Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Bacillus sp. đối kháng với Vibrio parahaemolyticus trong nuôi tôm công nghiệp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

LÊ THẾ XUÂN

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI KHUẨN Bacillus sp.
ĐỐI KHÁNG VỚI Vibrio parahaemolyticus
TRONG NUÔI TÔM CÔNG NGHIỆP

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
MÃ SỐ: 62620301

NĂM 2020


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM TẠ......................................................................................................................... i
TÓM TẮT.............................................................................................................................. ii
ABSTRACT ......................................................................................................................... iii
CAM KẾT KẾT QUẢ ......................................................... Error! Bookmark not defined.
MỤC LỤC ............................................................................................................................. v
DANH SÁCH BẢNG ........................................................................................................... x
DANH SÁCH HÌNH ........................................................................................................... xi
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................................... xiii
Chương 1: GIỚI THIỆU..................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề ......................................................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu và phạm vi nghiên cứu ..................................................................................... 2

1.2.1 Mục tiêu tổng quát .................................................................................... 2

1.2.2 Mục tiêu cụ thể .......................................................................................... 2
1.3 Nội dung nghiên cứu ........................................................................................................ 2
1.4 Ý nghĩa nghiên cứu .......................................................................................................... 3
1.5 Tính mới của luận án: ...................................................................................................... 3
1.6 Thời gian thực hiện .......................................................................................................... 3
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 4
2.1 Khái quát về hiện trạng nuôi tôm sú và tôm thẻ chân trắng (tôm nước lợ) ......... 4

2.1.1 Tình hình nuôi tôm nước lợ trên thế giới .................................................. 4
2.1.2 Tình hình nuôi tôm nước lợ ở Việt Nam ................................................... 5
2.2 Tình hình dịch AHPND ở tôm nuôi trên thế giới và Việt Nam ............................. 6
2.3 Tác nhân gây AHPND trên tôm nuôi ......................................................................... 7
2.4 Chẩn đốn AHPND và các biện pháp phịng, trị bệnh trên tôm nuôi .................. 8

2.4.1 Chẩn đoán AHPND ................................................................................... 8
2.4.2 Phịng chớng AHPND ở tơm ni............................................................. 9
2.5 Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ........................................................................... 12

2.5.1 Đặc tính chủng V. parahaemolyticus ...................................................... 12
2.5.2 Các độc tố của V. parahaemolyticus ....................................................... 14
2.5.3 Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến sự phát triển của V.
parahaemolyticus ............................................................................................. 18
2.5.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ .................................................................... 18
2.5.3.2 Ảnh hưởng của pH ............................................................................ 18
2.5.3.3 Ảnh hưởng của độ mặn ..................................................................... 18
2.6 Khái quát chung về Bacillus subtilis. ......................................................................... 19

2.6.1 Sơ lược về B. subtilis............................................................................... 19
2.6.2 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự phát triển của B. subtilis . 20
2.6.3 Phân loại Bacillus theo phương pháp truyền thống ................................. 22

2.6.4 Phân loại Bacillus theo các phương pháp phân tử................................... 22
2.6.5 Ứng dụng của B. subtilis trong công nghiệp và nuôi trồng thủy sản ....... 26
2.7 Bacteriocin ..................................................................................................................... 29

2.7.1 Khái niệm ................................................................................................ 29
2.7.2 Phân loại Bacteriocin .............................................................................. 31
2.7.3 Ứng dụng của bacteriocin từ Bacillus trong thủy sản ............................. 31
v


2.7.4 Subtilosin A............................................................................................. 33
Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 35
3.1 Địa điểm nghiên cứu và đối tượng nghiên cứu........................................................ 35
3.2 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................ 35

3.2.1 Phương pháp lấy mẫu .............................................................................. 36
3.2.2 Phương pháp phân lập Vibrio sp. và xác định V. parahaemolyticus từ ao
nuôi tôm ........................................................................................................... 37
3.2.3 Phương pháp phát hiện gen độc tố ở các chủng Vibrio sp. phân lập được
.......................................................................................................................... 37
3.2.3.1 pirA.................................................................................................... 39
3.2.3.2 pirB.................................................................................................... 39
3.2.3.3 toxR ................................................................................................... 39
3.2.3.4 tdh...................................................................................................... 40
3.2.3.5 trh ...................................................................................................... 40
3.2.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường (nhiệt độ,
pH, độ mặn) đến sự phát triển của V. parahaemolyticus .................................. 40
3.2.5 Phương pháp phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus trong ao nuôi tôm
công nghiệp ...................................................................................................... 41
3.2.5.1 Phương pháp lấy mẫu........................................................................ 41

3.2.5.2 Phương pháp phân lập Bacillus từ ao nuôi tôm ................................ 41
3.2.6 Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus sp....................... 42
3.2.6.1 Phương pháp tủn chọn chủng vi kh̉n Bacillus sp. có hoạt tính đối
kháng V. parahaemolyticus ........................................................................... 42
3.2.6.2 Phương pháp tuyển chọn chủng vi kh̉n Bacillus sp. có hoạt tính
protease cao ................................................................................................... 42
3.2.6.3 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính
amylase cao ................................................................................................... 42
3.2.6.4 Phương pháp tuyển chọn chủng vi kh̉n Bacillus sp. có hoạt tính
cellulase cao .................................................................................................. 43
3.2.7. Phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA hệ gen của Bacillus ............ 43
3.2.8 Phương pháp phát hiện và tách dòng gen mã hóa bacteriocin từ chủng
Bacillus BRB2.1 ............................................................................................... 43
3.2.8.1 Thiết kế mồi khuếch đại gen spaS và sboA từ chủng Bacillus BRB2.1
....................................................................................................................... 43
3.2.8.2. PCR khuếch đại gen spaS và sboA từ chủng Bacillus BRB2.1 ....... 44
3.2.8.3 Tách dòng và giải trình tự gen sboA từ chủng Bacillus BRB 2.1 ..... 44
3.2.8.4 Xây dựng cây phả hệ trình tự nucleotide và trình tự axít amin của
subtilosin A ................................................................................................... 44
3.2.9 Phương pháp đánh giá đa đạng di truyền của Bacillus sp. phân lập được
.......................................................................................................................... 45
3.2.9.1 Đánh giá đa dạng di truyền nhóm Bacillus dựa trên trình tự 16S
rDNA ............................................................................................................. 45
3.2.9.2 Đánh giá đa đạng di truyền của nhóm Bacillus dựa trên phân tích
MLST ............................................................................................................ 46
3.2.10 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố môi trường đến sự phát
triển của Bacillus sp. ........................................................................................ 47
vi

3.2.11 Kiểm tra khả năng gây AHPND của các chủng V. parahaemolyticus
BĐB1.3v, BĐB1.4v, BNB 3.1v, BRB1.1v, CĐB6v trên TTCT ...................... 48
3.2.12 Nghiên cứu đợc tính của chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v trên tôm
.......................................................................................................................... 49
3.2.13 Phương pháp thử nghiệm tính đối kháng của Bacillus sp. với Vibrio sp.
ở quy mô phòng thí nghiệm ............................................................................. 50
3.2.13.1 Lựa chọn các chủng Bacillus sp. có khả năng ức chế vi khuẩn V.
parahaemolyticus và hoạt tính enzyme ngoại bào cao ................................. 50
3.2.13.2 Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus của các
chủng vi khuẩn Bacillus sp. trong hệ thớng bể ni tơm 100 lít .................. 51
3.2.14 Phương pháp khảo sát khả năng kháng vi khuẩn Vibrio của các chủng vi
khuẩn Bacillus trong hệ thống bể ni tơm 1000 lít ........................................ 52
3.2.14.1 Bớ trí thí nghiêm: ............................................................................ 52
3.2.14.2 Phương thức thực hiện: ................................................................... 52
3.2.14.3 Cho ăn và quản lý ........................................................................... 52
3.2.14.4 Các chỉ tiêu theo dõi ....................................................................... 53
3.2.15 Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................... 53
Chương 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN ............................................................................. 54
4.1 Phân lập các chủng thuộc chi Vibrio trong ao nuôi tôm công nghiệp.................. 54
4.2 Kết quả phát hiện các gen độc lực ở các chủng Vibrio sp. phân lập được bằng
PCR....................................................................................................................................... 55

4.2.1 Phát hiện gen toxR đặc hiệu cho V. parahaemolyticus............................ 55
4.2.2 Phát hiện gen độc lực tdh ........................................................................ 58
4.2.3 Phát hiện gen độc lực trh......................................................................... 59
4.2.4 Phát hiện gen độc lực pirA ...................................................................... 60
4.2.5 Phát hiện gen độc lực pirB ...................................................................... 60
4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, độ mặn, pH đến sự phát triển của V.
parahaemolyticus ................................................................................................................. 62

4.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của chủng vi khuẩn V.
parahaemolyticus BĐB1.4v ............................................................................. 62
4.3.2. Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của chủng vi khuẩn V.
parahaemolyticus BĐB1.4v ............................................................................. 63
4.3.3 Ảnh hưởng của độ mặn đến sự phát triển của chủng vi khuẩn V.
parahaemolyticus BĐB1.4v ............................................................................. 64
4.4 Phân lập các chủng thuộc chi Bacillus trong ao nuôi tôm công nghiệp .............. 65
4.5 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính sinh học ứng dụng trong
ni tơm cơng nghiệp ......................................................................................................... 67

4.5.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính đới kháng V.
parahaemolyticus ............................................................................................. 67
4.5.2 Tủn chọn chủng vi kh̉n Bacillus sp. có hoạt tính sinh protease cao. 68
4.5.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính sinh amylase cao . 69
4.5.4 Tuyển chọn chủng vi kh̉n Bacillus sp. có hoạt tính sinh cellulase cao 70
4.6 Xác định sự có mặt của các gen mã hóa bacteriocin ở chủng BRB2.1 ................ 72

4.6.1 Phát hiện và tách dòng gen mã hóa bacteriocin từ chủng BRB2.1 ......... 72
4.6.2 Xây dựng cây phả hệ và so sánh trình tự axít amin subtilosin A của chủng
BRB2.1............................................................................................................. 75

vii


4.6.2.1 Xây dựng cây phả hệ trình tự axít amin của subtilosin A từ chủng
BRB2.1 .......................................................................................................... 75
4.6.2.2 So sánh trình tự axít amin subtilosin A ............................................. 76
4.6.3 Xây dựng cây phả hệ và so sánh trình tự nucleotide gen sboA của
chủng BRB2.1 với 10 chủng tham chiếu ...................................................... 77
4.6.3.1. Xây dựng cây phả hệ trình tự nucleotide gen sboA ......................... 77

4.6.3.2 So sánh trình tự nucleotide gen sboA ................................................ 77
4.7 Đa dạng di truyền 26 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus dựa trên trình tự gen
mã hóa 16S rDNA và phân tích MLST .......................................................................... 78

4.7.1. Phân tích đa dạng di truyền của 26 chủng vi khuẩn Bacillus bằng phương
pháp giải trình tự 16S rDNA ............................................................................ 78
4.7.2. Phân tích đa dạng di truyền của 26 chủng vi khuẩn nghi là Bacillus bằng
MLST ............................................................................................................... 79
4.8 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự phát triển của chủng B. subtilis
BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 ...................................................................................... 85

4.8.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của chủng B. subtilis BRB2.1
và B. siamensis BĐK2.3................................................................................... 85
4.8.2 Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của chủng B. subtilis BRB2.1 và B.
siamensis BĐK2.3............................................................................................ 86
4.8.3 Ảnh hưởng của độ mặn đến sự phát triển của chủng B. subtilis BRB2.1 và
B. siamensis BĐK2.3 ....................................................................................... 86
4.9 Kiểm tra khả năng gây AHPND của chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v trên
TTCT .................................................................................................................................... 87
4.10 Nghiên cứu độc tính của chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v trên tơm ......... 89
4.11 Thử nghiệm tính đối kháng của Bacillus sp. với V. parahaemolyticus BĐB1.4v
ở quy mô phịng thí nghiệm .............................................................................................. 91

4.11.1 Nghiên cứu tính đới kháng của chủng B. subtilis BRB2.1 và B.
siamensis BĐK2.3 đối với chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v gây AHPND
trong môi trường nước nuôi tôm ...................................................................... 91
4.11.2 Thử nghiệm khả năng phòng chống AHPND của chủng B. subtilis
BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 trong thùng nuôi 100 Lít............................. 93
4.12 Thử nghiệm khả năng bảo vệ tôm khỏi sự nhiễm V. parahaemolyticus gây bệnh
AHPND ở quy mơ ni 1000 lít ....................................................................................... 95

4.12.1. Sự biến đợng của các chỉ tiêu môi trường trong quá trình thử nghiệm 95
4.12.2 Sự biến động của chỉ tiêu vi sinh vật tổng số và mật độ Vibrio trong quá
trình thử nghiệm ............................................................................................... 97
4.12.3 Tỉ lệ sống và sự phát triển của tôm trong quá trình thử nghiệm ............ 99
Chương 5: KẾT LUẬN - ĐỀ XUẤT ............................................................................. 101
5.1 Kết luận .........................................................................................................................101
5.2 Đề xuất ..........................................................................................................................101
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 103
PHỤ LỤC A: SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM ....................................................................... 128
PHỤ LỤC B: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH.................................................. 149
PHỤ LỤC C: CÁC BẢNG ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI KHUẨN LẠC KHI PHÂN
LẬP ..................................................................................................................................... 150
PHỤ LỤC D: KẾT QUẢ ĐỊNH TÊN CỦA 30 CHỦNG NGHI LÀ BACILLUS
BẰNG GIẢI TRÌNH TỰ GEN 16S RDNA ................................................................. 161
viii


PHỤ LỤC E: KẾT QUẢ THỐNG KÊ ......................................................................... 164
PHỤ LỤC F: MỘT SỐ HÌNH THỰC NGHIỆM....................................................... 171

ix


DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Các gen được sử dụng để phân loại các loài thuộc nhóm B. cereus bằng kỹ
thuật MLST ................................................................................................................ 25
Bảng 2.2 Các bacteriocin từ Bacillus sp. được công bố trong khoảng thời gian 20002019 ............................................................................................................................ 32
Bảng 3.1 Số lượng mẫu thu tại Bạc Liêu, Sóc Trăng và Cà Mau .............................. 35

Bảng 3.2 Các chủng vi khuẩn sử dụng trong dựng cây phả hệ gen subtilosin A ....... 45
Bảng 3.3 Trình tự mồi sử dụng cho phân tích MLST ................................................ 46
Bảng 4.1: Kết quả phân lập chủng vi khuẩn nghi ngờ là Vibrio ................................ 54
Bảng 4.2 Tổng hợp kết quả PCR khuếch đại gen toxR và hình thái khuẩn lạc trên môi
trường Chromagar Vibrio ........................................................................................... 57
Bảng 4.3 Mật độ (Log cfu/ml) của V. parahaemolyticus BĐB1.4v ở các mức nhiệt độ
khác nhau sau 24 và 48 giờ nuôi cấy ......................................................................... 62
Bảng 4.4 Mật độ (Log cfu/mL) của vi khuẩn V. parahaemolyticus BĐB1.4v trong
các nghiệm thức pH khác nhau sau 24 và 48 giờ nuôi cấy ........................................ 63
Bảng 4.5 Mật độ (Log cfu/ml) của V. parahaemolyticus BĐB1.4v ở các độ mặn khác
nhau sau 24 và 48 giờ nuôi cấy .................................................................................. 65
Bảng 4.6 Kết quả phân lập chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus .............................. 65
Bảng 4.7 Kết quả phân tích MLST 7 gen “house-keeping”....................................... 81
Bảng 4.8 Mật độ của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 sau 24 giờ
nuôi cấy ở các nhiệt độ khác nhau ............................................................................. 85
Bảng 4.9 Mật độ của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 sau 24 giờ
nuôi cấy ở các giá trị pH khác nhau ........................................................................... 86
Bảng 4.10 Mật độ của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 sau 24 giờ
nuôi cấy ở các độ mặn khác nhau .............................................................................. 87
Bảng 4.11 Ảnh hưởng của 5 chủng V. parahaemolyticus đến tỉ lệ tôm chết sau 36 giờ
gây nhiễm trong hệ thống nuôi 100 lít ....................................................................... 88
Bảng 4.12 Ảnh hưởng của mật độ cảm nhiễm chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v
đến tỉ lệ tôm chết sau 24 giờ ...................................................................................... 90
Bảng 4.13 Ảnh hưởng của liều cấp giống của hai chủng B. subtilis BRB2.1 và B.
siamensis BĐK2.3 đến mật độ V. parahaemolyticus BĐB1.4v trong môi trường nước
nuôi tôm ..................................................................................................................... 93
Bảng 4.14 Kết quả thử nghiệm khả năng phòng chống AHPND của chủng B. subtilis
BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 trong thùng nuôi 100 lít sau 36 giờ gây nhiễm .... 94
Bảng 4.15: Các chỉ tiêu môi trường trong các nghiệm thức ...................................... 96
Bảng 4.16: Mật độ vi sinh vật tổng số của các nghiệm thức trong quá trình thử

nghiệm (cfu/mL) ........................................................................................................ 98
Bảng 4.17: Mật độ vi khuẩn Vibrio của các nghiệm thức trong quá trình thử nghiệm
(cfu/mL) ..................................................................................................................... 98
Bảng 4.18: Tỉ lệ sống của tôm thẻ chân trắng và hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR) sau
thí nghiệm ................................................................................................................ 100
Bảng C.1: Bảng mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus trong mẫu
nước lấy tại Bạc Liêu sau 24h cấy trên môi trường NA .......................................... 150
Bảng C.2: Bảng mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Vibrio trong mẫu
nước lấy tại Bạc Liêu sau 24h cấy trên môi trường TCBS ...................................... 151
Bảng C.3: Đặc điểm khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus trên môi
trường NA (Mẫu bùn thu tại Bạc Liêu).................................................................... 151

x


Bảng C.4: Đặc điểm khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghi ngờ là Vibrio trên môi
trường TCBS (Mẫu bùn thu tại Bạc Liêu) ............................................................... 152
Bảng C.5: Mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus trong ruột tôm
sau 24h cấy trên môi trường NA (Mẫu lấy tại Bạc Liêu) ........................................ 153
Bảng C.6: Mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Vibrio trong ruột tôm
sau 24h cấy trên môi trường TCBS (Mẫu lấy tại Bạc Liêu) .................................... 154
Bảng C.7: Bảng mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus trong
nước sau 24h cấy trên môi trường NA (Mẫu lấy tại Cà Mau) ................................. 155
Bảng C.8: Bảng mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Vibrio trong nước
sau 24h cấy trên môi trường TCBS .......................................................................... 156
Bảng C.9: Đặc điểm khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus trên môi
trường NA (Mẫu lấy tại Cà Mau)............................................................................. 156
Bảng C.10: Đặc điểm khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghi ngờ là Vibrio trên môi
trường TCBS (Mẫu lấy tại Cà Mau) ........................................................................ 157
Bảng C.11: Mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus trong ruột tôm

sau 24h cấy trên môi trường NA (Mẫu lấy tại Cà Mau) .......................................... 157
Bảng C.12: Mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Vibrio trong ruột tôm
sau 24h cấy trên môi trường TCBS (Mẫu lấy tại Cà Mau) ...................................... 158
Bảng C.13: Bảng mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus trong
nước sau 24h cấy trên môi trường NA (Mẫu lấy tại Sóc Trăng) ............................. 158
Bảng C.14: Đặc điểm khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus trên môi
trường NA (Mẫu lấy tại Sóc Trăng) ......................................................................... 159
Bảng C.15: Mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus trong ruột tôm
sau 24h cấy trên môi trường NA (Mẫu lấy tại Sóc Trăng) ...................................... 160

DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 2.1 Sơ đờ plasmid pVA1 và vị trí các gen pirA và pirB ..................................... 8
Hình 2.2 Vị trí gen pirA và pirB trên plasmid pVA1 của V. parahaemolyticus .......... 8
Hình 2.3 Nhuộm mô gan tụy bằng haematoxylin và eosin (Phiwsaiya et al., 2017) ... 9
Hình 2.4 Hình thái vi khuẩn V. parahaemolyticus dưới kính hiển vi điện tử
( ..................... 13
Hình 2.5 Cấu trúc và các tác nhân độc lực của V. parahaemolyticus (Wang et al.,
2015) .......................................................................................................................... 13
Hình 2.6 Cấu trúc của độc tố Cry của B. thuringiensis (Lin et al., 2017).................. 16
Hình 2.7 Cấu trúc của các độc tố PirA và PirB của V. parahaemolyticus (Lin et al.,
2017) .......................................................................................................................... 16
Hình 2.8 Hình thái vi khuẩn B. subtilis 168 dưới kính hiển vi điện tử (Zweers et al.,
2008) .......................................................................................................................... 19
Hình 2.9 Cấu trúc của Subtilosin A (Abriouel et al., 2011)....................................... 33
Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu của luận án ..................................................................... 36
Hình 3.2 Quy trình phát hiện các gen độc tố của các chủng V. parahaemolyticus .... 38
Hình 3.3. Hình thái các loài Vibrio trên môi trường CHROMagar (CHROMagar,
Paris, France).............................................................................................................. 38
Hình 4.1: Hình khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio phân lập tại Bạc lieu và Cà Mau ...... 55

Hình 4.2 Kết quả PCR khuếch đại gen toxR từ 31 chủng Vibrio phân lập được. ...... 57
Hình 4.3 Kết quả PCR khuếch đại gen tdh từ 31 chủng Vibrio phân lập được. ........ 59
Hình 4.4 Kết quả PCR khuếch đại gen trh từ 31 chủng Vibrio phân lập được. ......... 59
Hình 4.5 Kết quả PCR khuếch đại gen pirA từ 31 chủng Vibrio phân lập được. ...... 60
Hình 4.6 Kết quả PCR khuếch đại gen pirB từ 31 chủng Vibrio phân lập được ....... 61
xi


Hình 4.7 Kết quả điện di lại sản phẩm PCR khuếch đại gen pirB từ các mẫu
BDB11.1v (19); CRK1.2v (27); BĐB1.4v (31) ......................................................... 61
Hình 4.8: Hình khuẩn lạc của vi khuẩn Bacillus phân lập tại Bạc Liêu, Sóc Trăng và
Cà Mau ....................................................................................................................... 66
Hình 4.9 Vòng kháng khuẩn của 6 chủng BRB2.1, BĐK2.3, BNK 6.1, BRK4.4,
BNK7.1, BĐB11.1 trên đĩa thạch với vi khuẩn kiểm định là chủng V.
parahaemolyticus BĐB1.4v ....................................................................................... 68
Hình 4.10 Vòng ức chế vi sinh vật kiểm định (D-d) của 6 chủng nghi là Bacillus có
hoạt tính đới kháng V. parahaemolyticus. Thanh sai số thể hiện giá trị độ lệch chuẩn.
.................................................................................................................................... 68
Hình 4.11 Hình ảnh sàng lọc hoạt tính sinh protease của một số chủng nghi là
Bacillus sp. trên môi trường thạch SM. ..................................................................... 69
Hình 4.12 Khả năng sinh protease của tập hợp 30 chủng nghi là Bacillus ................ 69
Hình 4.13 Hình ảnh sàng lọc hoạt tính sinh amylase của một số chủng nghi là
Bacillus sp. trên môi trường Starch Agar. .................................................................. 70
Hình 4.14 Khả năng sinh amylase của 30 chủng nghi là Bacillus ............................. 70
Hình 4.15 Hình ảnh sàng lọc hoạt tính sinh cellulose của một số chủng nghi là
Bacillus sp. trên môi trường CMC. ............................................................................ 71
Hình 4.16 Khả năng sinh cellulase của 30 chủng nghi là Bacillus ............................ 71
Hình 4.17 Kết quả PCR khuếch đại gen spaS và sboA từ chủng BRB2.1 ................. 73
Hình 4.18 Kết quả sàng lọc đoạn gen sboA trong vector pJET1.2............................. 74
Hình 4.19 Cây phả hệ trình tự axít amin subtilosin A của chủng Bacillus BRB 2.1 và

10 chủng tham chiếu. ................................................................................................. 75
Hình 4.20 So sánh đối chiếu trình tự axít amin subtilosin A của chủng BRB2.1 với
10 chủng tham chiếu. ................................................................................................. 76
Hình 4.21 Cây phả hệ trình tự nucleotide gen sboA của chủng BRB2.1 và 10 chủng
tham chiếu. ................................................................................................................. 77
Hình 4.22 So sánh đối chiếu trình tự nucleotide gen sboA của chủng BRB2.1 với 10
chủng tham chiếu. ...................................................................................................... 78
Hình 4.23 Cây phát sinh chủng loại của 26 chủng Bacillus với các chủng tham chiếu
dựa trên trình tự 16S rDNA........................................................................................ 79
Hình 4.24 Kết quả khuếch đại bằng PCR các vùng gen ptA (A); rpoD (B); ilvD (C);
glpF (D); pycA (E); purH (F); tpiA (G)...................................................................... 80
Hình 4.25 Cây phát sinh chủng loại dựa trên kết quả phân tích MLST của 26 chủng
Bacillus....................................................................................................................... 83
Hình 4.26 Mô gan tụy của tôm thẻ chân trắng khi lây nhiễm với chủng V.
parahaemolyticus BNB3.1v (A) và BĐB1.4v (B), độ phóng đại 200X. ................... 89
Hình 4.27 Tương quan giữa mật độ cảm nhiễm của chủng V. parahaemolyticus
BĐB1.4v và tỉ lệ tôm chết (tính theo giá trị probit) ................................................... 90
Hình 4.28 Mô gan tụy của TTCT 24 giờ sau cảm nhiễm với chủng V.
parahaemolyticus BĐB1.4v ....................................................................................... 91
Hình 4.29 Tế bào gan tụy tôm bị bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) .............. 95
độ phóng đại 200X ..................................................................................................... 95

xii


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC

TIẾNG ANH

TIẾNG VIỆT

AHPND

Acute Hepatopancreatic
Necrosis Disease

Bệnh hoại tử gan tụy cấp

BHI

Brain heart infusion

Môi trường canh thang não
– tim
Bộ Nông Nghiệp và Phát
triển Nông thôn

BNNPTNT
CMC

Carboxymethyl cellulose

Môi trường CMC

CFU

Colony forming unit

Khuẩn lạc

DNA

Deoxyribonucleic acid

Axid nucleic

DO

Dissolved oxygen

Oxy hòa tan

EHP

Enterocytozoon Hepatopenaei

Vi bào tử trùng

EMS

Early Mortality Syndromy

Hội chứng tôm chết sớm

ĐC

Đối chứng

ĐBSCL

Đồng Bằng Sông Cửu Long

FAO

Food and Agriculture
Organization of the United
Nations

Tổ chức Nông Lương Thế
giới

IHHNV

Infectious hypodermal and
hematopoietic necrosis virus

Vi rút gây bệnh hoại tử cơ
quan tạo máu và cơ quan lập
biểu mô

IMNV

Infectious myonecrosis virus

Vi rút gây bệnh hoại tử cơ

LAB

Lactic acid bacteria

Vi khuẩn lactic

LB

Luria-Bertani broth

Môi trường LB

MLST

Multi-locus Sequence Typing

Kỹ thuật MLST

MRS

de Man, Rogosa and Sharpe
agar

Môi trường MRS

NA

Nutrient Agar

Môi trường
dưỡng
xiii

thạch

dinh


NB

Nutrien Broth

Canh trường dinh dưỡng

NCBI

National Center for
Biotechnology Information

Trung tâm Quốc gia về
Thông tin Công nghệ Sinh
học

NGS

Next Generation Sequencing

Giải trình tự thế hệ mới
Nghiệm thức

NT
PCR

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng chuỗi Polymerase

RFLP

Restriction Fragment Length
Polymorphism

Đa hình chiều dài các đoạn
cắt

RNA

Ribonucleic acid

Axít ribonucleic

SBO

Subtilosin

Mơi trường SM

Skim milk medium

Môi trường sữa gầy

TCBS

Thiosulfate-Citrate BileSucrose agar

Môi trường TCBS

TDH

Thermostable Direct
Hemolysin

Độc tố TDH

TRH

TDH Related Hemolysin

Độc tố TRH

TLH

Thermolabile Hemolysin

Độc tố TLH

TSB

Trypto-casein soy broth

Môi trường TSB

TSV

Taura syndrome virus

Vi rút gây hội chứng Taura
Tôm thẻ chân trắng

TTCT
VASEP

Vietnam Association of
Seafood Exporters and
Producers

Hiệp hội Chế biến và Xuất
khẩu Thủy sản Việt Nam

WHO

World Health Organization

Tổ chức Y tế Thế giới

WSSV

White spot syndrome virus

Vi rút gây bệnh đốm trắng

YHV

Yellow head virus

Vi rút gây bệnh đầu vàng

pirA

Photorhabdus insect-related
toxin – like gene A

Gen mã hóa đợc tớ liên
quan Photorhabdus A

pirB

Photorhabdus insect-related
toxin – like gene B

Gen mã hóa đợc tớ liên
quan Photorhbdus B

xiv


toxR

Cholera toxin transcriptional
activator gene

Gen mã hóa hoạt hóa phiên
mã đợc tố tả

tdh

Thermostable direct
hemolysin gene

Gen mã hóa hemolysin trực
tiếp bền nhiệt

trh

TDH-related hemolysin gene

Gen mã hóa hemolysin liên
quan TDH

xv


Chương 1: GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Nuôi tôm nước lợ ở quy mô công nghiệp hiện đang phát triển rất mạnh ở
Đông Nam Á, Nam Á và Châu Mỹ La tinh. Các loài tôm nước lợ được nuôi công
nghiệp nhiều nhất là tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và tôm sú
(Penaeus monodon). Nuôi tôm nước lợ công nghiệp là lĩnh vực kinh tế mũi nhọn,
góp phần quan trọng trong tởng giá trị xuất khẩu thủy sản của nước ta, đưa Việt
Nam vào nhóm các quốc gia xuất khẩu thủy sản đứng đầu trên thế giới. Năm
2017 cả nước có diện tích nuôi tôm nước lợ là 721.100 ha, đạt sản lượng 701.000
tấn. Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) chiếm ưu thế về nuôi tôm nước lợ, với
hơn 91,8% về diện tích và 82,5% sản lượng thu hoạch so với cả nước (Tổng cục

thủy sản, 2018).
Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam (VASEP), năm
2012, nguồn nguyên liệu tôm nuôi nước lợ cho xuất khẩu thiếu hụt nghiêm trọng,
do dịch bệnh ở khu vực ĐBSCL; trong đó bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm (Acute
Hepatopancreatic Necrosis Disease - AHPND) (Flegel, 2012) hay còn gọi là hội
chứng tôm chết sớm (Early Mortality Syndromy - EMS) (Lightner et al., 2012) là
nguyên nhân gây thiệt hại nặng nề nhất. Năm 2010, AHPND bắt đầu xuất hiện tại
vùng ĐBSCL. Đến năm 2011, bệnh này bùng phát thành dịch tôm trên diện rộng,
gây thiệt hại trên 97.000 ha tập trung ở các tỉnh: Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà Mau,
Bến Tre. Năm 2012 dịch bệnh bùng phát thêm các tỉnh Trà Vinh, Kiên Giang,
Hải Phòng, Quảng Ninh, Thanh Hóa, Nghệ An, Quảng Ngãi, Bình Định, Khánh
Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận. Theo báo cáo thống kê của Tổng cục Thủy sản,
năm 2012 diện tích tôm nuôi nước lợ bị AHPND là 46.093 ha, chiếm 45,7% diện
tích tôm nuôi bị bệnh. Trong năm 2017 theo báo cáo của Cục Thú Y, trong cả
nước tổng diện tích tôm nuôi thiệt hại do AHPND là 6.793 ha, chiếm hơn 17,9 %
tổng diện tích tôm nuôi bị bệnh (Báo cáo tổng kết 2017, Cục Thú Y).
Tháng 5/2013, nhóm nghiên cứu của GS. Lightner (Đại học Arizona) đã
công bố kết quả xác định tác nhân gây bệnh của hội chứng hoại tử gan tụy cấp ở
tôm chính là một chủng vi khuẩn thuộc loài V. parahaemolyticus, chủng Vibrio
này bị nhiễm thể thực khuẩn (phage) tiết ra các độc tố gây chết tôm (Tran et al.,
2013). Ngày 12/6/2013, tại Sóc Trăng, Tổng cục Thủy sản đã đưa ra những kết
luận về tác nhân gây AHPND là do nhóm vi khuẩn Vibrio gây ra (chủng V.
parahaemolyticus có mang phage, và có thể do các loài Vibrio khác). Bên cạnh
1


đó, nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy nguồn gốc gây bệnh do vi
khuẩn ở tôm nuôi chủ yếu do vi khuẩn Vibrio gây nên. Vi khuẩn Vibrio có thể
làm chết ấu trùng tôm, chết tôm giống và tôm trưởng thành, gây thiệt hại đáng kể
trong nghề nuôi tôm công nghiệp.

Để khống chế dịch bệnh ở tôm nuôi, hạn chế tác đợng của AHPND ở tơm ni do
nhóm vi khuẩn Vibrio, cần thiết phải nghiên cứu ứng dụng các giải pháp công
nghệ sinh học, kết hợp sử dụng chế phẩm sinh học hữu hiệu để hạn chế sự phát
triển của vi khuẩn Vibrio trong ao nuôi tôm công nghiệp. Một số chủng Bacillus
đã được áp dụng thành công trong chế phẩm sinh học, ví dụ, chủng B. subtilis
UTM 126 có khả năng sinh chất kháng khuẩn đối với V. parahaemolyticus
(Balcázar et al., 2007), hay hỗn hợp hai chủng B. subtilis L10 và G1 trong thức
ăn giúp tôm tăng trưởng nhanh hơn 1,5 lần và giúp tăng khả năng đề kháng với V.
harveyi thông qua việc kích hoạt hệ thống miễn dịch của tôm (Zokaeifar et al.,
2012). Đề tài “Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Bacillus sp. đối kháng với Vibrio
parahaemolyticus trong nuôi tôm công nghiệp” được thực hiện nhằm tìm kiếm
giải pháp hạn chế sự phát triển của vi khuẩn V. parahaemolyticus, hạn chế dịch
AHPND, đóng góp các giải pháp nuôi tôm công nghiệp hiệu quả và bền vững.
1.2 Mục tiêu và phạm vi nghiên cứu
1.2.1 Mục tiêu tổng quát
Nghiên cứu các giải pháp hạn chế sự phát triển của vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus nhằm kiểm soát dịch bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm nuôi.
1.2.2 Mục tiêu cụ thể
- Phân lập, lựa chọn và đánh giá các chủng Bacillus sp. đối kháng được vi
khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm nuôi.
- Đánh giá và xác định được đa dạng di truyền của nhóm vi kh̉n
Bacillus sp. trong ao ni tơm sú/tơm thẻ thâm canh.
1.3 Nội dung nghiên cứu
- Phân lập các chủng V. parahaemolyticus từ ao nuôi tôm công nghiệp và
nghiên cứu về các gen độc lực ở các chủng Vibrio sp. bằng PCR
- Nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố môi trường (nhiệt độ, pH, độ mặn) đến
sự phát triển của chủng V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp.

2

- Phân lập các chủng Bacillus sp. từ ao nuôi tôm công nghiệp và đánh giá
tính đối kháng với vi khuẩn V. parahaemolyticus, khả năng sinh enzyme thủy
phân của các chủng phân lập được và xác định gen mã hóa bacteriocin ở chủng
có hoạt tính đới kháng cao.
- Xác định đa dạng di truyền của nhóm Bacillus sp. trong ao nuôi tôm công
nghiệp.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố môi trường (nhiệt độ, pH, độ mặn) đến
sự phát triển của các chủng Bacillus sp. có hoạt tính đới kháng cao.
- Thử nghiệm khả năng phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tơm thẻ
chân trắng (L. vannamei) của vi kh̉n Bacillus sp. ở qui mơ phịng thí nghiệm.
1.4 Ý nghĩa nghiên cứu
Kết quả của luận án góp phần bổ sung cơ sở khoa học và thực tiễn về đa
dạng di truyền của nhóm vi khuẩn Bacillus sp. và khả năng đối kháng của
Bacillus sp. đối với V. parahaemolyticus trong ao ni tơm nước lợ cơng nghiệp;
tìm kiếm các giải pháp ức chế sự phát triển V. parahaemolyticus gây bệnh Hoại
tử gan tụy cấp trong nuôi tôm công nghiệp.
Kết quả của luận án góp phần vào các giải pháp nuôi tôm công nghiệp bền
vững theo hướng phòng chống bệnh Hoại tử gan tụy cấp bằng giải pháp sinh học.
1.5 Tính mới của luận án:
Luận án đã phân lập được hai chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis
BĐK2.3 có khả năng đối kháng mạnh với V. parahaemolyticus bao gồm cả chủng
gây AHPND. Lần đầu tiên luận án ứng dụng thành công phương pháp MLST để
phân loại Bacillus sp.
1.6 Thời gian thực hiện
Từ tháng 9/2013 đến 9/2017

3

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Khái quát về hiện trạng nuôi tôm sú và tôm thẻ chân trắng (tôm nước lợ)
2.1.1 Tình hình nuôi tôm nước lợ trên thế giới
Ngành nuôi tôm là lĩnh vực kinh tế mũi nhọn tại nhiều quốc gia trên thế
giới, đặc biệt là tại Châu Á. Giá trị kim ngạch ngành tôm trên toàn thế giới hiện
được ước tính khoảng 40 tỷ USD và dự đoán sẽ đạt mức 68 tỷ USD trong mười
năm tới (Moss, 2018). Tuy nhiên, để đáp ứng nhu cầu thị trường, các quốc gia
sản xuất tôm hiện đang gặp rất nhiều thách thức như sự thiếu hụt nguồn cung,
dịch bệnh, ô nhiễm môi trường, sự lạm dụng kháng sinh, hàng rào kỹ thuật của
quốc gia nhập khẩu…
Trước năm 2000, Thái Lan, Trung Q́c, Inđơnêxia, Ấn Đợ có sản lượng
tơm nuôi lớn nhất thế giới trong đó chủ yếu nuôi tôm sú (Portley, 2016). Từ sau
2000, phát triển nuôi tôm thẻ chân trắng (TTCT) được chú ý ở nhiều nước. Theo
Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO), sản lượng tôm nuôi
thế giới năm 2013 đạt 4,45 triệu tấn; trong đó có gần 80% là TTCT.
Các báo cáo của FAO cho thấy Trung Quốc hiện đang là nước có sản lượng
tơm ni lớn nhất Thế giới, xấp xỉ 1,4-1,6 triệu tấn mỗi năm (GOAL, 2017).
Phần lớn sản lượng tôm này là dành để tiêu thụ trong thị trường Trung Quốc
(Portley, 2016). Cần nhấn mạnh rằng do tình hình dịch bệnh diễn biến phức tạp,
tổng sản lượng tôm của Trung Quốc có xu hướng giảm liên tục trong thời gian
vừa qua (GOAL, 2017).
Ngành nuôi tôm nước lợ ở Thái Lan bắt đầu tại các vùng ven biển vào
những năm 1970. Năm 1990, có đến 15.060 trại ni tơm. Năm 1995, số trại nuôi
tăng vọt lên 25.210, đối tượng nuôi chủ yếu là tôm sú. Năm 2010, sản lượng
TTCT đã tăng lên 552.319 tấn (chiếm khoảng 90% tổng sản lượng tôm Thái
Lan). Năm 2011, Thái Lan là quốc gia đứng thứ 2 về sản xuất TTCT trên thế
giới, sau Trung Quốc (Holmyard, 2016). Tuy nhiên, cũng do tình hình dịch bệnh,
tổng sản lượng tôm của Thái Lan trong những năm gần đây giảm xuống mức trên
300000 tấn/năm (GOAL, 2017).
Hội chứng tơm chết sớm hay cịn gọi là bệnh hoại tử gan tụy cấp (Acute

hepatopancreatic necrosis disease hay AHPND) đã được ghi nhận tại nhiều quốc
gia: Trung Quốc năm 2009, Việt Nam năm 2010, Malaysia năm 2011, Thái Lan
năm 2012, Mexico năm 2013, Philippines năm 2014 (Flegel, 2012; Lightner et

4


al., 2012). Đây là nguyên nhân chính gây thiệt hại nghiêm trọng đến ngành nuôi
tôm, đặc biệt là TTCT tại các quốc gia châu Á. Năm 2013, có đến 80-90% diện
tích ao ni ở Đơng Thái Lan phải ngừng sản xuất do AHPND (Tổng cục Thủy
sản, 2013).
2.1.2 Tình hình nuôi tôm nước lợ ở Việt Nam
Nghề nuôi tôm ở Việt Nam hình thành vào những năm đầu thế kỷ 20. Năm
1974, diện tích nuôi tôm nước lợ ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) đạt
khoảng 70.000 ha. Ở Miền Bắc, trước năm 1975 có 15.000 ha nuôi tôm nước lợ.
Nghề nuôi tôm nước lợ ở Việt Nam thực sự phát triển từ sau năm 1987 (Vu Do
Quynh, 1989). Năm 2000, diện tích nuôi tôm nước lợ ở Việt Nam là 250.000 ha,
đến năm 2003 đạt mức 530.000 ha. Năm 2016, tổng diện tích nuôi tôm nước lợ
đạt 697.645 ha trong đó tôm sú là 600.399 ha và TTCT là 94.246 ha, với tổng sản
lượng đạt 657.282 tấn trong đó tôm sú là 263.853 tấn và 393.429 tấn TTCT. Năm
2017, cả nước có tổng diện tích thả nuôi là 721.100 ha, sản lượng 701.000 tấn;
tăng 3,8% về diện tích và tăng 6,7% sản lượng so với 2016 (Tổng cục Thủy sản,
2018).
Với các ưu thế về điều kiện tự nhiên, ĐBSCL là vùng nuôi tôm nước lợ chủ
yếu của cả nước, với tổng diện tích tôm nuôi khoảng trên 600.000 ha. Trong năm
2016, ĐBSCL chiếm ưu thế về nuôi tôm nước lợ, với hơn 91,8% về diện tích và
82,5% sản lượng thu hoạch của cả nước. Năm 2017, diện tích nuôi tôm sú vùng
ĐBSCL chiếm 94,3% và TTCT chiếm 75,8% diện tích nuôi của cả nước; tương
ứng với sản lượng tôm sú chiếm 94,7% và TTCT chiếm 74,4% so với tổng sản
lượng tôm nuôi của cả nước (Tổng cục Thủy sản, 2018).

Theo thống kê của Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn (BNNPTNT),
năm 2010, khoảng 40.000 ha nuôi tôm ở ĐBSCL có mức độ thiệt hại vì dịch
bệnh từ 20 đến 80%, nhất là tại các tỉnh Cà Mau, Trà Vinh, Bạc Liêu, Sóc Trăng,
Kiên Giang. Đỉnh điểm vào năm 2012, diện tích nuôi tôm nước lợ bị thiệt hại vì
dịch bệnh ở khu vực ĐBSCL khoảng trên 100.000 ha (trong đó tôm sú là 91.174
ha và tôm thẻ 7.068 ha). Bệnh ở tôm nuôi thường gặp nhất là AHPND, sau đó là
đốm trắng, đầu vàng. Trong hai năm 2010 và 2011, AHPND đã bùng phát thành
dịch, gây thiệt hại hơn 97 nghìn ha, tập trung ở các tỉnh Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà
Mau, Bến Tre. Năm 2012, AHPND tiếp tục diễn ra tại Trà Vinh, Kiên Giang, và
lan rộng tới mợt sớ tỉnh ven biển phía Bắc và Bắc Trung bộ, Nam Trung bộ. Ở
nước ta đã có quy hoạch phát triển nghề nuôi tôm nước lợ từ cấp quốc gia, cấp

5


tỉnh, cấp huyện. Tuy nhiên, do việc phát triển tràn lan diện tích ni tơm tại mợt
sớ khu vực dẫn đến ô nhiễm môi trường, sự lạm dụng của thuốc thú y, mật độ thả
nuôi cao, dịch bệnh trên tôm nuôi thường xuyên xảy ra, gây thiệt hại lớn cho người
ni.
2.2 Tình hình dịch AHPND ở tơm ni trên thế giới và Việt Nam
Theo Lightner et al. (2012), năm 2009, bệnh hoại tử gan tụy cấp lần đầu
xuất hiện và được gọi tên là “hội chứng tôm chết sớm”. Tới năm 2011 bệnh được
gọi dưới tên “hội chứng hoại tử gan tụy cấp” (AHPNS) dựa trên mơ tả bệnh tích.
Tới năm 2013 khi tác nhân gây bệnh được xác định do một số chủng V.
parahaemolyticus, bệnh được gọi tên “bệnh hoại tử gan tụy cấp”. AHPND xảy ra
ở giai đoạn đầu tôm nuôi thương phẩm (cả ở tôm thẻ chân trắng và tơm sú), khả
năng gây thiệt hại có thể lên đến 100% trong vòng 20-30 ngày sau khi thả ni.
Tơm bị bệnh có gan tụy sưng hoặc teo, trắng nhạt; vỏ mềm, tăng trưởng chậm,
khi sắp chết tơm chìm xuống chết ở đáy ao (Lightner et al., 2012).
Năm 2010 dịch bệnh lan rộng ở Trung Quốc và bắt đầu lan ra ở một số vùng

nuôi tôm ở Việt Nam. Tại Malaysia, AHPND xuất hiện đầu tiên năm 2010 ở
Johor. Ở Thái Lan, năm 2012, khoảng 0,7% tổng số ao nuôi tôm đã bị nhiễm bởi
AHPND, xảy ra ở các tỉnh Rayong, Chantaburi, Trat (Flegel, 2012). Nghiên cứu
trong và ngoài nước trong thời gian này cho rằng nguyên nhân gây nên AHPND
có thể do nhiều loại tác nhân khác nhau: vi khuẩn, virus, độc tố từ tảo hoặc từ
thuốc trừ sâu và quản lý ao nuôi không tốt.
Ở Việt Nam trong nhiều năm qua ở ĐBSCL, tôm nuôi chết hàng loạt trên
diện rộng do virus gây bệnh đốm trắng và dịch AHPND (Đặng Thị Hoàng Oanh
và Nguyễn Thanh Phương, 2012; Bùi Quang Tề, 2003). Năm 2011, diện tích tơm
chết nhiều nhất, ở một số tỉnh ĐBSCL thiệt hại lên tới 97.691 ha diện tích ni.
Năm 2012 cả nước có khoảng 100.776 ha diện tích tôm nước lợ bị thiệt hại do
dịch bệnh (trong đó 91.174 ha nuôi tôm sú và 7.068 ha nuôi tôm thẻ) bao gồm
dịch bệnh đốm trắng, đầu vàng và dịch AHPND. Các tỉnh có diện tích tôm nuôi
bị thiệt hại nhiều là Sóc Trăng 23.371,5 ha (chiếm 56,6 % diện tích thả ni); Bạc
Liêu 16.919 ha (chiếm 41,9 % diện tích thả ni); Bến Tre 2.237 ha (chiếm 29,1
% diện tích thả ni); Trà Vinh 12.200 ha tơm sú (chiếm 49,3 % diện tích thả
ni) và 24,2 ha tơm thẻ chân trắng; Cà Mau diện tích tôm nuôi công nghiệp bị
bệnh là 958,58 ha, tăng nhiều hơn so với năm 2011 là 420,02 ha (Tổng cục Thủy
sản, 2012; 2013). Tại Đồng Bằng Sông Cửu Long của Việt Nam, năm 2015 bệnh
AHPND trên tôm thẻ chân trắng gây thiệt hại 8,9 triệu đôla và trên tôm sú là 1,8
6


triệu đơla (Tởng cục Thủy sản, 2016). Ngồi ra, tởng diện tích nuôi tôm nước lợ
bị thiệt hại do dịch bệnh năm 2018 là 12.359 ha
Ở Việt Nam, một số nghiên cứu đã xác định nguyên nhân gây AHPND ở
tôm nuôi bao gồm: tôm giống có chất lượng không đảm bảo (nhiễm Vibrio, có
dấu hiệu bất thường gan tụy, thậm chí đã hoại tử gan tụy cấp), thả nuôi trong điều
kiện môi trường bất lợi (hiện diện của thuốc bảo vệ thực vật, oxy hịa tan thấp, đợ
mặn cao, ơ nhiễm hữu cơ..) và có hiện diện của Vibrio và phage (Đặng Thị

Hoàng Oanh, 2012). Năm 2013, Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I đã phân
lập được một số loài vi khuẩn Vibrio (V. alginolyticus, V. ordalii, V. vulnificus, V.
fischerii) trên tôm bị AHPND, đồng thời khẳng định tảo độc không liên quan đến
hiện tượng tôm chết do hoại tử gan tụy. Khảo sát tại một số vùng vừa xảy ra
AHPND ở khu vực phía Bắc đầu năm 2013, Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản
I đã phát hiện tơm bị AHPND có nhiễm Vibrio sp. với tỷ lệ cao, đặc biệt là V.
vulnificus và V. parahaemolyticus.
2.3 Tác nhân gây AHPND trên tôm nuôi
Tác nhân gây AHPND là do các chủng V. parahaemolyticus có khả năng
sinh độc tố PirA/PirB. Nhận định này đi từ các thử nghiệm nhân tạo trong đó dịch
nuôi cấy chủng gây bệnh V. parahaemolyticus được lọc tiệt trùng (để loại bỏ vi
khuẩn) trước khi được bổ sung vào môi trường nuôi cấy tôm khỏe cũng sẽ gây ra
các triệu chứng tương tự AHPND (Tran et al., 2013). Tiếp đó, bằng cách sử dụng
công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới, Yang et al. (2014) đã giải trình tự toàn bộ
hệ gen của 3 chủng V. parahaemolyticus gây AHPND và một chủng không gây
bệnh. Kết quả so sánh dữ liệu giải trình tự cho thấy tồn tại một plasmid đặc trưng
có kích thước khoảng 70 kb ở cả 3 chủng gây bệnh. Plasmid này không tồn tại ở
chủng lành tính và được đặt tên là pVA1 (Hình 2.1). Phân tích trình tự của
plasmid này cho thấy nó có mang hai gen pirA và pirB (Hình 2.2) mã hóa cho các
protein có độ tương đồng cao với độc tố nhị thể PirA/PirB của Photorhabdus vốn
gây độc cho các loài côn trùng (Yang et al., 2014). Vai trò của các protein này
đối với AHPND sau đó được khẳng định bởi nhiều nghiên cứu (Lai et al., 2015;
Tinwongger et al., 2016; Theethakaew et al., 2017). Hiện nay, các protein này
của V. parahaemolyticus chính thức được đặt tên là PirA/PirB.

7


Hình 2.1 Sơ đờ plasmid pVA1 và vị trí các gen pirA và pirB

Hình 2.2 Vị trí gen pirA và pirB trên plasmid pVA1 của V. parahaemolyticus
2.4 Chẩn đoán AHPND và các biện pháp phịng, trị bệnh trên tơm ni
2.4.1 Chẩn đốn AHPND
Bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tơm ni có thể được chẩn đoán thơng qua phân
tích mơ học (quan sát mô gan tụy) hoặc phát hiện gen mã hóa độc tố bằng kỹ
thuật PCR. Khi quan sát các ớng gan tụy của tơm bệnh, có thể thấy sự thối hóa
của mơ ở nhiều vị trí khác nhau (các mơ gan tụy bị bong tróc thành các hạt hình
trịn trong lịng ớng) (Hình 2.3) (Nunan et al., 2014). Ngoài ra, vào giai đoạn cuối
của bệnh, phản ứng viêm và nhiễm khuẩn thứ cấp cũng có thể được quan sát thấy
(Nunan et al., 2014). AHPND cũng có thể được chẩn đoán bằng phương pháp
PCR một bước, phát hiện sự có mặt của gen pirA hoặc pirB với đợ chính xác cao
trên 90% (Han et al., 2015; Sirikharin et al., 2015). Ngoài ra, phương pháp PCR
lồng AP4, real-time PCR với mẫu dò TaqMan, hay kỹ thuật khuếch đại đẳng
nhiệt LAMP cũng đã được áp dụng để phát hiện AHPND với đợ chính xác cao
mà khơng cần đến bước làm giàu vi khuẩn (Koiwai et al., 2016).

8


Hình 2.3 Nhuộm mô gan tụy bằng haematoxylin và eosin (Phiwsaiya et al., 2017)
A: mô gan tụy thông thường; B: mơ gan tụy mắc AHPND

2.4.2 Phịng chống AHPND ở tơm nuôi
Cũng như các loại bệnh khác có căn nguyên là tác nhân vi khuẩn, bệnh
AHPND có thể được điều trị bằng các loại kháng sinh (Wang et al., 2018).
Tetracycline là nhóm kháng sinh được sử dụng phổ biến nhất để điều trị các bệnh
vi khuẩn trên tôm (Neela et al., 2007). Tuy nhiên, hậu quả trực tiếp của việc lạm
dụng kháng sinh trong phòng chống AHPND ở tôm là tồn dư kháng sinh hoặc
chất cấm vượt quá mức quy định tại các quốc gia nhập khẩu tôm. Rất nhiều lô
hàng tôm xuất khẩu của Việt Nam đã bị tiêu hủy hoặc trả về vì lý do này, gây ảnh

hưởng nghiêm trọng đến hình ảnh của ngành sản xuất thủy sản của nước ta. Bên
cạnh đó, việc sử dụng kháng sinh trong một thời gian dài sẽ làm phát sinh tính
kháng thuốc ở tác nhân gây bệnh cũng như làm lan truyền tính kháng thuốc trong
tập hợp vi khuẩn trong môi trường nuôi tôm (Cabello, 2006; Thuy et al., 2011).
Đây là vấn đề hết sức nghiêm trọng đối với sức khỏe cộng đồng, đặc biệt khi các
hộ nuôi sử dụng các loại kháng sinh chuyên dụng cho người để điều trị bệnh cho
tôm. Một số chủng V. parahaemolyticus gây AHPND tại Mexico đã được xác
định là kháng với cả oxytetracycline và tetracycline (Han et al., 2015). Nghiên
cứu của Trương Thị Mỹ Hạnh và ctv (2017) tại vùng nuôi tôm tập trung ở Quỳnh
Lưu, Nghệ An đã phân lập được 9 chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus gây
AHPND có kết quả 100% kháng với thuốc ampicillin, 90,9% kháng với
neomycin, 66,7% kháng với erythromycin và 55,6% kháng với tetracycline. Đặc
biệt, hiện tượng đa kháng được tìm thấy với 33,3% tổng số chủng kháng với 4
loại thuốc (Trương Thị Mỹ Hạnh và ctv., 2017). Các kết quả nghiên cứu này cho
thấy liệu pháp điều trị AHPND bằng kháng sinh là không có tính bền vững.
Một giải pháp có tính căn cơ khác để phòng chống AHPND ở tôm là ngăn
ngừa sự lây nhiễm của tác nhân gây bệnh bằng cách đảm bảo an toàn sinh học
9


thông qua việc kiểm soát chặt chẽ chất lượng nguyên liệu đầu vào (con giống,
thức ăn...), nước, môi trường xung quanh (ao nuôi trong nhà kín, vệ sinh, tiêu độc
sát trùng). Tuy nhiên, giải pháp này thường chỉ phù hợp với các công ty lớn do
đòi hỏi chi phí đầu tư ban đầu rất cao và chỉ có những công ty này mới có khả
năng đảm bảo được toàn bộ các khâu trong quá trình nuôi từ con giống, nguồn
nước đến thức ăn. Cần nhấn mạng rằng phần lớn sản lượng tôm nuôi ở nước ta là
đến từ những hộ nuôi nhỏ lẻ không có khả năng ứng dụng giải pháp có tính tổng
thể này.
Để thay thế cho tác dụng phòng và chữa bệnh của kháng sinh, một số chất
kháng khuẩn có nguồn gốc tự nhiên, thân thiện với môi trường được coi là giải

pháp an toàn sinh học thay thế các thuốc hóa học tổng hợp (Renu, 2010). Khi
thêm dịch chiết từ lá trầu không (Piper betle) vào khẩu phần ăn của tôm, Mohtar
et al (2016) nhận thấy dịch chiết này có tác dụng giảm thiểu AHPND. Ở nước ta,
Đặng Thị Lụa và ctv (2015) cũng chỉ ra hoạt tính kháng các chủng V.
parahaemolyticus gây AHPND in vitro của các dịch chiết lá trầu không, lá ổi
(Psidium guajava) cũng như của lá sim và hạt sim (Rhodomyrtus tomentosa).
Gần đây, Trương Thị Mỹ Hạnh và ctv (2017) đã thử nghiệm hoạt tính kháng V.
parahaemolyticus gây AHPND của dịch chiết thân lá cây thồm lồm (Polygonum
chinense L.). Các kết quả thử nghiệm in vitro cho thấy hoạt tính kháng khuẩn đối
với V. parahaemolyticus gây AHPND là rất mạnh. Bên cạnh đó, việc bổ sung
dịch chiết này với liều lượng 30 g/m3 tại nhiều thời điểm cho phép giảm tỷ lệ tôm
chết do AHPND từ 100% xuống 40% (Trương Thị Mỹ Hạnh và ctv., 2017). Các
kết quả nghiên cứu này cho thấy triển vọng của việc sử dụng các sản phẩm có
nguồn gốc từ thảo dược trong việc phòng chống AHPND ở tôm. Tuy nhiên, việc
áp dụng giải pháp này hiện nay vẫn chưa được áp dụng ở quy mô sản xuất lớn do
thiếu nguồn nguyên liệu ổn định và giá thành sản xuất cao.
Một giải pháp rất hữu hiệu khác để phòng chống AHPND ở tôm là sử dụng
thực khuẩn thể đặc hiệu với V. parahaemolyticus. Cần nhấn mạnh rằng thực
khuẩn thể đã được nghiên cứu từ rất lâu trong điều trị nhiễm khuẩn ở người. Tuy
nhiên, với sự ra đời của kháng sinh, các nghiên cứu thực khuẩn thể dần bị quên
lãng (Marks and Sharp, 2000). Do hiện trạng kháng thuốc kháng sinh ngày càng
gia tăng mà liệu pháp thực khuẩn thể lại trở thành một giải pháp công nghệ sinh
học đầy hứa hẹn trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn. Cơ chế diệt khuẩn của thực
khuẩn thể dựa trên khả năng lây nhiễm của một số loại virus trên vật chủ là vi
khuẩn với kết quả cuối cùng là tế bào vật chủ bị ly giải (Alagappan et al., 2010).
10


Dựa trên cơ chế này, thực khuẩn thể đã được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản
ngay từ các năm 1990 để ức chế vi khuẩn Lactococcus garveyi ở cá cam Nhật

(Yellow tail fish). Ngoài khả năng diệt khuẩn hữu hiệu, ưu điểm của liệu pháp
thực khuẩn thể còn là tính đặc hiệu cao (chỉ diệt vi khuẩn đích mà không ảnh
hưởng đến các vi khuẩn hữu ích khác trong môi trường) và giá thành thấp (do khả
năng tự tái bản trong môi trường tự nhiên) (Kalatzis et al., 2018). Thực khuẩn thể
được phân lập từ môi trường nước lợ có thể ly giải hiệu quả các chủng V.
parahaemolyticus thử nghiệm (Alagappan et al., 2010). Gần đây, Jun et al.
(2016) đã lần đầu tiên sử dụng một thực khuẩn thể có tên là pVp-1 thuộc nhóm
Siphoviridae, để thử nghiệm khả năng diệt V. parahaemolyticus gây AHPND.
Kết quả thử nghiệm cho thấy pVp-1 có khả năng ly giải 20/22 (90%) chủng gây
AHPND (Jun et al., 2016). Tiếp theo, nhóm nghiên cứu này đã thử nghiệm khả
năng phòng chống AHPND trên mô hình TTCT. Các kết quả thử nghiệm cho
thấy pVp-1 có khả năng giúp tôm sống 100% khi cảm nhiễm chủng V.
parahaemolyticus gây AHPND nếu như thực khuẩn thể này được sử dụng trong
cả giai đoạn phòng bệnh (prophylactic treatment) và giai đoạn chữa bệnh
(therapeutic treatment). Mẫu đối chứng không được xử lý với pVp-1 cho tỷ lệ
chết là 100% với các triệu chứng điển hình của AHPND (Jun et al., 2018). Tuy
rất có triển vọng nhưng các liệu pháp sử dụng thực khuẩn thể đều có nguy cơ về
an toàn sinh học do khả năng chuyển độc tính vào chủng vi khuẩn (Flegel et al.,
2005). Yêu cầu tiên quyết là các chủng thực khuẩn thể phải có đặc tính ly giải
nhưng không có khả năng trở lại trạng thái tiềm tan (lysogenic) và không được
mang các gen độc tính có thể chuyển vào vi khuẩn chủ làm cho vi khuẩn này trở
nên nguy hiểm hơn (Kalatzis et al., 2018).
Gần đây, một số công nghệ mới quản lý chất lượng nước trong chăn nuôi
thủy sản cũng đã được đề xuất như là các giải pháp phụ trợ để phòng và giảm
thiểu tác hại của AHPND trên tôm như công nghệ bio-floc, sử dụng vi tảo, rêu,
nuôi cùng với cá hay các loại nhuyễn thể hai mảnh vỏ (Dash et al., 2017). Bản
chất của công nghệ bio-floc là dựa trên việc bổ sung nguồn carbon (rỉ đường,
saccharoza, tinh bột) vào nước nuôi để chuyển hóa lượng nitơ dưới dạng NH4+ và
nitơ hữu cơ khác về dạng nitơ sinh khối, có thể được dùng làm thức ăn cho chính
loại thủy sản nuôi một cách trực tiếp hay gián tiếp (Crab et al., 2012). Trong quá

trình phát triển sinh khối, một số loại vi khuẩn có thể tổng hợp poly-b-hydroxy
butyrate (PHB), một loại polymer của các axít béo mạch ngắn có tính kháng
khuẩn mạnh (Sinha et al., 2008). Tuy nhiên, công nghệ bio-floc vẫn tồn tại một

11


số nhược điểm như giá thành cao, cần nguồn oxy lớn hay nguy cơ tồn tại vi
khuẩn có hại trong nguồn nước tái sử dụng (Ray & Leffler, 2013). Tương tự như
vậy, một số loại vi tảo có khả năng sinh tổng hợp các axít hữu cơ tự do có tính
kháng khuẩn phổ rộng (Dash et al., 2017), nhưng khó có thể áp dụng trên diện
rộng do giá thành cao và chịu nhiều ảnh hưởng của các yếu tố môi trường
(Charoonnart et al., 2018)
Trong những năm gần đây, các chế phẩm probiotic, có bản chất là các vi
khuẩn có lợi cho người và vật nuôi, bắt đầu được sử dụng phổ biến trong nuôi
trồng thủy sản nói chung và nuôi tôm nói riêng. Cơ chế hoạt động của probiotic
bao gồm: (i) có tác dụng ức chế các tác nhân gây bệnh; (ii) cải thiện hệ vi khuẩn
đường ruột của vật nuôi; (iii) cạnh tranh nguồn thức ăn và vị trí gắn trên đường
ruột; (iv) cải thiện các chức năng tiêu hóa; (v) kích hoạt hệ miễn dịch và (vi) cải
thiện chất lượng nước (Verschuere et al., 2000; Balcázar et al., 2006; Nimrat et
al., 2012; Wang et al., 2018; Nguyen et al., 2018). Hoạt tính kháng khuẩn của
các loại probiotic là gắn liền với khả năng tiết các enzyme phân hủy, các
bacteriocins, H2O2, và các axít hữu cơ mạch ngắn như axít lactic, acetic, butyric,
propionic... (Loh, 2017; Tinh, 2007). Các nghiên cứu gần đây sử dụng các chủng
Lactobacillus plantarum, Pseudoalteromonas spp. và Bacillus subtilis cho phép
cải thiện tỷ lệ sống của TTCT khi được cảm nhiễm bằng các chủng V.
parahaemolyticus gây AHPND (Nguyen et al., 2018; Wang et al., 2018; Taylor
et al., 2017). Ưu điểm của giải pháp probiotic là có giá thành thấp so với các giải
pháp đã nêu ở trên, an toàn đối với môi trường và tính hiệu quả đã được chứng
minh trong thời gian dài (Leyva-Madrigal et al., 2011; Sapcharoen and

Rengpipat, 2013; Pham et al., 2014).
2.5 Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
2.5.1 Đặc tính chủng V. parahaemolyticus
V. parahaemolyticus là một loại vi khuẩn Gram âm, hình que, ưa ấm, có khả
năng di động, thường tồn tại trong môi trường nước biển và vùng cửa biển vùng
nhiệt đới và cận nhiệt đới (Wang et al., 2015). Dưới kính hiển vi điện tử, V.
parahaemolyticus có hình dạng của một trực khuẩn với roi ở một đầu (Hình 2.4).
Tuy nhiên, trên thực tế, V. parahaemolyticus có thể có hai hệ thống roi (Hình
2.5): hệ thống roi ở đầu cực để di chuyển, trong khi đó hệ thống roi ngang giúp tế
bào bám vào nhau để hình thành màng sinh học (biofilm) (Wang et al., 2015).
Đặc tính này giúp V. parahaemolyticus có khả năng thích ứng với các điều kiện
ngoại cảnh luôn thay đổi. Ngoài ra, trên bề mặt của tế bào vi khuẩn còn có các
12


thụ thể QS (quorum sensing) và SS (stress-sensing) giúp V. parahaemolyticus tồn
tại được trong các môi trường khắc nghiệt như pH kiềm, nồng độ muối cao.
Trong quá trình lây nhiễm, V. parahaemolyticus sử dụng các yếu tố bám dính như
MAM7 để liên kết với fibronectin và axít phosphatidic trên bề mặt tế bào vật chủ,
từ đó tiết các chất tác động biến cấu (effectors) và các độc tố vào tế bào vật chủ
qua hai hệ thống tiết là T3SS (bao gồm T3SS1 và T3SS2) và T6SS (bao gồm
T6SS1 và T6SS2) (Hình 2.5) (Gode-Potratz et al., 2011).

Hình 2.4 Hình thái vi khuẩn V. parahaemolyticus dưới kính hiển vi điện tử
( />
Hình 2.5 Cấu trúc và các tác nhân độc lực của V. parahaemolyticus (Wang et al.,
2015)

13