Khảo sát tính kháng khuẩn của cao chiết quế (Cinnamomum verum) và gừng (Zingiber officinale rose) tách chiết bằng ethanol đối với các chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae phân

VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN II

KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO CHIẾT QUẾ
(Cinnamomum verum) VÀ GỪNG (Zingiber officinale Rose)
TÁCH CHIẾT BẰNG ETHANOL ĐỐI VỚI CÁC CHỦNG VI KHUẨN
Streptococcus agalactiae PHÂN LẬP TRÊN CÁ RƠ PHI GIỐNG
(Oreochromis spp.)
Đồn Văn Cường 1*, Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh 1, Mã Tú Lan1, Nguyễn Thành Nhân1

TÓM TẮT
Vi khuẩn Streptococcus agalactiae được biết đến như là tác nhân gây bệnh và gây chết nghiêm
trọng trên nhiều loài cá nước ngọt và nước mặn. Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát hiệu quả
kháng khuẩn đối với hai chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae được phân lập từ cá rô phi bị
bệnh lồi mắt, xuất huyết thu tại thành phố Hồ Chí Minh bởi cao chiết quế và gừng, được tách chiết
bằng phương pháp ngấm kiệt với dung môi ethanol ở 3 nồng độ riêng rẻ (96%, 72%, 48%) và liên
tục (96% tiếp đến 72% và 48%). Kết quả cho thấy cao chiết quế trong dung mơi ethanol 96% cho
đường kính vịng kháng khuẩn 29-34 mm, giá trị MIC = 2 mg/ml, MBC = 8 mg/ml; cao chiết gừng
trong dung môi ethanol 96% cho đường kính vịng kháng khuẩn 14-17 mm, giá trị MIC = 1 mg/ml,
MBC = 2 mg/ml. Cao chiết quế và gừng trong ethanol 96% là hai loại cao thảo dược tiềm năng có
khả năng ứng dụng để phịng trị bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rơ phi.
Từ khóa: cá rô phi, cao chiết gừng, cao chiết quế, phương pháp ngấm kiệt, Streptococcus agalactiae.

I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Trên cá rô phi, bệnh lồi mắt, xuất huyết
thường xuất hiện vào mùa mưa và các tháng
giao mùa ở Đồng bằng sông Cửu Long và
Đông Nam Bộ, với tỷ lệ chết cao (gần như
100% từ khi phát hiện bệnh), gây thiệt hại
kinh tế nghiêm trọng cho người nuôi, bệnh
này được xác định do vi khuẩn Streptococcus
agalactiae gây ra (Đặng Thị Hoàng Oanh và

ctv., 2012). Vi khuẩn Streptococcus agalactiae
được biết đến như là tác nhân gây bệnh và gây
chết nghiêm trọng trên nhiều loài cá nước ngọt
và nước mặn như: cá hồi vân (Oncorhynchus
mykiss), cá rô phi (Oreochromis sp.), cá cam
(Seriola quinquerodiata), cá phèn (Upeneus
moluccensis), cá chim (Stromateoides). Tháng
7-9/2009, dịch bệnh xảy ra gây chết với tỷ lệ cao
86,5-100% tại Hà Nội, Hưng Yên, Hải Dương,
Hải Phòng, Quảng Ninh, Bắc Ninh và Hà Giang
(Viện NCNT Thuỷ sản I, 2017). S. agalactiae là

một trong hai loài vi khuẩn chính ảnh hưởng đến
việc sản xuất cá rơ phi trên thế giới, lồi cịn lại
là S. iniae (Evans và ctv., 2006). Nghiên cứu của
Brian cho thấy, bệnh do vi khuẩn Streptococcus
gây ra trên cá rô phi ở các nước Châu Á như:
Trung Quốc, Việt Nam, Indonesia, Philippines,
Thái Lan là S. agalactiae type 2 (Brian Sheehan
và ctv., 2009). Chủng vi khuẩn S. agalactiae
type 2 cũng được phân lập từ các mẫu cá rơ phi
đỏ có dấu hiệu xuất huyết và phù mắt tại Việt
Nam (Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv., 2012).
Hiện nay, giải pháp phổ biến để phòng trị
bệnh nhiễm khuẩn trên cá là sử dụng kháng sinh
hay hóa chất. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng
sinh, hóa chất vẫn còn bộc lộ nhiều bất cập,
gây nên hiện tượng kháng kháng sinh ở các
loài vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản,
và truyền các gene kháng kháng sinh cho các

lồi vi khuẩn trong mơi trường và vi khuẩn gây
bệnh trên người. Ngồi ra, việc tích lũy kháng

Viện Nghiên cứu ni trồng Thủy sản II
* Email:

1

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 15 - THÁNG 12/2019

3


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II

sinh trong động vật thủy sản có thể gây hại cho
mơi trường và cho người tiêu thụ. Vì vậy, các
nhà khoa học đang tìm kiếm các giải pháp thay
thế (vaccine, probiotic…) trong việc kiểm sốt
bệnh nhiễm khuẩn trong ni trồng thủy sản.
Trong thời gian gần đây, việc sử dụng thảo dược
trong phòng trị bệnh nhiễm khuẩn đang ngày
càng trở nên phổ biến do những ưu điểm: dễ tìm
kiếm, giá thành thấp, hoạt tính kháng khuẩn cao,
có khả năng kích thích hệ miễn dịch tự nhiên
của vật chủ, thân thiện với môi trường, không
gây nên hiện tượng đề kháng thuốc và đặc biệt
đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm đối với con
người (Rattanachaikunsopon và ctv., 2009).
Một số nghiên cứu đã chứng minh hoạt tính

kháng khuẩn của các loại thảo dược: cây xương
cá (Stella aquatic), hoa móc tay (Impatiens
biflora), cây anh thảo (Oenothera biennis), cây
ngải cứu (Artemisia vulgaris) và cây kim ngân
(Lonicera japonica) giúp kháng lại các bệnh do
vi khuẩn và virus ở cá (Shangliang, 1990). Dịch
chiết của cây ổi (Psidium guajava) có thể kiểm
soát bệnh xuất huyết do Aeromonas hydrophila
gây ra trên cá nước ngọt (Pachanawan và ctv.,
2008). Các nghiên cứu về cây dược liệu cũng
cho thấy rằng, củ hành tím (Allium ascalonicum)
có tác dụng kháng viêm và tiêu diệt các vi
khuẩn lây nhiễm (bao gồm cả vi khuẩn E.coli và
Salmonella), giúp tăng cường miễn dịch và được
xem như là loại thảo dược chứa các chất kháng
sinh tự nhiên cực kỳ an toàn và hiệu quả. Đối
với nhóm vi khuẩn Streptococcus, đã có nhiều
nghiên cứu tìm ra một số loại thảo dược có tác
dụng kháng Streptococcus cũng như xác định
được loại dung môi tạo dịch chiết đạt hiệu quả
kháng Streptococcus mạnh nhất. Dịch ép của cỏ
lào (Eupatorium odoratum) đã được đánh giá
là có khả năng kháng khuẩn đối với vi khuẩn
Streptococcus sp. gây bệnh trên cá rô phi vằn.
Dịch chiết lá hẹ (Allium tuberosum) có khả năng
kháng vi khuẩn Streptococcus sp. cao, trong đó
nước, ethanol và methanol là các loại dung mơi
cho dịch chiết có tác dụng kháng S.agalactiae
cao (Trương Thị Mỹ Hạnh, 2008). Dịch chiết
lá cây hương thảo (Rosmarinus officinalis) có

hiệu quả trị bệnh nhiễm khuẩn do Streptococcus
4

sp. trên cá rô phi (Oreochromis spp.) (Abutbul
và ctv., 2004). Nghiên cứu thực hiện trên cá rô
phi lai (O. niloticus x O. aureus) trong 4 tuần
với khẩu phần ăn có 0,5% tỏi (Allium sativum)
cho thấy có tác dụng nâng cao miễn dịch và
tính đề kháng bệnh của cá (Ndong và ctv.,
2007). Dịch chiết bằng nước của lá chùm ngây
(Moringa oleifera) có tác dụng kháng vi khuẩn
S. agalactiae type 2 mạnh nhất, theo sau là chiết
xuất bằng dung môi Chloroform của lá sầu đâu
(Azadirachta indica) (Kamble và ctv., 2014).
Dịch chiết vỏ quế (Cinnamomum verum), củ
tỏi (Allium sativum), hoa đinh hương (Eugenia
caryphyllus), cỏ xạ hương (Thymus vulgaris)
cũng có tác dụng kháng S. agalactiae (Alsaid và
ctv., 2010). Tác dụng kháng S. agalactiae của
6 loại dịch chiết thảo dược muồng trâu (Cassia
alata L), măng cụt (Garcinia mangostana),
xuyên tâm liên (Andrographis paniculata), ổi
(P. guajava), duối nhám (S.asper), tỏi (Allium
sativum) trong 3 dung môi khác nhau (nước,
95% ethanol, methanol) trên cá rô phi, kết quả
cho thấy dịch chiết bởi dung môi nước của
xuyên tâm liên (Andrographis paniculata) có
tác dụng kháng S. agalactiae mạnh nhất trong
số 6 loại thảo dược, với đường kính vịng vơ
khuẩn đạt 27,5 mm và giá trị MIC đạt 31,25

µg/ml. Bên cạnh đó, dịch chiết bởi ethanol của
ổi (P. guajava) và dịch chiết bởi nước của cây
duối nhám (S. asper) cũng có tác dụng kháng
S. agalactiae mạnh. Kết quả thí nghiệm in vivo
cho thấy khi cá rơ phi ăn thức ăn có bổ sung
bột lá xuyên tâm liên tách chiết bằng dung môi
nước, đã giúp làm giảm tỉ lệ chết của cá khi gây
nhiễm với S. agalactiae (Rattanachaikunsopon
và ctv., 2009).
Trước đây nhóm đã khảo sát trên mười loại
dược liệu bằng phương pháp ngâm trong dung
môi nước, ethanol 96% và methanol 96%, trong
đó quế và gừng ngâm trong ethanol và methanol
có tác dụng kháng Streptococcus agalactiae
cao nhất. Trong nghiên cứu này, chúng tơi tiếp
tục khảo sát tính kháng khuẩn của 2 loại cao
chiết thảo dược (gừng và quế) tách chiết bằng
phương pháp ngấm kiệt trong dung môi ethanol
với các nồng độ khác nhau nhằm tìm ra nồng độ

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 15 - THÁNG 12/2019


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II

tối ưu cho tách chiết đối với hai chủng vi khuẩn
Streptococcus agalactiae CC-2.1 và Q9-8.1 thu
từ cá rơ phi có biểu hiện xuất huyết, lồi mắt ở
thành phố Hồ Chí Minh.

chế, thái lát mỏng và sấy lạnh ở 40oC (Tủ sấy
lạnh, sản xuất ở Việt Nam) cho đến khi đạt độ
ẩm < 12%, được xay mảnh nhỏ bằng máy xay
khô (Xinganbangle-880Y) và làm ẩm bằng loại

II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU

dung môi ngấm kiệt, sau đó cho vào bình
ngấm kiệt ngâm 24 giờ, sau 24 giờ sử dụng 30
lít ethanol (Cơng ty CP dược phẩm OPC) cho
ngấm kiệt 1kg thảo dược khô, tốc độ rút dịch
chiết 5 ml/phút. Hai phương pháp thu dịch chiết
khác nhau được thực hiện.

2.1. Phương pháp thu mẫu, phân lập và
định danh vi khuẩn
Thu mẫu gan, thận, lách trên cá rô phi giống
đang bị bệnh lồi mắt, xuất huyết nuôi ao ở Trung
tâm Giống thủy sản và cây trồng tại xã Tân An
Hội, huyện Củ Chi và bè ni tại phường Long
Trường, quận 9, Tp. Hồ Chí Minh. Thu những
con cá cịn sống, có các triệu chứng bệnh tích:
lồi mắt, xuất huyết (hậu mơn, thân, đầu, nắp
mang,…), mổ cá và ghi nhận các dấu hiệu bệnh
lý bên trong cơ thể cá. Dùng que cấy để lấy mẫu
bệnh phẩm trên các nội tạng gan, thận, lách. Mẫu
bệnh phẩm được cấy trên đĩa môi trường BrainHeart Infusion Agar (110493, Merck) để phân
lập vi khuẩn và Blood Agar (110886, Merck) để
xác định các dạng tan huyết, trong đó tan huyết

dạng β là tan huyết hoàn toàn xung quanh khuẩn
lạc, tan huyết dạng α là chỉ tan huyết một phần
và có màu xanh hoặc nâu xung quanh khuẩn
lạc (Buxton, 2005). Đĩa cấy được ủ ở nhiệt độ
35°C trong tủ ấm (Memmert-UFB 400) trong
24-48 giờ. Hình dạng, kích thước của các khuẩn
lạc phân lập từ mẫu bệnh được xác định bằng
phương pháp nhuộm Gram (11885, Merck). Sử
dụng test kit API 32 Strep (BioMerieux, Pháp)
để test sinh hóa và xác định kết quả bằng phần
mềm APIweb (bio Mérieux SA, France). Bên
cạnh đó, vi khuẩn được gửi đến Công ty TNHH
Thương mại & Dịch vụ Nam Khoa, quận 7, Tp.
Hồ Chí Minh định danh bằng phương pháp giải
trình tự gen 16S rRNA và so sánh với trình tự
trên ngân hàng gen NCBI.

+ Mỗi loại thảo dược được ngấm kiệt với
ethanol 96%, dịch chiết thu được để riêng ra,
bã thảo dược tiếp tục ngấm kiệt với ethanol
72% rồi ethanol 48%. Cô quay dịch chiết của
từng phân đoạn và tổng của 3 phân đoạn, thu
được 4 loại cao chiết khác nhau đối với mỗi
loại thảo dược.
+ Mỗi loại thảo dược được ngấm kiệt riêng
rẽ với ethanol 96%, ethanol 72%, và ethanol
48% ("Assessment report on Hypericum
perforatum L., herba," 2018). Cô quay dịch
chiết thu được từ mỗi nồng độ ethanol và tổng
của 3 phân đoạn, thu được 4 loại cao chiết khác

nhau đối với mỗi loại thảo dược.
Các cao chiết được cô bằng máy cô quay
(Haake Phoenix II - C25P - Thermo) ở nhiệt
độ 60oC các dịch chiết tương ứng cho đến khi
99% dung môi được loại bỏ. Các cao chiết dạng

2.2. Phương pháp chiết xuất dược liệu
Sử dụng phương pháp ngấm kiệt với dung
môi ethanol để chiết xuất dược liệu (Nguyễn
Thượng Dong và ctv., 2008). Hai loại thảo
dược: Vỏ quế (mua ở Viện Y Học Dân Tộc Tp.
Hồ Chí Minh) và củ gừng (mua ở chợ Bà Chiểu,
quận Bình Thạnh, Tp. Hồ Chí Minh), được sơ

Hình 1: Hệ thống ngấm kiệt

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 15 - THÁNG 12/2019

5


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II

sệt được bảo quản lạnh ở -200C để sử dụng cho
các thí nghiệm thử khả năng kháng khuẩn bằng
phương pháp đĩa giấy khuếch tán, cũng như xác
định nồng độ ức chế tối thiểu (Yasuko Sekita và
ctv.,) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC).
2.3. Phương pháp đánh giá khả năng
kháng khuẩn của các cao chiết thảo dược

2.3.1. Phương pháp đĩa giấy khuếch tán
(Ahn và ctv., 1994)
Tẩm 20 µl cao chiết thảo dược (0,33 g/ml)
vào các đĩa giấy vơ trùng có đường kính 6 mm,
ở nghiệm thức đối chứng âm tẩm ethanol 96%,
72% và 48%, mỗi loại được tẩm vào 6 đĩa giấy,
đặt các đĩa giấy này vào tủ vô trùng trong 15
phút cho cao chiết khuếch tán vào đĩa giấy. Ở
nghiệm thức đối chứng dương, các đĩa giấy được
tẩm ba loại kháng sinh thương mại là amoxillin
(10 µg), doxycycline (30 µg) và florfenicol (30
µg) (Nam Khoa). Chủng S. agalactiae được
ni cấy trong mơi trường Brain Heart Infusion
Broth (110493, Merck) trong 24 giờ, sau đó so
với ống Mc Farland để được mật độ 108 CFU/
ml (tương ứng ống 0,5), tiếp tục pha loãng 100
lần với nước muối sinh lý để đạt mật độ 106
CFU/ml. Hút 1000 µl dịch khuẩn 106 CFU/ml,
tráng đều bằng que thủy tinh tam giác trên mặt
thạch BHI agar (110886, Merck) trong 30 giây
cho vi khuẩn thấm đều vào mặt thạch. Sau đó
dùng micropipet hút bỏ lượng dung dịch cịn
dư. Lật úp các đĩa thạch và để trong tủ cấy vô
trùng trong 5 phút cho khô. Đặt các đĩa thạch
vào tủ mát ở 4oC trong 15 phút để cao chiết có
thời gian khuếch tán ra đĩa thạch. Sau đó chuyển
tất cả các đĩa thạch vào ủ trong tủ ấm ở 30oC,
đo đường kính vịng vơ khuẩn tạo thành xung
quanh các đĩa giấy sau 24 giờ (nếu có). Vi khuẩn
mẫn cảm với dịch chiết nếu vịng vơ khuẩn ≥ 7

mm, vi khuẩn kháng với dịch chiết nếu vịng vơ
khuẩn <7mm (Nascimento và ctv., 2000).
2.3.2. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu
(Yasuko Sekita và ctv.,) và nồng độ diệt khuẩn
tối thiểu (MBC) của các cao chiết thảo dược
Sử dụng đĩa 96 giếng (thể tích giếng 200
µl) để xác định các giá trị MIC và MBC (Nagi
A Al-Haj và ctv., 2018) của các loại cao chiết
6

có hiệu quả kháng khuẩn mạnh bằng phương
pháp đĩa giấy khuếch tán. Các cao chiết thảo
dược được pha lỗng với dung mơi tương ứng
theo dãy 08 nồng độ bao gồm 32.000, 16.000,
8.000, 4.000, 2.000, 1.000, 500 và 250 µg/ml,
mỗi nồng độ lập lại trong 4 giếng. Dịch khuẩn
S. agalactiae được pha trong ống nghiệm chứa
nước muối sinh lý 0,85% để đạt mật độ 108
CFU/ml (tương ứng với Mc Farland 0,5), sau
đó được pha lỗng trong nước muối sinh lý để
đạt mật độ cuối cùng là 104 CFU/ml, sau khi
pha loãng sẽ trải đĩa BHI agar (110886, Merck)
để kiểm tra nồng độ vi khuẩn thực tế. Cho vào
các giếng 100 µl dịch khuẩn + 100 µl thảo dược
để đạt nồng độ cuối cùng theo dãy nêu trên, mật
độ vi khuẩn cuối cùng trong mỗi giếng là 5 x
103 CFU/ml. Các giếng đối chứng âm chỉ chứa
200µl mơi trường BHI Broth (110493, Merck).
Các giếng đối chứng dương chứa 100 µl BHI +
100 µl dịch khuẩn S. agalactiae. Ủ các đĩa 96

giếng này ở 300C, sau 48 giờ cho 20 µl thuốc
thử resazurine (0,01%) (RM125-1G, Himedia)
vào mỗi giếng. Thuốc thử resazurine có màu
xanh trong dung dịch, các giếng có vi khuẩn
phát triển sẽ chuyển màu thuốc thử từ xanh
sang hồng (Faikoh và ctv., 2014). Giá trị MIC
là nồng độ thấp nhất của thảo dược tại đó thuốc
thử resazurine khơng chuyển màu. Để xác định
giá trị MBC, lấy 100 µl mẫu ở các giếng thuộc
4 dãy nồng độ liên tiếp, bao gồm dãy nồng độ
tại đó xác định giá trị MIC và 3 dãy nồng độ
cao hơn liền kề, và trải trên đĩa BHIA. Giá trị
MBC là nồng độ thấp nhất của thảo dược tại
đó khơng có sự phát triển của vi khuẩn trên
môi trường BHIA sau khi trải đĩa. Các loại cao
chiết có giá trị MBC/MIC ≥ 4 được cho là có
khả năng kìm khuẩn, MBC/MIC < 4 được cho
là có khả năng diệt khuẩn.
2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Giá trị trung bình đường kính vịng vơ
khuẩn tạo xung quanh các đĩa giấy ở các
nghiệm thức được so sánh bằng trắc nghiệm
One-way ANOVA và Tukey's post hoc test ở
mức ý nghĩa 0,05, sử dụng phần mềm SPSS
(version 22.0).

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 15 - THÁNG 12/2019


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II

III. KẾT QUẢ
3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn gây bệnh
trên cá rô phi
Nghiên cứu đã thực hiện thu 5 mẫu cá rô
phi giống (cá rô phi vằn) nuôi ao tại Trung tâm
giống và cây trồng, xã Tân An Hội, huyện Củ
Chi vào tháng 04/2019 và 11 cá rô phi giống
(cá rô phi vằn) ni bè tại phường Long Bình,
quận 9 vào tháng 05/2019. Các cá thể này đều
thể hiện các dấu hiệu bệnh tích điển hình như
lồi mắt và xuất huyết ở vây hậu mơn, vây lưng

(Hình 2, 3), được thu thận cho phân lập và định
danh vi khuẩn bằng test sinh hóa và giải trình
tự gen 16S rRNA. Kết quả kiểm tra bằng test
API 32 strep (Bảng 1) và xác định kết quả bằng
phần mềm APIweb (bio Mérieux SA, France)
tất cả 16 mẫu cá bệnh đều bị nhiễm vi khuẩn
Streptococcus agalactiae (Hình 3). Trên mơi
trường thạch BA, khuẩn lạc Streptococcus
agalactiae có hình trịn, lồi, màu kem, kích
thước khoảng 1mm, dung huyết dạng β (Hình
5, 6), vi khuẩn nhuộm gram bắt màu xanh tím
(Gram dương), hình trịn, liên kết với nhau tạo

Bảng 1: Kết quả phân lập mẫu cá bệnh
STT

Nơi thu mẫu

Số mẫu

1

Củ Chi

5

2

Quận 9

11

Số mẫu nhiễm
Streptococcus agalactiae
5
11

Hình 2: Cá thu ở Củ chi bị lồi mắt, xuất huyết

Hình 3: Cá thu ở quận 9 bị lồi mắt, xuất huyết

thành chuỗi dạng liên cầu khuẩn xen kẽ với
những tế bào đơn lẻ. Chúng tôi chọn hai
chủng vi khuẩn CC-2.1 (phân lập từ cá 25gr
nuôi ao ở Củ Chi) và Q9-8.1 (phân lập từ cá
20gr nuôi bè ở Quận 9) để thực hiện các thí
nghiệm tiếp theo của nghiên cứu.

Quyên và ctv., 2019).
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiếp tục
khảo sát khả năng kháng khuẩn của hai loại cao
chiết quế và gừng, tách chiết bằng phương pháp
ngấm kiệt với dung môi ethanol ở 3 nồng độ
khác nhau (96%, 72% và 48%). Ở thí nghiệm
1, quá trình tách chiết được thực hiện chỉ với
ethanol 96% hoặc lần lượt với 2 hoặc 3 nồng
độ khác nhau của ethanol. Qua Bảng 2 cho thấy
cao chiết của quế với ethanol 96% có tác dụng
kháng khuẩn mạnh nhất đối với cả hai chủng vi
khuẩn với đường kính vịng vô khuẩn từ 32-34
mm, giá trị này là tương đương so với đường
kính vịng vơ khuẩn tạo ra bởi ba loại kháng sinh
(35,48 mm đối với amoxillin, 22,47 mm đối với
doxycillin và 35,08 mm đối với florfenicol).

3.2. Kết quả thử khả năng kháng khuẩn
của thảo dược bằng đĩa giấy khuếch tán
Kết quả khảo sát trước đây của nhóm về
hiệu quả kháng khuẩn của 10 loại cao chiết
thảo dược tách chiết bằng ethanol 96% và
methanol 99,8%, cho thấy cao chiết quế và
gừng tách chiết bằng ethanol 96% cho hiệu
quả kháng khuẩn cao nhất đối với vi khuẩn
Streptococcus agalactiae (Nguyễn Thị Trúc

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 15 - THÁNG 12/2019

7


VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN II

Hình 4. Kết quả xác định sinh hóa với API 32 Strep test

8

Hình 5: Dạng khuẩn lạc của chủng CC-2.1,

Hình 6: Dạng khuẩn lạc của chủng Q9-8.1,

dung huyết dạng β trên môi trường BA.

dung huyết dạng β trên mơi trường BA.

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 15 - THÁNG 12/2019


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II

Kế đến là cao chiết gừng với ethanol 96% cho
đường kính vịng vơ khuẩn 14-15 mm. Ngoài
ra, cả hai loại cao chiết quế và gừng tách chiết
bằng ethanol 96% đều cho đường kính vịng vơ

khuẩn lớn nhất và cao hơn có ý nghĩa thống kê
(p < 0,05) so với tách chiết bằng ethanol ở các
nồng độ thấp hơn và so với cao tổng.

Bảng 2. Đường kính vịng vơ khuẩn (mm) tạo thành xung quanh các đĩa giấy tẩm cao chiết
thảo dược, lần lượt tách chiết với ethanol ở các nồng độ khác nhau và sau 24 giờ tiếp xúc với
vi khuẩn S. agalactiae, chủng CC-2.1 và Q9-8.1.
Đường kính vịng vơ khuẩn (mm)
Dung mơi

S. agalactiae CC-2.1
Gừng

S. agalactiae Q9-8.1
Quế

Gừng

Quế

Ethanol 96%

15,12 ± 0,9c

34,23 ± 1,9b

14,88 ± 1,3b

32,67 ± 2,3b

Ethanol 96% và 72%

12,65 ± 1,2b

10,73 ± 1,1a

11,20 ± 0,8a

8,5 ± 0,5a

Ethanol 96%, 72% và 48%

9,67 ± 0,84a

7,53 ± 3,72a

10,05 ± 0,8a

9,33 ± 1,3a

Cao tổng từ 3 phân đoạn
trên (tỉ lệ 1:1:1)

12,17 ± 0,9b

9,62 ± 1,2a

10,30 ± 1,0a

9,52 ± 0,7a

Số liệu thể hiện giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. Trong cùng một cột, các nghiệm thức có
các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).

Ở thí nghiệm 2, quá trình tách chiết được
thực hiện riêng rẽ với một trong ba nồng độ của
ethanol (96%, 72% và 48%). Qua Bảng 3 cho
thấy cao chiết của quế với ethanol 96% có tác
dụng mạnh nhất đối với cả hai chủng vi khuẩn
với đường kính vịng vơ khuẩn từ 29-34 mm, kế
tiếp là cao chiết gừng với ethanol 96% có đường

kính vịng vơ khuẩn 16-17 mm. Ở thí nghiệm
này, cả hai loại cao chiết quế và gừng tách chiết
bằng ethanol 96% cũng cho đường kính vịng
vơ khuẩn lớn nhất và cao hơn có ý nghĩa thống
kê (p < 0,05) so với tách chiết bằng ethanol ở
các nồng độ thấp hơn và so với cao tổng.

Bảng 3. Đường kính vịng vơ khuẩn (mm) tạo thành xung quanh các đĩa giấy tẩm cao chiết
thảo dược tách chiết với ethanol ở các nồng độ khác nhau và sau 24 giờ tiếp xúc với vi khuẩn
S. agalactiae, chủng CC-2.1 và Q9-8.1.
Đường kính vịng vơ khuẩn (mm)
Dung môi

S. agalactiae CC-2.1
Gừng

S. agalactiae Q9-8.1

Quế

Gừng

Quế

Ethanol 96%

16,47 ± 1,3c

33,45 ± 1,8b

16,7 ± 0,9c

29,87 ± 0,3b

Ethanol 72%

13,77 ± 0,7ab

9,05 ± 0,6a

13,58 ± 0,6b

9,47 ± 0,3a

Ethanol 48%

12,58 ± 1,1a

8,53 ± 0,6a

11,85 ± 0,6a

8,95 ± 1,2a

Cao tổng từ 3
phân đoạn trên
(tỉ lệ 1:1:1)

14,83 ± 0,6b

8,50 ± 1,0a

15,0 ± 1,1c

10,1 ± 0,4a

Số liệu thể hiện giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. Trong cùng một cột, các nghiệm thức có các
chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 15 - THÁNG 12/2019

9


VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN II

Hình 7: Vịng vơ khuẩn của cao chiết gừng đối
với chủng CC-2.1

Hình 8: Vịng vơ khuẩn của cao chiết quế đối
với chủng Q9-8.1

Hình 9: Vịng vơ khuẩn của ba loại kháng sinh đối

với chủng Q9-8.1
3.3. Kết quả xác định giá trị MIC và MBC của các cao chiết thảo dược
Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn
của các cao chiết thảo dược ở điều kiện in vitro,
chúng tôi xác định được cao chiết vỏ quế và
gừng trong ethanol 96% có khả năng kháng

10

khuẩn mạnh đối với chủng vi khuẩn CC-2.1 và
chủng vi khuẩn Q9-8.1, chúng tôi chọn hai loại
cao chiết này để xác định giá trị MIC và MBC.
Kết quả được thể hiện trong Bảng 4.

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 15 - THÁNG 12/2019


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II

Bảng 4. Kết quả xác định giá trị MIC và MBC của các cao chiết vỏ quế đối với chủng
Streptococcus agalactiae CC-2.1 và Q9-8.1
Loại cao chiết/dung mơi
Vỏ quế, ethanol 96%
Gừng, ethanol 96%

Chủng

MIC

MBC

Vi khuẩn

(µg/ml)

(µg/ml)

CC-2.1

2.000

8.000

Q9-8.1

2.000

8.000

CC-2.1

1.000

2.000

Q9-8.1

1.000

2.000

Hình 10: Đĩa 96 giếng xác định giá trị MIC
của cao chiết quế (hàng 1-4) và cao chiết gừng
(hàng 5-8) đối với chủng CC-2.1.

Hình 11: Đĩa 96 giếng xác định giá trị MIC
của cao chiết quế (hàng 1-4) và cao chiết gừng
(hàng 5-8) đối với chủng Q9-8.1.

IV. THẢO LUẬN

Lậy – tỉnh Tiền Giang phân lập được vi khuẩn
Streptococcus agalactiae nhưng các chủng vi
khuẩn này không gây dung huyết khi nuôi cấy
trên môi trường BA.

Qua 16 mẫu vi khuẩn thu được từ cá rô phi
giống bị bệnh lồi mắt, xuất huyết nuôi tại ao và
bè tại Tp. Hồ Chí Minh, sau nhuộm gram, test
sinh hóa và giải trình tự gen 16S rRNA đều có
kết quả dương tính với vi khuẩn Streptococcus
agalactiae. Khuẩn lạc của vi khuẩn Streptococcus
agalactiae hình trịn, lồi, màu kem, kích thước
khoảng 1-2mm, dung huyết dạng β, đây là tan
máu hồn tồn, vịng tan máu trong suốt và có
đường kính gấp 2-4 lần đường kính của khuẩn
lạc. Những Streptococci có khả năng gây tan
máu β phần lớn có khả năng gây bệnh, hầu hết
các chủng vi khuẩn Streptococci không gây tan
huyết thu từ cá bệnh đều là vi khuẩn S. difficae

(Alsaid và ctv., 2010; Buller, 2004). Tuy nhiên,
nghiên cứu của (Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv.,
2012) phân lập vi khuẩn gây bệnh lồi mắt, xuất
huyết trên cá rô phi nuôi năm 2010 ở huyện Cai

Trong nghiên cứu này chiết xuất với ethanol
96%, khả năng kháng khuẩn Streptococcus
agalactiae (106 CFU/ml) của gừng (330 mg/
ml) cho vòng kháng khuẩn 29-34 mm và quế
(330 mg/ml) cho vòng kháng khuẩn 14-17 mm,
khả năng ức chế và diệt vi khuẩn Streptococcus
agalactiae (mật độ 5 x 103 CFU/ml) của gừng
có giá trị MIC = 1 mg/ml, MBC = 2 mg/ml và
của quế có giá trị MIC = 2 mg/ml, MBC = 8 mg/
ml, giá trị MBC/MIC ≤ 4 chứng tỏ hai loại thảo
dược này có khả năng diệt khuẩn cao.
Giá trị MIC xác định bởi nghiên cứu này là
tương đồng với kết quả nghiên cứu của một số
tác giả khác. Nghiên cứu dịch chiết bằng nước
từ gừng trên 18 chủng vi khuẩn A. hydrophila có

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 15 - THÁNG 12/2019

11


VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN II

vịng kháng khuẩn từ 7 - 13,67 mm (10 mg/đĩa),
MIC = 0,05 – 0,20 mg/ml và MBC = 0,78-50

mg/ml (Snuossi và ctv., 2016). Nghiên cứu dịch
chiết bằng nước từ gừng trên 6 chủng vi khuẩn
Staphilococcus sciuri có vịng kháng khuẩn từ
8,67 - 15,33 mm (10 mg/đĩa), MIC = 0,05 – 0,20
mg/ml và MBC = 1,26 - 25 mg/ml (Snuossi và
ctv., 2016). Nghiên cứu dịch chiết bằng nước
lạnh, nước nóng và ethanol (95%) từ gừng (200
mg/ml) trên chủng vi khuẩn Streptococcus sp có
vịng kháng khuẩn lần lượt 14, 11 và 28 mm
(Nader, 2010). Chiết xuất gừng với ethanol
95% (100 mg/ml) cho vòng kháng khuẩn 15,5
mm với vi khuẩn Streptococcus pneumonia
(Suleiman AG và ctv., 2019). Chiết suất vỏ quế
với nước (1 g/ml) cho vòng kháng khuẩn 21,5
mm với vi khuẩn Streptococcus iniae (105 CFU/
ml), MIC = 0,04 mg/ml (Rattanachaikunsopon
và ctv., 2010). Nghiên cứu chiết xuất bằng
ethanol 95% trên tỏi, nguyệt quế, muồng
trâu, măng cụt, ổi và cây duối (10 mg/ml) khả
năng kháng khuẩn Streptococcus agalactiae
(108 CFU/ml) cho đường kính vịng kháng
khuẩn từ 20-22 mm, khả năng ức chế vi khuẩn
Streptococcus agalactiae (108 CFU/ml) trên
muồng trâu, ổi, cây duối có giá trị MIC ≤ 0,125
mg/ml (Rattanachaikunsopon và ctv., 2009).
Nghiên cứu của chiết xuất bằng ethanol 95%
trên lá sầu đâu (100 mg/ml) có khả năng kháng
khuẩn Streptococcus agalactiae (108 CFU/ml)
cho đường kính vịng kháng khuẩn 10,5 mm,
trên lá cây tơng dù (100 mg/ml) cho đường kính

vịng kháng khuẩn 10,9 mm, khả năng ức chế
vi khuẩn Streptococcus agalactiae (108 CFU/
ml) của sầu đâu có giá trị MIC = 1,25 mg/ml,
của lá cây tơng dù có giá trị MIC = 0,6 mg/ml
(Kamble và ctv., 2014).
V. KẾT LUẬN
Vi khuẩn phân lập được từ cá rô phi giống
bị bệnh lồi mắt, xuất huyết thu tại Tp. Hồ Chí
Minh là Streptococcus agalactiae. Khả năng
kháng khuẩn Streptococcus agalactiae của cao
chiết quế trong ethanol 96% (nồng độ cao chiết
330 mg/ml) cho đường kính vịng kháng khuẩn
29-34 mm và cao chiết gừng trong ethanol 96%
12

(nồng độ cao chiết 330 mg/ml) cho đường kính
vịng kháng khuẩn 14-17 mm, khả năng ức chế
và diệt vi khuẩn Streptococcus agalactiae (5 x
103 CFU/ml) của cao chiết gừng có giá trị MIC
= 1 mg/ml, MBC = 2 mg/ml và của cao chiết
quế có giá trị MIC = 2 mg/ml, MBC = 8 mg/ml.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
Đặng Thị Hoàng Oanh, Nguyễn Thanh Phương,
2012. Phân lập và xác định đặc điểm của vi khuẩn
S. agalactiae từ cá điêu hồng (Oreochromis sp.)
bệnh phù mắt và xuất huyết. Tạp chí Khoa học Đại
học Cần Thơ, 22C, 203-212.
Nguyễn Thượng Dong, Vietnam, Bộ giáo dục và đào
tạo, Vietnam, Bộ y tế, Viện dược liệu, 2008. Kỹ

thuật chiết xuất dược liệu. Hà Nội: Nhà xuất bản
Khoa học và kỹ thuật.
Trương Thị Mỹ Hạnh, 2008. Nghiên cứu tính kháng
khuẩn và kháng nấm của một số loại thảo mộc.
Báo cáo đề tài khoa học – Viện Nghiên cứu Nuôi
trồng thủy sản I, Bắc Ninh.
Nguyễn Thị Trúc Quyên, Lê Linh Chi, Đoàn Văn
Cường, Nguyễn Diễm Thư, Mã Tú Lan, Trần
Hồng Bích Ngọc, Nguyễn Thành Nhân, Nguyễn
Thị Ngọc Tĩnh, 2019. Khả năng đối kháng vi
khuẩn Streptococcus agalactiae phân lập trên cá
rô phi (Oreochromis spp.) bởi một số cao chiết
thảo dược. Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy
sản, 3, 124-132.
Viện NCNT Thuỷ sản I, 2017. Các bệnh thường gặp
trên cá rơ phi ni tại Việt Nam, tình hình nghiên
cứu bệnh do TiLV trên cá rô phi. Báo cáo hội nghị
phịng chống bệnh mới do TiLV trên cá rơ phi nuôi
tại Việt Nam, 10/2017.
Tài liệu tiếng Anh
Abutbul S., Golan Avi, Barazani Oz, Zilberg Dina,
2004. Use of Rosmarinus officinalis as a treatment
against Streptococcus iniae in tilapia (Oreochromis
sp.). Aquaculture, 238, 97-105. doi:10.1016/j.
aquaculture.2004.05.016
Ahn Y. J., Kwon J. H., Chae S. H., Park J. H., Yoo J.
Y., 1994. Growth-inhibitory Responses of Human
Intestinal Bacteria to Extracts of Oriental Medicinal
Plants. Microbial Ecology in Health and Disease,
7(5), 257-261. doi:10.3109/08910609409141363

Alsaid Milud, Mohd Daud Hassan, Bejo Siti,
Abuseliana Ali, 2010. Antimicrobial Activities

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 15 - THÁNG 12/2019


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
of Some Culinary Spice Extracts against
Streptococcus agalactiae and Its Prophylactic
Uses to Prevent Streptococcal Infection in Red
Hybrid Tilapia (Oreochromis sp.). World Journal
of Fish and Marine Sciences, 2.
Assessment report on Hypericum perforatum L., herb,
2018. Committee on Herbal Medicinal Products
(HMPC). European Medicines Agency.
Brian Sheehan Ph.D. , L. Labrie, DVM , Y.S. Lee, B.S.
, F.S. Wong, B.S. , J. Chan, B.S. , C., Komar DVM
, N. Wendover, B.S. and L. Grisez, Ph.D, 2009.
Streptococcosis in tilapia. Global Aquaculture
Advocate.
Buller Nicky B., 2004. Bacteria from Fish and Other
Aquatic Animals. A Practical Identification
Manual.
Buxton Rebecca, 2005. Blood Agar Plates and
Hemolysis Protocols. American Society for
Microbiology.
Evans Joyce, Klesius P. H., Shoemaker Craig, 2006.
An overview of Streptococcus in warmwater fish.
Aquaculture Health International, 7, 10-14.
Faikoh E.N., Hong Y.H., Hu S.Y., 2014. Liposomeencapsulated

cinnamaldehyde
enhances
zebrafish (Danio rerio) immunity and survival
when challenged with Vibrio vulnificus and
Streptococcus agalactiae. Fish & shellfish
immunology, 38, 15-24.
Kamble Manoj, Gallardo Wenresti, Yakupitiyage
Amararatne,
Chavan
Balasaheb,
Rusydi
Rachmawati, Rahma Aulia, 2014. Antimicrobial
Activity of Bioactive Herbal Extracts Against
Streptococcus agalactiae Biotype
2. International Journal of Basis and Applied Biology,
2, 152-155.
Nader Mohammed & Kassim, Kais & Ali, Safaa &
Azhar, Dalia, 2010. Antibacterial activity of ginger
extracts and its essential oil on some of pathogenic
bacteria. Baghdad Science Journal, 7, 1159-1165.
Nagi A Al-Haj, Khadija Zedan Hassan, Alabed Ali A
Alabed, Abdullah Y Al Mahdi, Rasheed Abdsalam,
Albawani. Sami Mohammed, 2018. Antibacterial
Assays of Malaysian Medicinal Plant Polygonum
minus Using Different Extraction Methods**
Nagi A. Al-Haj," Khadija Zedan Hassan,“Alabed
Ali A. Alabed,“Abdullah Y. Al Mahdi.
Nascimento Gislene G. F., Locatelli Juliana, Freitas
Paulo C., Silva Giuliana L., 2000. Antibacterial
activity of plant extracts and phytochemicals on

antibiotic-resistant bacteria. Brazilian Journal of
Microbiology, 31, 247-256.
Ndong Diegane, Chen Yu-Yuan, Lin Yu-Hung,
Vaseeharan Baskaralingam, Chen Jiann-Chu,
2007. The immune response of Mozambique
tilapia Oreochromis mossambicus (Peters) and
its susceptibility to Streptococcus iniae under
stress in low and high temperatures. Fish &
shellfish immunology, 22, 686-694. doi:10.1016/j.
fsi.2006.08.015
Pachanawan A. , Phumkhachorn P.
,
Rattanachaikunsopon P., 2008. Potential of
Psidium guajava Supplemented Fish Diets in
Controlling Aeromonas hydrophila Infection
in Tilapia (Oreochromis niloticus). Journal of
bioscience and bioengineering, 106(5), 419-424.
Rattanachaikunsopon P., Phumkhachorn P., 2009.
Prophylactic effect of Andrographis paniculata
extracts against Streptococcus agalactiae infection
in Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Journal
of bioscience and bioengineering, 107, 579-582.
doi:10.1016/j.jbiosc.2009.01.024
Rattanachaikunsopon P., Phumkhachorn P., 2010.
Potential of cinnamon (Cinnamomum verum) oil
to control Streptococcus iniae infection in tilapia
(Oreochromis niloticus). Fisheries Science, 76,
287-293.
Shangliang T., Hetrick, F. M., Roberson, B. S., and

Baya, A., 1990. The antibacterial and antiviral
activity of herbal extracts for fish pathogens. J.
Ocean. Uni. Qingdao, 20, 53-60.
Snuossi Mejdi, Trabelsi Najla, Ben Taleb Sabrine,
Dehmeni Ameni, Flamini Guido, De Feo
Vincenzo, 2016. Laurus nobilis, Zingiber
officinale and Anethum graveolens Essential
Oils: Composition, Antioxidant and Antibacterial
Activities against Bacteria Isolated from Fish and
Shellfish. Molecules (Basel, Switzerland), 21(10),
1414. doi:10.3390/molecules21101414
Suleiman A.G., Hamisu M., Adamu M.D., Rabiu S.,
Abdulrazak M.H., Mujaheed A., Usman A.H., I
and Marwan, 2019. In Vitro Antibacterial Activity
and Phytochemical Analysis of Zingiber officinale
L. Rhizome Extracts. Med Chem (Los Angeles),
9(4), 056-059.
Yasuko Sekita, Keiji Murakami, Hiromichi Yumoto,
2016. Preventive Effects of Houttuynia cordata
Extract for Oral Infectious Diseases. Department
of Pharmacognosy, Tokushima - Japan, 770-8505.

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 15 - THÁNG 12/2019

13


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II

ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF CINNAMON BARK (Cinnamomum

verum) AND GINGER (Zingiber officinale rose) ETHANOL EXTRACT
AGAINST Streptococcus agalactiae ISOLATED FROM TILAPIA
FINGERLINGS (Oreochromis spp.)
Doan Van Cuong 1*, Nguyen Thi Ngoc Tinh1, Ma Tu Lan1, Nguyen Thanh Nhan1

ABSTRACT
Streptococcus agalactiae is known as an important pathogen that causes high mortality in many
freshwater and marine fish species. In this study, Streptococcus agalactiae was isolated from
tilapia with haemorrhage and eye-protrusion symptoms colected in Ho Chi Minh city. Extraction
of two herbs namely cinnamon bark (Cinnamon verum), ginger (Zingiber officinale Rose) by
exhaustion method with ethanol solvent at three separate concentrations (96%, 72%, and 48%) or
three consecutive concentrations (96%, then 72% and 48%, respectively). The results showed that
cinnamon extract in 96% ethanol demonstrated a highest antibacterial activity, with the diameter of
inhibition zone ranging from 29-34 mm, MIC value = 2 mg/ml, and MBC value = 8 mg/ml; while
Ginger extract in 96% ethanol showed the diameter of inhibiton zone ranging from 14-17 mm, MIC
value = 1 mg/ml, and MBC value = 2 mg/ml. In sum, cinnamon and ginger extract in 96% ethanol
are considered two potential herbal extracts that can be applied to prevent and to treat diseases
caused by Streptococcus agalactiae in tilapia.
Keywords: Cinnamon bark extract, ginger extract, Streptococcus agalactiae, tilapia.
Người phản biện: TS. Nguyễn Ngọc Du

Người phản biện: TS. Ngô Huỳnh Phương Thảo

Ngày nhận bài: 18/10/2019

Ngày nhận bài: 18/10/2019

Ngày thông qua phản biện: 02/11/2019

Ngày thông qua phản biện: 10/11/2019

Ngày duyệt đăng: 25/12/2019

Ngày duyệt đăng: 25/12/2019

Research Institute for Aquaculture II
* Email:

1

14

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 15 - THÁNG 12/2019