Xây dựng phương pháp elisa gián tiếp xác định dư lượng fluoroquinolone trong sữa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
=============***=============

HẮC BÁ THÀNH

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ELISA GIÁN TIẾP
XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG FLUOROQUINOLONE TRONG SỮA

LUÂṆ VĂN THACC̣ SĨSINH HOCC̣

Hà Nội – 2015

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
1




BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
=============***=============

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ELISA GIÁN TIẾP
XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG FLUOROQUINOLONE TRONG SỮA

LUÂṆ VĂN THACC̣ SĨSINH HOCC̣
Chuyên ngành: Hóa sinh thực nghiệm
Mã số: 60 42 01 14

Ngƣời hƣớng dẫn khoa hocC̣: TS. NGUYỄN THỊ DIỆU THÚY
Học viên:
HẮC BÁ THÀNH

Hà Nội - 2015

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
2




MỤC LỤC
MỞ ĐẦU…………………………………………………………………………… 7
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU……………………………………….. 9
1.1. Kháng sinh nhóm Fluoroquilone……………………………………………… 9
1.1.1. Nguồn gốc và sự phát triển của kháng sinh nhóm Fluoroquilone…………… 9
1.1.2. Phân loại và cơ chế tác dụng………………………………………………… 9
1.1.3. Cấu trúc, đặc điểm một số kháng sinh thuộc họ Fluoroquinolone…………. 12

1.1.4. Ngƣỡng giới haṇ cho phép ởmôṭsốthƣcc̣ phẩm…………………………… 18
1.2. Các phƣơng pháp xác định hàm lƣợng kháng sinh nhóm Fluoroquilone……. 22
1.2.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) và sắc ký khối phổ (LC-MS)…... 22
1.2.2. Phƣơng pháp ELISA (Enzyme - Linked Immuno sorbent Assay)………… 23
1.2.2.1. Nguyên lý phƣơng pháp ELISA…………………………………………. 24

1.2.2.2. Các phản ứng ELISA…………………………………………………….. 25
b. ELISA gián tiếp (indirect ELISA)……………………………………………... 26
c.ELISA cạnh tranh (competitive ELISA)……………………………………….. 28
1.2.3. Ứng dụng phƣơng pháp ELISA……………………………………………. 29
1.4. Tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi……………………………… 29
1.5. Tác hại của Fluoroquinolone tồn dƣ trong thực phẩm………………………. 30
1.6. Tác hại của Fluoroquinolone đến môi trƣờng……………………………….. 31
1.5. Các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc sử dụng ELISA phát hiện dƣ lƣợ ng
Fluoroquilone……………………………………………………………………... 32
1.5.1. Các nghiên cứu ngoài nƣớc………………………………………………… 32
1.5.2. Các nghiên cứu trong nƣớc………………………………………………… 34
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP………………………………… 36

2.1. Vật liệu nghiên cứu………………………………………………………….. 36
2.1.1. Dụng cụ, thiết bị……………………………………………………………. 36

2.1.2. Hoá chất……………………………………………………………………. 36
2.1.3. Các dung dịch đệm…………………………………………………………. 37
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu…………………………………………………….. 38
2.2.1. Mục tiêu của nghiên cứu…………………………………………………… 38

2.2.2. Địa điểm và đối tƣợng nghiên cứu………………………………………… 38
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
3




2.2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu…………………………………………………… 38

2.2.3.1. Nội dung nghiên cứu…………………………………………………….. 38
a. Phƣơng pháp tổng hơpc̣ hapten gắn LEV với OVA/BSA……………………….. 38
b. Phƣơng pháp taọ kháng thểđa dòng kháng LEV trên thỏ…………………….. 40
c. Phƣơng pháp ELISA gián tiếp xác đinḥ dƣ lƣơngc̣ LEV………………………... 41
2.2.3.2. Giới hạn phát hiện nồng độ và độ đặc hiệu của nghiên cứu…………….. .44
2.2.3.4. Đánh giá hiệu suất thu hồi của LEV khi gây nhiễm nhân tạo……………. 44
2.2.3.3. Chuẩn bị mẫu sữa………………………………………………………… 45
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………………………. 47

3.1. Các thông số phản ứng ELISA gián tiếp…………………………………….. 48
3.2. Kết quả phản ứng ELISA gián tiếp………………………………………….. 48
3.5. Đánh giá độ ổn định của phƣơng pháp………………………………………..55
3.6. Phản ứng ELISA để xác định dƣ lƣợng LEV trong sữa……………………… 55
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………………………… 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………… 59

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
4




DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1. Giới hạn tồn dƣ tối đa của các Quinolone theo Quyết định số 2377/90/EC

của Ủy ban Châu Âu [16] .........................................................................................
Bảng 3.1. Kết quả đo OD450
Bảng 3.2. Kết quả đo OD450
Bảng 3.3. Bảng kết quả hiệu suất thu hồi .................................................................
Bảng 3.4. Kết quả xác định hàm lƣợng LEV ở các mẫu sữa……………………54

DANH MỤC SƠ ĐỒ,
Hình 1. Cấu trúc phân tử gốc Fluoroquinolone..........................................................
Hình 2. Cấu trúc phân tử Danofloxacin ...................................................................
Hình 3. Cấu trúc phân tử Difloxacin ........................................................................
Hình 4. Cấu trúc phân tử Enrofloxacin ....................................................................
Hình 5. Cấu trúc phân tử Ibafloxacin .......................................................................
Hình 6.

Cấu trúc phân tử Marbofloxacin ...........

Hình 7.

Cấu trúc phân tử Orbifloxacin ...............

Hình 8.

Cấu trúc phân tử Sarafloxacin ...............

Hình 9.

Cấu trúc phân tử Levofloxacin ..............

Hình 10. Sơ đồ các phản ứng ILISA……………………………………………..23
Hình 11. Sơ đồ phản ứng ELISA gián tiếp.................................................................................... 25
Hình 12. Tổng hợp liên hợp của LEV với OVA (LEV - OVA)........................................... 38
Hình 13. Sơ đồ ELISA gián tiếp cạnh tranh ………………………….………...41
Hình 14. Đồ thị tuyến tính nồng độ LEV chuẩn......................................................................... 51
Hình 15. Đồ thị tuyến tính nồng độ LEV chuẩn…………………………………49
Hình 16. Đồ thị tuyến tính nồng độ LEV chuẩn đƣợc xây dựng từ đƣờng chuẩn

gốc....................................................................................................................
Hình 17. Cấu trúc phân tử của Fluoroquinolone………………………………..51
Hình 18. Biểu đồ tỷ lệ phản ứng chéo của Fluoroquinolone…………………...52
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
5




DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

ELISA
HPLC
GC-MS
OD
TMB
EU
FAO
WHO
MRLs
FDA
PBST
PBS
SD
HPRO
QĐ
TT - BNN

Enzym - Link Immuno sorbent Assay
High Pressure Liquid Chromatography

(Sắc ký lỏng cao áp)
Gas Chromatography/Mass Spetrometry
(Sắc ký khí - khối phổ)
Optical Density (Mật độ quang học)
3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine
Liên minh Châu Âu
Tổ chức Lƣơng thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc
Tổ chức y tế thế giới
Maximum Residual Limit
Food and Drug Administration
Phosphate buffer saline Tween
Phosphate buffer saline
Standard deviation (độ lệch chuẩn)
Horseradish peroxidase
Quyết định
Thông tƣ - Bộ nông nghiệp

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
6




MỞ ĐẦU
Fluoroquilone làmôṭtrong nhƣƣ̃ng nhóm kháng sinh tổng hơpc̣ hoáhocc̣, có tác
dụng diệt khuẩn rộng hiệu quả, có khả năng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn một cách
nhanh chóng nên kháng sinh nhóm Fluoroquilone ngày càng đƣơcc̣ sƣƣ̉ dungc̣ nhiều
trong phòng và điều trị bệnh trong chăn nuôi và thuỷ sản. Trƣớc thực trạng nguy cơ
và kiểm soát dịch bệnh chƣa thật nghiêm ngặt, dƣ lƣợng của loại kháng sinh này
thƣờng tìm thấy trong nhiều sản phẩm nông nghiệp nhƣ thịt, cá, trứng, sữa,...Trong

quá trình nuôi dƣỡng, nếu không tuân thủ về thời gian dùng thuốc và thời gian sản
xuất hoặc chế biến thì sẽ dẫn đến lƣợng Fluoroquilone còn lại trong thịt, sữa, gia
cầm và thủy sản...Việc lạm dụng kháng sinh Fluoroquilone trong phòng bệnh, điều
trị, kích thích sinh trƣởng hay bảo quản đối với ngành chăn nuôi dẫn đến sự tồn dƣ
kháng sinh trong chăn nuôi, vì thế ảnh hƣởng nghiêm trọng đến môi trƣờng và sức
khoẻ ngƣời tiêu dùng.
Điều này gây nhiều mối nguy hiểm, hiện tƣợng kháng thuốc của một số vi
khuẩn nhƣ: Salmonella, Campylobaccer spp, Escherichia coli,…hậu quả là giảm
hiệu quả của kháng sinh nói chung, kháng sinh dòng Fluoroquilone nói riêng đối
với các chủng vi khuẩn. Để bảo vệ ngƣời tiêu dùng ở châu Âu, tổ chức EU đã thiết
lập giới hạn lớn nhất (MRLs) đối với dƣ lƣợng thuốc kháng sinh trong nguồn thực
phẩm khi cung cấp cho con ngƣời vào năm 1990. Theo sự kiểm tra và định lƣợng
của các chuyên gia phòng thí nghiệm, EU đã công bố “Council directive 96/23/EU
in 1996” [12], trong đó quy định rõ hàm lƣợng kháng sinh theo từng loại thực
phẩm và từng loại thuốc, ví dụ nhƣ với Enrofloxacin trong cơ, gan, thận của bò,
lợn, gia cầm (gà, vịt) là 30 µg/kg; trong sữa bò là 100 µg/kg; Ở châu Âu, Hoa kỳ và
các nƣớc Bắc Mỹ đã cấm sử dụng kháng sinh họ Fluoroquinolon.
Tồn dƣ kháng sinh trong thƣcc̣ phẩm ảnh hƣởng xấu đến sƣƣ́c khoẻcôngc̣ đồng
và môi trƣờng . Đây làmôṭtrong nhƣƣ̃ng nguyên nhân gây nên các bênḥ nan y , tăng
nguy cơ di ƣc̣ƣ́ng, tăng khảnăng xuất hiêṇ các nguồn gen kháng thuốc ởcác chủng vi
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
7




vâṭg ây bê nḥ . Viê cc̣ tồn dƣ khá ng si nh trong thƣ cc̣ phẩ m (thị t, thuỷ hải sản , sinh

trƣƣ́ng, sƣƣ̃a,…) là rất phổ biến ở nƣớc ta . Tình trạng trên không chỉ gây thiệt hại
lớn vềkinh tếmàquan trọng hơn là ảnh hƣởng đến uy tín các sản phẩm nông nghiêpc̣

nƣớc ta, ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sƣƣ́c khoẻcon ngƣời và môi trƣờng.
Đã nhiều phƣơng pháp phân tích đƣợc nghiên cứu nhằm phát hiện dƣ lƣợng
kháng sinh Fluoroquilone trong thực phẩm nhƣ HPLC, LC-MS, GC-MS, … với độ
chính xác cao, bên cạnh các đặc điểm ƣu việt, phƣơng pháp trên yêu cầu cao về
thiết bị, hóa chất, trình độ sử dụng. ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)
là phƣơng pháp miễn dịch dựa trên phản ứng đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể đã
có ứng dụng nhiều trong xác định dƣ lƣợng kháng sinh trong thực phẩm, môi
trƣờng, y học…
Mục đích của nghiên cứu này là dựa trên các kết quả nghiên cứu đã có chúng
tôi xây dƣngc̣ phƣơng pháp ELISA gián tiếp xác đinḥ dƣ lƣơngc̣ kháng sinh
Levofloxacin trong sƣƣ̃a ở điều kiêṇ phòng thinƣ́ ghiêṃ.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
8




CHƢƠNG I. TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU
1.1. Kháng sinh nhóm Fluoroquilone
1.1.1. Nguồn gốc và sự phát triển của kháng sinh nhóm Fluoroquilone
Quinolone

(Flumequin,

Norfloxacin,

Enrofloxacin,

Ciprofloxacin,

Difloxacin, Marbofloxacin, Ofloxacin...) là nhóm kháng sinh nhân tạo gồm những
dẫn xuất của quinolein. Quinolone đầu tiên (acid nalidixic) có phổ kháng khuẩn
hẹp (tác dụng trên vi khuẩn Gram âm). Kháng sinh đầu tiên trong nhóm là acid
nalidixic đƣợc phát hiện vào năm 1962, đƣợc phân lập nhƣ một tạp chất trong sản
xuất quinine sau đó một loạt các quinolon thế hệ I đƣợc tổng hợp nhƣ cinoxacin,
oxolinic, pipermidic…Trong cấu trúc không gian không có nhân piperidin và
không có nguyên tử Flour. Quinolon thế hệ I có phổ tác dụng hẹp, chỉ tác dụng trên
vi
khuẩn gram âm (trừ Pseudomonas aeruginosa) [1,10]. Hiện nay
quinolon thế hệ
I nhanh chóng bị kháng thuốc nên hạn chế đƣợc sử dụng [11].
Quinolone đƣợc fluor hóa gọi là Fluoroquinolone đã đƣợc đƣa vào sử dụng
trong lâm sàng vào những năm 1970. Fluoroquinolone có phổ kháng khuẩn rộng,
tác dụng trên cả vi khuẩn Gram âm và Gram dƣơng. Kháng sinh nhóm này phân bố
đồng đều cả trong dịch nội và ngoại bào, phân bố hầu hết các cơ quan: Phổi, gan,
mật, xƣơng, tiền liệt tuyến, tử cung, dịch não tủy... và qua đƣợc hàng rào nhau thai.
Fluoroquinolone bài thải chủ yếu qua đƣờng tiết niệu ở dạng còn nguyên hoạt chất
và tái hấp thu thụ động ở thận.[1,2,10] do vậy nhóm Fluoroquilone đƣợc sử dụng
trong y học, chăn nuôi thú y, thủy sản…[10,11].
1.1.2. Phân loại và cơ chế tác dụng
Fluoroquilone là gốc thuốc kháng sinh hiệu quả, phổ rộng đƣợc sử dụng nhiều
và phổ biến cả ở ngƣời và động vật (trong chăn nuôi gia súc, gia cầm và thủy sản…).
Tuy nhiên tác dụng phụ của chúng đã đƣợc xác nhận. Sử dụng quá liều và

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

9


tồn dƣ các gốc thuốc này trong thực phẩm là vấn đề không chỉ ở nƣớc ta mà còn ở
nhiều nƣớc trên thế giới.
Fluroquinolone là một trong những nhóm kháng sinh tổng hợp hoá học có
khả năng khuếch tán tốt trong mô bào, nhanh chóng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn
thông qua sự ức chế tổng hợp ADN (Brown, 1996) do đó đƣợc sử dụng phổ biến và
hiệu quả trong thú y. Tuy nhiên, việc sử dụng nhóm kháng sinh này trong chăn nuôi
thú y và thuỷ sản có tác dụng xấu đến môi trƣờng và sức khoẻ cộng đồng (WHO,
1998). Nhóm Fluroquinolones đƣợc sử dụng trong thú ý gồm các loại sau:
Danofloxacin (Advocin,

Advocid),

Difloxacin (Dicural,Vetequinon),

Enrofloxacin (Baytril), Ibafloxacin (Ibaflin), Marbofloxacin (Marbocyl, Zenequin),
Orbifloxacin (Orbax, Victas), Sarafloxacin (Floxasol, Saraflox, Sarafin).

Hình 1. Cấu trúc phân tử gốc Fluoroquinolone
Công thức cấu tạo chung của nhóm quinolone là hợp chất vòng thơm có chứa
N, vị trí thứ 4 có gắn nhóm ketone, vị trí thứ 3 có gắn nhóm carboxylic. Các dẫn
xuất của quinolone gồm những hợp chất mà: Vị trí: Có gắn thêm nhóm alkyl hoặc
aryl; Vị trí 6: Có thể gắn thêm F; vị trí 2,6,8 có thể gắn thêm một nguyên tử N [15].
Cơ chế tác động của Fluoroquinolone là ức chế tổng hợp acid nucleic. Gốc
quinolone (acid nalidixic và các Fluoroquinolone) ức chế mạnh sự tổng hợp DNA
trong giai đoạn nhân đôi do ức chế enzyme DNA gyrase. Cơ chế tác động này hiệu
quả trên cả vi khuẩn gram dƣơng và gram âm. Các quinolon đều ức chế tổng hợp
AND - gyrase, là enzym mở vòng xoắn AND, giúp cho sự sao chép và phiên mã, vì

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
10




vậy ngăn cản sự tổng hợp AND của vi khuẩn. Ngoài ra còn tác dụng trên cả ARNm
nên ức chế tổng hợp protein vi khuẩn. Các quinolon đều là kháng sinh diệt khuẩn [10].

Quinolon thế hệ 1: Acid nalidixic, acid oxolinic, cinocacin, flumequin, acid
pipemidic, acid promidic…Quinolon thế hệ 1 chỉ ức chế AND- gyrase nên chỉ có
tác dụng diệt vi khuẩn gram âm đƣờng tiết niệu và đƣờng tiêu hóa, không có tác
dụng trên trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) [10,11].
Các Fluoroquinolon có tác dụng trên 2 enzym đích là AND gyrase và
topoisomerase IV của vi khuẩn, nên phổ kháng khuẩn rộng hơn. Hoạt tính kháng
khuẩn mạnh so với quinolon thế hệ 1 từ 10 - 30 lần [10]. Phổ kháng khuẩn của các
Fluoroquinolon gồm: E. coli, Salmonela, Shigella, Enterobacter, Neisseria spp, P.
aeruginosa, Eterococi, Enterococcus faecalis, Klebsiella spp, Proteus mirabilis,
Morganella morgani, Morganella catarrhalis, Haemophilus fluenzae, Bacteroides
fragilis, Streptococus pneumonia, Streptococcus aureus kể cả loại đã kháng
methicilin. Các vi khuẩn trong tế bào cũng bị ức chế bởi nồng độ Fluoroquinolon
trong huyết tƣơng nhƣ Chlamydia, Mycoplasma, Brucella, Mycobacterium [10].
Quinolon thế hệ 2: Rosoxacin, Norfloxacin, Lomefloxacin, Ofloxacin,
Enrofloxacin, Ciprofloxacin, Enoxacin, có khác tƣơng đối về tác động gyrase và
topoisomerase IV: Trên vi khuẩn gram âm hiệu lực kháng gyrase mạnh hơn, còn
trên vi khuẩn gram dƣơng lại có hiệu lực kháng topoisomerase IV mạnh hơn thế hệ
1, đặc biệt là chúng có tác dụng trên Pseudomonas aeruginosa có tác dụng nhanh
và mạnh hơn do khả năng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn cao hơn. Ngoài gram âm
chúng còn tác dụng trên cả gram dƣơng, trừ Pseudomonas aeruginosa [3,10,11].

Quinolon thế hệ 3: Amifloxacin, Levofloxacin, Lerofloxacin, Pefloxacin,
Rufloxacin, Sparfloxacin, Temafloxacin, Tosufloxacin tác động cân bằng trên 2
enzym, vì vậy phổ kháng khuẩn phổ rộng trên gram dƣơng kể cả Streptococus
pneuminiae nhƣng trên Pseudomonas aeruginosa tác dụng yếu hơn so với
Ciprofloxacin.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
11




Quinolon thế hệ 4: Moxifloxacin, Trovafloxacin, phổ tác dụng trên tất cả các
loại vi khuẩn gram âm và gram dƣơng hiếu khí, trên Streptococus pneuminiae tác
dụng gấp 10 lần so với Ciprofloxacin và mạnh gấp 2 lần so với Sparfloxacin [10],
ngoài ra tất cả các kháng sinh trong nhóm còn có tác dụng trên vi khuẩn kỵ khí.
Riêng moxifloxacin nhạy cảm trở lại với các vi khuẩn kháng với các kháng sinh
nhóm quinolon [10,13,14].
Nhƣng cũng có thể do cơ chế ức chế tổng hợp acidnucleic này mà kháng
sinh nhóm Fluoroquinolone đƣợc cho là có nguy cơ gây đột biến gene, gây sẩy thai
khi sử dụng cho động vật mang thai và khuyến cáo là không nên sử dụng kháng
sinh nhóm Fluoroquinolone cho động vật mang thai, động vật sinh sản và làm
giống. Ngoài ra, sử dụng kháng sinh nhóm Fluoroquinolone có thể gây rối loạn
phát triển xƣơng. Nguyên nhân có thể do kháng sinh nhóm Fluoroquinolone có
phản ứng các ion hóa trị II (Mg2+). Nghiên cứu của Jason et al. (2009) trên cừu non
đã cho thấy kháng sinh nhóm Fluoroquinolone đã gây tác động lớn, làm cho hệ
xƣơng, sụn hầu nhƣ không phát triển trong thời gian sử dụng kháng sinh nhóm
này. Trƣớc đây, đã có các nghiên cứu về việc ảnh hƣởng đến sự phát triển xƣơng,
sụn của thú non (chó, cừu) khi sử dụng kháng sinh nhóm Fluoroquinolone nhƣng
do hiệu quả điều trị và mức độ cần thiết của các kháng sinh nhóm kháng sinh này

mà ngƣời ta đã bỏ qua tác hại của nó. Bên cạnh đó, sự tồn lƣu thời gian dài sau khi
sử dụng thuốc kháng sinh nhóm Fluoroquinolone cũng là nguyên nhân dẫn đến việc
hạn chế và cấm sử dụng những kháng sinh thuộc nhóm này.
1.1.3. Cấu trúc, đặc điểm một số kháng sinh thuộc họ Fluoroquinolone
-

+

Danofloxacin:
Tên khoa học: (1S)-1-Cyclopropyl-6-fluoro-1,4-dihydro-7-(5-methyl-2,5-

diazabicyclo[2.2.1]hept-2-yl)-4-oxo-3-quinoline cacboxylic axit methanesulphonate.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
12




Hình 2. Cấu trúc phân tử Danofloxacin
+ Công thức phân tử: Danofloxacin - C19H20O3FN3
+ Trọng lƣợng phân tử: 357,39 g/mol.
+ Nhiệt độ sôi: Danofloxacin 263°C.
+

Danofloxacin là một Fluoroquinolone tổng hợp với phổ rộng hoạt tính

kháng khuẩn. Nó đƣợc sử dụng trong điều trị các bệnh đƣờng hô hấp ở gà, trâu, bò
và lợn. Danofloxacin không có ý định để sử dụng trong chăn nuôi bò sữa sản xuất
sữa cho con ngƣời và không ở gà mái đẻ [15].

- Difloxacin:
+

Tên khoa học: 6-fluoro-1-(4-fluorophenyl)-7-(4-methylpiperazin-1-yl)-4-

oxoquinoline-3-carboxylic acid.

Hình 3. Cấu trúc phân tử Difloxacin
+ Công thức hóa học: C21H19F2N3O3.
+ Trọng lƣợng phân tử: 399 g/mol.
+

Difloxacin ức chế men gyrase DNA của vi khuẩn và các enzyme

topoisomerase II, ức chế sự sao chép AND và phiên mã, tác dụng trên vi khuẩn

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
13




gram âm và gram dƣơng. Difloxacin là một kháng sinh fluoroquinolone thƣờng
đƣợc sử dụng trong y học và thú y [15].
-

Enrofloxacin:

Enrofloxacin là kháng sing thuộc nhóm Fluoroquinolone, loại PQ, có thể
chống vi khuẩn gram dƣơng và gram âm.

+ Tên khoa học: 1 - Cyclopropul - 7- (4 - ethylpiperazin-1-yl) - 6 fluoro 1,4
- dihydro - 4 - oxo - 3 - quinolinecarboxylic acid.

Hình 4. Cấu trúc phân tử Enrofloxacin
+ Công thức hóa học: C19H22FN3O3
+ Trọng lƣợng phân tử: 359,4 g/mol
+

+ Nhiệt độ nóng chảy: 219 - 221oC
Tính chất: Là tinh thể màu vàng nhạt, tan nhẹ một phần trong nƣớc ở pH =

7, có hai giá trị pKa: Khoảng 5 và 8 - 9.
+

Enrofloxacin đƣợc đƣa vào gia súc, gia cầm dƣới dạng nguyên liệu thức

ăn chăn nuôi, hoặc do ngƣời chăn nuôi trộn vào thức ăn, hoặc vào môi trƣờng sống
của các loài thủy sản [15].
- Ibafloxacin:
+
Tên khoa học: 6,7-dihydro-5,8-dimethyl-9-fluoro-1-oxo-1H, 5H-benzo (i,j)
axit quinolizine-2-carboxylic.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




14

Hình 5. Cấu trúc phân tử Ibafloxacin
+ Công thức hóa học: C15H14FNO3
+ Trọng lƣợng phân tử: 275 g/mol
+
Ibafloxacin là một kháng sinh thuộc nhóm Fluoroquinolone, hoạt động
bằng cách ngăn chặn một enzyme DNA gyrase, enzyme này chỉ đƣợc tìm thấy
trong các tế bào của vi khuẩn, và không có một chức năng tƣơng tự trong tế bào
động vật. Bằng cách ngăn chặn gyrase DNA và ngăn chặn tạo ra các protein phát
triển [15].
- Marbofloxacin:
+

Tên khoa học: 9-fluoro-2,3-dihydro-3-methyl-10-(4-methyl-1-piperazinyl)-

7-oxo-7H pyridol (3,2,1-ij)(4,2,1) benzoxadiazin-6 axit carboxylic.

Hình 6. Cấu trúc phân tử Marbofloxacin
+ Công thức hóa học: C17H19FN4O4
+ Trọng lƣợng phân tử: 362,356 g/mol.
+

Ibafloxacin là một kháng sinh thuộc nhóm Fluoroquinolone, làm suy yếu

các vi khuẩn gyrase DNA [15].

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
15

Orbifloxacin:

-

+

Tên khoa học: 1-Cyclopropyl-7-[(3s, 5r-3,5-dimethylpiperazin-1-yl]-5,6,8-

trifluoro-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxylic acid.

Hình 7. Cấu trúc phân tử Orbifloxacin
+

Công thức hóa học: C19H20F3N3O3

+ Trọng lƣợng phân tử: 395,37 g/mol.
+

Orbifloxacin là diệt khuẩn chống lại một loạt các vi khuẩn gram âm và

gram dƣơng và có tác dụng hữu kháng khuẩn của nó thông qua sự can thiệp với các
enzyme của vi khuẩn DNA gyrase đó là cần thiết cho việc duy trì và tổng hợp DNA
của vi khuẩn [15].
- Sarafloxacin:
+Tên khoa học: 6-fluoro-1-(4-fluorophenyl)-4-oxo-7-piperazin-1ylquinoline3-carboxylic acid.

Hình 8. Cấu trúc phân tử Sarafloxacin
+

Công thức hóa học: C20H17F2N3O3

+ Trọng lƣợng phân tử: 385,36 g/mol.
+

Sarafloxacin là một kháng sinh Fluoroquinolone hoạt động bằng cách ức

chế các vi khuẩn DNA-topoisomerase II. Nó đã đƣợc đề xuất để sử dụng trong
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
16




nƣớc uống của gia cầm để điều trị vi khuẩn bệnh, và trong thức ăn cá để điều trị
các bệnh nhƣ nhọt, vibriosis và redmouth ruột [15].
- Levofloxacin:
+

Tên khoa học: (S)-9-fluoro-2,3-dihydro-3-methyl-10-(4-methylpiperazin-

1-yl)-7-oxo-7H-pyrido [1,2,3-de]-1,4-benzoxazine-6-carboxylic acid.

Hình 9. Cấu trúc phân tử Levofloxacin
+

Công thức hóa học: C18H20FN3O4.

+ Trọng lƣợng phân tử: 361,368 g/mol.

+

Cơ chế tác dụng của Levofloxacin là ức chế tổng hợp acid nucleic.

Levofloxacin có tác dụng diệt khuẩn do gắn với topoisomerase II của vi khuẩn
(AND - gyrase) và topoisomerase IV là những enzyme thiết yếu của vi khuẩn tham
gia xúc tác trong quá trình sao chép, phiên mã và sửa AND của vi khuẩn nên làm
mất hoạt tính enzyme. Do không có khả năng mở vòng xoắn để thực hiện việc sao
chép mã di truyền nên vi khuẩn bị tiêu diệt.
Levofloxacin là đồng phân L - isome của Ofloxacin, nó có tác dụng diệt
khuẩn mạnh gấp 8 - 128 lần so với đồng phân D - isome và mạnh gấp 2 lần so với
Ofloxacin racemic. Levofloxacin, cũng nhƣ các Fluoroquinolon khác là kháng sinh
phổ rộng có tác dụng trên nhiều vi khuẩn kỵ khí tốt hơn các Fluoroquinolon khác,
tuy nhiên tác dụng invitro trên Pseudomonas aeruginosa lại yếu hơn so với
Ciprofloxacin.
Sau khi dùng, levofloxacin đƣợc hấp thu nhanh và gần nhƣ hoàn toàn; nồng độ
đỉnh trong huyết tƣơng thƣờng đạt đƣợc sau 1 - 2 giờ; sinh khả dụng tuyệt đối xấp xỉ
99%. Các thông số dƣợc động học của levofloxacin sau khi dùng đƣờng tĩnh

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
17




mạch và đƣờng uống với liều lƣợng tƣơng đƣơng và gần nhƣ nhau, do đó có thể
sử dụng hai đƣờng này thay thế cho nhau. Khoảng 30 - 40% Levofloxacin gắn với
các protein huyết tƣơng, trong vòng 3 ngày. Levofloxacin phân bố rộng rãi trong cơ
thể, kháng sinh thâm nhập tốt vào niêm mạc phế quản, phổi và dịch lót biểu mô hô
hấp, dịch bọng nƣớc ở da, tuyến tiền liệt và đạt nồng độ cao trong nƣớc tiểu, tuy

nhiên thuốc khó thấm vào dịch não tủy. Tỷ lệ gắn protein huyết tƣơng là 30 - 40%.
Levofloxacin rất ít chuyển hóa trong cơ thể và thải trừ qua nƣớc tiểu ở dạng còn
nguyên hoạt tính, chỉ dƣới 5% liều điều trị đƣợc tìm thấy trong nƣớc tiểu dƣới
dạng chất chuyển hóa desmathyl và N - oxid, các chất chuyển hóa này có rất ít hoạt
tính sinh học. Thời gian bán thải của Levofloxacin từ 6 - 8 giờ, kéo dài ở ngƣời
bệnh suy thận [4,13,14].
1.1.4. Ngƣỡng giới haṇ cho phép ởmôṭsốthƣcC̣ phẩm
Ở

Mỹ, cơ quan quản lý thực phẩm và dƣợc phẩm của Mỹ (FDA: Food and

Drug Administration) đã không chấp nhận sự tồn lƣu kháng sinh nhóm
Fluoroquinolone trong sản phẩm thủy sản nhập khẩu. Ở châu Âu, EU đã thiết lập
giới hạn lớn nhất (MRLs - Maximum Residual Limit) đối với dƣ lƣợng thuốc trong
thực phẩm cung cấp cho con ngƣời vào những năm 1990. Trong “Council directive
96/23/EC in 1996” đã quy định rõ là Enrofloxacin trong cơ, gan, thận của bò, lợn,
gia cầm (gà, vịt) là 30 µg/kg; trong sữa bò là 100 µg/kg. Ủy ban thực phẩm
CODEX thành lập bởi FAO và WHO đã quy định MRL đối với Danofloxacin và
Sarafloxacin dùng trong thú y ở các loại thịt, gan lợn, bò và gà tƣơng ứng trong
khoảng là 50 - 400 µg/kg và 10 - 80 µg/kg.
Trong Liên minh châu Âu, giới hạn dƣ lƣợng tối đa (MRL) của kháng sinh
trong sữa bột nhƣ benzylpenicillin, ampicillin, amoxicillin là 4 mg/kg.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
18




Bảng 1.1. Giới hạn tồn dƣ tối đa của các Quinolone theo

Quyết định số 2377/90/EC của Ủy ban Châu Âu [16]
Hoạt tính
Danofloxacin

Difoxacin

Enrofloxacin

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN



Flumequin

Sarafloxacin
Fluroquinolone

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
20




Ở Việt Nam cũng đã có nhiều nghiên cứu về sự tồn dƣ kháng sinh nhóm
Fluoroquinolone trong thực phẩm nói chung và sản phẩm thủy sản nói riêng (Trần
Minh Phú et al., 2008; Phạm Minh Đăng et al., 2008…). Theo Trần Minh Phú et al.
(2008), bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng đã xác định sự tồn lƣu của Enrofloxacin
trong thịt của cá tra nuôi. Cụ thể là cá ăn thức ăn có Enrofloxacin với hàm lƣợng
10,6 mg/kg thức ăn trong 7 ngày, tồn dƣ kháng sinh trong cá là 2.796 ± 482 µg/kg.
Sau 60 ngày ngừng cho ăn kháng sinh, tồn dƣ kháng sinh trong cá là 97,9 ± 66,5

µg/kg, cao hơn quy định của châu Âu. Nhƣ vậy, có thể nói kháng sinh
Enrofloxacin có sự tồn lƣu lớn, lâu sau khi sử dụng và ảnh hƣởng không tốt đến
nguồn thực phẩm của chúng ta [5].
Bộ thủy sản đã ra Quyết định 07/2005/QĐ-BTS ban hành ngày 24/02/2005
quy định danh mục 17 kháng sinh cấm sử dụng và danh mục 34 loại hạn chế sử
dụng, trong đó có nhóm Fluoroquinolone và Quyết định 26/2005/QĐ-BTS ban
hành ngày 18/08/2005 bổ sung nhóm kháng sinh Fluoroquinolone cấm sử dụng
trong sản xuất, kinh doanh thủy sản xuất khẩu vào thị trƣờng Mỹ và Bắc Mỹ. Các
Quyết định này đƣợc thay thế bởi Thông tƣ số 15/2009/TT-BNN ban hành ngày
17/03/2009 của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, quy định danh mục thuốc,
hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng và hạn chế sử dụng. Fluoroquinolone vẫn bị cấm
sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sản xuất khẩu vào thị trƣờng Mỹ và Bắc
Mỹ. Các kháng sinh Enrofloxacin, Ciprofloxacin, Ofloxacin bị cấm sử dụng trong
thú y. Một số kháng sinh quinolone nằm trong danh mục kháng sinh hạn chế sử
dụng trong sản xuất kinh doanh thủy sản.
Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã ra Quyết định số 3074/QĐ-BNNKHCN ngày 11/12/2012 về việc chỉ định phòng thử nghiệm ngành nông nghiệp và
phát triển nông thôn đã quy định xác định họ Fluoroquinolone bằng phƣơng pháp
LC/MS/MS trong thực phẩm và thủy sản với giới hạn phát hiện (nếu có)/phạm vi
đo là: 0,6 µg/kg.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
21




1.2. Các phƣơng pháp xác định hàm lƣợng kháng sinh nhóm Fluoroquilone
1.2.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) và sắc ký khối phổ (LC-MS)
Sắc ký lỏng cao áp: Quá trình tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận
chuyển và phân bố của các chất tan giữa hai pha khác nhau (pha động, pha tĩnh). Dung

dịch các chất phân tích khi vào cột sẽ đƣợc hấp thụ hay liên kết với pha tĩnh thùy
thuộc vào bản chất của cột và của chất cần phân tích. Khi pha động dịch chuyển với
một tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lƣu giữ ra khỏi cột.
Tùy theo bản chất của pha tĩnh, bản chất của chất tan, bản chất của dung môi mà quá
trình rửa tách đƣợc các chất ra khỏi nhau. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ đƣợc phát
hiện bởi detector và đƣợc chuyển qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng đƣợc đƣa
ra máy in hoặc hiển thị trên màn hình. Nếu ghi quá trình tách sắc ký của hỗn hợp nhiều
thành phần, ta sẽ có một sắc đồ gồm nhiều pic. Quá trình tách sắc ký tốt thì hỗn hợp có
bao nhiêu thành phần thì sẽ có bấy nhiêu pic riêng biệt trên sắc đồ [7,8].

Phƣơng pháp sắc ký:
+ Là phƣơng pháp tách dành cho hỗn hợp mẫu.
+ Nhận dạng các mẫu dựa trên thời gian lƣu.
+ Cho phép phân tích định tính và định lƣợng.
+ Phân lập và tinh chế chất.
Sắc ký khối phổ: Phƣơng pháp phổ khối lƣợng là một trong những phƣơng
pháp phân tích công cụ quan trọng. Phổ khối lƣợng cung cấp các thông tin về phân
tích định tính, định lƣợng các nguyên tố, thành phần và cấu trúc của các hợp chất
vơ cơ và hữu cơ. Cơ sở của phƣơng pháp phổ khối lƣợng đối với các hợp chất hữu
cơ là sự bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa thành ion phân tử mang
điện tích dƣơng hoặc phá vỡ thành các mảnh ion, các gốc theo sơ đồ sau bằng các
phần tử mang năng lƣợng cao.
Sự hình thành các ion mang điện tích +1 chiếm hơn 95%, còn lại các ion
mang điện tích +2 hoặc ion âm, năng lƣợng bắn phá các phân tử thành ion phân tử
khoảng 10ev, nhƣng với năng lƣợng cao thì ion phân tử có thể phá vỡ thành mảnh
ion dƣơng, hoặc các ion gốc, các gốc hoặc các phân tử trung hòa nhỏ hơn.
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
22