Nghiên cứu phân lập các hợp chất phenolic từ một số thực vật việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN THỊ QUỲNH HOA

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT PHENOLIC

TỪ MỘT SỐ THỰC VẬT VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2012

1


Nguyễn Thị Quỳnh Hoa

Luận văn thạc sĩ khoa học

MỤC LỤC
Trang
MỞ
ĐẦU………………………………………………………………………………1
Chƣơng 1: TỔNG
QUAN…………………………………………………………….3
1.1 Các hợp chất phenolic thực
vật...………………………………………………...3
1.1.1 Giới thiệu về các hợp chất phenolic thực
vật………………………………3

1.1.2 Phân loại các hợp chất
phenolic…………………………………………….3
1.1.3 Hoạt tính sinh học của các hợp chất
phenolic…………………………….9
1.1.4 Phƣơng pháp chiết và phân lập các hợp chất
phenolic………………….10
1.1.4.1 Phƣơng pháp
chiết…………………………………………………….11
1.1.4.2 Phƣơng pháp phân lập và tinh
chế…………………………………..14
1.1.4.3 Định tính và xác định cấu trúc………………………………………
16
1.2 Giới thiệu về cây Chẹo lá phong (Engelhardtia spicata Lesh ex. Blume)
…..19
1.2.1 Đặc điểm thực vật
học…………………………………………………….19

1


Nguyn Th Qunh Hoa

1.2.2
hỏi..19
1.2.3Cụngdngca
phong...19
1.1.4 Mt s nghiờn cu v thnh phn húa hc v hot tớnh sinh hc ca
chi
(Juglandaceae).21
Ch-ơng

2

CU23
2.1
văn..23
2.2
cứu.24
2.2.1 Các ph-ơng pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các

hợp
chất..
24
2.2.2 Các ph-ơng pháp xác định cấu
trúc..24
Chng 3 : KT QU V THO
LUN...26
3.1 i tng nghiờn
cu...26
3.2 Quy trỡnh chit cỏc phn chit t lỏ cõy Cho lỏ
phong...26
3.3 Phõn tỏch phn chit etyl axetat (EG3)
.29
3.4 Phõn tỏch phn chit nc (EG4)
..31

2


Nguyễn Thị Quỳnh Hoa

3.5

Cấu trúc các hợp chất đƣợc phân

lập………………………………………….33
Chƣơng 4: THỰC
NGHIỆM……………………………………………………….38
4.1

Thiết bị và hóa

chất……………………………………………………………..38
4.2

Nguyên liệu thực

vật…………………………………………………………….39
4.3
ĐiềuchếcácphầnchiếttừcâyChẹolá
phong………………………………..39
4.4
Phân
(EG3)………………………...40
4.4.1 Phân tích
(EG3)………………..40
4.4.2
(EG3)………………………………….40
4.5
Phân

(EG4)…………………………………..41
4.5.1Phântích
(EG4)……………………...41
4.5.2
(EG4)………………………………………..42
4.6
lập……………..43

Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất đƣợc phân

KẾT
LUẬN………………………………………………………………………….46
TÀI LIỆU THAM
KHẢO………………………………………………………….47

3


Nguyễn Thị Quỳnh Hoa

Luận văn thạc sĩ khoa học

CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN
CC (Column Chromatography): Sắc ký cột thường dưới trọng lực dung môi
13

C-NMR (Carbon 13 Nuclear Magnetic Resonance): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

cacbon 13
DEPT (Distortionless Enhancement by Polarition Tranfer): Phổ DEPT ESI-MS

(Electrospray Ionization-Mass Spectrometry): Phổ khối lượng phun bụi điện tử
FC (Flash Chromatography): Sắc kí cột nhanh
1

H-NMR (Proton Nuclear Magnetic Resonance): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

proton
LC (Liquid Chromatography): Sắc ký lỏng
Mini-C (Mini-column Chromatography): Sắc kí cột tinh chế
TLC (Thin-Layer Chromatography): Sắc kí lớp mỏng

4


Nguyễn Thị Quỳnh Hoa

Luận văn thạc sĩ khoa học

MỤC LỤC CÁC HÌNH, CÁC BẢNG VÀ CÁC SƠ ĐỒ
H×nh 1.1: Cấu trúc minh häa của stilben và lignin
H×nh 1.2: Cấu trúc minh häa của flavonoid, axit phenolic và tannin
H×nh 1.3: Cây Chẹo l¸ phong ( Engelhardtia spicata Lesh ex. Blume, Juglandaceae

)
B¶ng 1.1: Phân loại các hợp chất phenolic thiên nhiên
Bảng 4.1: Hiệu suất điều chế các phần chiết từ lá cây Chẹo lá phong
Bảng 4.2: Phân tích phần chiết etyl axetat (EG3) bằng TLC
Bảng 4.3: Phân tích phần chiết nước (EG4) bằng TLC
Sơ đồ 1.1: Quy trình chung phân lập các hợp chất phenolic
Sơ đồ 3.1: Điều chế các phần chiết hữu cơ từ nguyên liệu thực vật

Sơ đồ 3.2: Phân tách sắc kí phần chiết etyl axetat (EG3)
Sơ đồ 3.3: Phân tách sắc kí phần chiết nước (EG4)

5


Nguyễn Thị Quỳnh Hoa

Luận văn thạc sĩ khoa học

MỞ ĐẦU
Các hợp chất phenolic thực vật như các axit phenolic, các flavonoid và các
flavonoid polyme đang ngày càng thu hút được nhiều sự quan tâm do tính chất
chống oxi hóa, tác dụng phòng ngừa ung thư và các bệnh liên quan đến tim mạch
của các hợp chất phenolic. Các nghiên cứu (hóa học, dược lý học, lâm sàng) đã
phần nào lý giải được mối liên quan giữa sức khỏe con người và việc tiêu thụ các
sản phẩm thực phẩm giàu các hoạt chất phenolic thiên nhiên.
Các nghiên cứu theo hướng phát hiện các hợp chất có tác dụng dự phòng ung
thư (cancer chemoprevention) đã thiết lập được một hướng ứng dụng mới của các
hợp chất phenolic. Các hợp chất phân tử nhỏ này thường là các chất chống oxi hóa
và có thể làm giảm sự phát triển của bệnh ung thư bằng cách ngăn chặn sự phát
triển của các tế bào ung thư qua các cơ chế ngăn chặn sự hư hại ADN hoặc ức chế
hoặc đảo ngược quá trình phát triển của các tế bào tiền ác tính đã có sự hư hại ADN.
Một chương trình nghiên cứu các tác nhân dự phòng và chống ung thư từ nguồn
thực vật Việt Nam của chúng tôi đã được xây dựng trên cơ sở lựa chọn các nhóm
hợp chất có các cấu trúc tiềm năng; trong chương trình này các hợp chất phenolic có
tác dụng dự phòng ung thư đã được phát hiện với tỷ lệ cao. Chương trình nghiên
cứu này cũng đã xác định một thách thức được đặt ra cho các nhà hóa học các hợp
chất thiên nhiên là cần có các qui trình phân lập hiệu quả các nhóm cấu trúc cần
thiết từ các nguồn nguyên liệu thực vật, các qui trình này phải dễ được triển khai

tiếp cho các qui mô công nghệ phân lập lượng lớn hoạt chất một khi các hoạt chất
hữu ích được phát hiện.
Các hợp chất phenolic chiếm một vị trí đáng kể trong số các nhóm hợp chất
thiên nhiên có tác dụng dự phòng ung thư; chúng có cấu trúc đa dạng và xuất hiện
phổ biến trong giới thực vật. Việc phân lập các hợp chất này cho các thử nghiệm
hoạt tính sinh học có thể được thực hiện bằng các phương pháp chiết và sắc ký điều
chế; tuy nhiên phổ rộng độ tan của các hợp chất này cho thấy mỗi qui trình phân lập
nên được giới hạn vào một nhóm hợp chất phenolic. Các sàng lọc sắc ký lớp mỏng

6


Nguyễn Thị Quỳnh Hoa

Luận văn thạc sĩ khoa học

sơ bộ đã xác định được nhóm hợp chất phenolic trong các phần chiết từ các loài
cây: Alnus nepalensis D. Don (Betulaceae), Betula alnoides Buch. Ham. ex D. Don
(Betulaceae) và Engelhardtia spicata Lesch. ex. Blume (Juglandaceae). Mục tiêu
nghiên cứu của luận văn này là xây dựng một qui trình chiết các phần chiết giàu các
hợp chất phenolic và phân lập sắc ký các hợp chất phenolic, sau đó cấu trúc chính
xác của các các hợp chất được phân lập sẽ được xác định bằng các phương pháp
phổ hiện đại. Qui trình này đã được áp dụng thành công để phân lập các hợp chất
phenolic thành phần chính từ lá cây Chẹo lá phong (E. spicata Lesch. ex. Blume).

7


Nguyễn Thị Quỳnh Hoa

Luận văn thạc sĩ khoa học

Chương 1
TỔNG QUAN
1.1 Các hợp chất phenolic thực vật
1.1.1 Giới thiệu về các hợp chất phenolic thực vật [6]
Các hợp chất phenolic là các hợp chất có một hoặc nhiều vòng thơm với một hoặc
nhiều nhóm hydroxy. Chúng được phân bố rộng rãi trong giới thực vật và là các sản
phẩm trao đổi chất phong phú của thực vật. Hơn 8.000 cấu trúc phenolic đã được
tìm thấy, từ các phân tử đơn giản như các axit phenolic đến các chất polyme như
tannin.
Các hợp chất phenolic thực vật có tác dụng chống lại bức xạ tia cực tím hoặc
ngăn chặn các tác nhân gây bệnh, ký sinh trùng và động vật ăn thịt, cũng như làm
tăng các màu sắc của thực vật. Chúng có ở khắp các bộ phận của cây và vì vậy,
chúng cũng là một phần không thể thiếu trong chế độ ăn uống của con người.
Các hợp chất phenolic là thành phần phổ biến của thức ăn thực vật (trái cây, rau,
ngũ cốc, ô liu, các loại đậu, sô-cô-la, vv) và đồ uống (trà, cà phê, bia, rượu, vv), và
góp phần tạo nên các đặc tính cảm quan chung của thức ăn thực vật. Ví dụ, các
hợp chất phenolic làm tăng vị đắng, sự se của trái cây và nước trái cây, bởi vì sự
tương tác giữa các hợp chất phenolic, chủ yếu là các procyanidin và glycoprotein
trong nước bọt. Các anthocyanin, một trong sáu phân nhóm của một nhóm
polyphenol thực vật lớn được gọi là các flavonoid, tạo màu da cam, đỏ, xanh và
màu tím của nhiều loại trái cây và rau quả như táo, quả, củ cải và hành tây. Các
hợp chất phenolic được biết đến như là những hợp chất quan trọng nhất ảnh hưởng
đến hương vị và sự khác biệt màu sắc giữa các loại rượu vang trắng, hồng và đỏ,
các hợp chất này phản ứng với oxy và có ảnh hưởng đến việc bảo quản, lên men
và cất giữu rượu vang.
1.1.2 Phân loại các hợp chất phenolic [6, 10]

8

Nguyễn Thị Quỳnh Hoa

Luận văn thạc sĩ khoa học

Các hợp chất phenolic có cấu trúc rất đa dạng và có thể được chia thành 10
nhóm chính được đưa ra trong Bảng 1.1.
B¶ng 1.1: Phân loại các hợp chất phenolic thiên nhiên
Số nguyên
tử cacbon

C6

C6-C1

C6-C2

C6-C3


9


Nguyễn Thị Quỳnh Hoa
học

Luận văn thạc sĩ khoa

Số nguyên

tử Cacbon
C6-C3

C6-C4

C6-C1-C6

C6-C2-C6

C6-C3-C6

(C6-C3)2Lignan, Neolignan

10


Nguyễn Thị Quỳnh Hoa

Số nguyên
tử Cacbon
(C6-C1)n

(C6-C3)n
Các hợp chất phenolic thực vật bao gồm các stilben, các lignan (Hình 1.1), các
axit phenolic, các flavonoid và các tannin (Hình 1.2).

Hình 1.1: Cấu trúc minh họa của stilben và lignan

11

Nguyễn Thị Quỳnh Hoa

Luận văn thạc sĩ khoa học

H×nh 1.2: Cấu trúc minh häa của flavonoid, axit phenolic và tannin

7


Nguyễn Thị Quỳnh Hoa

Luận văn thạc sĩ khoa học

Các flavonoid là các polyphenol có nhiều nhất trong thức ăn của chúng ta. Một
cấu trúc flavonoid cơ bản là nhân flavan, chứa 15 nguyên tử cacbon được sắp xếp theo
ba vòng (C6-C3-C6), được kí hiệu là A, B và C. Các flavonoid được chia thành sáu
phân nhóm: flavon, flavonol, flavanol, falavanon, isoflavon và anthocyanin theo trạng
thái oxy hóa của vòng C trung tâm.
Sự thay đổi cấu trúc của chúng trong mỗi nhóm một phần là do mức độ và mô
hình hydroxyl hóa, methoxyl hóa, prenyl hóa, hoặc glycosyl hóa.
Một số chất flavonoid phổ biến nhất bao gồm quercetin, một flavonol có rất nhiều
trong hành tây, bông cải xanh, táo; catechin, một flavonol được tìm thấy trong trà và
một số loại trái cây; naringenin, một flavonol có trong quả bưởi; các cyaniding
glycoside, anthocyanin có nhiều trong các loại trái cây mọng (nho đen, mâm xôi,
blackberry, …) và daidzein, genistein và glycitein, các isoflavon trong đậu tương.
Các axit phenolic có thể được chia thành hai nhóm: nhóm các dẫn xuất của axit
benzoic chẳng hạn như axit gallic và nhóm các dẫn xuất của axit cinnamic như axit
coumaric, axit caffeic và axit ferulic. Axit caffeic là một axit phenolic phổ biến nhất,
chứa trong nhiều loại trái cây và rau quả, thường được este hóa với axit quinic trong

axit chlorogenic, là một hợp chất phenolic chủ yếu trong cà phê. Một axit phenolic phổ
biến khác là axit ferulic, đó là chất có trong ngũ cốc và được este hóa tạo thành các
hemicelluose có trong thành tế bào.
Các tannin là một nhóm lớn các polyphenol trong khẩu phần ăn của chúng ta và
thường được chia thành hai nhóm: nhóm các tannin thủy phân và nhóm các tannin
ngưng tụ. Các tannin thủy phân là các hợp chất có chứa nhân của glucose hoặc polyol
khác, được este hóa với axit galic tạo thành các gallotannin, hoặc với axit
hexahydroxydiphenic tạo thành các gellagitannin. Sự đa dạng trong cấu trúc của các
hợp chất này là do khả năng hình thành các liên kết oxy. Phản ứng oxy hóa giữa các
phân tử tạo thành nhiều hợp chất oligomeric có khối lượng phân tử khoảng 2.000 đến
5.000 dalton. Các tannin ngưng tụ là các oligome hoặc polymer của flavan-3-ol liên kết

35


Nguyễn Thị Quỳnh Hoa

Luận văn thạc sĩ khoa học

với nhau bằng một liên kết cacbon giữa các flavan. Chúng cũng được coi là các
proanthocyanidin bởi vì chúng bị phân hủy thành các anthocyanidin thông qua phản
ứng oxy hóa, trong điều kiện xúc tác axit, nhiệt độ với các dung dịch rượu. Sự đa dạng
cấu trúc các tannin là một kết quả của sự biến đổi trong mô hình thủy phân, lập thể tại
ba trung tâm lập thể, vị trí và loại liên kết giữa các flavan, cũng như mức độ và mô
hình của sự glycosyl hóa, methoxyl hóa và galloyl hóa.
1.1.3 Hoạt tính sinh học của các hợp chất phenolic
Do sự phân bố rộng rãi, các polyphenol có vai trò đối với sức khỏe của con người
nên chế độ ăn uống dinh dưỡng được chú ý trong những năm gần đây. Các nhà nghiên
cứu và các nhà sản xuất thực phẩm đã tập trung vào các polyphenol có đặc tính chống
oxy hóa mạnh trong chế độ ăn uống, các hiệu ứng đáng tin cậy của chúng trong việc

phòng ngừa những chứng bệnh căng thẳng oxy hóa liên quan.Theo các nghiên cứu
dịch tễ học, hấp thụ các hợp chất phenolic sẽ giảm được nguy cơ mắc các bệnh tim
mạch ngăn ngừa được bệnh ung thư. Hơn nữa các polyphenol còn có các tác dụng sinh
lý học cụ thể trong việc ngăn ngừa và điều trị bệnh [6].
Các catechin được tìm thấy nhiều trong hạt nho, trà, ca cao, có tác dụng chống
oxy hóa và có hiệu quả ngăn ngừa ung thư [30].
Các tannin có nhiều trong rượu vang đỏ, trà và các loại hạt làm phát huy các tác
dụng sinh lý, chúng có thể làm giảm áp lực máu, thúc đẩy đông máu, giảm nồng độ
lipit trong huyết thanh, điều chỉnh sự đáp ứng miễn dịch và ngăn ngừa hoại tử gan [10,
30].
Các isoflavon, genistein và daidzein (được tìm thấy trong đậu nành và có ảnh
hưởng tốt đến xương ở phụ nữ mãn kinh, cùng với một số tác dụng nội tiết tốt [30].
Các procyanidin có nồng độ cao trong rượu vang đỏ, nho và hạt nho, ca cao, nam
việt quất, táo, có tác dụng chống viêm và có ảnh hưởng rất tốt đến hệ thống mạch máu.
Chất này cũng được sử dụng làm chất phụ gia thực phẩm để ngăn chặn quá trình oxy
hóa của các thành phần trong thực phẩm [30].

35


Nguyễn Thị Quỳnh Hoa

Luận văn thạc sĩ khoa học

Một stilben, resveratrol là một polyphenol đặc biệt, có tiềm năng chống ung thư
và chống lão hóa [30].
Các quercetin (đại diện chính của lớp flavonol, chứa nhiều trong hành tây, táo,
rượu vang đỏ, bông cải xanh, trà) ức chế chất sinh ung thư và có tác dụng chống oxy
hóa của huyết tương trong cơ thể [30].
1.1.4 Phƣơng pháp chiết và phân lập các hợp chất phenolic

1.1.4.1 Phƣơng pháp chiết
Chiết là một trong những bước quan trọng nhất trong tiền xử lý mẫu nghiên cứu,
là các quy trình được sử dụng nhiều nhất do sự dễ sử dụng, hiệu quả và khả năng áp
dụng rộng [8]. Nói chung, hiệu suất chiết phụ thuộc vào dạng dung môi với các độ
phân cực khác nhau, thời gian chiết và nhiệt độ, tỷ lệ mẫu và dung môi cũng như thành
phần hóa học và các đặc tính vật lý của các mẫu. Độ tan của các phenolic được quyết
định bởi bản chất hóa học của mẫu thực vật, cũng như độ phân cực của các dung môi
được sử dụng. Các nguyên liệu thực vật có thể chứa các hợp chất phenolic từ các hợp
chất đơn giản (ví dụ: các axit phenolic, các anthocyanin) đến các chất được polymer
hóa cao (ví dụ: các tannin ở các lượng khác nhau). Hơn thế nữa các hợp chất phenolic
cũng có thể liên kết với các thành phần thực vật khác như cacbohydrat và các protein.
Do đó phụ thuộc vào hệ dung môi được sử dụng trong khi chiết, một hỗn hợp các hợp
chất phenolic tan trong dung môi sẽ được chiết khỏi nguyên liệu thực vật. Hỗn hợp này
có thể chứa các chất phi phenolic như: đường, các tecpen, các chlorophyll, các axit hữu
cơ và các chất béo [11, 25].
1.1.4.1.1 Chiết bằng dung môi
Các phương pháp chiết các hợp chất phenolic đơn giản (axit benzoic, andehit
bezoic, axit cinnamic và catechin) từ các nguyên liệu rắn chủ yếu được ngâm chiết với
các dung môi hữu cơ. Hiệu suất chiết phụ thuộc vào dạng dung môi với các độ phân
cực khác nhau, thời gian chiết và các đặc trưng vật lý của mẫu chiết. Ánh sáng, không
khí và nhiệt độ là các yếu tố thúc đẩy các phản ứng thoái biến.

35


Nguyễn Thị Quỳnh Hoa

Luận văn thạc sĩ khoa học

Các dung môi như: etanol, metanol, propanol, aceton, etyl acetat, và sự kết hợp

của các dung môi này với tỷ lệ khác nhau của nước cũng được sử dụng để chiết các
hợp chất phenolic. Nói chung, chiết dung môi được sử dụng ở độ phòng để tránh sự
thoái biến của các hợp chất phenolic; nhiều nghiên cứu sử dụng nhiệt độ khoảng 20o

40 C. Các hợp chất phenolic bị thủy phân ở nhiệt độ 80-95ºC (sự thủy phân axit) hoặc
45ºC (sự thủy phân bazơ).
Các anthocyanin thường được chiết từ nguyên liệu thực vật với một dung môi
hữu cơ được axit hóa, phổ biến nhất là metanol. Hệ dung môi này phá hủy các màng tế
bào, hòa tan đồng thời cả các anthocyanin và ổn định chúng. Tuy nhiên, axit có thể
đem lại sự thay đổi dạng gốc của các anthocyanin bằng cách phá vỡ các phức của
chúng với các kim loại và các sắc tố [31].
Việc thu hồi các hợp chất phenolic từ nguyên liệu thực vật cũng bị ảnh hưởng bởi
thời gian chiết và nhiệt độ, thể hiện tác dụng của sự hòa tan và sự thoái hóa chất phân
tích do quá trình oxy hóa. Tăng nhiệt độ chiết có thể thúc đẩy quá trình hòa tan chất
phân tích bằng cách tăng cả độ tan và tốc độ truyền khối. Ngoài ra, độ
nhớt và sức căng bề mặt của dung môi được giảm xuống ở nhiệt độ cao hơn, giúp các
dung môi tiếp cận được các mẫu chiết, cải thiện tỷ lệ chiết. Tuy nhiên, các hợp chất
phenolic có thể dễ dàng bị thủy phân và oxy hóa. Thời gian chiết lâu dài và nhiệt độ
cao làm tăng khả năng của quá trình oxy hóa các hợp chất phenolic, giảm sản lượng
phenol trong các chất chiết xuất. Ví dụ, thông thường chiết và cô đặc các anthocyanin
o

thường được tiến hành ở nhiệt độ 20-50°C, vì nhiệt độ cao hơn 70 C đã chứng minh là
gây ra sự thoái biến nhanh các anthocyanin. Vì vậy, các yếu tố này đóng vai trò quan
trọng để lựa chọn phương pháp chiết hiệu quả và duy trì sự ổn định của các hợp chất
phenolic [11].
1.1.4.1.2 Chiết pha rắn (SPE) [11, 26]
Chiết pha rắn (SPE) là một kỹ thuật chuẩn bị mẫu trong phân tích ngày càng hữu
ích. Với SPE, những vấn đề liên quan đến chiết hai pha lỏng (LLE), chẳng hạn như sự

35


Nguyễn Thị Quỳnh Hoa

Luận văn thạc sĩ khoa học

phân tách không hoàn toàn, độ thu hồi thấp, sử dụng và loại bỏ lượng lớn, dung môi
hữu cơ đắt tiền có thể tránh được, mặc dù chi phí của các thiết bị cần thiết cho SPE cao
hơn so với LLE. Kỹ thuật này thường được sử dụng nhất để chuẩn bị các mẫu lỏng và
các chất phân tích bay hơi hoặc không bay hơi, nhưng cũng có thể được sử dụng với
chất rắn được chiết trước vào các dung môi. Các kỹ thuật SPE đa dạng với nhiều loại
chất hóa học, các chất hấp phụ, và kích thước, do đó cần thiết để lựa chọn sản phẩm
SPE phù hợp cho mỗi ứng dụng và mẫu chiết. Phân tích SPE đã được thử nghiệm để
xác định các hợp chất phenolic trong nho, rượu vang và các đồ uống. Trường hợp chiết
các hợp chất phenolic từ các mẫu dầu ô-liu cũng đã được nghiên cứu rộng rãi.
1.1.4.1.3 Chiết chất lỏng siêu tới hạn (SFE) [4, 19, 24]
Thông thường, các hợp chất phenolic được chiết từ các mẫu thực vật bằng
phương pháp SPE kết hợp các kỹ thuật khác, chẳng hạn chiết chất lỏng siêu tới hạn
(SFE). SFE là một kỹ thuật mới cho ưu điểm hơn so với phương pháp truyền thống,
như sử dụng nhiệt độ thấp, giảm tiêu thụ năng lượng và cho chất lượng sản phẩm cao
do không dùng dung môi trong pha hòa tan.Tuy nhiên, kỹ thuật này được áp dụng cho
các hợp chất phân cực thấp hoặc trung bình. SFE thường được mô tả để chiết các
polyphenol, các đặc điểm chính của phương pháp này là cần các tỷ lệ phần trăm cao
của các chất biến cải hữu cơ, điều này có nghĩa rằng quá trình này xảy ra trong các điều
kiện dưới tới hạn.
Cacbon đioxit siêu tới hạn (SC-CO 2) là dung môi được sử dụng rộng rãi nhất cho
SFE do đặc điểm đặc biệt của nó, như điều kiện tới hạn (31,1ºC và 73,8 MPa) và sẵn
có. Đây là phương pháp không độc hại, không dễ cháy nổ và bền hóa học. Tuy nhiên,
SFE sử dụng CO2 làm dung môi chiết không được áp dụng cho các hợp chất phenolic

vì CO2 phân cực thấp hơn so với hầu hết các phenol.
Thông thường, quá trình chiết này có các bước sau: mẫu được nạp lên trên chất
hấp phụ của cột SPE và các cột này được lắp vào các bộ phận chiết SPE/SFE. Các

35


Nguyễn Thị Quỳnh Hoa

Luận văn thạc sĩ khoa học

chất lỏng siêu tới hạn được sử dụng, có thể là cacbon dioxit, phải đi qua các cột SPE
được đổ đầy mẫu đã được thủy phân. Do đó, các chất phân tích (các hợp chất phenolic)
bị giữ lại toàn lượng bởi một dung môi bẫy (ví dụ: metanol) ở nhiệt độ phòng thí
nghiệm (các dung môi bẫy được làm lạnh tự nhiên trong suốt quá trình chiết bởi sự
giãn nở CO2). Cuối cùng, các dịch chiết được cô quay kiệt, hòa tan trong các pha động,
và được bơm trực tiếp vào hệ thống HPLC/ESI-MS.
1.1.4.1.4 Chiết lỏng dưới áp suất nén (PLE) [15,18]
Chiết lỏng dưới áp suất nén (PLE) sử dụng các dung môi hữu cơ ở các áp suất cao
và nhiệt độ trên điểm sôi bình thường của chúng. Đây là phương pháp hiện đại mới
nhất để phân lập riêng chất phân tích từ các mẫu rắn. Nói chung, với LLE, một mẫu rắn
được nạp vào bộ phận chiết bằng thép không gỉ và được chiết với một dung
môi thích hợp dưới nhiệt độ cao (40-200ºC) và áp lực (5-300 psi) trong một thời gian
ngắn (5-15 phút). Các dịch chiết được gộp vào một bình thu mẫu bằng một loại
khí nén.
Qui trình được mô tả bởi Alonso-Salces và cộng sự, dựa trên sự chiết polyphenol
từ các mẫu táo. PLE đã được chứng minh là một phương pháp chiết hiệu quả để phân
lập các polyphenol và nhiệt độ cao đã được sử dụng để đẩy nhanh quá trình chiết.
1.1.4.1.5 Chiết bằng vi sóng (MAE) [5, 27]
Công nghệ vi sóng thường được biết đến với việc sử dụng để xử lý nhiệt. Ví dụ,

nó được sử dụng như một quá trình nhiệt cho các sản phẩm trái cây thương phẩm để
đạt được sự khử trùng nhanh và êm dịu của các sản phẩm này. Đồng thời, vi sóng được
sử dụng để xác định độ ổn định của hàm lượng polyphenol sau xử lý. Công nghệ này
cũng được sử dụng để tăng quá trình làm khô trong rượu vang và các mẫu nho tươi, cải
thiện sự tiền xử lý và là qui trình hữu ích để kiểm tra các hợp chất phenolic.
Gần đây, phương pháp chiết bằng vi sóng (MAE), còn được gọi là quá trình vi
sóng hỗ trợ (MAP), đã được áp dụng trong việc phát triển các phương pháp chiết các

35


Nguyễn Thị Quỳnh Hoa

Luận văn thạc sĩ khoa học

hợp chất hữu cơ từ đất, trầm tích, hạt giống, và các mẫu thực phẩm. Các nghiên cứu
này cho thấy chiết hiệu quả hơn khi năng lượng lò vi sóng được sử dụng. Nghiên cứu
của Sutivisedsak và cộng sự, đã chứng minh tiện ích của vi sóng trong xác định hàm
lượng phenolic trong tám loại đậu thông thường, sử dụng phương pháp đo màu FolinCiocalteau.
1.1.4.1.6 Chiết siêu âm (UAE) [8, 18, 32]
Bức xạ siêu âm là một trợ giúp mạnh mẽ các bước khác nhau của quá trình phân
tích. Năng lượng này giúp nhiều trong việc xử lí các mẫu rắn vì nó làm dễ dàng và tăng
tốc độ các quá trình chiết các hợp chất hữu cơ và vô cơ, đồng nhất và nhiều ứng dụng
khác. Ví dụ, các hệ thống chiết siêu âm đã được sử dụng rộng rãi để chiết xuất
capsaicinoid trong ớt nóng.
Chiết bằng siêu âm (UAE) được cho là một trong các kỹ thuật chiết đơn giản bởi
vì nó dễ thực hiện bằng các thiết bị thông thường trong phòng thí nghiệm. Trong
phương pháp này, mẫu được nghiền nát trộn với dung môi thích hợp và được đặt vào
bể siêu âm, nơi mà nhiệt độ và thời gian chiết định.
Các ứng dụng của chiết siêu âm (UAE) trong công nghệ chế biến thực phẩm dễ

cho việc chiết các thành phần từ các nguyên liệu thực vật. Hiệu suất cao đạt được trong
các qui trình UAE là quan tâm lớn nhất từ khía cạnh công nghiệp, do công nghệ UAE
chỉ là một bước thêm vào qui trình đã có với sự thay đổi tối thiểu, sử dụng được chiết
nước, giảm lượng dung môi sử dụng và rút ngắn thời gian chiết. Sử dụng siêu âm cho
các nguyên liệu chiết thô đắt tiền là sự thay thế kinh tế các phương pháp chiết truyền
thống, là một yêu cầu phát triển của công nghiệp. Siêu âm có thể tăng cường quá trình
chiết hiện có và cho phép chiết được các polyphenol và carotenoid trong cả hai hệ
thống chiết dịch nước và dung môi. Các thử nghiệm chiết hỗ trợ siêu âm đã chứng
minh là cải tiến được hiệu suất chiết từ 6 đến 35%.
1.1.4.2. Phƣơng pháp phân lập và tinh chế

35


Nguyễn Thị Quỳnh Hoa

Luận văn thạc sĩ khoa học

Các phần chiết thực vật thô thường chứa một lượng lớn các hợp chất cacbohydrat
hoặc nguyên liệu lipoid và hàm lượng của các hợp chất phenolic trong phần chiết thực
vật thô có thể thấp. Để cô đặc và có được phân đoạn giàu polyphenol, qui trình bao
gồm: chiết lần lượt hoặc phân bố hai pha lỏng hoặc chiết pha rắn (SPE) dựa trên độ
phân cực và axit thường được sử dụng. Nói chung, việc loại bỏ nguyên liệu lipoid có
thể đạt được bằng cách rửa phần chiết thô với các dung môi không phân cực như
hexan, diclometan, hoặc cloroform.
Trong quá trình phân lập và tinh chế SPE được sử dụng để loại bỏ các hợp chất
không phenolic như các đường và axit hữu cơ. SPE đang trở thành phổ biến vì là kỹ
thuật nhanh, nhạy và kinh tế và vì các cột và đĩa SPE với các chất hấp phụ khác nhau
có thể được sử dụng. Ngoài ra, kỹ thuật này có thể được tự động hóa. Các cột C18 đã
được sử dụng rộng rãi nhất trong phân tách các hợp chất phenolic. Sau khi các mẫu

dung dịch được đưa qua các cột C18 đã được ổn định trước, các cột được rửa bằng
nước axit để loại bỏ các đường, axit hữu cơ và các thành phần tan trong nước khác. Các
polyphenol sau đó được rửa giải bằng metanol tuyệt đối hoặc dung dịch nước aceton.
Phân tách tiếp các hợp chất phenolic đạt được bằng cách điều chỉnh pH của mẫu cũng
như độ pH và độ phân cực của các hệ dung môi. Ví dụ, Pinelo và cộng sự đã điều chỉnh
độ pH của mẫu rượu vang loại ancol đến pH 7.0 và rửa giải hỗn hợp các axit phenolic
với nước trong phân đoạn đầu [28]. Theo bước này, cột C18 được rửa axit với dung
dịch HCl 0,01M và các phenol không polyme như các catechin, anthocyanin, và
flavonol được rửa giải với etyl acetat. Cuối cùng, một hỗn hợp aceton, nước và metanol
được sử dụng để rửa giải các phenol dạng polyme.
Các chất hấp phụ khác như Amberlite XAD-2, XAD-7, XAD-16, Oasis HLB [16,
20, 34] cũng đã được sử dụng để tinh chế các hợp chất phenolic trong các phần chiết
thô hay của các mẫu rượu vang. Sự so sánh một vài cột SPE bao gồm Amberlite, C8
silica gel, copolyme HLB, PH, ENV và MCX C18 silica gel để phân lập các hợp chất
phenolic trong rượu vang ở nồng độ thấp cho thấy rằng phương pháp SPE với cột HLB

35


Nguyễn Thị Quỳnh Hoa

Luận văn thạc sĩ khoa học

có độ nhạy cao hơn, độ thu hồi và khả năng nạp mẫu cao hơn cột C18 và cột HLB có thể là
một sự thay thế tốt cho cột C18 để phân lập các hợp chất phenolic của rượu vang.

Sắc ký cột cũng đã được sử dụng để phân tách các phần chiết phenolic. Mặc dù
phương pháp này thường tốn nhiều công sức và tiêu thụ dung môi nhưng nó tạo lượng
lớn các phân đoạn tiếp theo cho sự phân lập và xác định các chất tinh khiết. Các chất
hấp phụ cột thường sử dụng là RP-C18, Toyopearl, LH-20 và với mức độ ít hơn nhựa

polyamit [29]. Etanol, metanol, aceton và nước là các dung môi rửa giải thường được
sử dụng. Đặc biệt, sự phân lập các proanthocyanidin (tannin ngưng tụ) thường xuyên
được thực hiện bằng cột sắc ký Sephadex LH-20 [3, 12]. Phần chiết thô được đưa lên
và rửa giải bằng metanol hoặc etanol, chất không tannin sau đó rửa giải với aceton
nước hoặc rượu-nước để nhận được các proanthocyanidin. Sử dụng cột sắc ký LH-20,
methanol thường được dùng hơn etanol để rửa giải các chất không tannin. Hệ dung
môi aceton-nước tốt hơn so với hệ dung môi etanol-nước để rửa giải các procyanidin
từ cột, đặc biệt là các procyanidin dạng polyme. Trong một số trường hợp, hệ thống
HPLC điều chế cũng đã được sử dụng để tinh chế mẫu polyphenol [2, 9].
1.1.4.3 Phân tích và xác định cấu trúc
Các polyphenol cho sự hấp thụ ở vùng UV và UV/VIS. Do đó các phương tiện
phổ biến nhất để phát hiện các hợp chất phenolic được ghép nối với sắc ký lỏng (LC)
là các đetectơ UV/VIS, PDA và UV-huỳnh quang. PDA là phương pháp phổ biến nhất
vì nó cho phép quét phổ UV/VIS của tất cả các chất tan đi qua đetectơ, cung cấp thông
tin của các hợp chất trong hỗn hợp phức tạp như các phần chiết thực vật thô. Các
phương pháp khác được sử dụng để phát hiện các hợp chất phenolic bao gồm: kỹ thuật
điện hóa (ECD), điện lượng kế, PDA và phát hiện chuỗi điện tử (EAD) được kết nối
online, kỹ thuật phát hiện phản ứng hóa học, phổ khối lượng (MS) và phổ cộng hưởng
từ hạt nhân (NMR).
Các kỹ thuật điện di bao gồm điện di mao quản (CE), vùng điện di mao quản
(CZE), sắc ký điện động Mixen kết hợp với phổ UV và ít hơn sự nhận

35


Nguyễn Thị Quỳnh Hoa

Luận văn thạc sĩ khoa học

dạng EC và MS cũng được sử dụng để phân tích các hợp chất phenolic [14].

Sơ đồ quy trình phân lập và phân tích các hợp chất phenolic từ nguyên liệu thực
vật được trình bày trong Sơ đồ 1.1.

35


Nguyễn Thị Quỳnh Hoa

Luận văn thạc sĩ khoa học

Làm khô không khí, làm khô đông lạnh
Xay
Xử lý thô

Nghiền
Đồng nhất

Ngâm chiết
Chiết
Chiết

MAE
UAE
PFE (PLE/ASE, SWE, SFE)

SPE
Phân lập

Sắc ký cột

Tinh chế

CCC

Các thử nghiệm quang phổ kế: FD, F-C, …
GL/LC/điện di với phân tích công cụ
Phân tích

(UV/VIS, FLU, PDA, EAD, điện lượng kế,
ECD, MS, NMR)

Sơ đồ 1.1: Quy trình chung phân lập các hợp chất phenolic

35