
2.2.3. Tình hình gây hại.........................................................................................7
2.2.4. Biotype (loại hình sinh học).........................................................................7
2.3. Lúa kháng rầy....................................................................................................8
2.3.1. Các giống lúa kháng rầy nâu đã du nhập vào Việt Nam ...............................8
2.3.2. Các giống lúa kháng rầy trong nước ............................................................9
2.3.3. Đặc tính kháng rầy của lúa ........................................................................10
2.4. Gen kháng rầy nâu trong cây lúa......................................................................11
2.5. Kỹ thuật PCR ..................................................................................................13
2.5.1. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR ....................................................................13
2.5.2. Thực nghiệm .............................................................................................14

ii

2.5.3. Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến phản ứng PCR................................................14
2.6. Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeats) .......................................................16
2.7. Kỹ thuật STS (Sequence-tagget site)................................................................16
2.8. Một số nghiên cứu sử dụng marker phân tử .....................................................16
CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................19
3.1 Thời gian và địa điểm .......................................................................................19
3.2. Phương tiện nghiên cứu ...................................................................................19
3.2.1. Dụng cụ.....................................................................................................19
3.2.2. Thiết bị......................................................................................................19
3.2.3. Hóa Chất ...................................................................................................19
3.2.4. Nguyên liệu ...............................................................................................19
3.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................20
3.3.1. Trích DNA (Quy trình CTAB)...................................................................20
3.3.2. Xác định hàm lượng và độ tinh sạch của DNA bằng phương pháp đo quang
phổ hấp thụ .........................................................................................................21
3.3.3 Kỹ thuật PCR .............................................................................................22
3.3.4. Điện di.......................................................................................................23
3.3.5. Gel Agarose...............................................................................................24
3.3.6. PCR đa thành phần. ...................................................................................24
3.4. Bố trí thí nghiệm..............................................................................................25
3.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự liên kết giữa các marker phân tử và gen kháng
rầy nâu. ...............................................................................................................25
3.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự đa hình giữa các mẫu với 2 cặp primer (PCR đa
thành phần) .........................................................................................................26

iii


3.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát các nhân tố ảnh hưởng đến sự phân tích sản phẩm
PCR. ...................................................................................................................26

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN ....................................................................29
4.1. Kết quả khảo sát tính liên kết giữa marker phân tử và gen kháng rầy nâu trên
một số giống lúa ở ĐBSCL.....................................................................................29
4.1.1. Sử dụng marker RM13, RM190, RM270...................................................29
4.1.2. Sử dụng marker B43, S4019A, 7312.T4 ....................................................30
4.2. Khảo sát sự đa hình của các mẫu với 2 cặp primer (PCR đa thành phần) .........31
4.3. Khảo sát các nhân tố ảnh hưởng đến sự phân tích sản phẩm PCR ....................32
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...............................................................37
5.1. Kết luận ...........................................................................................................37
5.2. Kiến nghị.........................................................................................................37
TÀI LIỆU THAM KHẢO..........................................................................................38

iv


DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1. Danh sách các giống lúa ...............................................................................20
Bảng 2. Trình tự của các Primer.................................................................................22
Bảng 3. Thành phần phản ứng PCR ...........................................................................23
Bảng 4. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR................................................................23
Bảng 5. Bảng mối liên hệ giữa nồng độ gel và kích thước phân tử DNA....................24
Bảng 6. Thành phần cho một phản ứng PCR đa thành phần .......................................25
Bảng 7. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR đa thành phần .........................................25
Bảng 8. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR ở nghiệm thức 1 .....................................27
Bảng 9. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR ở nghiệm thức 2 .....................................27
Bảng 10. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR ở nghiệm thức 3 ...................................28

v

DANH SÁCH HÌNH
Hình 1. Vòng đời của rầy nâu (A), Rầy nâu cánh dài (B), Rầy nâu cánh ngắn và ấu
trùng rầy nâu (C)......................................................................................................... 5
Hình 2. Lúa bị bệnh VLLXL....................................................................................... 6
Hình 3. Nhiễm rầy mật độ cao .................................................................................... 6
Hình 4. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 3% ..................................... 30
Hình 5. Kết quả điện di sản phẩm PCR gel agarose 3% ............................................ 31
Hình 6. Kết quả điện di sản phẩm PCR đa thành phần trên gel agarose 2%............... 32
Hình 7. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 3% (A) và 2% (B) .............. 32
Hình 8. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2% ..................................... 33
Hình 9. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2% ..................................... 34
Hình 10. Kết quả điện di sản phẩm PCR gel trên agarose 3% với nhiệt độ bắt cặp
primer là 54oC sử dụng RM13 (A), RM190 (B) và RM270 (C)................................ 35

vi


CÁC TỪ VIẾT TẮT
Bph

Brown plant hopper

Biotype

Loại hình sinh học

CTAB

Cetyl trimethyl ammonium bromide

DNA

Deoxyribonucleic acid

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic acid

ĐBSCL

Đồng bằng sông Cửu Long

PCR

Polymerase chain reaction

SDS

Sodium dodecyl sulfate

SSR

Simple sequence repeat

STS

Sequence-tagged site

TE

Tris-EDTA

TBE

Tris-Borate-EDTA

VLLXL

Vàng lùn, lùn xoắn lá

vii


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 - 2010

Trường Đại học Cần Thơ

CHƯƠNG 1 – GIỚI THIỆU
Việt Nam là một trong những nước xuất khẩu gạo lớn trên thế giới mà Đồng
bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) chiếm hơn 50% diện tích trồng lúa của cả nước.
Chính vì vai trò quan trọng của cây lương thực này đã thúc đẩy người dân trồng
lúa 2-3 vụ/năm và canh tác nhiều năm liền để tăng sản lượng lúa, nhằm đáp ứng được
nhu cầu thị trường. Trước tình hình thâm canh tăng vụ như hiện nay đã tạo điều kiện
thuận lợi cho sâu bệnh phát triển và rất có khả năng bùng phát thành dịch. Bên cạnh
đó, nước ta còn là một nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới quanh năm ẩm ướt, là
điều kiện thích hợp cho rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal.) phát triển. Rầy nâu không
phải là một vấn đề gì mới mẽ đối với người trồng lúa. Tuy nhiên, nó là côn trùng gây
thiệt hại lớn nhất đối với cây lúa ở nước ta cũng như các nước khác. Để phòng trừ rầy
nâu, người trồng lúa thường có thói quen sử dụng các loại thuốc hóa học trừ sâu, việc
này không chỉ làm tốn kém tiền của, công sức mà còn góp phần làm ô nhiễm môi

trường. Thêm vào đó việc lạm dụng thuốc trừ sâu sẽ gây hiện tượng phục hồi quần thể
rầy nâu kháng thuốc mạnh hơn (Chao et al. 2006). Để giải quyết vấn đề này, việc chọn
giống lúa kháng là con đường hiệu quả nhất trong quản lý dịch hại rầy nâu, kết hợp với
biện pháp quản lý tính kháng rầy ổn định trên đồng ruộng. Do vậy việc chọn tạo nhanh
chóng những giống lúa vừa có năng suất cao, chất lượng tốt, lại mang nhiều gen kháng
là công việc được quan tâm không chỉ ở Việt Nam mà còn ở nhiều quốc gia khác.
Chọn tạo truyền thống thường mất rất nhiều thời gian và chi phí nghiên cứu. Với
sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ Sinh học và Sinh học Phân tử, việc áp dụng các
tiến bộ kỹ thuật marker phân tử trong chọn giống lúa chống chịu sâu bệnh hại chính đã
và đang được phát triển.
Hiện nay đã phát hiện có 21 gen kháng rầy nâu từ những dòng lúa hoang và lúa
địa phương (Alam and Cohen, 1998; Rahman et al., 2009; Soundararajan et al., 2004;
Su et al., 2002; Zhang, 2007). Do đó chọn lựa marker nào liên kết với một gen kháng
sâu bệnh là điều cần thiết. Chính vì thế đề tài ”Khảo sát một số marker phân tử dùng
trong chọn giống lúa kháng rầy nâu” sẽ góp phần giải quyết nhiều vấn đề trong công
tác chọn giống để đạt hiệu quả kinh tế cao.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

1

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 - 2010

Trường Đại học Cần Thơ

Mục tiêu của đề tài: Khảo sát sự liên kết giữa gen kháng rầy nâu và marker phân
tử thông qua sự phân tích sản phẩm PCR trên gel agarose.

Nội dung của đề tài: Sử dụng các marker phân tử RM13, RM190, RM270, B43,
S4019A, 7312.T4A để khảo sát tính liên kết giữa marker với gen kháng rầy.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

2

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 - 2010

Trường Đại học Cần Thơ

CHƯƠNG 2 – LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Sơ lược về cây lúa
Từ xa xưa cây lúa đã hiện diện trong cuộc sống của con người, cây lúa trồng hiện
nay đã trải qua một lịch sử tiến hóa rất lâu dài và khá phức tạp, với nhiều thay đổi rất
lớn về đặc điểm hình thái, nông học, sinh lý và sinh thái để thích nghi với điều kiện
khác nhau của môi trường thay đổi theo không gian và thời gian. Sự tiến hoá này bị
ảnh hưởng rất lớn bởi 2 tiến trình chọn lọc: chọn lọc tự nhiên và chọn lọc nhân tạo.
Hiểu biết về nguồn gốc cây lúa trồng giúp ta hình dung được quá trình tiến hóa và hiểu
được điều kiện môi trường cùng những yêu cầu sinh thái tự nhiên mà cây lúa cần cho
nhu cầu sinh trưởng và phát triển đặc biệt của nó. Điều này sẽ rất cần thiết cho công
cuộc nghiên cứu cải tiến giống và biện pháp kỹ thuật để gia tăng năng suất lúa, cũng
như việc chọn tạo ra các giống có khả năng chống chịu sâu bệnh để hại chế việc sử
dụng hóa chất, nhằm góp phần bảo vệ môi trường sinh thái (Nguyễn Ngọc Đệ, 2007).
2.1.1. Nguồn gốc
Về nguồn gốc cây lúa, đã có nhiều tác giả đề cập tới nhưng cho tới nay vẫn chưa
có những dữ liệu chắc chắn và thống nhất. Có một điều là lịch sử cây lúa đã có từ lâu

và gắn liền với lịch sử phát triển của nhân dân các nước Châu Á.
Nơi xuất phát trồng lúa
Makkey E. cho rằng vết tích cây lúa cổ xưa nhất được tìm thấy trên các di chỉ
đào được ở vùng Penjab Ấn Độ, có lẽ của các bộ lạc sống ở vùng này cách đây khoảng
2000 năm.
Roschevicz (1931) phân các loài Oryza thành 4 nhóm: sativa, granulata,
coarctata và rhynchoryza, đồng thời khẳng định nguồn gốc của Oryza sativa là một
trường hợp của nhóm sativa, có lẽ là Oryza sativa f. spontanea, ở Ấn Độ, Đông
Dương hoặc Trung Quốc.
Theo Chowdhury và Ghosh thì những hạt lúa hóa thạch cổ nhất của thế giới đã
được tìm thấy ở Hasthinapur (Bang Uttar Pradesh – Ấn Độ) vào khoảng năm 1000 –
750 trước công nguyên.
Theo Grist D.H cây lúa xuất phát từ Đông Nam Á, từ đó lan dần lên phía Bắc.
Gutchtchin, Ghose, Erughin và nhiều tác giả khác thì cho rằng Đông Dương là cái nôi
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

3

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 - 2010

Trường Đại học Cần Thơ

của lúa trồng. De Candolle, Rojevich lại quan niệm rằng Ấn Độ mới là nơi xuất phát
chính của lúa trồng. Đinh Dĩnh (Trung Quốc) dựa vào lịch sử phát triển lúa hoang ở
trong nước cho rằng lúa trồng có xuất xứ ở Trung Quốc. Một số nhà nghiên cứu Việt
Nam lại cho rằng nguồn gốc cây lúa là ở miền Nam nước ta và Campuchia.
Sampath và Kao thì cho rằng sự hiện diện của nhiều loại lúa hoang ở Ấn Độ và

Đông Nam Á chứng tỏ rằng Ấn Độ, Miến Điện hay Đông Dương là nơi xuất xứ của
lúa trồng.
Tuy có nhiều ý kiến nhưng chưa thống nhất, nhưng căn cứ vào các tài liệu lịch
sử, di tích khảo cổ, đặc điểm sinh thái học của cây lúa trồng và sự hiện diện rộng rãi
của các loài lúa hoang dại trong khu vực, nhiều người đồng ý rằng nguồn gốc cây lúa
là ở vùng đầm lầy Đông Nam Á, rồi từ đó lan dần đi các nơi. Thêm vào đó, sự kiện
thực tế là cây lúa và nghề trồng lúa đã có từ rất lâu ở vùng này, lịch sử và đời sống của
các dân tộc Đông Nam Á lại gắn liền với lúa gạo đã minh chứng nguồn gốc của lúa
trồng (Nguyễn Ngọc Đệ, 2007).
2.1.2. Phân loại
Hiện nay, có nhiều cách phân nhóm cây lúa: đặc tính thực vật học, sinh thái địa
lý, đặc tính sinh lý, điều kiện môi trường canh tác, đặc tính sinh hóa hạt gạo, đặc tính
của hình thái.
Lúa là cây hằng niên có tổng số nhiễm sắc thể 2n = 24. Về mặt phân loại thực
vật, cây lúa thuộc họ Gramineae (hòa thảo), tộc Oryzeae, chi Oryza. Oryza có khoảng
20 loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới ẩm của Châu Phi, Nam và Đông Nam Châu
Á, Nam Trung Quốc, Nam và Trung Mỹ và một phần ở Úc Châu (Chang, 1976 theo
De Datta, 1981). Trong đó, chỉ có 2 loài là lúa trồng, còn lại là lúa hoang hằng niên và
đa niên. Loài lúa trồng quan trọng nhất, thích nghi rộng rãi và chiếm đại bộ phận diện
tích lúa thế giới là Oryza sativa L. Loài này hầu như có mặt ở khắp nơi từ đầm lầy đến
sườn núi, từ vùng xích đạo, nhiệt đới đến ôn đới, từ khắp vùng phù xa nước ngọt đến
vùng đất cát sỏi ven biển nhiễm mặn phèn... Một loài lúa trồng nữa là Oryza
glaberrima Steud., chỉ được trồng giới hạn ở một số quốc gia Tây Phi Châu và hiện
đang bị thay thế dần bởi Oryza sativa L. (De Datta, 1981).

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

4

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 - 2010

Trường Đại học Cần Thơ

Tên khoa học của cây lúa là Oryza sativa L. Tiêu biểu cho nhóm lúa trồng ở
Châu Á có tổ tiên trực tiếp là Oryza nivara, một loại lúa hoang hàng niên và Oryza
glaberrima Steud. cũng tiến hóa từ một lúa hoang hàng niên khác.
2.2. Sơ lược về rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal.)
Rầy nâu có tên khoa học là Nilaparvata lugens Stal..
Rầy nâu rất nhỏ, con trưởng thành (thành trùng) chỉ to bằng hạt gạo, màu nâu. Có
2 dạng rầy nâu cánh ngắn và rầy nâu cánh dài, chúng sống quanh gốc lúa ngay phần bẹ
lúa, phía trên mặt nước. Rầy nâu sinh sản và phát triển rất nhanh. Mỗi lứa, rầy cái đẻ
hàng trăm trứng trong bẹ lá. Trứng nở ra rầy con (ấu trùng) chỉ to bằng hạt tấm, hạt
cám, màu trắng ngà nên được gọi là rầy cám hay mò cám. Rầy con phải trải qua 5 lần
lột xác để trở thành rầy trưởng thành (thành trùng) (Hình 2.1).

B

C
A
Hình 1. Vòng đời của rầy nâu (A), Rầy nâu cánh dài (B), Rầy nâu cánh ngắn và
ấu trùng rầy nâu (C)
(Nguyễn Ngọc Đệ, 2007)
2.2.1. Tập quán sinh sống và cách gây hại
Thành trùng cái bắt đầu đẻ trứng bằng cách rạch bẹ lá hoặc gân chính của phiến
lá ở gần cổ lá. Các vết đẻ trên bẹ lúa có màu nâu do nấm bệnh xâm nhập vào thường
dài khoảng 8 – 10 mm chạy dọc theo bẹ lá.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

5

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 - 2010

Trường Đại học Cần Thơ

Rầy cái tập trung đẻ trứng ở gốc cây lúa, cách mặt nước từ 10 – 15 cm. Rầy
trưởng thành bị thu hút nhiều bởi ánh sáng đèn nhất là vào lúc trăng tròn và thường
bay vào đèn nhiều nhất vào khoảng 8 – 11 giờ đêm.
Cả thành trùng và ấu trùng rầy nâu đều thích sống dưới gốc cây lúa và có tập
quán nhảy xuống nước, lên tán lá hoặc bò quanh thân cây lúa khi bị khuấy động. Rầy
nâu thích tấn công cây lúa còn nhỏ nhưng vẫn có khả năng gây hại mọi giai đoạn tăng
trưởng của cây lúa và gây nên hiện tượng cháy rầy.
Ngoài ảnh hưởng trực tiếp nêu trên, rầy nâu còn gây hại gián tiếp cho cây lúa
như: ảnh hưởng đến sự phát triển của cây lúa, gây bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá
(VLLXL) cho cây lúa.

Hình 2. Lúa bị bệnh VLLXL

Hình 3. Nhiễm rầy mật độ cao

Nguồn /> />Ngày truy cập 04/01/2010
2.2.2. Đặc điểm gây hại
Rầy nâu xâm nhập vào ruộng lúa ngay từ khi mới cấy và hại cả trên mạ. Rầy nâu
phát sinh với mật độ cao và gây hại nặng vào giai đoạn trước khi lúa trổ bông, ngậm

sữa và bắt đầu chín.
Rầy nâu vừa có phản ứng kháng, vừa có phản ứng nhiễm với các giống lúa rất rõ,
nó có khả năng hình thành các biotype (loại hình sinh học) mới khi có sức ép chọn lọc
của môi trường. Rầy có khả năng di cư đám đông rất xa và kháng thuốc cao.
Rầy nâu còn là vật chủ trung gian truyền những virus gây bệnh. Nguy hiểm hơn
cả là virus VLLXL. Bệnh này làm cho lá chuyển sang màu vàng nhạt hoặc vàng da
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

6

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 - 2010

Trường Đại học Cần Thơ

cam và cây lúa không phát triển được. Phân rầy nâu chứa nhiều dưỡng chất hấp dẫn
nhiều nấm hoại sinh như bồ hóng làm gốc lúa bị đen dẫn đến quang hợp giảm,… Thiệt
hại của loại bệnh này là rất nghiêm trọng ( />2.2.3. Tình hình gây hại
Theo Cục Bảo vệ Thực vật (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn), hiện nay
có trên 140.000 ha lúa đông xuân ở các tỉnh phía Nam đang bị nhiễm rầy nâu. Trong
số đó, rầy nâu đang phá hại 91.115 ha. Hiện tượng nhiễm rầy nhiều nhất là tại vùng
ĐBSCL, tập trung tại các tỉnh Hậu Giang, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Vĩnh Long, Long An
với mật số rầy phổ biến từ 750 – 3.000 con/m2. Lúa ở những địa phương nhiễm rầy
nặng như Hậu Giang, Vĩnh Long, Bạc Liêu... mật số rầy lên tới 6.000 – 8.000 con/m2.
Tại Vĩnh Long, Hậu Giang, Sóc Trăng đã có hàng chục ha bị cháy rầy. Riêng bệnh
VLLXL đã tăng vọt với mức độ đáng lo ngại ().
2.2.4. Biotype (loại hình sinh học)
Qua việc nghiên cứu trên tính thay đổi của côn trùng người ta thấy ít nhất có 5

biotype xuất hiện. Mặc dù biotype 1 xuất hiện chiếm ưu thế ở Tây và Nam Á, biotype
2 gần đây phân bố ở Philipin và Indonesia, nới đây những giống kháng với biotype 1
đã phát triển trong vài năm. Những biotype của rầy nâu ở Nam Á không xác định rõ
hoàn toàn, một số loài khác không tên phát hiện vào năm 1977, chiếm ưu thế về số
lượng (Jenning P.R. et al., 1979).
Các biotype của rầy nâu (Jennings P.R et al., 1979).
Biotype 1: khu vực chiếm ưu thế về số lượng là Tây và Nam Á, giống kháng
chính là Mudgo, gen kháng là Bph1.
Biotype 2: khu vực chiếm ưu thế về số lượng là Phillipin và Indonesia, giống
kháng chính ASD và PTB18, gen kháng là Bph2.
Biotype 3: có giống kháng chính Rathu Heenati, gen kháng là Bph3.
Biotype 4: có giống khang chính Babawee, gen kháng là Bph4.
Biotype unnamed: khu vực chiếm ưu thế về số lượng là Nam Ấn Độ và
SriLankan, giống kháng chính là PTB19, PTB20 và ARC6650.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

7

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 - 2010

Trường Đại học Cần Thơ

2.3. Lúa kháng rầy
Đầu thập niên 1970, rầy nâu đã xuất hiện và tấn công mạnh mẽ trên các giống lúa
đang phổ biến như IR5, IR8, C4-63. Một thế hệ giống lúa mới ra đời như IR20, IR22,
IR26, IR28, IR29, IR30, TN73-1, TN73-2... Các giống này rất được ưa chuộng và phát

triển mạnh ở khắp các tỉnh vùng ĐBSCL vào những năm 1970, chúng kháng rầy nâu
loại 1 và một số loại sâu bệnh khác. Diện tích lúa cao sản tăng nhanh từ 41.000 ha năm
1968 lên đến 890.400 ha năm 1973. Đến năm 1976-1977, loại hình rầy nâu mới lại
xuất hiện (rầy nâu loại 2) và phát triển thành dịch lớn gây thiệt hại nặng trên nhiều
cánh đồng, đặc biệt là ở các tỉnh Kiên Giang, Bến Tre, Long An. Rầy nâu đã gây mất
trắng hàng loạt diện tích, làm giảm sản lượng lúa trầm trọng.
Trước tình hình khó khăn đó, giống IR36 ra đời. Giống IR36 được Trường Đại
học Cần Thơ tuyển chọn từ bộ giống lúa cao sản ngắn ngày của Viện Nghiên Cứu lúa
Quốc tế (IRRI) ở Philipin. IR36 kháng rầy nâu loại 2, nở bụi mạnh, thích nghi rộng đã
nhanh chóng lan tràn trong sản xuất, kịp thời chặn đứng dịch rầy nâu nên ổn định năng
suất lúa. Sự ra đời của giống lúa IR36 đã một lần nữa khẳng định mạnh mẽ vai trò của
giống lúa trong thực tế sản xuất. Đây là một biện pháp rất có hiệu quả, ít tốn kém, rất
dễ thực hiện và có kết quả nhanh chóng trong sản xuất. Giống IR36 đã được Bộ Nông
nghiệp công nhận, cho phổ biến rộng rãi với tên là NN3A.
2.3.1. Các giống lúa kháng rầy nâu đã du nhập vào Việt Nam
Ở miền Bắc
Một số giống lúa lai nhập nội từ Trung Quốc và chọn tạo trong nước chỉ có tính
kháng vừa với rầy nâu là Minh hiu 63, Minh hiu 86, CR203 (đối chứng), My sơn 1,
My sơn 3, TB3-3 trong 24 giống khảo sát (gồm 2 đối chứng) (Nguyễn Văn Đĩnh và
Trần Thị Liên 2004).
Ở miền Nam
Các giống lúa kháng rầy nâu có nguồn gốc từ IRRI đã được đưa vào thử nghiệm
ở phía Nam Việt Nam từ năm 1973, sau đó nhiều giống đã được gieo trồng rộng rãi
trong sản xuất như IR2151, IR2153, IR28, IR30, TN73-2..., hầu hết các giống này đều
mang gen Bph1. Cùng với sự xuất hiện của rầy nâu biotype 2 vào năm 1977, những
giống này đã trở nên nhiễm rầy và được thay thế bằng các giống mang gen kháng rầy

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

8

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 - 2010

Trường Đại học Cần Thơ

Bph2 như: IR36, IR38, IR42, IR2797 (NN3B), IR13240 (NN9A), IR17494... (Nguyễn
Văn Luật, 2002).
2.3.2. Các giống lúa kháng rầy trong nước
Ở miền Bắc
Các giống lúa kháng rầy nâu đầu tiên được thử nghiệm vào năm 1978 bao gồm
các giống mang gen kháng rầy bph1 như: IR2151, IR2153, IR1561, IR26, IR28,
IR30... và mang gen kháng rầy bph2 như: IR8423, IR9846, IR42, IR48, IR19746. Cuối
năm 1988, sự thay đổi biotype của rầy nâu đã xảy ra. Tuy nhiên các giống lúa trên vẫn
giữ được tính kháng rầy nâu ổn định vì chúng có mang gen Bph2 (Nguyễn Văn Luật,
2002).
Một số giống kháng rầy nâu Hà Nội ở Đồng bằng sông Hồng có 6 giống kháng là
BM9855, CR203 (đối chứng), MT4-2, TSC3, VH5, 13/2 và 12 giống kháng vừa là
CH208, CN2, DT36, ĐB5, ĐB6, HĐB5, MT14, MT204, N201, TSC2, Xi23, 88-5
trong 65 giống khảo sát (gồm 2 đối chứng) (Nguyễn Văn Đĩnh và Trần Thị Liên,
2004).
Một số giống lúa địa phương ở miền núi phía Bắc có một giống kháng là khẩu
tam nương và 3 giống kháng vừa là khẩu tam lai, nếp cẩm vỏ đỏ Lào Cai, nếp tan vàng
trong 43 giống khảo sát (Nguyễn Văn Đĩnh và Trần Thị Liên, 2004).
Ngoài ra còn một số giống kháng rầy nâu hiện đang được trồng là: CN2, CR203
(Nguyễn Văn Luật, 2002).
Ở miền Nam
Một số giống lúa mới lai tạo gần đây tại Viện Lúa ĐBSCL như: OMCS97,

OM1632, OM1633, OM1589-5k-1, OM15895k3, NCM16-27... cũng cho phản ứng
kháng với quần thể rầy nâu ở ĐBSCL (Phạm Thị Mùi và Bùi Bá Bổng, 1999).
Mỗi giống lúa có thể có một hoặc một vài gen hoặc không có gen kháng rầy nây.
Các gen kháng rầy nâu đang được sử dụng trong chương trình lai tại giống mới tại
ĐBSCL . Các giống có khả năng kháng trung bình với quần thể rầy nâu mới là:
MTL98, MTL99, MTL119, OM269, OMCS97, OM1643, OM2031, NCM16-27,
NCM84...

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

9

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 - 2010

Trường Đại học Cần Thơ

2.3.3. Đặc tính kháng rầy của lúa
Một số giống lúa được coi là kháng rầy nâu khi rầy nâu không thể ăn, ở, đẻ
trứng và phát triển trên giống đó (Nguyễn Văn Huỳnh và Nguyễn Thị Nghiêm, 1997).
Các giống này có thể mang một, hai hoặc ba cơ chế sau:
+ Không thích hợp: Rầy không thích ăn, ở hay đẻ trứng.
+ Kháng sinh: Giống ảnh hưởng bất lợi đến sinh lý của rầy khi chúng ăn phải.
+ Chịu đựng: Giống có khả năng chịu được sự tấn công của rầy mà thiệt hại
không đáng kể.
Cơ chế chịu đựng được cho là có liên hệ nhiều với tính kháng trung bình đối với
sự tấn công của rầy nâu. Cơ chế này có tính kháng không ổn định vì nó phụ thuộc vào
sinh thái nên tính kháng thay đổi theo từng địa phương, canh tác, mùa vụ… Ngược lại,

cơ chế không thích hợp và cơ chế kháng sinh thì tính kháng đòi hỏi phải có sự hiện
diện của một số đặc tính kháng rầy nâu trong lúa, đồng thời phản ứng của rầy nâu đối
với giống cũng không được thuận lợi. Tính kháng sinh mà hiện nay đa số các giống
kháng rầy đều có là do ảnh hưởng bất lợi của giống lúa trên rầy nâu khi chúng ăn phải.
Đối với các giống rầy mang cơ chế kháng sinh có đặc điểm như sau:
– Trứng rầy không nở được hay nở rất ít khi chúng đẻ trên những giống lúa này.
– Ấu trùng rầy nâu chết ngay từ tuổi một.
– Con cái có tuổi thọ giảm sút và đẻ trứng ít hay không đẻ trứng được do trứng
không phát triển hoặc phát triển không đủ.
– Thời gian tăng trưởng của ấu trùng kéo dài ra một cách bất thường.
– Sinh lý và tập quán của thành trùng bị xáo trộn.
Các giống kháng rầy nâu hiện nay, tính kháng chỉ điều khiển bởi một gen được
gọi là tính kháng dọc kháng rất mạnh nhưng chỉ kháng đối với một biotype. Nếu được
điều khiển bởi nhiều gen thì tính kháng sẽ không kháng mạnh nhưng có thể kháng đối
với nhiều biotype khác nhau. Cây có tính kháng đa gen sẽ hạn chế tối đa sự phát triển
của các biotype rầy nâu.
Các phản ứng trên quyết định số lượng rầy nâu tồn tại trong một giai đoạn nhất
định. Giống kháng rầy nâu có hàm lượng Aparagin thấp hơn bình thường, nồng độ
Henolic glycosede thường ở giống kháng cao hơn giống nhiễm (Sogawa và Pathak,
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

10

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 - 2010

Trường Đại học Cần Thơ

1970). Giống TN1 (Taichung Native 1), có nguồn gốc Đài Loan, từ cặp lai DEE GEO
WOOGEN/TSAI-YIAN-CHAN, là giống chuẩn nhiễm rầy nâu, rầy lưng trắng, không
có gen kháng.
Công tác sử dụng giống kháng được coi là biện pháp hàng đầu trong chương
trình phòng trừ tổng hợp rầy nâu hiện nay, chỉ có việc canh tác giống kháng mới có thể
làm giảm đồng loạt mật số của rầy nâu xuống ngưỡng kinh tế, từ đó các biện pháp
khác mới phát huy được hiệu quả cùng phối hợp để đi đến việc khống chế rầy nâu
(Nguyễn Văn Huỳnh, 1979).
2.4. Gen kháng rầy nâu trong cây lúa
Theo Ikeda và Vaughan (2006) về vấn đề xếp hạng các nhóm gen kháng với
biotype (theo phân loại của Nhật và Philipin) gồm 4 nhóm sau:
Nhóm Bph1 thì kháng với biotype 1 và 3, nhiễm với biotype 2, gen chủ lực là
Bph1.
Nhóm Bph2 thì kháng với biotype 1 và 2, nhiễm với biotype 3, gen chủ lực là
Bph2.
Nhóm Bph3 thì kháng với tất cả các biotype, gen chủ lực là Bph3, Bph4,
Bph8, và Bph9.
Nhóm khác thì kháng với biotype 4, có các gen chủ lực là Bph5, Bph6, Bph7.
Theo thuyết gen chống gen, mỗi gen điều khiển độc tính của ký sinh đều có gen
kháng tương ứng của ký chủ nhằm vô hiệu hoá hoạt động gây hại của ký sinh. Dựa
vào học thuyết gen chống gen các nhà chọn giống sẽ áp dụng thường xuyên vào công
tác tạo giống cải tiến.
Trong 50 năm gần đây, người ta đã phát hiện nhiều kỹ thuật thanh lọc ngân hàng
gen đối với tính trạng chống chịu côn trùng gây hại cây trồng, xác định nguồn cung
cấp gen kháng. Số gen được dùng trong các giống lúa sản xuất đại trà hiện nay vẫn còn
rất ít số với nguồn dự trữ trong ngân hàng gen lúa bản địa và lúa hoang. Do đó, chúng
ta có nhiều cơ hội rất lớn trong khai thác nguồn biến dị này trên đồng ruộng, nhằm
khám phá ra những biến dị có ích. Việc sử dụng các mồi DNA tương ứng với gen
kháng mong muốn đã tạo ra khả năng tìm kiếm được nhiều gen kháng hơn trong ngân
hàng gen (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007).

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

11

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 - 2010

Trường Đại học Cần Thơ

Cây trồng thể hiện tính kháng đối với ký sinh gây bệnh là do chúng mang các đặc
tính phân loại khác với nhóm ký chủ của ký sinh gây bệnh, hoặc là cây chứa các gen
kháng mà ký sinh không có gen tương ứng để phá vỡ. Hiện tượng từ kháng trở thành
nhiễm của cây trồng đối với vi sinh vật gây bệnh là do số lượng khác nhau của gen
kháng hiện diện ở mỗi giống cây và ảnh hưởng của gen kháng đối với ký sinh (Bùi Chí
Bửu, 2002).
Một gen kháng bệnh mới có thể bảo vệ cho cây từ nhiều tháng thậm chí đến vài
năm. Do áp lực thâm canh, giống lúa càng bị nhiễm nhanh hơn. Một gen mới được
chuyển vào cây trồng trên đồng ruộng, đồng thời sẽ có một quần thể sinh học có gen
độc mới lại xuất hiện để tấn công gen kháng mới. Gen kháng mới thường được biểu
hiện không tương hợp đối với sự xâm nhập của ký sinh ngoại trừ ở một ít cá thể. Theo
thời gian, dần dần quần thể ký sinh được nhân lên cho đến một lúc nào đó đủ để phá
vỡ cả một quần thể ký chủ mang gen kháng mới.
Ngày nay, trong 17 gen kháng rầy nâu được phân lập trên thế giới hiện nay, có 8
gen lặn và 9 gen trội (Bùi Chí Bửu, 1997). Những nghiên cứu được thực hiện bởi
Athwal et al. (1971) đã chứng minh rằng gen trội Bph1 chi phối tính kháng ở giống
Mudgo, MTU15, CO22, và MGL2 kháng với rầy nâu biotype 1, trong khi đó một gen
lặn Bph2 điều khiển tính kháng ở giống ASD7 và Ptb18 kháng đối với rầy nâu
biotype 2. Hai gen này liên kết chặt nhau và không tái tổ hợp giữa chúng.

Theo Lakshminarayana và Khush (1977), giống Rathu Heenati của Sri Lankan có
mang một gen kháng trội và độc lập với gen trội Bph1 và đã được xác định rõ là gen
Bph3 kháng với rầy nâu biotype 3. Một giống khác ở Sri Lankan là Babawee mang
một gen kháng lặn (Lakshminarayana và Khush, 1977). Gen này độc lập với gen Bph2
và được xác định là mang gen Bph4 kháng với rầy nâu biotype 4. Hai gen Bph3 và
Bph4 liên kết với nhau rất chặt chẽ.
Theo Kabir và Khush (1988) gen Bph5 có trong giống ARC10550, gen lặn Bph5
điều khiển tính kháng với rầy nâu biotype 4, phân ly độc lập với các gen Bph1, Bph2,
bph3. Một gen trội Bph6 phân ly độc lập đối với các gen Bph5 ở giống Swarnalatha và
Bph7 ở T12, kháng trung bình với những biotype từ Bangladesh. Nemamoto et al
(1989) đã xác định một gen lặn mới là gen Bph8 có ở giống Thai Col.5, Thai Col.11 và

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

12

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 - 2010

Trường Đại học Cần Thơ

Chin Saba và một gen trội mới là Bph9, ở những giống được trồng ở khu vực Sri
Lankan là Pokkali, Balamavee, và Kaharamana.
Gen lặn Bph8 không tương tác với Bph2 và Bph4 và, gen trội Bph9 không tương
tác alen với Bph1, Bph3.
Hai gen kháng rầy nâu Bph1 và Bph10 được tìm thấy liên kết rất chặt chẽ với
markerRFLP, C185 và RG457 trên nhiễm sắc thể số 12. Quần thể lúa hoang Oryza
australiensis được phát hiện có mang gen Bph10.

Những loài Oryza hoang dại tiềm ẩn những nguồn gen kháng mới đối với các
biotype. Ước lượng khoảng 11.000 quần thể lúa hoang dại là phương tiện để nghiên
cứu gen kháng với biotype 1, 2 và 3, IRRI đã phát hiện được 19 nhóm thuộc bốn loài
lúa hoang là kháng hay kháng vừa phải với cả ba biotype trên (Wu et al., 1986).
Các gen kháng rầy nâu đang được sử dụng trong chương trình lai tạo giống
mới tại ĐBSCL: Các gen Bph1, Bph2, Bph9, Bph10 và Bph18 nằm trên nhiễm sắc
thể 12; Các gen Bph3, Bph12 và Bph15 nằm trên nhiễm sắc thể 4, gen Bph4 nằm trên
nhiễm sắc thể 6; Gen Bph6 nằm trên nhiễm sắc thể 11; Các gen Bph11, Bph13, Bph14
nằm trên nhiễm sắc thể 3 (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007).
2.5. Kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR viết tắt từ chữ polymerase chain reaction (phản ứng tổng hợp dây
chuyền nhờ polymerase) do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 được sử dụng
rộng rãi nhất. Thực chất đây là phương pháp tạo dòng in vitro, không cần sự hiện diện
của tế bào (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003).
2.5.1. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR
Tất cả DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch
khuôn đều cần sự hiện diện của những primer (mồi) chuyên biệt. Primer là những đoạn
oligonucleotid, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn. Và DNA
polymerase sẽ nối dài primer để hình thành mạch mới. Kỹ thuật PCR đã được hình
thành dựa vào đặc tính đó của các DNA polymerase. Nếu ta cung cấp hai primer
chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn
DNA nằm giữa hai primer. Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác
định, ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo các primer bổ sung chuyên
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

13

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 - 2010

Trường Đại học Cần Thơ

biệt; các primer này gồm reverse primer (mồi ngược) và forward primer (mồi xuôi).
Từ “xuôi” và “ngược” phải hiểu là “xuôi” và “ngược” so với chiều phiên mã của gen
(Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003).
2.5.2. Thực nghiệm
Kỹ thuật PCR ngày càng được tiếp thu hoàn thiện thông qua việc phát hiện và
sản xuất được enzyme DNA polymerase chịu nhiệt

từ vi khuẩn Thermophilus

aquaticus và một số vi khuẩn khác. Máy PCR ngày càng hoàn thiện cho phép thay đổi
nhanh chóng, chính xác nhiệt độ cho từng giai đoạn phản ứng nhân bản DNA. Phản
ứng PCR diễn ra qua ba giai đoạn cho mỗi chu kỳ dựa trên tính chất biến tính, lai cặp,
tổng hợp đoạn DNA đích (Trịnh Đình Đạt, 2006).
Giai đoạn biến tính: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần
cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của
phân tử., thường là 94 – 95oC, trong thời gian 30 giây – 1 phút.
Giai đoạn gắn primer: Nhiệt độ khi được hạ thấp cho phép các primer bắt cặp
với khuôn; trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 – 70 oC, tùy
thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây – 1 phút. Các đoạn primer sẽ bắt
cặp với mạch khuôn theo nguyên tắc bổ sung. Đây là giai đoạn quan trọng. Nhiệt độ
gắn mồi phải bảo đảm đúng để khả năng gắn tốt nhất, tránh hiện tượng gắn không đặc
hiệu.
Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase
sử dụng vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian tùy thuộc
độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường thời gian khoảng 20 giây đối với đoạn
DNA khuôn nhỏ hơn 500 nucleotide (nu), 40 giây đối với đoạn DNA khuôn nhỏ hơn

1200 nucleotide. Thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Các dNTP sẽ được lắp ráp
để tạo thành mạch đơn DNA mới bổ sung với mạch DNA khuôn bắt đầu từ mồi.
Một chu kỳ bao gồm ba bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, và mỗi lần lại
làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân; theo
tính toán sau 30 chu kỳ sự khuếch đại sẽ là 106 so với số lượng bản mẫu ban đầu (Hồ
Huỳnh Thùy Dương, 2003).
2.5.3. Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến phản ứng PCR

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

14

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 - 2010

Trường Đại học Cần Thơ

- Mẫu: để phản ứng PCR tối ưu cần DNA phải được tinh sạch.
- Enzyme: enzyme sử dụng đần tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase I. Vì
đây là enzyme không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp (phải thêm
enzyme mới vào phản ứng sau mỗi lần biến tính vì enzyme cũ bị nhiệt phân hủy, nhiệt
độ lai thấp khiến sự khuếch đại kí sinh rất cao,…). Phương pháp PCR chuyển sang
bước ngoặt mới cùng với sự phát hiện một DNA polymerase chịu nhiệt được tách chiết
từ một vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus. Enzyme này – Taq polymerase –
không bị phân hủy ở nhiệt độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá
trình phản ứng.
Ngày nay, nhiều polymerase chịu nhiệt khác đã được đưa ra thị trường với nhiều
chức năng chuyên biệt hay hoàn thiện hơn. Tth polymerase, một enzyme tách chiết từ

Thermus thermophilus, có khả năng hoạt động như một enzyme phiên mã ngược khi
có mặt RNA khuôn và ion Mg2+, Tth polymerase lại xúc tác phản ứng khuếch đại
DNA. Enzyme này cho phép khuếch đại bản mẫu là RNA thông qua sự hình thành
cDNA.
- Primer: là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu
quả cao. Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phương pháp PCR, và phải tuân
thủ một số nguyên tắc:
+ Trình tự của mồi được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi
xuôi và mồi ngược và cũng không có những cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ
sung giữa các phần khác nhau của một mồi.
+ Tm của mồi xuôi và mồi ngược không cách biệt quá xa. Thành phần
nucleotide của các mồi cân bằng tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần.
+ Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng
với các trình tự lặp lại trên gen.
+ Trình tự nằm giữa hai mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn; phản ứng PCR
sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1kb.
- Các thành phần khác của phản ứng PCR: dNTP thường được sử dụng ở nồng độ
là 20 – 200 M/mỗi nu. Nồng độ cao hơn sẽ dễ dẫn đến sự khuếch đại kí sinh. Sự mất
cân bằng trong thành phần các nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của DNA
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

15

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học