Nghiên cứu cơ chế phản ứng giữa một số kháng sinh β lactam và enzym PBP2a bằng các phương pháp hóa tin

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----------------------------

NGUYỄN HỌA MI

NGHIÊN C U CƠ CHẾ PHẢN NG GIỮA MỘT SỐ
KHÁNG SINH β-LACTAM VÀ ENZYM PBP2a BẰNG
CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA TIN

U N ÁN TIẾN S HÓA HỌC

Hà Nội – 2012

1


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----------------------------

NGUYỄN HỌA MI

NGHIÊN C U CƠ CHẾ PHẢN NG GIỮA MỘT SỐ
KHÁNG SINH β-LACTAM VÀ PBP2a BẰNG CÁC
PHƯƠNG PHÁP HÓA TIN
Chuyên ngành: Hóa lí thuyết và Hóa lí
Mã số: 62 44 31 01

U N ÁN TIẾN S HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. GS.TSKH. ĐẶNG ỨNG VẬN
2. GS.TS. TRƯƠNG NGUYỆN
THÀNH

Hà Nội – 2012

2


MỤC LỤC

STT

NỘI DUNG
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH

CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT TRONG L
MỞ ĐẨU
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

CHƢƠNG 2: CƠ SỞ LÝ THUYẾT V
PHÁP TÍNH
2.1

MÔ PHỎNG ĐỘNG LỰC CƠ HỌC

2.1.1

Mẫu cơ học phân tử (M/M)

2.1.2

Phƣơng pháp động lực phân tử M

2.2.2

Cơ cở của phƣơng pháp tính gần

2.3

PHƢƠNG PHÁP QM/MM (HYBRID

MECHANICS/MOLECULAR MECH
2.3.1

Phƣơng pháp lai hóa QM/MM tron

CHƢƠNG 3: CHUẨN BỊ INPUT VÀ
NGHIÊN CỨU CHO HỆ CỤ THỂ
3.1

ĐIỀU KIỆN TÍNH VỚI PHƢƠNG PH

3.1.1

Nghiên cứu đặc điểm của tâm hoạ
gần tâm

3.1.2

Nghiên cứu tính hoạt động của pr

3.1.3

Tính năng lƣợng tự do gắn kết củ

nitrocefin lên các cấu trúc khác n
PBP2a
3.2

ĐIỀU KIỆN TÍNH VỚI PHƢƠNG PH


(ONIOM)
3.2.1

Các mô hình tâm hoạt hóa

3.2.2

Các mô hình enzym

CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO L
4.1

KẾT QUẢ TÍNH MM/ND

4.1.1

Về sự tồn tại của khe hẹp gần tâm
SER403 của PBP2a

4.1.2

Về tính linh động của phối tử và c

tâm hoạt động trong các phức ax

michaelis của methicillin(MC1) và
với PBP2a
4.1.3

Năng lƣợng tự do gắn kết nitroce

lên các cấu trúc khác nhau của PB
4.2

KẾT QUẢ TÍNH QM/MM

4.2.1

Đƣờng năng lƣợng phản ứng của
hoạt hóa

4.2.2

Đƣờng năng lƣợng phản ứng của
protein

4.2.3

Lý do cho sự khác biệt trong hoạ
NC1

4.2.4

Thảo luận
KẾT LUẬN
TÀI LIÊU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


STT
1

Bảng 4.1

2

Bảng 4.2

3

Bảng 4.3

4

Bảng 4.4

5

Bảng 4.5

6

Bảng 4.6

7

Bảng4.7

8

Bảng 4.8

9

Bảng 4.9

5


DANH MỤC CÁC HÌNH
STT

TÊN HÌNH

1

Hình 1.1

2

Hình 1.2

3

Hình 1.3

4

Hình 1.4

5

Hình 1.5

6

Hình 2.1

7

Hình 2.2

8

Hình 2.3

9

Hình 2.4
khoảng cách tâm khối; r1A2B và r2A1B : khoảng cách giữa các
site không ở trong cùng một phân tử
10

Hình 2.5

11

Hình 2.6

6

Trang


12

Hình 2.7

13

Hình 2.8

14

Hình 3.1

15

Hình 3.2

16

Hình 3.3

17

Hình 3.4

18

Hình 3.5

19

Hình 3.6

20

Hình 4.1

21

Hình 4.2

22

Hình 4.3

7


23

Hình 4.4

24

Hình 4.5

25

Hình 4.6

26

Hình 4.7

27

Hình 4.8

28

Hình 4.9

29

Hình 4.10

30

Hình 4.11

8


CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT TRONG U N ÁN
KÝ HIỆU
SA
QM/MM
MM/MD
ONIOM
MM
PBP2a
MRSA
PBP
DFT
NR
Phức michaelis
Phức axyl
cấu trúc apo
1MWU
1MWS
PBP2a*
SER403

MC1
NC1

9


MM-PBS
MD
QM

MM+, AMBER
(CHARMM),
MM+

AMBER

BIO+ (CHAR
OPLS
UHF
RHF
RMSD
RMSF

MO-LCA
SCF
LA
LAC
LAH

10

MỞ ĐẦU
Kháng sinh β-lactam lúc đầu gồm penicillin được Fleming phát hiện vào
năm 1929 và đến năm 1955, cephalosporin được phát hiện lần đầu. Từ đó, các
kháng sinh β-lactam được sử dụng rộng rãi với những lượng lớn và liên tục
được phát triển, nhằm tìm ra những hợp chất mới có hiệu quả cao hơn để đối
phó với tác dụng của vi khuẩn làm vô hiệu hoá các kháng sinh đã có trước,
hay còn gọi là hiện tượng kháng các kháng sinh, cũng được gọi là “nhờn
thuốc”. Đây là một vấn đề có tầm quan trọng hàng đầu, thu hút sự quan tâm
lớn của các nhà khoa học trong các lĩnh vực hoá dược, hoá sinh, sinh lý, vi
trùng học và y học. Chủ đề của đề tài là “ Nghiên cứu cơ chế phản ứng giữa
một số kháng sinh β-lactam và enzym PBP2a bằng các phương pháp Hóa
tin” nhằm đi đến có đóng góp vào việc giải quyết vấn đề nan giải nói trên, tức
là nghiên cứu lý giải cơ chế kháng sinh β-lactam liên tục bị các vi khuẩn làm
mất hiệu quả. Nghiên cứu của chúng tôi tập trung về mặt bản chất hóa học, cơ
chế hóa học để tìm ra phương pháp nghiên cứu, cơ chế tác dụng của các thuốc
β-lactam đối với vi khuẩn gây bệnh. Thông qua việc tính toán các tính chất
hóa lý, hàng rào thế năng, năng lượng tương tác giữa thuốc kháng sinh với
enzym của vi khuẩn gây bệnh bằng các phương pháp tính lý thuyết, chúng tôi
đã thu được các kết quả khả quan trong việc đánh giá khả năng ức chế của
thuốc và giải thích được phần nào nguyên nhân kháng thuốc β-lactam của vi
khuẩn tụ cầu vàng.
Với sự phát triển mạnh mẽ của tốc độ các hệ thống máy tính hiệu năng
cao, cộng với việc ra đời của các phương pháp tính mới như các phương pháp
lai hóa giữa cơ học phân tử kết hợp với cơ học lượng tử QM/MM, hay giữa
phương pháp động lực phân tử kết hợp với cơ học phân tử MM/MD đã trở
thành công cụ hỗ trợ đắc lực giúp giảm thời gian tính và đem lại rất nhiều kết
quả như mong muốn, góp phần giúp con người khám phá, giải quyết được

11


nhiều bài toán hóc búa phức tạp. Có thể kể ra đây một vài nghiên cứu hiện
nay trên thế giới như: Sử dụng phương pháp QM/MM, MM/MD trong nghiên
cứu chất ức chế proteaza-HIV và malate Dehydrogenaza. Ứng dụng QM/MM
trong nghiên cứu phức các kim loại chuyển tiếp. Ứng dụng phương pháp
QM/MM trong tính toán các phản ứng hữu cơ quang hóa…cùng vô số các
ứng dụng và thành tựu nổi bật khác nữa89,99,100,102. Chính vì tính hấp dẫn của
phương pháp cũng như các kết quả thu được rất đáng khích lệ đó, việc tiếp tục
nghiên cứu, ứng dụng các thành tựu đã có của phương pháp lai hóa QM/MM,
MM/MD đã trở thành một hướng đi mới của lĩnh vực hóa học tính toán cực
kỳ thu hút, nhiều hứa hẹn và đã đóng góp không ít các kết quả khoa học hữu
ích cho thực tiễn.
Song song với việc phát triển của phần cứng máy tính, việc phát triển
các phần mềm hỗ trợ việc tính toán cũng không ngừng cải tiến. Trong luận án
chúng tôi sử dụng cả các phần mềm thương mại (mã nguồn đóng) và các phần
mềm miễn phí (mã nguồn mở). Phần mềm GAUSSIAN09 là phần mềm đóng
gói, được Giáo sư Keiji Morokuma tại Đại học Kyoto tạo điều kiện cho tác
giả luận án cộng tác nghiên cứu và sử dụng. Phần mềm GROMACS4.06 là
phần mềm mã nguồn mở miễn phí với tiêu chí nhanh hơn, mềm dẻo hơn, đã
được cộng đồng các nhà khoa học công nhận sử dụng và công bố các công
trình trên các tạp chí uy tín. Với hai phần mềm này có thể sử dụng phương
pháp lai hóa QM/MM và MM/MD giúp cho việc nghiên cứu các hệ hóa sinh
với số lượng rất lớn các nguyên tử một cách hữu hiệu và có những bước đột
phá mới.
Đây là luận án tiến sỹ đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu theo hướng lý
thuyết sử dụng các phương pháp lai hóa QM/MM và MM/MD để nghiên cứu
cơ chế phản ứng của một số β-lactam với enzym PBP2a. Luận án đã thu được

12


một số kết quả mới nhiều triển vọng, mở ra một hướng nghiên cứu hiệu quả,
có thể triển khai và đóng góp cho nghiên cứu cơ bản của Việt Nam.

13


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
Staphylococcus aureus (SA) hay còn gọi là vi khuẩn tụ cầu vàng một loại
vi khuẩn gây bệnh và là nguyên nhân phổ biến của bệnh nhiễm trùng tụ cầu
khuẩn. Nghiên cứu của các tạp chí chuyên ngành cho thấy rằng khoảng 50%
loài người có mang SA trên cơ thể, và việc cơ thể có mang SA có liên quan
với việc tăng nguy cơ nhiễm tụ cầu khuẩn.35,107 Các triệu chứng của nhiễm
trùng SA bao gồm lở loét, mụn mủ, nhọt, viêm phổi, và nhiễm trùng sau phẫu
thuật là một vấn đề nghiêm trọng tại các bệnh viện. Alexander Fleming
(1881 – 1955) là một bác sĩ, nhà sinh học và đồng thời là một nhà dược lý học
người Scotland. Ông được coi là người mở ra kỉ nguyên sử dụng kháng sinh
trong y học. Ông đã được trao giải thưởng Nobel về y học năm 1945 cùng với
Ernst Boris Chain và Howard Walter Florey về việc tìm ra và phân tách được
penicilin – được coi là loại kháng sinh đầu tiên trong việc điều trị những bệnh
nhiễm trùng. Từ năm 1942 bệnh nhiễm trùng tụ cầu khuẩn có thể được chữa
khỏi bằng thuốc kháng sinh penicillin, tuy nhiên, vào đầu những năm 1960, sự
xuất hiện của một chủng SA mới kháng β-lactam được gọi là Staphylococcus
aureus kháng methicillin (MRSA) (Hình 1.1), đã được công bố35 . MRSA gây
ra một trong những bệnh nhiễm trùng nguy hiểm và thường gặp nhất ngày
nay, việc kháng thuốc gây ra một trở ngại lớn trong điều trị dứt điểm bệnh,
nhu cầu có những thuốc kháng sinh mới để điều trị loại bệnh này là rất cần
thiết và quan trọng.

14


Hình 1.1. Ảnh SEM hiển vi của methicillin-kháng Staphylococcus aureus (hình
tham khảo từ internet)
Chủng mới này có mang một gen đặc biệt gọi là gen MecA, không có nguồn gốc
từ SA, từ một nguồn không xác định bên ngoài nào đó. Các kháng sinh β-lactam như

penicillin và methicillin khi thâm nhập vào tế bào của vi khuẩn SA liên kết
với enzym penicillin binding protein (PBP) cản trở PBP xúc tác cho sự hình
thành liên kết giữa các peptit của các chuỗi peptidoglycan của thành tế bào.
Sự ức chế cộng hóa trị của β-lactam với PBP dẫn tới thành tế bào suy yếu và
cuối cùng gây chết các tế bào. Tập quán của gen MecA giữ lại trong mã hóa của
(PBP2a) MRSA,

57,34,45,108,72,20,79,52,39,38,70

. Gen MecA được bảo toàn rất cao

giữa các MRSA cô lập được (hơn 90% chuỗi PBP2a là đồng nhất giữa các
dòng), PBP2a mới phát hiện không giống bất kì PBP thông thường được tạo
ra bởi SA (chỉ có dưới 20% chuỗi là đồng nhất) và các PBP2a này không nhạy
với β-lactam. PBP2a gây ra sự kháng thuốc phổ rộng với methicillin và các
kháng sinh β-lactam. PBP2a thể hiện ái lực thấp với β-lactam một cách bất
thường ở chỗ nó vẫn giữ được khả năng làm trung gian xây dựng thành tế bào và giữ
nguyên hoạt tính cho phép sự tổng hợp thành tế bào ngay cả ở nồng độ gây
chết người của β-lactam. Cơ chế và cấu trúc tinh thể của PBP2a được trình
bày ở đây làm sáng tỏ những đặc trưng cấu trúc lí giải cho sự kháng β-lactam
của chúng và đưa ra những hiểu biết quan trọng cho việc thiết kế những kháng

sinh tiềm năng chống lại MRSA.

15


Hình 1.2. Cấu trúc phức axyl hóa của 1MWU từ ngân hàng dữ liệu protein data
bank

Sự ức chế hoạt động PBP2a bởi một phân tử nhỏ, dự kiến sẽ dẫn đến ly
giải tế bào của vi khuẩn, do đó nên nó được coi là cách tiếp cận trực tiếp nhất
để điều trị các bệnh nhiễm trùng MRSA. Thông thường các β-lactam như
methicillin, làm ức chế hoạt động của PBP2a trong việc làm trung gian xây
dựng thành tế bào, các hợp chất thay thế methicillin cần được thiết kế một
cách nào đó cho phép nó liên kết mạnh mẽ hơn với tâm hoạt động của enzym
PBP2a. Để làm điều này một cách hợp lý, chi tiết cơ chế phân tử của β-lactam
liên kết với PBP2a nên được hiểu rõ. Như đã biết, quá trình này có tính ràng
buộc liên quan đến quá trình tạo phức không cộng hóa trị michaelis giữa betalactam và PBP2a sau đó là đến quá trình axyl hóa, kết quả là hình thành liên
kết cộng hóa trị với Ser403 nằm ở vị trí tâm hoạt động (Hình 1.2, hình
1.4).43,112 Trong quá trình axyl hóa, nhóm hydroxyl của Ser403 tấn công
cacbon trong nhóm cacbonyl của phối tử. Kết quả là, liên kết C-N của phối tử
β-lactam được phân tách, trong khi nhóm cacboxyl hình thành mối liên kết
cộng hóa trị với nhóm hydroxyl của SER403. Việc kháng phổ rộng của
MRSA với kháng sinh nên được liên kết với việc giảm tỷ lệ phản ứng axyl
hóa PBP2a. Điều này có nghĩa là việc thiết kế các thuốc kháng sinh mới sẽ

16


yêu cầu kiểm soát cẩn thận các hàng rào năng lượng cần thiết trong bước axyl
hóa cũng như bước tạo thành phức không cộng hóa trị trước đó.

Đã có các công trình tổng quan về cơ chế kháng β-lactam. 34,108,52,70 Có
rất nhiều giả thuyết về cơ chế kháng β-lactam của MRSA nhưng nổi bật nên là
3 giả thiết kháng β-lactam của MRSA như sau: Cơ chế thứ nhất34,108 là việc
sản sinh ra các enzym β-lactamase có khả năng thủy phân β-lactam. Theo cơ
chế này đề xuất phổ biến nhất của việc kháng kháng sinh β-lactam có liên
quan đến việc sản sinh ra một loại enzym thích hợp, ví dụ, β-lactamase có thể
làm suy thoái, sửa đổi và thậm chí phá hủy các kháng sinh trước khi chúng có
thể tiếp cận các tâm hoạt động trên MRSA. Các kháng sinh β-lactam có một
yếu tố chung trong cấu trúc phân tử của chúng: đó là một vòng bốn nguyên tử
được gọi là vòng lactam. Các lactamase phá vỡ β-lactam bằng cách mở vòng
lactam và từ đó khử hoạt tính kháng khuẩn của phân tử. Những enzym này
đặc biệt quan trọng trong vi khuẩn Gram âm khi chúng tạo thành các cơ chế
bảo vệ chính đối với thuốc trên cơ sở β-lactam.

Beta-- lactam

AmpC

R

1

H2O

HO

Hình 1.3. Sản sinh ra men β-lactamase có khả năng xúc tác thủy phân β-lactam


Việc phân loại phân tử của β-lactamase được dựa trên các nucleotit và

trình tự axit amin trong các enzym này. Cho đến nay có bốn lớp (class) phân

17


loại theo chức năng được công nhận (A-D). Các lớp A, C, và D tác động theo
cơ chế dựa trên serine, trong khi đó lớp B hoặc Metallo-β-lactamase cần kẽm
cho tác dụng của chúng.34 Ví dụ, β-lactamase kiểu AmpC là loại β-lactamase
lớp C, thường được phân lập từ vi khuẩn Gram âm kháng cephalosporin phổ
rộng. AmpC được mã hóa đặc trưng trên nhiễm sắc thể của nhiều loại vi
khuẩn gram âm bao gồm Citrobacter, Serratia và Enterobacter. Hình 1.3 minh
họa việc sản sinh ra enzym β-lactamase có khả năng xúc tác thủy phân βlactam cũng như là cơ chế kháng β-lactam.
Cơ chế thứ hai34,108 là sử dụng các men protein transpeptidases (được
biết như là các penicillin-binding protein (PBP) cần cho việc nối các mạch
peptidoglycan để tạo màng tế bào cứng tham gia gây vô hiệu hóa kháng sinh.
Cơ chế này dựa trên giả thiết cho rằng quá trình axyl hóa protein bởi các
kháng sinh có 3 giai đoạn:
Giai đoạn 1. PBP2a tương tác với β-lactam với hằng số Kd tạo ra phức
không cộng hóa trị (PBP2a - β-lactam).
Giai đoạn 2. Phức không cộng hóa trị (PBP2a- β-lactam) sẽ chuyển
thành phức cộng hóa trị axyl β-lactam -PBP2a với hằng số chuyển hóa K2.
Giai đoạn 3. Với một hằng số K3 vô cùng nhỏ phức cộng hóa trị axyl βlactam -PBP2a phân ly tạo ra PBP2a và β-lactamoate.
Trong đó: Hằng số phân ly của phức không cộng hóa trị Kd, Hằng số tốc độ
bậc 1 K2, Hằng số tốc độ của quá trình phân hủy phức axyl K3.
So sánh các thông số động học của PBP2a với các PBP nhạy cảm với βlactam thấy việc kháng β-lactam của PBP2a chủ yếu là do việc tạo phức axyl
β-lactam - PBP trung gian là không hiệu quả mà không phải là do sự không
khớp của phân tử β-lactam với tâm hoạt động (K d) cũng không phải do sự
phân huỷ nhanh hơn của phức trung gian axyl-PBP (K3)72,70,36,73.

18

Bởi vì các giá trị Kd đặc trưng cho PBP là tương đối cao (cỡ millimol),
tính hiệu quả của các chất ức chế β-lactam là do khả năng của chúng tạo thành
phức cộng hoá trị bền với các protein đối của chúng. Do đó, giảm tốc độ tạo
phức trung gian Kd và quá trình tạo phức axyl hóa (K 2) là một chiến lược hiệu
quả để đạt tới tính kháng thuốc phổ rộng.70,112,41 Các PBP kháng như vậy
không nhất thiết cản trở sự tăng trưởng tế bào hoặc khả năng tồn tại của nó
nếu các yếu tố khác có thể bù đắp cho việc giảm tính hiệu quả của các enzym.
24,62

Cơ chế này hiện đang là nguyên nhân chính gây ra sự kháng thuốc trong
một số tác nhân gây bệnh bao gồm các vi khuẩn Gram dương loài
Staphylococcal và Streptococcal. 108
Cơ chế thứ ba là sự thải loại các phân tử β-lactam khỏi các tế bào
Gram-âm bằng cách bơm thoát.108
Theo cơ chế này thì sự ngăn cản kháng sinh tiếp cận protein đối tác
(target protein) bằng cách thẩm thấu ngược (altered permeability) hoặc
thoát cưỡng bức (forced efflux) – còn gọi là thoát hoạt động (active eflux).
Ví dụ, điều này có thể được thực hiện bởi các bơm kháng sinh thoát cưỡng
bức (forced efflux pump) MexA, B-OprM vốn là một nguyên nhân chính gây
kháng ở Pseudomonas và trong các loài gây bệnh Gram âm khác.
Thoát hoạt động là một cơ chế đáp ứng việc thải loại các chất độc hại
và kháng sinh ra khỏi tế bào. Nó được xem là phần không thể thiếu của sự
trao đổi dị chất (xenobiotic metabolism). Cơ chế này là quan trọng trong dược
học bởi vì nó tham gia vào việc kháng các kháng sinh.
Các hệ thoát (efflux) hoạt động thông qua một cơ chế phụ thuộc năng
lượng (Active transport) để bơm đẩy những chất độc không mong muốn qua
một cái bơm thoát đặc biệt. Một số hệ thoát đặc hiệu cho từng loại thuốc, một

19


số khác lại có tác dụng kháng đa thuốc phổ rộng (multidrug resistance MDR).
Các chất vận chuyển thoát khuẩn (bacterial efflux transporters) được
phân thành 5 họ chủ yếu dựa trên trật tự axit amin và nguồn năng lượng được
dùng để thải cơ chất. Một trong những chất đặc trưng tốt nhất cho chúng là hệ
thoát thuốc (drug efflux system) MexAB–OprM của thể sinh bệnh cơ hội
(opportunistic pathogen) Pseudomonas aeruginosa. Cái bơm tay ba này
(tripartite pump - gồm có “bơm” MexB vận chuyển RND màng trong, lớp xốp
OprM màng ngoài, và chất bao MexA tan được) tác động trên một phổ rộng
các chất kháng sinh bao gồm tetracycline, chloramphenicol... cũng như các lactam và các chất thụ động -lactamase như là axit clavulanic108.
Tuy nhiên tất cả đều dưới dạng giả thuyết. Một trong những kết quả đáng
lưu tâm nhất là của Lim và Strynadka70. Đề xuất của Lim và Strynadka theo
cơ chế thứ hai tức là việc kháng -lactam liên quan đến liên kết với các
enzym protein transpeptidases (được biết như là các penicillin-binding protein
(PBP) cần cho việc nối các mạch peptidoglycan để tạo màng tế bào cứng, sự
kháng của các “siêu bọ” này đối với các kháng sinh dòng -lactam rất quan
trọng trong điều trị được thực hiện gián tiếp thông qua enzym protein binding
penicilin 2a (penicillin-binding protein 2a (PBP2a)). Lim và Strynadka đã dẫn
chứng ra được rằng, cấu trúc tâm hoạt động của PBP2a thay đổi và sự chuyển
dạng của phối tử cũng như hốc phản ứng tại tâm hoạt động từ cấu trúc apo
ban đầu so với cấu trúc đã axyl hóa thông qua các cấu trúc Xray chụp được.
Căn cứ trên các cấu trúc tinh thể của ngân hàng dữ liệu protein (protein data
bank) về các cấu trúc trước và sau phản ứng là 1VQQ ( protein chưa có phối
tử) và 1MWU (protein đã bị axyl hóa bởi methicillin), 1MWS (protein đã axyl
hóa bởi nitrocefin). Hai dẫn chứng trên dẫn chúng tôi đến việc tập trung

20

nghiên cứu 2 cơ chất methicillin và nitrocefin của nhóm kháng sinh β-lactam
này theo cơ chế thứ hai.

R NH

O

Ser

Hình 1.4. Cơ chế axyl hóa trong đó nhóm cacbonyl của β-lactam bị tấn công bởi
SER403 của tâm hoạt hóa

Phản ứng axyl hóa (xem hình 1.4) là chìa khóa để thụ động PBP2a bằng
β-lactam. Tương tác của PBP2a với chất thụ động hay cơ chất β-lactam bắt
đầu bằng việc tạo nhanh phức michaelis không có liên kết cộng hóa trị. Kế
tiếp là sự tấn công ái nhân của axit amin SER403 trong tâm hoạt động của
enzym vào vòng β-lactam để cho ra một phức trung gian axyl-PBP2a bền.
Như thế, việc kháng phổ rộng của SA với các thuốc kháng sinh có liên quan
đến sự giảm tốc độ của quá trình axyl hóa - của quá trình hình thành các phức
axyl-PBP2a - cũng như độ bền của các phức được tạo thành. 112,41
Cụ thể cơ chế này bao gồm 3 giai đoạn:
Giai đoạn 1: Bước này, giữa β-lactam và enzym PBP2a hình thành
phức không cộng hóa trị. Quá trình đi vào của β-lactam trong hốc phản
ứng và tạo liên kết không cộng hóa trị với Ser403 cho phức michaelis βlactam-PBP2a .
Sự tương tác của một PBP có trong vi khuẩn kháng thuốc với một chất
ức chế β-lactam đã qua màng tế bào vi khuẩn bắt đầu bằng sự hình thành
nhanh một phức không cộng hoá trị gọi là phức michaelis (Kd). Hình 1.4

21


minh họa nhóm cacbonyl -lactam bị tấn công bởi axit amin Serine 403 ở tâm
hoạt động.
Giai đoạn 2: Việc kháng này có liên kết với quá trình axyl hóa. Quá
trình axyl hóa là chìa khóa của ức chế PBP2a bằng các β-lactam.
Tiếp theo giai đoạn 1 là việc tấn công ái nhân tâm hoạt động Ser403 của
enzym lên các vòng lactam của β-lactam để tạo phức cộng hóa trị axyl-PBP
tương đối bền (K2).
Rất nhiều các tài liệu được tìm thấy nghiên cứu việc MRSA bị kháng bởi
cả methicillin và nitrocefin34,70,108. Nhưng hầu hết các tài liệu đều chưa trả lời
nguyên nhân kháng vì sao? Bản chất của việc kháng này đến đâu? Cơ chế
kháng cụ thể của quá trình tạo phức cộng hóa trị hay không cộng hóa trị như
thế nào? Tại sao sau phản ứng tạo thành phức axyl rất bền mà thuốc vẫn bị
kháng?

O
NH
O
O
O

MC1

Hình 1.5. Các cơ chất MC1 và NC1

Mặc dù hiểu biết mức độ sơ đẳng hiện nay là đã có cho quá trình axyl
hóa các PBP, cơ chế chi tiết của nó, đặc biệt là với PBP2a, vẫn chưa được làm
sáng tỏ. Hướng nghiên cứu lý thuyết về động lực cơ học phân tử (MM/MD)

và lai hóa cơ học lượng tử với cơ học phân tử (QM/MM hay ONIOM) giải
quyết bài toán cơ chế của β-lactam với PBP2a lần đầu được chúng tôi thực
hiện tại Viện nghiên cứu hóa học cơ bản Fukui, Đại học Kyoto và Trung tâm
Ứng dụng Tin học trong Hóa học, Khoa Hóa học, ĐHKH Tự Nhiên, ĐHQG

22


Hà Nội. Trong luận án, chúng tôi nghiên cứu cơ chế phản ứng giữa methicillin
(MC1) và nitrocefin (NC1) (hình 1.5) với PBP2a từ lúc hình thành phức
không cộng hóa trị đến khi tạo thành phức cộng hóa trị. Về mặt lý thuyết, để
nghiên cứu mô phỏng quá trình hình thành gắn kết thông thường của các phối
tử lên tâm hoạt hóa bằng phần mềm Autodock. Quá trình tạo phức không
cộng hóa trị giữa β-lactam và enzym được nghiên cứu bằng phương pháp
MM/MD dùng phần mềm Gromacs. Quá trình hình thành và phá vỡ liên kết
trong vòng lactam của phản ứng axyl hóa được nghiên cứu bằng cách sử dụng
phần mềm Gaussian09 qua phương pháp lý thuyết phiếm hàm mật độ (DFT)
và phương pháp lai hóa QM/MM, ONIOM (DFT: MM). Trong phối tử MC1
và NC1, phần β-lactam là hợp nhất thiazolidine và dihydrothiazine, tương
ứng.
Mục tiêu của Đề tài
Mục tiêu chính của đề tài này là chi tiết hóa được cơ chế kháng thuốc
của MRSA dựa trên một nghiên cứu tương đối đầy đủ về hệ phức phối tử –
PBP2a từ việc sử dụng trường lực cơ học phân tử (MM) đến cơ học lượng tử
(QM) và trường lực lai tạp QM/MM, từ việc tính toán bề mặt thế năng tĩnh
của phối tử (và các axit amin có liên quan) trong môi trường protein tĩnh đến
việc tính toán động lực cơ học phân tử MM/MD của protein, phối tử và của
tâm hoạt động. Nghiên cứu cơ chế này để giải đáp nghịch lý là vì sao phức
axyl β-lactam-PBP2a rất bền nhưng thuốc kháng sinh vẫn bị kháng, cơ chế
cũng sẽ làm sáng tỏ vai trò của tương tác không cộng hoá trị giữa phối tử và

PBP2a từ đó là vai trò của cấu trúc phân tử phối tử đến chiến lược kháng
thuốc của MRSA. Đề tài này nhằm đi đến đóng góp vào việc giải quyết vấn
đề nan giải nói trên, tức là nghiên cứu lý giải cơ chế kháng sinh β-lactam liên
tục bị các vi khuẩn làm mất hiệu quả, đóng góp cho việc thiết kế các loại

23